相关申请
本申请是2002年7月23日提交的美国申请序列号10/200,148 的部分继续申请，后者是2002年5月7日提交的美国申请序列号 10/141,647的部分继续申请，后者是2001年7月23日提交的美国 申请序列号9/909,796的部分继续申请。
发明领域
本发明涉及细胞凋亡(apoptosis)-特异性的真核起始因子-5A (eIF-5A)和脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶(DHS)核酸和多肽和使 用细胞凋亡-特异性的eIF-5A和DHS调节细胞凋亡的方法。
发明背景
细胞凋亡是遗传程序性的细胞事件，其特征在于明确的形态特征， 例如细胞收缩、染色质凝聚、核碎裂和膜起泡。Kerr等(1972)Br.J. Cancer，26，239-257；Wyllie等(1980)Int.Rev.Cytol.，68， 251-306。它在正常的组织发育和内环境稳定中起重要作用，且认为细 胞凋亡程序中的缺陷会导致许多人类病症，从神经变性病和自身免疫 病到赘生物。Thompson(1995)Science，267，1456-1462；Mullauer 等(2001)Mutat.Res，488，211-231。尽管充分地表征了细胞凋亡 的细胞的形态特征，但对调节该过程的分子途径的阐明还仅仅处于开 始阶段。
认为在细胞凋亡中起关键作用的一组蛋白是称为天冬氨酸特异性 半胱氨酸蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶家族，似乎大多数细胞凋亡途径都 需要它。Creagh & Martin(2001)Biochem.Soc.Trans，29，696-701； Dales等(2001)Leuk.Lymphoma，41，247-253。天冬氨酸特异性半 胱氨酸蛋白酶通过剪切多种细胞蛋白来触发细胞凋亡，以响应细胞凋 亡刺激，这导致细胞凋亡的典型表现，包括细胞收缩、膜起泡和DNA 断裂。Chang & Yang(2000)Microbiol.Mol.Biol.Rev.，64， 821-846。
前细胞凋亡(pro-apoptotic)蛋白，例如Bax或Bak，也通过释 放能活化天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的分子在细胞凋亡途径中起 关键作用，所述的分子例如线粒体细胞色素c，由此通过细胞凋亡促进 细胞死亡。Martinou & Green(2001)Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.， 2，63-67；Zou等(1997)Cell，90，405-413。抗细胞凋亡蛋白，例 如Bcl-2，通过拮抗前细胞凋亡蛋白Bax和Bak的活性来促进细胞的 存活。Tsujimoto(1998)Genes Cells，3，697-707；Kroemer(1997) Nature Med.，3，614-620。认为Bax：Bcl-2的比率是决定细胞命运 的一种途径；过量的Bax会促进细胞凋亡，而过量的Bcl-2会促进细 胞存活。Salomons等(1997)Int.J.Cancer，71，959-965； Wallace-Brodeur & Lowe(1999)Cell Mol.Life Sci.，55，64- 75。
参与细胞凋亡的另一种关键蛋白是肿瘤抑制基因p53编码的蛋 白。该蛋白是调节细胞生长和诱导受损的和遗传不稳定的细胞中的细 胞凋亡的转录因子，可能是通过Bax的上调。Bold等(1997)Surgical Oncology，6，133-142；Ronen等，1996；Schuler & Green(2001) Biochem.Soc.Trans.，29，684-688；Ryan等(2001)Curr.Opin. Cell Biol.，13，332-337；Zrnig等(2001)Biochem.Biophys. Acta，1551，F1-F37。
能表征经历细胞凋亡的细胞的独特形态特征已经产生了许多评价 细胞凋亡的开始和进程的方法。可以用于它们的检测的细胞凋亡细胞 的一个这种特征是外转酶的活化，这导致磷脂酰丝氨酸(通常定位于 质膜内小叶的磷脂)的外化。Fadok等(1992)J.I mmunol.，149， 4029-4035。通过用与荧光染料相缀合的磷脂酰丝氨酸结合蛋白膜联蛋 白(Annexin)V进行染色，可以检测携带有外化的磷脂酰丝氨酸的细胞 凋亡细胞。通过用荧光素标记的脱氧核苷酸标记暴露的DNA片段的 3′-OH端，可以检测在细胞凋亡过程中发生的特征性的DNA断裂。能 结合核酸的荧光染料，例如Hoescht 33258，可以用于检测细胞凋亡 细胞的染色质凝聚和核碎裂。还可以从细胞提取物中存在的天冬氨酸 特异性半胱氨酸蛋白酶的蛋白水解活性的程度推断出细胞群体中的细 胞凋亡的程度。
作为一种遗传上确定的过程，细胞凋亡与所有的其它发育程序一 样，可以被突变破坏。据信细胞凋亡途径中的变化在许多疾病过程、 包括癌症中起关键作用。Wyllie等(1980)Int.Rev.Cytol.，68， 251-306；Thompson(1995)Science，267，1456-1462；Sen & D′Incalci(1992)FEBS Letters，307，122-127；McDonnell等(1995) Seminars in Cancer and Biology，6，53-60。关于癌症发展和进 程的研究已经常规地集中在细胞增殖上。但是，细胞凋亡在肿瘤发生 中所起的重要作用近来变得明显了。实际上，已经使用肿瘤模型研究 了许多现在已知的关于细胞凋亡的内容，因为肿瘤细胞中的细胞凋亡 的控制总是以某些方式发生变化。Bold等(1997)Surgical Oncology， 6，133-142。
在肿瘤发展的过程中，许多信号可以触发细胞凋亡。胞外信号包括 生长或存活因子耗尽、低氧和电离辐射。可以触发细胞凋亡的内部信 号包括DNA损伤、缩短端粒和能产生不合适的增殖信号的致癌突变。 Lowe & Lin(2000)Carcinogenesis，21，485-495。认为电离辐射 和几乎所有的用于治疗恶性肿瘤的细胞毒性化疗剂是通过触发内源的 细胞凋亡机制以诱导细胞死亡来发挥作用的。Rowan & Fisher(1997) Leukemia，11，457-465；Kerr等(1994)Cancer，73，2013-2026； Martin & Schwartz(1997)Oncology Research，9，1-5。
有证据表明，在癌症进程的早期，肿瘤细胞对能诱导细胞凋亡的试 剂(例如电离辐射或化学疗法药)是敏感的。但是，随着肿瘤的发展， 细胞产生了对细胞凋亡刺激的抗性。Naik等(1996)Genes and Development，10，2105-2116。这可以解释为什么早期的癌症对治疗 的反应比更晚期的病变更好。晚期癌症产生对化学疗法和放射治疗的 抗性的能力似乎与能限制肿瘤细胞对细胞凋亡刺激作出反应的能力的 细胞凋亡途径的变化有关。Reed等(1996)Journal of Cellular Biology，60，23-32；Meyn等(1996)Cancer Metastasis Reviews， 15，119-131；Hannun(1997)Blood，89，1845-1853；Reed(1995) Toxicology Letters，82-83，155-158；Hickman(1996)European Journal of Cancer，32A，921-926。在慢性淋巴细胞性白血病和结 肠癌中，已经将对化学疗法的抗性分别与抗细胞凋亡基因bcl-2的超 表达和前细胞凋亡bax基因的缺失或突变相关联。
肿瘤细胞的成功地实现扩散性转移的能力似乎也涉及细胞凋亡途 径的变化。Bold等(1997)Surgical Oncology，6，133-142。例如， 认为在70％的肿瘤中会发生肿瘤抑制基因p53中的突变。Evan等(1995) Curr.Opin.Cell Biol.，7，825-834。能使p53失活的突变会限制 细胞对DNA损伤作出反应诱导细胞凋亡的能力，使细胞容易受到进一 步突变的破坏。Ko & Prives(1996)Genes and Development，10， 1054-1072。
因此，细胞凋亡密切地与肿瘤转化和转移的发展和进程相关，对涉 及的细胞凋亡途径的更好理解会产生新的潜在的用于通过基因治疗方 案调节细胞凋亡途径来治疗癌症的靶位。Bold等(1997)Surgical Oncology，6，133-142。
已知脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶(DHS)和含有8-羟-2，7， 10-三氨基癸酸的真核翻译起始因子-5A(eIF-5A)在许多细胞进程中 起重要作用，包括细胞生长和分化。8-羟-2，7，10-三氨基癸酸是一种 独特的氨基酸，在所有检测的真核生物和古细菌中都有发现，但是在 真细菌中未发现，且eIF-5A是唯一已知的含有8-羟-2，7，10-三氨基 癸酸的蛋白。Park(1988)J.Biol.Chem.，263，7447-7449； Schümann & Klink(1989)System.Appl.Microbiol.，11，103-107； Bartig等(1990)System.Appl.Microbiol.，13，112-116；Gordon 等(1987a)J.Biol.Chem.，262，16585-16589。有活性的eIF-5A 是在2个翻译后步骤中形成的：第一步是，通过脱氧8-羟-2，7，10-三 氨基癸酸合酶的催化，将亚精胺的4-氨基丁基部分转移到前体eIF-5A 的特定赖氨酸的α-氨基上，形成脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸残基； 第二步包括，脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸羟化酶对该4-氨基丁基部 分进行羟基化，形成8-羟-2，7，10-三氨基癸酸。
eIF-5A的氨基酸序列在物种之间是非常保守的，且在eIF-5A的 8-羟-2，7，10-三氨基癸酸残基周围的氨基酸序列存在严格的保守，这 暗示该修饰对于存活是重要的。Park等(1993)Biofactors，4， 95-104。该假设进一步得到了下述发现的支持，即迄今为止在酵母中 发现的eIF-5A的两种同种型的失活或DHS基因的失活均阻断细胞分 裂，其中所述DHS基因能催化它们的活化中的第一步。Schnier等(1991) Mol.Cell.Biol.，11，3105-3114；Sasaki等(1996)FEBS Lett.， 384，151-154；Park等(1998)J.Biol.Chem.，273，1677-1683。 但是，酵母中eIF-5A蛋白的耗尽仅仅导致总蛋白合成的微小降低，这 暗示eIF-5A可能是翻译mRNA的特定亚型所需要的，而不是蛋白总合 成所需要的。Kang等(1993)，“Effect of initiation factor eIF-5A depletion on cell proliferation and protein synthesis，”in Tuite，M.(编)，Protein Synthesis and Targeting in Yeast，NATO Series H。近来发现能结合eIF-5A的 配体共有高度保守的基序，这也支持了eIF-5A的重要性。Xu & Chen (2001)J.Biol.Chem.，276，2555-2561。另外，发现修饰的eIF- 5A的8-羟-2，7，10-三氨基癸酸残基对于与RNA的序列特异性的结合 是重要的，且结合没有提供防止核糖核酸酶作用的保护。
Smit-McBride等在1989年从人克隆出了eIF-5A的第一个cDNA， 此后，已经从各种真核生物克隆出了eIF-5A的cDNA或基因，包括酵 母、大鼠、鸡胚胎、苜蓿和番茄。Smit-McBride等(1989a)J.Biol. Chem.，264，1578-1583；Schnier等(1991)(酵母)；Sano，A.(1995) in Imahori，M.等(eds)，Polyamines，Basic and Clinical Aspects， VNU Science Press，荷兰，81-88(大鼠)；Rinaudo & Park(1992) FASEB J.，6，A453(鸡胚胎)；Pay等(1991)Plant Mol.Biol.， 17，927-929(苜蓿)；Wang等(2001)J Biol.Chem.，276， 17541-17549(番茄)。
另外，eIF-5A的胞内耗尽会导致特定的mRNA在核中明显积累，表 明eIF-5A可能负责将特定种类的mRNA从核中穿梭运送到细胞质中。 Liu & Tartakoff(1997)Supplement to Molecular Biology of the Cell，8，426a.Abstract No.2476，37th American Society for Cell Biology Annual Meeting。eIF-5A在与核孔有关的核内丝处积 累和它与一般的核输出受体的相互作用进一步暗示，eIF-5A是核质穿 梭蛋白，而不是多核糖体的组分。Rosorius等(1999)J.Cell Science， 112，2369-2380。
已经在许多人组织和哺乳动物细胞系中探究了eIF-5A mRNA的表 达。例如，在血清丧失后加入血清之后，已经在人成纤维细胞中观察 到了eIF-5A表达的变化。Pang & Chen(1994)J.Cell Physiol.， 160，531-538。还在衰老的成纤维细胞中观察到了与年龄有关的脱氧 8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶活性的降低和充裕的前体eIF-5A，尽管 还没有确定这会反映同种型中的平均差异变化的可能性。Chen & Chen (1997b)J.Cell Physiol.，170，248-254。
研究已经显示，eIF-5A可能是病毒蛋白的细胞靶位，所述病毒蛋 白例如1型人免疫缺陷病毒Rev蛋白和1型人T细胞白血病病毒Rex 蛋白。Ruhl等(1993)J.Cell Biol.，123，1309-1320；Katahira 等(1995)J.Virol.，69，3125-3133。初步研究表明，eIF-5A可以 通过与其它RNA结合蛋白(例如Rev)的相互作用来导向到RNA上， 这暗示这些病毒蛋白能召集用于病毒RNA加工的eIF-5A。Liu等(1997) Biol.Signals，6，166-174。
已知脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶和eIF-5A在关键的细胞 过程中起重要作用，所述细胞过程包括细胞生长和衰老。例如，植物 中的脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶表达的反义减少会导致叶子和 果实的延迟衰老，表明植物中存在能诱导衰老的eIF-5A的同种型。见， WO 01/02592；PCT/US01/44505；美国申请号09/909,796。酵母中脱 氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶或eIF-5A基因的失活导致细胞分裂 的抑制。Schnier等(1991)Mol.Cell.Biol.，11，3105-3114； Sasaki等(1996)FEBS Lett.，384，151-154；Park等(1998)J.Biol. Chem.，273，1677-1683。
亚精胺类似物已经成功地用于体外地抑制脱氧8-羟-2，7，10-三氨 基癸酸合酶，以及体内地抑制8-羟-2，7，10-三氨基癸酸的形成，这伴 随着蛋白合成和细胞生长的抑制。Jakus等(1993)J.Biol.Chem.， 268，13151-13159；Park等(1994)J.Biol.Chem.，269， 27827-27832。多胺自身，特别是腐胺和亚精胺，似乎也在细胞增殖和 分化中起重要作用。Tabor & Tabor(1984)Annu.Rev.Biochem.， 53，749-790；Pegg(1988)Cancer Res.，48，759-774。例如，其 中的多胺生物合成途径已经被封闭的酵母突变体不能生长，除非提供 外源的多胺。Cohn等(1980)J.Bacteriol.，134，208-213。
还已经显示，多胺能保护细胞避免诱导细胞凋亡。例如，通过暴露 于亚精胺和精胺，已经阻止了胸腺细胞的细胞凋亡，其机理可能是阻 止了内切核酸酶的激活。Desiderio等(1995)Cell Growth Differ.， 6，505-513；Brune等(1991)Exp.Cell Res.，195，323-329。另 外，已经显示外源多胺能抑制B细胞受体介导的细胞凋亡以及单细胞 寄生物枯氏锥虫(Trypanosoma cruzi)的细胞凋亡。Nitta等(2001) Exptl.Cell Res.，265，174-183；Piacenza等(2001)Proc.Natl. Acad.Sci.，USA，98，7301-7306。还已经发现，低浓度的精胺和亚 精胺能减少新生大鼠的正常发育过程中神经细胞损失的数目，以及在 脑缺血过程中保护脑免于神经元损伤。Gilad等(1985)Brain Res.， 348，363-366；Gilad & Gilad(1991)Exp.Neurol.，111，349- 355。多胺还能抑制植物组织的衰老(程序性细胞死亡的一种形式)。 已经显示，亚精胺和腐胺能延迟康乃馨花和脱落的萝卜叶在收获后的 衰老。Wang & Baker(1980)HortScience，15，805-806(康乃馨 花)；Altman(1982)Physiol.Plant.，54，189-193(脱落的萝卜 叶)。
但是，在其它的研究中，已经发现外源多胺会诱导细胞凋亡。例如， 人乳腺癌细胞系通过诱导细胞凋亡对多胺类似物作出反应，已经显示 过量的腐胺会诱导DH23A细胞的细胞凋亡。McCloskey等(1995) Cancer Res.，55，3233-3236；Tome等(1997)Biochem.J，328， 847-854。
从这些多胺实验得到的结果集中地表明，eIF-5A的特异性同种型 的存在在诱导细胞凋亡中起作用。更具体地，这些数据与下述观点一 致，即存在由DHS激活的细胞凋亡-特异性的eIF-5A同种型。该DHS 反应需要亚精胺这一事实与下述发现相一致，即已经显示多胺会引起 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(与细胞凋亡有关的蛋白水解的重要 执行者)的活化。Stefanelli等(2000)Biochem.J，347，875-880； Stefanelli等(1999)FEBS Lett.，451，95-98。在类似的静脉中， 多胺合成的抑制剂可以延迟细胞凋亡。Das等(1997)Oncol.Res.，9， 565-572；Monti等(1998)Life Sci.，72，799-806；Ray等(2000) Am.J.Physiol，278，C480-C489；Packham & Cleveland(1994)Mol. Cell Biol.，14，5741-5747。
可以用下述事实解释外源多胺能抑制和促进细胞凋亡这一发现：根 据应用的水平，它们可以抑制会活化eIF-5A的DHS反应，由此阻止细 胞凋亡，或者通过毒性原因诱导细胞凋亡。低浓度的外源多胺能阻断 植物和动物系统中的细胞凋亡这一事实与下述事实一致，即低浓度的 多胺和它们的类似物可以作为DHS反应的竞争性抑制剂。实际上，甚 至外源的亚精胺(DHS反应的底物)也能通过底物抑制来阻止反应。 Jakus等(1993)J.Biol.Chem.，268，13153-13159。
但是，所有的多胺和它们的类似物在高浓度都是有毒性的，且能诱 导细胞凋亡。尽管它们能抑制推定的细胞凋亡-特异性的eIF-5A同种 型的活化，这还会因2个原因而发生。首先，活化的eIF-5A具有较长 的半衰期。Torrelio等(1987)Biochem.Biophys.Res.Commun.，145， 1335-1341；Dou & Chen(1990)Biochim.Biophys.Acta.，1036， 128-137。因此，由于脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶活性的抑制 导致的活化的细胞凋亡-特异性的eIF-5A的耗尽不能及时阻断亚精胺 的毒性作用造成的细胞凋亡。其次，多胺是脱氧8-羟-2，7，10-三氨基 癸酸反应的竞争性抑制剂，因此即使在毒性浓度也不能彻底阻断反 应。
本发明涉及紧接在诱导细胞凋亡之前上调的eIF-5A cDNA的克 隆。该细胞凋亡-特异性的eIF-5A可能是用于干涉能造成细胞凋亡的 疾病状态的合适靶位，因为它似乎是在参与细胞凋亡途径的下游效应 物和转录因子的转录后调节水平发挥作用的。更具体地，细胞凋亡-特 异性的eIF-5A似乎能选择性地促进编码细胞凋亡的下游效应物和转 录因子的mRNA从核向细胞质中的转移，它们随后在那里翻译。启动细 胞凋亡的最终决定似乎是源自内部的和外部的前-和-抗细胞凋亡信号 之间的复杂相互作用。Lowe & Lin(2000)Carcinogenesis，21， 485-495。通过它的促进下游细胞凋亡效应物和转录因子翻译的能力， 与细胞凋亡有关的eIF-5A似乎能有利于细胞凋亡地打乱这些信号之 间的平衡。
如前所述，非常确定的是，抗癌剂会诱导细胞凋亡，且细胞凋亡途 径的变化会削弱药物诱导的细胞死亡。Schmitt & Lowe(1999)J. Pathol.，187，127-137。例如，许多抗癌剂上调p53，已经丧失了 p53的肿瘤细胞会对这些药物产生抗性。但是，如果剂量足够，几乎所 有的化疗剂都能诱导不依赖于p53的细胞凋亡，这表明即使在药物抗 性的肿瘤中，也没有彻底阻断细胞凋亡的途径。Wallace-Brodeur & Lowe(1999)Cell Mol.Life Sci.，55，64-75。这暗示，即使不 能改正突变的基因，细胞凋亡eIF-5A的诱导也能绕开依赖于p53的 途径，并通过促进替代途径来诱导细胞凋亡。
与细胞凋亡有关的eIF-5A的诱导具有选择性地靶向癌细胞的潜 能，同时对正常的临近细胞具有较小影响的或没有影响。其产生原因 是，在肿瘤细胞中表达的促有丝分裂的癌基因能提供在正常细胞中不 存在的特定种类的mRNA形式的细胞凋亡信号。Lowe等(1993)Cell，74， 954-967；Lowe & Lin(2000)Carcinogenesis，21，485-495。例 如，p53-突变体肿瘤细胞中的野生型p53的恢复可以直接诱导细胞凋 亡，并增加肿瘤细胞系和xenograph的药物敏感性(Spitz等，1996； Badie等，1998)。
细胞凋亡-eIF-5A的选择性源自下述事实，即它选择性地促进下游 细胞凋亡效应物和转录因子的mRNA的翻译，这通过介导它们的从核到 细胞质中的转移来实现。因而，为了使细胞凋亡eIF-5A具有作用， 必须转录这些效应物和转录因子的mRNA。由于这些mRNA会在癌细胞 中转录，而不会在临近的正常细胞中转录，预期细胞凋亡eIF-5A会 促进癌细胞中的细胞凋亡，但是对正常细胞具有最小的影响，即使有 的话。因而，由于肿瘤细胞的选择性靶向，在含有与细胞凋亡有关的 eIF-5A的肿瘤细胞中的细胞凋亡潜能的恢复会减小癌症患者遭受的毒 性和副作用。细胞凋亡eIF-5A的诱导还具有加强肿瘤细胞对抗癌剂 的反应的潜能，并由此提高这些试剂对抗药性肿瘤的有效性。这反过 来会导致实现药效所需的更低剂量的抗癌剂和降低的对患者的毒性。
发明概述
本发明提供了分离的和/或纯化的大鼠细胞凋亡-特异性的eIF-5A 和DHS核酸以及细胞凋亡-特异性的eIF-5A和DHS的多肽和反义寡核 苷酸和表达载体。本发明还提供了分离的和/或纯化的细胞凋亡-特异 性的eIF-5A(在本文中也称作人eIF-5A1或eIF5a)。本发明还提供 了分离的和/或纯化的人eIF-5A2(在本文中也称作增殖的eIF-5A或 eIF5b)。本发明还提供了使用细胞凋亡-特异性的eIF-5A和DHS调节 细胞凋亡的方法。
本发明还提供了鉴别哺乳动物组织、特别是哺乳动物心脏组织局部 缺血的发生的方法。而且，提供了减少哺乳动物组织、优选心脏组织 中的细胞凋亡的方法。这些方法包含：测量和对比细胞凋亡-特异性的 eIF-5A和增殖的eIF-5A的基因表达水平，并在细胞凋亡-特异性的 eIF-5a的表达水平超过增殖的eIF-5A时与局部缺血的发生相关联。 在减少哺乳动物组织的细胞凋亡的方法中，提供了能抑制细胞凋亡-特 异性的eIF-5A的表达的试剂。
附图简述
图1说明了大鼠细胞凋亡-特异性的eIF-5A的3′端的核苷酸序列 和衍生的氨基酸序列。
图2说明了大鼠细胞凋亡-特异性的eIF-5A cDNA的5′端的核苷酸 序列和衍生的氨基酸序列。
图3说明了大鼠黄体细胞凋亡-特异性的eIF-5A全长cDNA的核苷 酸序列。
图4说明了大鼠细胞凋亡-特异性的DHS cDNA的3′端的核苷酸序 列和衍生的氨基酸序列。
图5是大鼠黄体细胞凋亡-特异性的eIF-5A cDNA的全长核苷酸序 列和人eIF-5A的核苷酸序列(编号BC000751或NM-001970，SEQ ID NO： 3)的比对。
图6是大鼠黄体细胞凋亡-特异性的eIF-5A cDNA的全长核苷酸序 列和人eIF-5A的核苷酸序列(编号NM-020390，SEQ ID NO：4)的比 对。
图7是大鼠黄体细胞凋亡-特异性的eIF-5A cDNA的全长核苷酸序 列和小鼠eIF-5A的核苷酸序列(编号BC003889)的比对。小鼠核苷酸 序列(编号BC003889)是SEQ ID NO：5。
图8是大鼠黄体细胞凋亡-特异性的eIF-5A的衍生的全长氨基酸 序列和人eIF-5A的衍生的氨基酸序列(编号BC000751或NM-001970) 的比对。
图9是大鼠黄体细胞凋亡-特异性的eIF-5A的衍生的全长氨基酸 序列和人eIF-5A的衍生的氨基酸序列(编号NM-020390)的比对。
图10是大鼠黄体细胞凋亡-特异性的eIF-5A的衍生的全长氨基酸 序列和小鼠eIF-5A的衍生的氨基酸序列(编号BC003889)的比对。
图11是大鼠黄体细胞凋亡-特异性的DHS cDNA的部分长度的核苷 酸序列和人DHS的核苷酸序列(编号BC000333，SEQ ID NO：8)的比 对。
图12是大鼠黄体细胞凋亡-特异性的eIF-5A cDNA的限制性酶切 图。
图13是部分长度的大鼠细胞凋亡-特异性的DHS cDNA的限制性酶 切图。
图14是使用32P-dCTP标记的大鼠黄体细胞凋亡-特异性的eIF-5A cDNA的3′-端测得的总RNA的RNA印迹(图14A)和溴化乙锭染色的凝 胶(图14B)。
图15是使用32P-dCTP标记的大鼠黄体细胞凋亡-特异性的DHS cDNA的3′-端测得的总RNA的RNA印迹(图15A)和溴化乙锭染色的凝 胶(图15B)。
图16说明了DNA梯化(DNA laddering)实验，其中检测了注射 PGF-2α后的超排卵的大鼠黄体中的细胞凋亡程度。
图17是从细胞凋亡的大鼠黄体中分离的基因组DNA的琼脂糖凝 胶，显示了用PGF-2α处理大鼠后的DNA梯化。
图18说明了DNA梯化实验，其中检测了超排卵的大鼠黄体的分散 细胞中的细胞凋亡程度，所述的大鼠在暴露于前列腺素F-2α(PGF-2α) 之前用亚精胺处理。
图19说明了DNA梯化实验，其中检测了超排卵的大鼠黄体中的细 胞凋亡程度，所述的大鼠用亚精胺和/或PGF-2α处理过。
图20是使用32P-dCTP标记的部分长度的大鼠黄体细胞凋亡-特异 性的eIF-5A cDNA测得的大鼠基因组DNA的DNA印迹。
图21说明了pHM6，它是哺乳动物附加表位表达载体(Roche Molecular Biochemicals)。
图22是使用32P-dCTP标记的大鼠黄体细胞凋亡-特异性的DHS cDNA的3′-非翻译区测得的、通过撤出血清诱导细胞凋亡后从COS-7 细胞分离出的总RNA的RNA印迹(图2 2A)和溴化乙锭染色的凝胶(图 22B)。
图23是说明瞬时转染COS-7细胞的方法的流程图。
图24是用pHM6转染后外源蛋白在COS-7细胞中的瞬时表达的蛋 白印迹。
图25说明了当用在有义方向含有全长大鼠细胞凋亡-特异性的 eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞时，由提高的天冬氨酸特异性半 胱氨酸蛋白酶活性反映的增强的细胞凋亡。
图26说明了当用在有义方向含有全长大鼠细胞凋亡-特异性的 eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞时，由提高的DNA断裂反映的增 强的细胞凋亡。
图27说明了当用在有义方向含有全长大鼠细胞凋亡-特异性的 eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞时，由提高的核碎裂反映的细胞 凋亡的检测。
图28说明了当用在有义方向含有全长大鼠细胞凋亡-特异性的 eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞时，由提高的核碎裂反映的增强 的细胞凋亡。
图29说明了当用在有义方向含有全长大鼠细胞凋亡-特异性的 eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞时，由磷脂酰丝氨酸暴露反映的 细胞凋亡的检测。
图30说明了当用在有义方向含有全长大鼠细胞凋亡-特异性的 eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞时，由提高的磷脂酰丝氨酸暴露 反映的增强的细胞凋亡。
图31说明了当用在有义方向含有全长大鼠细胞凋亡-特异性的 eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞时，由提高的核碎裂反映的增强 的细胞凋亡。
图32说明了当用在有义方向含有全长大鼠细胞凋亡-特异性的 eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞时，增强的细胞凋亡。
图33说明了当用在有义方向含有全长大鼠细胞凋亡-特异性的 eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞时，Bcl-2的下调。图33A是考 马斯蓝染色的蛋白印迹；图33B是对应的蛋白印迹。
图34是使用Bcl-2作为探针，用在反义方向含有全长大鼠细胞凋 亡-特异性的eIF-5A的pHM6瞬时转染的COS-7细胞的考马斯蓝染色的 蛋白印迹和对应的蛋白印迹。
图35是使用c-Myc作为探针，用在有义方向含有全长大鼠细胞凋 亡-特异性的eIF-5A的pHM6瞬时转染的COS-7细胞的考马斯蓝染色的 蛋白印迹和对应的蛋白印迹。
图36是使用p53作为探针时，用在有义方向含有全长大鼠细胞凋 亡-特异性的eIF-5A的pHM6瞬时转染的COS-7细胞的考马斯蓝染色的 蛋白印迹和对应的蛋白印迹。
图37是使用抗-[HA]-过氧化物酶探针对pHM6-全长大鼠细胞凋亡 -特异性的eIF-5A在COS-7细胞中的表达的考马斯蓝染色的蛋白印迹 和对应的蛋白印迹，和使用p53探针时，pHM6-全长大鼠细胞凋亡-特 异性的eIF-5A在COS-7细胞中的表达的考马斯蓝染色的蛋白印迹和 对应的蛋白印迹。
图38是从RKO细胞分离的人eIF5A2和人eIF5A2的序列(Genbank 编号XM-113401)的比对。
图39中的图说明了瞬时转染后，在RKO和RKO-E6细胞中发生的 细胞凋亡的百分比。用pHM6-LacZ或pHM6-eIF5A1瞬时转染了RKO和 RKO-E6细胞。用放线菌素D处理的和用pHM6-eIF5A1转染的RKO细胞 的细胞凋亡比用pHM6-LacZ转染的但是未用放线菌素D处理的细胞增 加了240％。用放线菌素D处理的和用pHM6-eIF5A1转染的RKO-E6细 胞的细胞凋亡比用pHM6-LacZ转染的但是未用放线菌素D处理的细胞 增加了105％。
图40中的图说明了瞬时转染后，在RKO细胞中发生的细胞凋亡的 百分比。用pHM6-LacZ，pHM6-eIF5A1，pHM6-eIF5A2或pHM6-截短的 eIF5A1瞬时转染了RKO细胞。用pHM6-eIF5A1转染的细胞的细胞凋亡 比用pHM6-LacZ转染的对照细胞增加了25％。用pHM6-eIF5A2或pHM6- 截短的eIF5A1转染的细胞没有明显的增加。
图41中的图说明了瞬时转染后，在RKO细胞中发生的细胞凋亡的 百分比。RKO细胞未转染，或者用pHM6-LacZ或pHM6-eIF5A1进行了 瞬时转染。校正转染效率后，60％的用pHM6-eIF5A1转染的细胞是细胞 凋亡的。
图42提供了瞬时转染后RKO细胞凋亡的流式细胞仪分析结果。RKO 细胞未转染，或者用pHM6-LacZ，pHM6-eIF5A1，pHM6-eIF5A2或pHM6- 截短的eIF5A1进行了瞬时转染。该表说明了基于每种方式的峰下面积 计算出的经历细胞凋亡的细胞的百分比。对未转染细胞中的背景细胞 凋亡和转染效率进行校正后，80％的用pHM6-eIF5A1转染的细胞表现出 细胞凋亡。用pHM6-LacZ，pHM6-eIF5A2或pHM6-截短的eIF5A1转染 的细胞仅仅表现出背景水平的细胞凋亡。
图4 3提供了从用0.25μg/ml放线菌素D处理0、3、7、24和48 小时的RKO细胞提取出的蛋白的蛋白印迹。上图说明了使用抗-p53作 为第一抗体的蛋白印迹。中图说明了使用抗-eIF5A1作为第一抗体的 蛋白印迹。下图说明了化学发光检测证实相同加载后用于考马斯蓝染 色的抗-eIF5A1印迹的膜。p53和eIF5A1都通过放线菌素D处理来上 调。
图44中的条线图表明细胞凋亡-特异性的eIF-5A(eIF5a)和增殖 eIF-5A(eIF5b)都在心脏组织中表达。心脏组织取自接受冠状动脉旁 路移植术(CABG)的患者。将eIF5a的基因表达水平(浅灰柱)与eIF5b (深灰柱)进行了对比。X-轴是患者识别号码。Y-轴是pg/ng 18s(信 使RNA的皮克数比核糖体RNA 18S的纳克数)。
图45中的条线图表明细胞凋亡-特异性的eIF-5A(eIF5a)和增殖 eIF-5A(eIF5b)都在心脏组织中表达。心脏组织取自接受瓣膜换置术 的患者。将eIF5a的基因表达水平(浅灰柱)与eIF5b(深灰柱)进行 了对比。X-轴是患者识别号码。Y-轴是pg/ng 18s(信使RNA的皮克 数比核糖体RNA 18S的纳克数)。
图46中的条线图显示了在局部缺血前的心脏组织和局部缺血后的 心脏组织中，通过实时PCR测得的细胞凋亡-特异性的eIF-5A(eIf5a) 与增殖eIF-5A(eIF5b)比较的基因表达水平。Y-轴是pg/ng 18s(信 使RNA的皮克数比核糖体RNA 18S的纳克数)。
图47示意地说明了在心脏组织上进行的实验。将心脏组织暴露于 正常的氧水平，并测量细胞凋亡-特异性的eIF-5A(eIF5a)和增殖的 eIF-5A(eIF5b)的表达水平。然后，降低输送给心脏组织的氧量，从 而诱导低氧和局部缺血，最后，在心脏组织发作心脏病。测量了细胞 凋亡-特异性的eIF-5A(eIF5a)和增殖的eIF-5A(eIF5b)的表达水 平，并与受到局部缺血破坏以前的心脏组织的表达水平进行了对比。
图48显示了在诱导局部缺血之前和之后心脏组织的EKG。
图49显示了具有图47所述实验的装置的实验台。
发明详述
本发明部分地基于从大鼠黄体分离出的能编码eIF-5A的全长 cDNA的发现和特征，其参与细胞凋亡(细胞凋亡-特异性的)。因此， 在一个实施方案中，本发明提供了分离的核酸，其含有能编码大鼠细 胞凋亡-特异性的eIF-5A多肽的核苷酸序列。本发明还提供了纯化的 多肽，其包含大鼠细胞凋亡-特异性的eIF-5A多肽的氨基酸序列。大 鼠细胞凋亡-特异性的eIF-5A多肽是指任何对大鼠特异性的多肽，其 在细胞凋亡的细胞中有差别地表达，且产生途径是，通过脱氧8-羟- 2，7，10-三氨基癸酸合酶的催化，将亚精胺的4-氨基丁基部分转移到 前体eIF-5A的特定保守赖氨酸的α-氨基上，形成脱氧8-羟-2，7，10- 三氨基癸酸残基，且脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸羟化酶对该4-氨基 丁基部分进行羟基化，形成8-羟-2，7，10-三氨基癸酸，由此活化 eIF-5A。
另外，使用本文提供的指导和本领域的技术人员熟知的技术，可以 将本发明的核酸和多肽大鼠细胞凋亡-特异性的eIF-5A序列用于从其 它细胞、组织、器官或动物中分离细胞凋亡-特异性的核酸和多肽。本 发明还提供了核酸分子，其适用作引物或杂交探针，用于检测能编码 本发明的大鼠细胞凋亡-特异性的eIF-5A多肽的核酸。
本发明的核酸可以是DNA、RNA、DNA/RNA双链体、蛋白-核酸(PNA) 或其衍生物。如本文所使用的，当基本上不含有细胞材料或化学前体 或其它化学制剂时，就说核酸或多肽是“分离的”或“纯化的”。应当 理解，术语分离的或纯化的不是指含有许多其它序列片段的库类型的 制剂。本发明的核酸或多肽可以纯化至同质性或其它的纯度。纯化的 水平基于目的用途。关键特征是，制剂能发挥需要的核酸或多肽的功 能，即使存在可观量的其它组分。
分离的多肽可以从能自然地表达它的细胞纯化，从已经变成能表达 它的细胞(重组体)纯化，或者使用已知的蛋白合成方法合成。例如， 蛋白的重组生产包括，将能编码诱导细胞凋亡的eIF-5A或DHS的核酸 分子克隆进表达载体中。将表达载体导入宿主细胞中，使蛋白在宿主 细胞中表达。然后可以通过任何合适的纯化方案，使用标准的蛋白纯 化技术，从细胞中分离蛋白。
优选地，本发明的能编码大鼠细胞凋亡-特异性的eIF-5A多肽的 分离的核酸具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列，且本发明的纯化的 多肽具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。本发明的大鼠细胞凋亡- 特异性的eIF-5A核酸和多肽包含分别与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2具有基本的序列同一性或同源性的序列及其功能衍生物和 变体。
如本文所使用的，术语“基本的序列同一性”或“基本的同源性” 是指与另一个序列表现出基本上的结构的或功能的等价的序列。具有 基本的序列同一性或基本的同源性的序列之间的任何结构的或功能的 差异都是最小的；也就是说，它们不会影响该序列如目标应用所示发 挥功能的能力。差异可以是由于例如不同物种之间的密码子选择中的 固有变化。如果2个或多个不同序列之间存在显著量的序列重叠或相 似性，或者即使序列的长度或结构不同，但是如果该不同序列表现出 类似的物理特征，则认为结构差异是最小的。这样的特征包括，例如， 在限定的条件下进行杂交的能力，或在蛋白的情况下，免疫学上的交 叉反应性，类似的酶活性等。通过本领域已知的方法，熟练的专业人 员可以容易地确定这些特征中的每一项。
另外，2个核苷酸序列是“基本上互补的”，如果它们之间具有至 少约70％或更大、更优选80％或更大、甚至更优选约90％或更大、和 最优选约95％或更大的序列相似性的话。2个氨基酸序列是基本上同 源的，如果它们在有活性的或功能上有关的多肽部分具有至少50％、优 选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少90％和最优选至少95％ 的相似性的话。
为了确定2个序列的百分比同一性，为了最佳的对比而将序列进行 比对(例如，为了最佳的比对，可以将缺口引入第一个和第二个氨基酸 或核酸序列中的1个或2个，为了对比目的，可以忽略非同源的序列)。 在优选的实施方案中，为了对比目的，比对了至少30％、40％、50％、 60％、70％、80％或90％或更大长度的参考序列。然后对比了在对应的氨 基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一个序列中的 位置被与第二个序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据 时，则在该位置分子是相同的(如本文所使用的，氨基酸或核酸的“同 一性”等同于氨基酸或核酸的“同源性”)。2个序列的百分比同一性 是序列共有的相同位置的数目的函数，同时应考虑缺口的数目和每个 缺口的长度，为了2个序列的最佳比对，需要导入所述的缺口。
使用数学算法，可以完成2个序列之间的序列对比和百分比同一性 和相似性的确定。(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.， 编，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing： Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，编，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data， Part 1，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，编，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer， Gribskov，M.和Devereux，J.，编，M Stockton Press，New York， 1991)。
本发明的核酸和蛋白序列还可以用作“查询序列”，以对序列数据 库进行搜索，例如，鉴别其它家族成员或相关的序列。可以使用 Altschul，等(1990)J.Mol Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST 程序(2.0版)进行这样的搜索。可以使用NBLAST程序进行BLAST核苷 酸搜索。可以使用XBLAST程序进行BLAST蛋白搜索，以得到与本发明 的蛋白同源的氨基酸序列。为了对比目的，为了获得有缺口的比对， 可以如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402 所述使用有缺口的BLAST。当使用BLAST和有缺口的BLAST程序时， 可以使用各程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
术语核酸的“功能衍生物”在本文中是指基因或核苷酸序列的同系 物或类似物。功能衍生物可以保留至少一部分给定基因的功能，这赋 予它根据本发明的用途。如本文所述的细胞凋亡-特异性的eIF-5A多 肽的“功能衍生物”是细胞凋亡-特异性的eIF-5A的片段、变体、类 似物或化学衍生物，其保留至少一部分细胞凋亡-特异性的eIF-5A活 性或与对细胞凋亡-特异性的eIF-5A特异性的抗体的免疫交叉反应 性。细胞凋亡-特异性的eIF-5A多肽的片段是指该分子的任何亚型。
功能变体还可以含有类似氨基酸的替代，其不会导致功能的变化， 或不会导致功能的不明显的变化。通过本领域已知的方法，例如定点 诱变或丙氨酸-扫描诱变，可以鉴别出对功能必需的氨基酸 (Cunningham等(1989)Science 244：1081-1085)。后一种方法在分 子中的每个残基处导入一个丙氨酸突变。然后测试得到的突变分子的 生物活性，例如激酶活性，或者在测定中，测试例如体外增殖活性。 通过结构分析，例如结晶、核磁共振或光亲和标记，还可以确定对于 结合配偶体/底物结合关键的位点(Smith等(1992)J.Mol.Biol.224： 899-904；de Vos等(1992)Science 255：306-312)。
“变体”是指与完整基因或其片段基本上相似的分子，例如含有一 个或多个替代的核苷酸、但是保留与特定基因杂交或编码能与天然DNA 杂交的mRNA转录物的能力的核苷酸替代变体。“同系物”是指来自不 同动物属或种的片段或变体序列。“类似物”是指非天然的分子，其与 完整分子、其变体或片段基本上相似或功能上相关。
变体肽包括天然产生的变体和通过本领域熟知的方法生产的那 些。使用分子技术和本文公开的序列信息，可以容易地鉴别/制造出这 样的变体。而且，基于与本发明的eIF-5A或DHS蛋白的序列和/或结 构同源性，可以将这些变体容易地与其它蛋白区别开。存在的同源性/ 同一性的程度主要基于蛋白是功能变体还是非功能变体、平行进行同 源(paralog)家族中存在的趋异量和定向进化同源(ortholog)之间 的进化距离。
使用重组技术，可以容易地产生本发明的eIF-5A或DHS蛋白的非 天然产生的变体。这样的变体包括但不限于蛋白的氨基酸序列中的缺 失、添加和替代。例如，一类替代是保守的氨基酸替代。这样的替代 是，将蛋白中的给定氨基酸替代为具有相似特征的另一种氨基酸。一 般视为保守替代的是，脂族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile中的彼此替 代；羟基残基Ser和Thr的互换；酸性残基Asp和Glu的交换；酰胺 残基Asn和Gln之间的替代；碱性残基Lys和Arg的交换；和芳族残 基Phe和Tyr中的替代。关于哪种氨基酸变化可能是表型沉默的指导， 参见Bowie等，Science 247：1306-1310(1990)。
或者，但也是优选地，能编码本发明的大鼠细胞凋亡-特异性的 eIF-5A多肽的核酸能在高度严格条件下与核苷酸序列(它与SEQ ID NO： 1的序列互补)杂交。如本文所使用的，术语“杂交”通常是指核酸在 合适的严格条件下的杂交，如本领域的技术人员根据探针序列和靶序 列的性质能容易地明白的。杂交和洗涤条件是本领域熟知的，通过改 变温育时间、温度和/或溶液的离子强度，可以根据需要的严格性容易 地调节条件。见，例如，Sambrook，J.等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbour Press，Cold Spring Harbor，New York，1989。
条件的选择取决于要杂交的序列的长度，特别是探针序列的长度， 核酸的相对G-C含量和允许的错配量。当需要在具有更低程度的互补 性的链间进行部分杂交时，优选低严格性的条件。当需要完全的或接 近完全的互补性时，优选高严格性的条件。对于一般的高严格性条件， 杂交溶液含有6×S.S.C.，0.01M EDTA，1×Denhardt氏溶液和0.5％ SDS。对于克隆的DNA片段，在约68℃杂交约3至4小时，对于总真 核DNA，杂交约12至16小时。对于更低的严格性，将杂交温度降低到 双链体的解链温度(Tm)以下约42℃。已知Tm是G-C含量、双链体长 度以及溶液离子强度的函数。
如本文所使用的，短语“与DNA或RNA分子的对应部分杂交”是指， 在合适的条件下，杂交的分子，例如，寡核苷酸、多核苷酸或任何核 苷酸序列(以有义或反义方向)识别另一种近似相同大小、且与其具有 足够的序列相似性的核酸分子的序列并与之杂交，以实现杂交。例如， 100个核苷酸长的有义分子识别核苷酸序列的约100个核苷酸的部分 并与之杂交，只要2个序列之间具有约70％或更多的序列相似性。应当 明白，“对应部分”的大小能允许杂交中的一些错配，从而“对应部分” 可以小于或大于与其杂交的分子，例如比其大或小20-30％、优选比其 大或小不超过约12-15％。
另外，多肽的功能变体还可以含有类似氨基酸的替代，其不会导致 功能的变化，或导致轻微的功能变化。通过本领域已知的方法，例如 定点诱变或丙氨酸-扫描诱变，可以鉴别出对功能必需的氨基酸 (Cunningham等，Science 244：1081-1085(1989))。后一种方法在 分子中的每个残基处导入一个丙氨酸突变。然后测试得到的突变分子 的生物活性，或者在测定中测试该生物活性。
例如，细胞凋亡-特异性的eIF-5A的类似物是指与完整蛋白或其 片段基本上类似的非天然的蛋白或肽模拟物(peptidomimetic)。细胞 凋亡-特异性的eIF-5A的化学衍生物含有其它的化学部分，其通常不 是肽或肽片段的一部分。通过使肽的目标氨基酸残基与有机衍生剂(它能 与选定的侧链或末端残基反应)反应，可以将修饰导入肽或其片段中。
从大鼠黄体分离出的能编码细胞凋亡-特异性的eIF-5A的全长 cDNA的初始发现和表征导致了能编码DHS的部分长度的cDNA克隆的 发现和表征，后者也是从大鼠黄体中分离出来的，且参与细胞凋亡。 因此，在其它实施方案中，本发明提供了分离的核酸，其含有能编码 大鼠细胞凋亡-特异性的DHS多肽的核苷酸序列。还提供了纯化的多 肽，其含有大鼠细胞凋亡-特异性的DHS多肽的氨基酸序列。大鼠细胞 凋亡-特异性的DHS多肽是指任何对大鼠特异性的多肽，其在细胞凋亡 的细胞中有差别地表达，且其通过将亚精胺的4-氨基丁基部分转移到 失活的eIF-5A的特定保守赖氨酸的α-氨基上形成脱氧8-羟-2，7，10- 三氨基癸酸，来催化脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸残基的形成，由此 活化eIF-5A。
优选地，本发明的能编码大鼠细胞凋亡-特异性的DHS多肽的分离 的核酸具有SEQ ID NO：6的核苷酸序列，且本发明的纯化的多肽具 有SEQ ID NO：7的氨基酸序列。本发明的大鼠细胞凋亡-特异性的 DHS核酸和多肽也包含这样的序列，其分别与SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7具有基本的序列同一性或同源性，及其功能衍生物和变体，其 已经在前面描述过。或者，也是优选地，本发明的分离的核酸具有能 在高严格条件下与SEQ ID NO：6的互补序列杂交的核苷酸序列，其 也已经在前面描述过。
正如本文所述的大鼠细胞凋亡-特异性的eIF-5A序列的核酸和多 肽的情况，本发明的大鼠细胞凋亡-特异性的DHS序列的核酸和多肽可 以用于从其它动物(包括人)中分离细胞凋亡-特异性的DHS核酸和多 肽。使用本领域已知的方法和本文提供的教导，基于物种间的至少80％ 的序列相似性，可以从动物和人分离这样的DHS序列。本发明还提供 了核酸分子，其适用作引物或杂交探针，用于检测能编码本发明的大 鼠细胞凋亡-特异性的DHS多肽的核酸。
细胞凋亡-特异性的eIF-5A和DHS是用于调节细胞凋亡(包括处 于疾病发展中的细胞凋亡)的合适靶位，因为它可能在参与细胞凋亡 途径的下游效应物和转录因子的转录后调节中发挥作用。因而，本发 明还提供了通过给细胞施用能调节细胞凋亡-特异性的eIF-5A和/或 DHS功能的试剂来调节细胞凋亡的方法。本领域的技术人员应当明白， 该试剂可以是仅仅调节细胞凋亡-特异性的eIF-5A功能，仅仅调节细 胞凋亡-特异性的DHS功能，或调节细胞凋亡-特异性的eIF-5A和DHS 功能二者。
细胞中的细胞凋亡-特异性的eIF-5A和/或DHS功能的正常水平的 任何合适的变化，都可以调节细胞凋亡。如本文所指的，改变或变化 可以是完全的或部分的，且可以包括转录或翻译控制中的变化，或者 能改变细胞中的细胞凋亡-特异性的eIF-5A和/或DHS功能的其它变 化。细胞凋亡-特异性的eIF-5A或DHS功能是指与下述的脱氧8-羟- 2，7，10-三氨基癸酸残基的形成有关的任何活性：DHS催化亚精胺的4- 氨基丁基部分转移到前体的eIF-5A的特定保守赖氨酸的α-氨基上， 脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸羟化酶羟化该4-氨基丁基部分形成8- 羟-2，7，10-三氨基癸酸，由此活化eIF-5A。
在本发明的一个实施方案中，该试剂能抑制细胞凋亡-特异性的 eIF-5A和/或DHS功能，由此抑制细胞凋亡。抑制细胞凋亡是指任何 或所有明确的细胞凋亡形态特征(例如，细胞收缩、染色质凝聚、核 碎裂和膜起泡)的强度和/或数量的任何降低和/或开始的延迟。
可以抑制细胞凋亡-特异性的eIF-5A和/或DHS功能的一种试剂是 反义寡核苷酸。优选地，反义寡核苷酸具有这样的核苷酸序列，其能 编码一部分细胞凋亡-特异性的eIF-5A多肽和/或细胞凋亡-特异性的 DHS多肽。本领域已知许多合适的能编码细胞凋亡-特异性的eIF-5A 多肽和/或DHS多肽的核酸序列。例如，SEQ ID NO：1、3、4、5、11、 15、19、20和21(细胞凋亡-特异性的eIF-5A核酸序列)，SEQ ID NO： 6和8(细胞凋亡-特异性的DHS核酸序列)，SEQ ID NO：12和16 eIF-5A(细胞凋亡-特异性的多肽序列)和SEQ ID NO：7(细胞凋亡- 特异性的DHS多肽序列)或其部分提供了合适的序列。根据本文所述的 方法，使用已知的序列作为探针，可以发现其它合适的序列。
因此，本发明还提供了反义寡核苷酸，其能编码一部分细胞凋亡- 特异性的eIF-5A多肽和/或细胞凋亡-特异性的DHS多肽，或其互补序 列。本发明的反义寡核苷酸可以是RNA或DNA的形式，例如cDNA、基 因组DNA或合成的RNA或DNA。DNA可以是双链的或单链的，且如果是 单链的则可以是编码链或非编码链。会干扰核酸的正常功能的寡聚化 合物与其靶核酸的特异性杂交通常称作“反义”。要干扰的DNA功能包 括复制和转录。要干扰的RNA功能包括所有的功能，例如，RNA向蛋白 翻译位点的转移，从RNA向蛋白的翻译，剪接RNA以产生一种或多种 mRNA种类，可以涉及RNA或由其促进的催化活性。这种反义寡核苷酸 的总体作用是抑制细胞凋亡-特异性的eIF-5A和/或DHS的表达和/或 生成的活化的细胞凋亡-特异性的eIF-5A的量。
或者，通过施用能抑制DHS酶反应的化学剂，可以抑制细胞凋亡- 特异性的DHS对细胞凋亡-特异性的eIF-5A的活化。例如，当在注射 PGF-2α诱导细胞凋亡后，用亚精胺(一种DHS反应的抑制剂)处理动 物时，会延迟反映大鼠黄体中的细胞凋亡的DNA梯化的开始(图18- 19)。Jakus等，(1993)J.Biol.Chem.268：13151-13159。
通过加入能降解细胞凋亡-特异性的eIF-5A DNA、RNA或蛋白的试 剂，或能降解细胞凋亡-特异性的DHS DNA、RNA或蛋白的试剂，由此 防止细胞凋亡-特异性的DHS活化细胞凋亡-特异性的eIF-5A，也可以 抑制或基本上减少细胞凋亡。在本发明的另一实施方案中，通过使用 核酶，可以抑制内源的哺乳动物细胞凋亡-特异性的DHS、细胞凋亡- 特异性的eIF-5A或二者的表达。合适的药物的实例包括，能抑制细胞 凋亡-特异性的DHS活化细胞凋亡-特异性的eIF-5A的那些，能抑制脱 氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸羟化酶活化细胞凋亡-特异性的eIF-5A的 那些，能抑制细胞凋亡-特异性的DHS的转录和/或翻译的那些，能抑 制细胞凋亡-特异性的脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸羟化酶的转录和 /或翻译的那些，以及能抑制细胞凋亡-特异性的eIF-5A的转录或翻译 的那些。能抑制细胞凋亡-特异性的DHS活化eIF-5A的药物的实例是 亚精胺，1，3-二氨基-丙烷，1，4-二氨基-丁烷(腐胺)，1，7-二氨基- 庚烷或1，8-二氨基-辛烷。
通过使细胞中的编码细胞凋亡-特异性的eIF-5A的基因失活，也 可能抑制细胞凋亡-特异性的eIF-5A。通过删除细胞中的基因，或将 缺失或突变导入基因中从而使该基因失活，可以实现这样的失活。通 过在基因中插入另一种DNA片段，从而使内源的细胞凋亡-特异性的 eIF-5A蛋白不表达，也可以使该基因失活。类似地，通过使细胞中的 编码细胞凋亡-特异性的DHS的基因失活，可能抑制细胞凋亡-特异性 的eIF-5A的活化。本领域已知将突变(例如缺失或插入)导入真核细 胞的基因中的方法，例如，美国专利号5,464,764。根据本领域已知 的方法和本文提供的教导，可以制备用于细胞中的基因突变的寡核苷 酸和表达载体；例如，使用用于制备和表达反义寡核苷酸的方法，可 以制备出对细胞中的突变基因有用的寡核苷酸和表达载体。
通过抑制细胞中的能编码细胞凋亡-特异性的eIF-5A的基因的表 达，也可能抑制细胞凋亡-特异性的eIF-5A的表达。通过共抑制可以 实现这样的失活，例如，通过将能编码细胞凋亡-特异性的eIF-5A的 核苷酸序列导入细胞中，以发生共抑制。类似地，通过共抑制来抑制 细胞中能编码细胞凋亡-特异性的DHS的基因的表达，可能抑制细胞凋 亡-特异性的eIF-5A的活化。根据本领域已知的方法和本文提供的教 导，可以制备用于共抑制的寡核苷酸和表达载体；例如，用于制备和 表达反义寡核苷酸的方法，可以用于制备对共抑制有用的寡核苷酸和 表达载体。本领域已知共抑制的方法，例如，美国专利号5,686,649。
抑制(通过例如反义、突变或共抑制)的一个结果是，减少了内源的 可翻译的细胞凋亡-特异性的eIF-5A或DHS的编码mRNA的量。结果， 减少了生成的细胞凋亡-特异性的DHS蛋白的量，由此减少了活化的 eIF-5A的量，这反过来减少了细胞凋亡-特异性的蛋白的翻译。这样 抑制或延迟了细胞凋亡，因为细胞凋亡的开始需要从头进行蛋白合 成。
在本发明的另一个实施方案中，试剂可以诱导细胞凋亡-特异性的 eIF-5A或DHS功能，由此诱导细胞凋亡。诱导细胞凋亡是指任何或所 有明确的细胞凋亡形态特征(例如，细胞收缩、染色质凝聚、核碎裂 和膜起泡)的强度和/或数量的任何增加和/或开始的加速。
可以使用任何合适的能诱导细胞凋亡-特异性的eIF-5A和/或DHS 功能的试剂。本领域的技术人员能够明白，可以施用细胞凋亡-特异性 的eIF-5A的失活的和有活性的形式。如果施用失活的形式或8-羟- 2，7，10-三氨基癸酸-未修饰的形式，天然的细胞凋亡-特异性的DHS会 活化eIF-5A。许多合适的能编码细胞凋亡-特异性的eIF-5A多肽和/ 或DHS多肽的核酸序列是本领域已知的。例如，SEQ ID NO：1、3、4、 5、11、15、19、20和21(细胞凋亡-特异性的eIF-5A核酸序列)，SEQ ID NO：6和8(细胞凋亡-特异性的DHS核酸序列)，SEQ ID NO：12 和16 eIF-5A(细胞凋亡-特异性的多肽序列)和SEQ ID NO：7(细 胞凋亡-特异性的DHS多肽序列)或其部分提供了合适的序列。根据本 文所述的方法，使用已知的序列作为探针，可以发现其它的合适的序 列。
例如，可以给细胞施用裸核酸(裸DNA载体，例如寡核苷酸或质粒) 或多肽，包括重组地生产的多肽。重组地生产的多肽是指，将能编码 eIF-5A或DHS蛋白的DNA序列置于合适的表达载体中，其在下面详 述。用该表达载体转染宿主，此后生产所需多肽。然后从宿主细胞中 分离多肽。本领域的技术人员可以制备出重组的能诱导细胞凋亡的 eIF-5A蛋白，例如，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，并使用重组的DHS 进行活化。Wang等(2001)J.Biol.Chem.，276，17541-17549； Eriksson等，(2001)Semin.Hematol.，38，24-31。多肽还可以 是合成的，它是使用已知的蛋白合成方法合成的。
可以使用配体促进多肽的摄入，例如源自能介导摄入广范的细胞的 炭疽的配体。Liu等(2001)J.Biol.Chem.，276，46326-46332。 也可以使用脂质体将重组蛋白施用给哺乳动物的靶细胞、组织和器 官。静脉内地施用包含蛋白的脂质体。通过将特定细胞受体的配体整 合入脂质体中，可以实现靶向定位。见，例如，Kaneda，Adv Drug Delivery Rev 43：197-205(2000)。
可以诱导细胞凋亡-特异性的eIF-5A或DHS功能的一种优选的试 剂是表达载体。因此，本发明提供了具有可操作地连接到核酸上的启 动子的表达载体，所述的核酸能编码细胞凋亡-特异性的eIF-5A多肽 和/或DHS多肽。本发明的表达载体可以是RNA或DNA的形式，例如 cDNA、基因组DNA或合成的RNA或DNA。DNA可以是双链的或单链的， 且如果是单链的，则可以是编码链或非编码链。可以使用任何合适的 表达载体(见，例如，Pouwels等，Cloning Vectors：A Laboratory Manual(Elsevior，N.Y.：1985))。优选地，表达载体具有可操作 地连接到核苷酸序列上的启动子序列，所述的核苷酸序列能编码细胞 凋亡-特异性的(有关的)eIF-5A多肽和/或细胞凋亡-特异性的(有关 的)DHS多肽。
在表达载体中，所需核酸和启动子是可操作地连接的，从而使该启 动子能驱动该核酸的表达。可以使用任何合适的启动子，只要能表达 核酸即可。这样的合适的启动子的实例包括各种病毒启动子、真核启 动子和结构上有活性的启动子。只要维持这样的可操作的连接，表达 载体可以包含超过一种的核酸(例如，能编码细胞凋亡-特异性的eIF- 5A和/或DHS两者的核酸)。表达载体可以任选地包含其它的元件，例 如多腺苷酸化序列、核糖体进入位点、转录调节元件(例如，增强子、 沉默子等)、其它的用于增强载体或转录物的稳定性或细胞中的所需转 录物的翻译或加工的序列(例如，分泌信号、前导序列等)或任何其它 合适的元件。
表达载体可以源自病毒，例如腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、逆 转录病毒或慢病毒。可以将本发明的表达载体转染进宿主细胞中，其 包括但不限于细菌物种、哺乳动物或昆虫宿主细胞系统，包括杆状病 毒系统(见，例如，Luckow等，Bio/Technology，6，47(1988))和 建立起的细胞系，例如293，COS-7，C127，3T3，CHO，HeLa，BHK 等。
腺病毒载体是优选的，因为它与质粒和其它的病毒载体(例如，单 纯疱疹病毒)不同，腺病毒载体能将基因转移进分裂的和未分裂的细胞 中，在心血管相关的位点(例如心肌、血管内皮和骨骼肌)具有较高 的蛋白表达水平。而且，腺病毒载体转移的基因能在染色体外 (epichromosomal)位置发挥功能，从而具有较小的将转移的基因不 合适地插入宿主基因组的关键位点的风险。腺病毒载体还理想地缺少 至少一个病毒复制所需的基因功能。优选地，腺病毒载体缺少腺病毒 基因组的E1、E2和/或E 4区域的至少一种必需的基因功能。更优选地， 载体还缺少至少一部分腺病毒基因组的E3区域(例如，E3区域的XbaI 缺失)。
通过简单地将病毒添加到培养基中，可以将重组的腺病毒输送给培 养的细胞。通过直接将病毒微粒注射进血流或所需组织中，可以感染 宿主动物/人。通过使病毒与脂质体(例如，Lipofectin，Life Technologies)或聚乙二醇复合，可以延长病毒在血清中的半衰期。腺 病毒载体通常通过病毒纤维蛋白的突出结构域(knob domain)和柯萨 奇病毒和腺病毒受体CAR之间的相互作用进入细胞。通过对病毒进行 基因工程处理以使其表达对某些细胞受体特异性的配体，可以使病毒 载体指向特定的细胞或不能表达CAR的细胞。
在一个替代实施方案中，通过使用化学制剂化学地上调内源的细胞 凋亡-特异性的eIF-5A、或细胞凋亡-特异性的DHS或二者的转录，或 者通过化学地增强细胞凋亡-特异性的eIF-5A的活化，可以启动或增 强细胞凋亡。在一个这样的实施方案中，将PGF-2α施用给动物/人的 癌细胞或肿瘤，以上调DHS和eIF-5A的转录。
细胞凋亡-特异性的eIF-5A是适用于调节细胞凋亡(包括造成疾 病进程的细胞凋亡)的靶物，因为它可能在参与细胞凋亡途径的下游 效应物和转录因子的转录后调节中发挥作用。在动物细胞中可以单独 地或组合地实现本发明的调节细胞凋亡-特异性的eIF-5A和细胞凋亡 -特异性的DHS的方法，从而诱导或增强细胞凋亡，并产生用于治疗和 预防疾病的新的方法和组合物，所述疾病由细胞不能发生细胞凋亡的 能力造成，或者造成该无能力，或者具有与其相关的病因学。
许多重要的人疾病是由细胞凋亡控制的异常造成的。这些异常会导 致细胞数目的病理学增加(例如癌症)或细胞的破坏性的损失(例如变 性病)。作为非限制性的实例，本发明的方法和组合物可以用于预防或 治疗下述的与细胞凋亡有关的疾病和病症：神经学的/神经变性病(例 如，阿尔茨海默病，帕金森病，亨延顿舞蹈病，肌萎缩性侧索硬化症 (Lou Gehrig氏病))，自身免疫病(例如，类风湿关节炎，全身性红斑 狼疮(SLE)，多发性硬化)，杜兴肌营养不良(DMD)，运动神经元病症， 局部缺血，心脏缺血，慢性心力衰竭，中风，婴儿脊髓性肌萎缩，心 搏停止，肾衰竭，特应性皮炎，脓毒症和脓毒性休克，AIDS，肝炎，绿 内障，糖尿病(1型和2型)，哮喘，色素性视网膜炎，骨质疏松症，异 种移植物排斥和烧伤。
本发明的方法可以用于治疗性治疗具有癌性细胞的或患有肿瘤的 动物，其量足以分别杀死癌性细胞或抑制肿瘤的进程。足以实现它的 量定义为治疗上有效的剂量。对于该应用有效的量取决于疾病的严重 性和动物自身免疫系统的总体状态。
肿瘤生长的抑制是指肿瘤进程的阻止或减小，例如肿瘤的生长、侵 袭力、转移和/或复发。本发明的方法可以用于治疗任何合适的肿瘤， 包括，例如，乳腺、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头和颈、 卵巢、前列腺、脑、胰腺、皮肤、骨、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾 丸、子宫颈或肝脏的肿瘤。使用本发明的组合物和方法，可以治疗动 物、优选哺乳动物、更优选人。本发明的方法因而可以体外地、离体 (ex vivo)地或体内地实现。
给药方案也随动物的疾病状况和状况而变化，一般从每日一次快速 灌注方式剂量或连续输注至多次施用(例如，每4-6小时)，或根据治 疗和动物的状况确定。但是，应当指出，本发明不限于任何特定剂量。
在本发明中，任何合适的方法或途径都可以用于施用，例如，经口 的、静脉内的、腹膜内的、皮下的或肌内的施用。施用的拮抗剂的剂 量取决于多个因素，包括，例如，施用的分子的类型，要治疗的肿瘤 的类型和严重性，和施用途径。但是，应当强调，本发明不限于任何 特定的方法和施用途径。
在一个替换实施方案中，本发明的方法可以与一种或多种传统的疗 法组合使用。例如，可以使用合适的抗肿瘤剂，例如化疗剂或放射。 在另一个替换实施方案中，本发明的方法可以与一种或多种合适的佐 剂组合使用，例如，细胞因子(例如，IL-10和IL-13)或其它的免疫刺 激剂。
在另一个替换实施方案中，通过测量细胞凋亡-特异性的eIF-5A 和增殖的eIF-5A(eIF-5b)的表达水平，可以诊断与细胞凋亡有关的 或伴随的病症(例如心脏组织的局部缺血)。增殖的eIF-5A(eIF-5b) 和细胞凋亡-特异性的eIF-5A的不同之处在于，它们由不同的启动子 从不同的位置转录；虽然它们两个在结构上是同源的，但是羧基末端 不同。本发明的诊断方法包括：对比给定细胞中的增殖的eIF-5A的量 和相同细胞中的细胞凋亡-特异性的eIF-5A的量。测量增殖的eIF-5A 和细胞凋亡-特异性的eIF-5A的基因表达水平，并相互对比。在正常 发挥功能时，细胞具有的增殖的eIF-5A(在本文中也称作eIF-5A2)的 量与细胞凋亡-特异性的eIF-5A(在本文中也称作eIF-5A1)的量相同 或更大。但是，在经历死亡或应激(例如局部缺血)的细胞中，细胞 凋亡-特异性的eIF-5A的表达水平比增殖的eIF-5A更高。因而，检测 细胞凋亡-特异性的eIF-5A的提高的表达水平，可以提供鉴别或诊断 与细胞凋亡有关的或伴随的病症(例如局部缺血)的方法。
图46显示了实验结果，其中在诱导心脏组织中局部缺血之前和之 后，测量了细胞凋亡-特异性的eIF-5A(eIF5a)和增殖的eIF-5A (eIF5b)的水平。也参见实施例6。在局部缺血前，细胞凋亡-特异性 的eIF-5a(eIF5a)和增殖的eIF-5A(eIF5b)的表达水平大致相似， 且处于低水平。诱导局部缺血后，细胞凋亡-特异性的eIF-5a(eIF5a) 的水平的增加比增殖的eIF-5A(eIF5b)的水平大的多。
知道正常组织中的细胞凋亡-特异性的eIF-5a(eIF5a)和增殖的 eIF-5A(eIF5b)的表达水平处于相对较低的水平，且彼此相对平衡 时，监控和检测细胞凋亡-特异性的eIF-5a(eIF5a)的基因表达水平 的增加，可以提供诊断将细胞或组织置于应激(例如局部缺血)中的 各种疾病或状况的方法。
而且，由于通过测量基因表达水平能够来检测这些状况，所以提供 了治疗这些状况的方法。例如，如果通过本领域已知的方法或通过检 测细胞凋亡-特异性的eIF-5a(eIF5a)基因表达水平的增加检测出了 心脏中的局部缺血，可以提供能抑制或降低基因表达水平的试剂，从 而降低细胞死亡的发生率。
本文上面讨论了能抑制或降低细胞凋亡-特异性的eIF-5a(eIF5a) 的基因表达水平的试剂，包括向细胞凋亡-特异性的eIF-5a(eIF5a) 使用反义寡核苷酸。优选的反义寡核苷酸含有与核苷酸序列的编码链 互补的寡核苷酸，所述的核苷酸序列能编码细胞凋亡-特异性的eIF- 5a，例如但不限于SEQ ID NO：3或4所列出的核苷酸序列。
在一些癌细胞中，正常的调节机制发生偏离，且细胞凋亡-特异性 的eIF-5A的量相对于增殖的eIF-5A的量发生变化(细胞凋亡-特异性 的eIF-5A的水平有所增加，使得它们超过了增殖的eIF-5A)。这潜在 地使得在细胞中出现任何表型变化之前就能诊断出细胞的癌性。
另外，在局部缺血的心脏组织中，细胞凋亡-特异性的eIF-5A的 量相对于增殖的eIF-5A的量有所变化，使得细胞凋亡-特异性的 eIF-5A的水平相对于增殖的eIF-5A的水平有所提高。
在另一个实施方案中，增殖的eIF-5A与细胞凋亡-特异性的eIF- 5A的比率可以用于药物筛选。这样的方法还包括，对比给定细胞中的 增殖的eIF-5A的量和相同细胞中的细胞凋亡-特异性的eIF-5A的量。 将增殖的eIF-5A和细胞凋亡-特异性的eIF-5A的正常比率与使细胞与 药物候选物接触后的增殖的eIF-5A和细胞凋亡-特异性的eIF-5A的 比率进行对比。接触后的增殖的eIF-5A和细胞凋亡-特异性的eIF-5A 的比率的变化使得能够鉴别具有细胞凋亡-调节活性的那些候选物。具 有细胞凋亡-调节活性的候选物可以用于通过抑制或降低细胞凋亡来 治疗与细胞凋亡有关的疾病。另外，增殖的eIF-5A和细胞凋亡-特异 性的eIF-5A的比率的变化可以用于调节细胞凋亡，其还可以用于治疗 本文所述的与异常的细胞凋亡有关的任何状况。
使用该方法，可以有效地筛选大量潜在的候选物(即库)，以鉴别 出能调节细胞凋亡的库成员。使用该方法可以筛选任何候选物或候选 物库。例如，使用本方法可以筛选已经表现出用作细胞凋亡调节剂前 途的生物反应调节剂的明确的细胞凋亡-调节活性，所述调节剂包括能 改变信号转导途径的单克隆抗体，细胞因子例如TRAIL(Apo2配体)， 类视黄醇/类固醇家族核受体的配体，和能结合和抑制蛋白激酶的小分 子化合物。
一种合适的候选物是蛋白激酶C-α反义寡核苷酸ISIS 3521(ISIS Pharmaceuticals，Inc.，Carlsbad，CA)，它具有抗肿瘤活性。其 它的特异性的候选物包括天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Idun Pharmaceuticals，San Diego，CA)，已知它在触发和执行能导致癌 症和神经变性病的多种细胞类型的细胞凋亡中起关键作用； GENASENSETM(Genta，Inc.，Berkeley Heights，NJ)，它是能阻断 Bcl-2的生成的反义药物；INGN 241(Introgen Therapeutics，Inc.， Houston，TX)，它是靶向P53的基因治疗剂；rituximab(IDEC Corporation，Osaka，日本)，它是抗-CD20的单克隆抗体；和用于心 血管疾病和癌症的一般细胞凋亡驱动治疗剂(AEgera Therapeutics Inc.，Quebec，加拿大)。
应当理解，当本发明的核酸和多肽在动物中用于预防或治疗目的 时，它们以另外含有药学上可接受的载体的组合物的形式施用。合适 的药学上可接受的载体包括，例如水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、 甘油、乙醇等中的一种或多种，以及它们的组合。药学上可接受的载 体还可以含有小量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲 剂，其能增强结合蛋白的保存期限和有效性。如本领域熟知的，可以 配制成注射组合物，以在施用给哺乳动物后提供活性成分的快速的、 持续的或延迟的释放。
本发明的组合物可以是多种形式。它们包括，例如，固体、半固体 和液体剂型，例如片剂、丸剂、粉末、液体溶液、分散体或悬浮液、 脂质体、栓剂、可注射的和可输注的溶液。优选的形式取决于预期的 施用模式和治疗用途。
这样的组合物可以以制药领域熟知的方式制备。在制备组合物时， 通常将活性成分与载体混合，或用载体稀释，和/或包封在载体中，其 可以是例如胶囊、囊剂、纸或其它容器的形式。当载体用作稀释剂时， 它可以是固体、半固体或液体材料，其作为活性成分的载体、赋形剂 或介质。因而，组合物可以是片剂、锭剂、囊剂、胶质囊(cachet)、 酏剂、悬浮液、气溶胶(如固体或在液体介质中)、含有例如按重量计 算高达10％的活性化合物的软膏、软和硬明胶胶囊、栓剂、注射液、悬 浮液、无菌包装的粉末和局部贴剂。
现在，已经一般地描述了本发明，通过参考下面的用作说明的实施 例，可以更容易地理解本发明。提出的实施例用于辅助理解本发明， 但是无意于、也不应当理解为以任何方式限制其范围。实施例不包括 常规方法的详细描述。这样的方法是本领域的普通技术人员熟知的， 并且在许多文献中有所记载。可以从许多文献得到常规方法的详细说 明，例如在构建载体和质粒、将能编码多肽的核酸插入这样的载体和 质粒、将质粒导入宿主细胞和表达和确定基因和基因产物时采用的方 法，所述文献包括Sambrook，J.等，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press。所有提及的文献在本文中都整体引作参考。
实施例
实施例1
本实施例示范了全长cDNA的分离和表征，所述cDNA能编码表现 出细胞凋亡-特异性的表达的大鼠eIF-5A核酸。
大鼠黄体中的超排卵和细胞凋亡的诱导
通过皮下注射50IU的PMSG(怀孕母马(Pregant Mare)血清促 性腺激素)，并在60至65小时后注射50IU的HCG(人绒毛膜促性腺 激素)，使未成熟的(21-30天龄)雌性大鼠超排卵。用HCG处理后7天， 通过皮下注射500mg的PGF-2α，诱导黄体细胞凋亡。在PGF-2α处理 后的各个时间(例如，1、8和24小时)处死大鼠，取出黄体，并置于液 氮中。在即将进行PGF-2α处理前处死大鼠，得到对照黄体组织。
大鼠卵巢黄体细胞的分散
超排卵后6-9天，通过多位点皮下注射500mg PGF-2α处理大鼠。 15-30分钟后，从超排卵的大鼠中取出卵巢，置于冰上的EBSS(Gibco) 中，吸干，称重。剪除结缔组织，用刀片切碎卵巢，用EBSS 2×洗涤2 次。通过在5ml EBS S中涡旋6.5mg胶原酶(Sigma，目录号C5138)， 制备出胶原酶溶液。将来自8个卵巢的切碎的组织加入到5ml在EBSS 中的胶原酶(在50ml锥形瓶中)中，通过吸入到Diamed吸管中数 次，温和地搅拌。然后将装有切碎的组织的烧瓶置于37℃水浴中20 分钟，在95％空气、5％CO2时轻摇(在GFL培养箱的位置45处)。
温育后，将烧瓶置于冰上，用塑料移液管将细胞悬浮液转移到安装 有瑞士Nitex尼龙单丝(75m)的Nitex过滤器上。将滤液收集到15ml Falcon试管中。将胶原酶溶液(6.5mg胶原酶/5ml EBSS)的第2份等 分试样(2.5ml)加入到保留在50ml锥形瓶中的切碎的组织中，使用 吸管轻轻搅拌，温育10分钟，如上进行过滤。合并2份滤液，在临床 离心机(～200g)中室温离心5分钟。用吸管取出除约2ml之外的上清 液并抛弃，将沉淀的细胞重新悬浮到剩余的2ml上清液中。
通过加入5mlMEM，并如上进行离心和重新悬浮，洗涤细胞2次。 将洗涤的细胞重新悬浮到50ml锥形瓶中的含有10mm谷氨酰胺的 30ml MEM中，在9 5％空气、5％CO2，在37℃不振荡的情况下温育1小 时。然后如上进行离心以沉淀细胞，并重新悬浮到含有10mM谷氨酰 胺的MEM中。
使用血细胞计数器检测分散细胞的浓度，使用锥虫蓝染料估计生存 力。将2-5×105细胞的等分试样置于12×75mm试管中，在95％空气、 5％CO2，在37℃不振荡的情况下温育2-5小时。通过估计DNA梯化的 程度，监控在该时间段中的细胞凋亡进程。
通过DNA梯化使大鼠黄体中的细胞凋亡可视化
通过DNA梯化检测了细胞凋亡的程度。根据生产商的说明书，使 用QIAamp DNA血液试剂盒(Qiagen)，从分散的黄体细胞或从切断的 黄体组织分离出了基因组DNA。在用PGF-2α处理诱导细胞凋亡之前、 诱导细胞凋亡后1和24小时，切断了黄体组织。通过将500ng DNA 与0.2μCi[α-32P]dCTP、1mM Tris、0.5mM EDTA、3单位克列诺 酶和各0.2pM的dATP、dGTP和dTTP在室温温育30分钟，对分离的 DNA进行末端标记。根据Sambrook等的方法，通过使样品穿过1ml Sepadex G-50柱，去除来整合的核苷酸。然后通过Tris-醋酸盐-EDTA (1.8％)凝胶电泳分离样品。在室温下真空干燥凝胶30分钟，在-80℃ 暴光于x-射线胶片24小时。
在一个实验中，注射PGF-2α后0、1或24小时，检查超排卵的大 鼠黄体中的细胞凋亡的程度。在0小时的对照中，取出的卵巢没有注 射PGF-2α。在用PGF-2α处理之前切断的对照黄体组织中，反映与细 胞凋亡有关的核酸酶活性的低分子量DNA片段的梯化不明显，但是在 诱导细胞凋亡后1小时内是可辨别的，在诱导细胞凋亡后24小时是显 著的，如图16所示。在该图中，上图是使用大鼠黄体细胞凋亡-特异 性的DHS cDNA的32P-dCTP标记的3′-非翻译区作为探针的RNA印迹的 放射自显影图。下图是总RNA的溴化乙锭染色的凝胶。每泳道含有10 μgRNA。数据表明，撤出血清后，存在eIF-5A转录物的下调。
在另一个实验中，用盐水代替PGF-2α处理了对应的对照动物。用 盐水或PGF-2α处理后15分钟，从动物取出黄体。在从动物取出组织 后3小时和6小时，从黄体分离基因组DNA。从PGF-2α-处理的动物取 出组织后6小时，基因组DNA的DNA梯化和增加的末端标记是明显的， 但是在取出组织后3小时却不明显。参见图17。当用PGF-2α处理后 15分钟切断黄体并在体外条件下在EBSS(Gibco)中维持6小时时，反 映细胞凋亡的DNA梯化也是明显的。从基因组DNA更大程度的末端标 记看出，与细胞凋亡有关的核酸酶活性也是明显的。
在另一个实验中，通过皮下注射500μg PGF-2α诱导了超排卵。 用等同体积的盐水溶液处理了对照大鼠。15-30分钟后，取出卵巢，用 胶原酶切碎。将来自用PGF-2α处理的大鼠的分散细胞在10mm谷氨 酰胺+10mm亚精胺中温育1小时，再在无亚精胺的10mm谷氨酰 胺中温育5小时(泳道2)，或在10mm谷氨酰胺+10mm亚精胺中温 育1小时，并再在10mm谷氨酰胺+1mm亚精胺中温育5小时(泳 道3)。用胶原酶分散来自盐水处理的大鼠的对照细胞，温育1小时， 再仅在谷氨酰胺中温育5小时(泳道1)。使用克列诺酶，用[α-32P]- dCTP标记来自每个样品的500纳克DNA，在1.8％琼脂糖凝胶上分离， 暴光于胶片24小时。结果如图18所示。
在另一个实验中，在皮下注射500μg PGF-2α之前的24、12和2 小时，使用以3个相同剂量0.333mg/100g体重输送的1mg/100g 体重的亚精胺对超排卵的大鼠进行皮下注射。将对照大鼠分成3组： 无注射，3次注射亚精胺，但是无PGF-2α；和3次在PGF-2α处理之前 注射等体积的盐水。前列腺素处理后1小时35分钟或3小时45分钟， 从大鼠取出卵巢，并用于分离DNA。使用克列诺酶，用[α-32P]-dCTP 标记来自每个样品的500纳克DNA，在1.8％琼脂糖凝胶上分离，暴光 于胶片24小时：泳道1，无注射(动物与泳道3-5的同时处死)；泳道 2，3次注射亚精胺(动物与泳道3-5的同时处死)；泳道3，3次注射 盐水，随后注射PGF-2α(用PGF-2α处理后1小时35分钟处死动物)； 泳道4，3次注射亚精胺，随后注射PGF-2α(用PGF-2α处理后1小时 35分钟处死动物)；泳道5，3次注射亚精胺，随后注射PGF-2α(用 PGF-2α处理后1小时35分钟处死动物)；泳道6，3次注射亚精胺，随 后注射PGF-2α(用PGF-2α处理后3小时45分钟处死动物)；泳道7，3 次注射亚精胺，随后注射PGF-2α(用PGF-2α处理后3小时45分钟处 死动物)。结果如图19所示。
RNA分离
在PGF-2α诱导细胞凋亡后的不同时间，从由大鼠取出的黄体组织 分离出总RNA。简而言之，将组织(5g)在液氮中磨碎。将磨碎的粉末 与30ml胍缓冲液(4M异硫氰酸胍，2.5mM NaOAc pH 8.5，0.8％β- 巯基乙醇)相混合。穿过4层Miracloth过滤混合物，在4℃、10,000g 离心30分钟。然后在11,200g对上清液进行氯化铯密度梯度离心20 小时。用75％乙醇冲洗沉淀的RNA，重新悬浮在600ml DEPC-处理过 的水中，用1.5ml95％乙醇和60ml 3M NaOAc在-70℃沉淀RNA。
基因组DNA分离和梯化
根据生产商的说明书，使用QIAamp DNA血液试剂盒(Qiagen)，从 提取的黄体组织或分散的黄体细胞中分离基因组DNA。通过将500ng DNA与0.2μCi[α-32P]dCTP、1mM Tris、0.5mM EDTA、3单位克 列诺酶和各0.2 pM的dATP、dGTP和dTTP在室温温育30分钟，对DNA 进行末端标记。根据Maniatis等描述的方法，通过使样品穿过1ml Sepadex G-50柱，去除未整合的核苷酸。然后通过Tris-醋酸盐-EDTA (2％)凝胶电泳分离样品。在室温下真空干燥凝胶30分钟，在-80℃暴 光于x-射线胶片24小时。
质粒DNA分离，DNA测序
使用上述的Sambrook等描述的碱裂解方法，分离质粒DNA。使用 双脱氧测序法，对全长阳性cDNA克隆进行了测序。Sanger等，Proc. Natl.Acad.Sci.USA，74：5463-5467。编辑了可读框，使用BLAST 搜索(GenBank，Bethesda，MD)进行了分析，使用BCM Search Launcher：Multiple Sequence Alignments Pattern-Induced Multiple Alignment Method(见，F.Corpet，Nuc.Acids Res.，16： 10881-10890，(1987))，进行了序列比对。序列和序列比对如图5-11 所示。
大鼠黄体RNA的RNA印迹杂交
在1％变性的甲醛琼脂糖凝胶上分离了在各个细胞凋亡阶段从大鼠 黄体分离出的20mg总RNA，并固定化到尼龙膜上。使用随机引物试 剂盒(Boehringer)、以32P-dCTP标记的全长大鼠细胞凋亡-特异性的 eIF-5A cDNA(SEQ ID NO：1)用于探测膜7×107。或者，使用随机 引物试剂盒(Boehringer)、以32P-dCTP标记的全长大鼠细胞凋亡-特 异性的DHS cDNA(SEQ ID NO：6)用于探测膜(7×107cpm)。在室温 用1×SSC，0.1％SDS洗涤膜1次，在65℃用0.2×SSC，0.1％SDS 洗涤3次。干燥膜，在-70℃暴光于X-射线胶片过夜。
如可以看到的，eIF-5A和DHS都在细胞凋亡的黄体组织中上调。 用PGF-2α-处理诱导细胞凋亡后的细胞凋亡-特异性的eIF-5A的表达 显著增强：在0时刻低，在处理的1小时内相当大地增加，在处理的8 小时内仍然增加，在处理的24小时内轻微增加(图14)。DHS的表达在 0时刻较低，在处理的1小时内相当大地增加，在处理的8小时内仍然 增加，在处理的24小时内又轻微增加(图15)。
使用基于酵母、真菌和人eIF-5A序列的引物生产细胞凋亡的大鼠 黄体RT-PCR产物
使用一对从酵母、真菌和人eIF-5A序列设计的寡核苷酸引物，通 过RT-PCR，从细胞凋亡的大鼠黄体RNA模板生成了与基因的3′端相 对应的部分长度的细胞凋亡-特异性的eIF-5A序列(SEQ ID NO：11)。 用于分离大鼠eIF-5A基因的3′端的上游引物是20个核苷酸的简并引 物：5′TCSAA RACHGGNAAGCAYGG 3′(SEQ ID NO：9)，其中S选自C 和G；R选自A和G；H选自A、T和C；Y选自C和T；且N是任意的 核酸。用于分离大鼠eIF-5A基因的3′端的下游引物含有42个核苷酸： 5′GCGAA GCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3′(SEQ ID NO： 10)。进行了逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)。简而言之，使用5mg 下游引物，合成了cDNA的第一链。然后将第一链用作使用上游和下游 引物的RT-PCR的模板。
RT-PCR产物在琼脂糖凝胶上的分离表明存在900碱基对的片段， 使用平端连接，将其亚克隆进pBluescriptTM(Stratagene Cloning Systems，LaJolla，CA)中，并测序(SEQ ID NO：11)。3′端的cDNA 序列是SEQ ID NO：11，3′端的氨基酸序列是SEQ ID NO：12。见 图1-2。
通过RT-PCR，从细胞凋亡的大鼠黄体RNA模板生成了与基因的5′ 端相对应且与3′端相重叠的部分长度的细胞凋亡-特异性的eIF-5A序 列(SEQ ID NO：15)。5′引物是具有序列5′CAGGTCTAGAGTTGGAATC GAAGC 3′(SEQ ID NO：13)的24-聚物，该序列是从人eIF-5A序列 设计的。3′引物是具有序列5′ATATCTCGAGCCTTGATTGCAACAGCT GCC 3′ (SEQ ID NO：14)的30-聚物，该序列是根据3′端RT-PCR片段设计 的。进行了逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)。简而言之，使用5mg 下游引物，合成了cDNA的第一链。然后将第一链用作使用上游和下游 引物的RT-PCR的模板。
RT-PCR产物在琼脂糖凝胶上的分离表明存在500碱基对的片段， 使用分别存在于上游和下游引物中的XbaI和XhoI克隆位点，将其亚 克隆进pBluescriptTM(Stratagene Cloning Systems，LaJolla，CA) 中，并测序(SEQ ID NO：15)。5′端的cDNA序列是SEQ ID NO：15， 5′端的氨基酸序列是SEQ ID NO：16。见图2。
大鼠细胞凋亡-特异性的eIF-5A的3′和5′端的序列(分别是SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：15)是重叠的，且产生全长cDNA序列(SEQ ID NO：1)。将该全长序列与GeneBank数据库中的序列进行了比对 和对比。见，图1-3。cDNA克隆能编码154个氨基酸的多肽(SEQ ID NO： 2)，其具有计算的分子量16.8 KDa。通过RT-PCR得到的大鼠细胞凋 亡-特异性的黄体eIF-5A基因的全长cDNA核苷酸序列SEQ ID NO：1 如图3所示，对应的衍生的氨基酸序列是SEQ ID NO：2。将eIF-5A 的衍生的全长氨基酸序列与人和小鼠eIF-5a序列进行了比对。见，图 8-10。
使用基于人DHS序列的引物生产细胞凋亡的大鼠黄体RT-PCR产物
使用一对从人DHS序列设计的寡核苷酸引物，通过RT-PCR，从细 胞凋亡的大鼠黄体RNA模板生成了与基因的3′端相对应的部分长度的 细胞凋亡-特异性的DHS序列(SEQ ID NO：6)。5′引物是具有序列 5′GTCTGTGTATTATTGGGCCC 3′(SEQ ID NO：17)的20-聚物；3′引物 是具有序列5′GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTT 3′ (SEQ ID NO：18)的42-聚物。进行了逆转录酶聚合酶链反应(RT- PCR)。简而言之，使用5mg下游引物，合成了cDNA的第一链。然后 将第一链用作使用上游和下游引物的RT-PCR的模板。
RT-PCR产物在琼脂糖凝胶上的分离表明存在606碱基对的片段， 使用平端连接，将其亚克隆进pBluescriptTM(Stratagene Cloning Systems，LaJolla，CA)中，并测序(SEQ ID NO：6)。通过RT-PCR 得到的大鼠细胞凋亡-特异性的黄体DHS基因的部分长度cDNA核苷酸 序列(SEQ ID NO：6)如图4所示，对应的衍生的氨基酸序列是SEQ ID NO：7。
基因组DNA的分离和DNA印迹(Southern)分析
从切断的大鼠卵巢中分离出了用于DNA印迹的基因组DNA。将约 100mg卵巢组织分成小块，置于15ml试管中。通过轻轻振荡组织悬 浮液，用1ml PBS洗涤组织2次，然后使用吸管去除PBS。将组织重 新悬浮到2.06ml DNA-缓冲液(0.2 M Tris-HCl pH 8.0和0.1mM EDTA) 中，并加入240μl 10％SDS和100μl蛋白酶K(Boehringer Manheim； 10mg/ml)。将组织置于振荡的45℃水浴中过夜。次日，加入另外100 μl蛋白酶K(10mg/ml)，将组织悬浮液在45℃水浴中温育另外的4 小时。温育后，用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取组织悬 浮液一次，且用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)提取一次。提取后，加 入1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和2体积的乙醇。使用以本生煤气 喷灯密封的且形成钩的玻璃吸管，从溶液中拉出DNA丝，将DNA转移 到清洁的微量离心管中。在70％乙醇中洗涤DNA一次，空气干燥10分 钟。将DNA沉淀溶解到500μl 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)中，加入 10μl核糖核酸酶A(10mg/ml)，然后在37℃温育DNA1小时。用 苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取DNA一次，通过加入1/10体积的 3M醋酸钠(pH 5.2)和2体积的乙醇，沉淀DNA。通过在4℃、13，000×g 离心10分钟，沉淀DNA。在70％乙醇中洗涤DNA沉淀一次，通过在4℃ 旋转DNA过夜，将其溶解在200μl 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)中。
为了DNA印迹分析，使用不切割内源基因或仅仅切割一次的各种限 制酶，消化了从大鼠卵巢分离出的基因组DNA。为此目的，在200μl 的总反应体积中，使10μg基因组DNA、20μl 10×反应缓冲液和100 U限制酶反应5至6小时。将消化的DNA加载到0.7％琼脂糖凝胶上， 在40伏电泳6小时或在15伏电泳过夜。电泳后，在0.2 NHCl中， 将凝胶脱嘌呤10分钟，随后在变性溶液(0.5M NaOH，1.5M NaCl) 中洗涤2次，每次15分钟，并在中和缓冲液(1.5M NaCl，0.5M Tris-HCl pH 7.4)中洗涤2次，每次15分钟。将DNA转移到尼龙膜 上，该膜在杂交溶液(40％甲酰胺，6×SSC，5×Denhart氏溶液(1× Denhart氏溶液是0.02％Ficoll，0.02％PVP和0.02％BSA)，0.5％SDS 和1.5mg变性的鲑精DNA)中预杂交。通过随机引发，用[α-32P]-dCTP 标记了大鼠eIF-5A cDNA的3′UTR的700碱基对的PCR片段(3′UTR 的650碱基对和编码的50碱基对)，并以1×106cpm/ml加到膜上。
类似地，用[α-32P]-dCTP随机引物地标记了大鼠DHS cDNA的606 碱基对的PCR片段(编码的450碱基对和3′UTR的156碱基对)，并以 1×106cpm/ml加到第2个相同的膜上。印迹在42℃杂交过夜，然后 用2×SSC和0.1％SDS在42℃洗涤2次，并用1×SSC和0.1％SDS 在42℃洗涤2次。然后将印迹暴光于胶片3-10天。
如图20所示，用限制酶切割了大鼠黄体基因组DNA，并用32P-dCTP 标记的全长eIF-5A cDNA进行探测。在高严格性条件下的杂交揭示了 全长cDNA探针与每种限制酶消化的DNA样品的几个限制片段的杂交， 这表明存在eIF-5A的几个同种型。特别指出，当用EcoRV(它具有在 细胞凋亡-特异性的eIF-5A的可读框内的限制位点)消化大鼠基因组 DNA时，在DNA印迹中可以检测到eIF-5A的细胞凋亡-特异性的同种 型的2个限制片段。在图20中用两个箭标指示了这2个片段。在用 EcoRI和BamHI(可读框中没有这些限制酶的剪切位点)标记的泳道 中，通过一个箭标指示了与eIF-5A的细胞凋亡-特异性的同种型相对 应的限制片段。这些结果暗示，细胞凋亡-特异性的eIF-5A在大鼠中 是单拷贝基因。如图5至13所示，eIF-5A基因在物种之间是高度保 守的，因此可以预期任何物种内的同种型之间存在显著量的保守。
图21显示了大鼠基因组DNA的DNA印迹，它是用32P-dCTP-标记的 部分长度的大鼠黄体细胞凋亡-特异性的DHS cDNA探测的。用EcoRV 切割了基因组DNA，所述EcoRV是不能切割用作探针的部分长度的cDNA 的限制酶。2个限制片段是明显的，这表明，存在2个拷贝的基因，或 者基因含有带有EcoRV位点的内含子。
实施例2
本实施例示范了用细胞凋亡-特异性的eIF-5A和DHS调节细胞凋 亡。
COS-7细胞的培养和RNA的分离
将COS-7(用能编码野生型T抗原的SV40突变体转化的非洲绿猴 肾成纤维样细胞系)用于所有的基于转染的实验。在含有0.584g/LL- 谷氨酰胺、4.5g/L葡萄糖和0.37％碳酸氢钠的Dulbecco氏修饰的 Eagle培养基(DMEM)中培养了COS-7细胞。该培养基补充了10％胎牛 血清(FBS)和100单位青霉素/链霉素。在5％CO2和95％空气的湿润环境 下，在37℃培养细胞。通过用0.25％胰蛋白酶和1mM EDTA的溶液使 贴壁的细胞脱附，每3至4天传代培养细胞一次。以1∶10的分离比， 将脱附的细胞分散在含有新鲜培养基的新培养皿中。
在150-mm组织培养物处理的皿(Corning)中，培养要用于分离RNA 的COS-7细胞。通过用胰蛋白酶-EDTA溶液脱附它们，来收获细胞。 将脱附的细胞收集在离心管中，通过在3000rpm离心5分钟，沉淀细 胞。取出上清液，将细胞沉淀在液氮中瞬间冷冻。根据生产商的说明 书，使用GenElute哺乳动物总RNA Miniprep试剂盒(Sigma)，从冷 冻的细胞分离出RNA。
重组质粒的构建和COS-7细胞的转染
使用如图21所示的哺乳动物附加表位表达载体pHM6(Roche Molecular Biochemicals)，构建了在有义方向携带大鼠细胞凋亡 eIF-5A的全长编码序列、在反义方向携带大鼠细胞凋亡eIF-5A的3′ 非翻译区(UTR)的重组质粒。该载体包含下述部分：CMV启动子-人巨 细胞病毒立即早期启动子/增强子；HA-来自流感血凝素的九氨酸肽附 加表位；BGH pA-牛生长激素多腺苷酸化信号；flori-f1起始点；SV40 ori-SV40早期启动子和起始点；新霉素-新霉素抗性(G418)基因；SV40 pA-SV40多腺苷酸化信号；ColE1-ColE1起始点；氨苄青霉素-氨苄 青霉素抗性基因。通过PCR，从pBluescript中的原始大鼠eIF-5A RT-PCR片段(SEQ ID NO：1)扩增了大鼠细胞凋亡eIF-5A的全长编 码序列和大鼠细胞凋亡eIF-5A的3′UTR。为了扩增全长eIF-5A，使 用的引物如下：正向5′GCC AAGCTTAATGGCAGATGATTT GG 3′(Hind3) (SEQ ID NO：22)，和反向5′CT GAATTCCAGT TATTTTGCCATGG 3′(EcoRI) (SEQ ID NO：23)。为了扩增大鼠eIF-5A的3′UTR，使用的引物如下： 正向5′AAT GAATTCCGCCATGACAGAGGAGGC 3′(EcoRI)(SEQ ID NO： 24)，和反向5′GCG AAGCTTCCATGG CTCGAGTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTT 3′ (Hind3)(SEQ ID NO：10)。
琼脂糖凝胶电泳后，分离的全长大鼠eIF-5A PCR产物的长度是430 碱基对，而3′UTR大鼠eIF-5A PCR产物的长度是697碱基对。将2 个PCR产物亚克隆进pHM6的Hind 3和EcoRI位点中，以生成pHM6- 全长eIF-5A和pHM6-反义3′UTReIF-5A。将全长大鼠eIF-5A PCR产 物在框内与位于多克隆位点上游的来自流感血凝素(HA)的九氨酸肽附 加表位进行亚克隆，以使得能够使用抗-[HA]-过氧化物酶抗体检测重 组蛋白。表达由人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子驱动，以确保在 哺乳动物细胞系中高水平表达。该质粒的特征还在于新霉素-抗性 (G418)基因，其使得能够对稳定的转染子进行筛选，以及SV40早期启 动子和起始点，其使得能够在能表达SV40大T抗原的细胞(例如 COS-7)中进行附加型复制。
在用于蛋白提取的细胞的24孔细胞培养板(Corning)中，或在用 于染色的细胞的4室培养载玻片(Falcon)中，培养了要用在转染实验 中的COS-7细胞。在补充了10％FBS、但是缺少青霉素/链霉素的DMEM 培养基中，使细胞生长至50～70％汇合。通过将0.32μg质粒DNA稀 释在42.5μl无血清的DMEM中，并将混合物在室温温育15分钟，制 备了足够24-孔板或培养载玻片的一个孔的转染培养基。将1.6μl转 染试剂LipofectAMINE(Gibco，BRL)稀释在42.5μl无血清的DMEM 中，并在室温温育5分钟。5分钟后，将LipofectAMINE混合物加入 DNA混合物中，在室温一起温育30至60分钟。在覆盖转染培养基之前， 用无血清的DMEM洗涤要转染的细胞一次，将细胞放回生长室中4小 时。
温育后，将0.17ml DMEM+20％FBS加入细胞中。在染色前诱导 进行细胞凋亡或收获用于蛋白印迹分析之前，再培养细胞40小时。作 为对照，还进行了假转染，其中转染培养基中不含有质粒DNA。
蛋白提取和蛋白印迹
通过在PBS(8g/L NaCl，0.2g/L KCl，1.44g/L Na2HPO4和 0.24g/L KH2PO4)中洗涤细胞2次，然后加入150μl热SDS凝胶加载 缓冲液(50mM Tris-HCl pH 6.8，100mM二硫苏糖醇，2％SDS，0.1％ 溴酚蓝和10％甘油)，从转染的细胞中分离了用于蛋白印迹的蛋白。将 细胞裂解物收集到微量离心管中，在95℃加热10分钟，然后在13,000 ×g离心10分钟。将上清液转移到新的微量离心管中，在-20℃储存至 准备使用。
对于蛋白印迹，在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离了2.5或5μg 总蛋白。将分离的蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上。然后将膜在封闭溶 液(5％脱脂奶粉，0.02％叠氮化钠，在PBS中)中温育1小时，在 PBS-T(PBS+0.05％Tween-20)中洗涤3次进行15分钟。将膜在PBS-T 中、在4℃储存过夜。次日，升至室温后，将膜在1μg/ml聚乙烯醇 中封闭30秒。在去离子水中冲洗膜5次，然后在5％牛奶的PBS溶液中 封闭30分钟。在与膜温育之前，将第一抗体在5％牛奶的PBS溶液中预 温育30分钟。
使用了几种第一抗体。抗-[HA]-过氧化物酶抗体(Roche Molecular Biochemicals)以1∶5000的稀度使用，以检测重组蛋白 的表达。由于该抗体能与过氧化物酶缀合，无需第二抗体，洗涤印迹， 并通过化学发光显影。使用的其它第一抗体是来自Oncogene的能识别 p53(Ab-6)、Bcl-2(Ab-1)和c-Myc(Ab-2)的单克隆抗体。p53的单 克隆抗体以0.1μg/ml的稀度使用，Bcl-2和c-Myc的单克隆抗体均 以0.83μg/ml的稀度使用。与第一抗体温育60至90分钟后，在PBS-T 中洗涤膜3次进行15分钟。然后在1％牛奶的PBS溶液中稀释第二抗 体，并与膜温育60至90分钟。当p53(Ab-6)用作第一抗体时，使用 的第二抗体是1∶1000稀度的山羊抗-小鼠IgG，其与碱性磷酸酶 (Rockland)缀合。当Bcl-2(Ab-1)和c-Myc(Ab-2)用作第一抗体时， 以1∶5000的稀度使用与过氧化物酶(Sigma)缀合的兔抗-小鼠IgG。 与第二抗体温育后，在PBS-T中洗涤膜3次。
使用2种检测方法来对印迹显影，一种比色方法和一种化学发光方 法。只有当p53(Ab-6)用作与碱性磷酸酶-缀合的第二抗体相结合的 第一抗体时，才使用比色方法。通过在黑暗中、在0.33mg/mL氮蓝四 唑、0.165mg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸、100mM NaCl、5mM MgCl2和100mM Tris-HCl(pH 9.5)的溶液中温育印迹，使结合的抗体可视 化。通过在2mM EDTA的PBS溶液中温育印迹，终止颜色反应。化学 发光检测方法用于所有其它的第一抗体，包括抗-[HA]-过氧化物酶、 Bcl-2(Ab-1)和c-Myc(Ab-2)。ECL Plus蛋白印迹检测试剂盒 (Amersham Pharmacia Biotech)用于检测过氧化物酶-缀合的结合抗 体。简而言之，轻轻地吸干膜，然后在暗处与试剂A和试剂B的40∶1 混合物温育5分钟。吸干膜，置于醋酸盐层之间，暴光于X-射线胶片 10秒至10分钟。
在COS7细胞中诱导细胞凋亡
2种方法用于诱导转染的COS-7细胞的细胞凋亡，血清丧失和用链 霉菌属物种(Streptomyces sp)的放线菌素D(Calbiochem)处理。 对两种处理而言，转染后40小时去除培养基。在血清饥饿实验中，将 培养基替换为不含血清和抗生素的DMEM。将在补充了10％FBS的、不 含抗生素的DMEM中生长的细胞用作对照。在细胞凋亡的放线菌素D诱 导中，将培养基替换为补充了10％FBS和1μg/ml溶解在甲醇中的放 线菌素D的、不含抗生素的DMEM。在补充了10％FBS和等体积甲醇的、 不含抗生素的DMEM中，培养对照细胞。在2个方法中，48小时后，通 过用Hoescht或膜联蛋白V-Cy3染色，确定了细胞凋亡细胞的百分比。 还通过RNA印迹分析确认了细胞凋亡的诱导，如图22所示。
Hoescht染色
用核染料(Hoescht)来标记转染的COS-7细胞的核，以基于形态 特征(例如核碎裂和凝聚)鉴别细胞凋亡的细胞。在即将使用之前， 制备由无水甲醇和冰醋酸的3∶1混合物组成的固定剂。将等体积的固 定剂加入到在培养载玻片上生长的COS-7细胞的培养基中，并温育2 分钟。从细胞取出培养基/固定剂混合物，并抛弃，给细胞加入1ml 固定剂。5分钟后，抛弃固定剂，给细胞加入1ml新鲜的固定剂，并 温育5分钟。抛弃固定剂，在加入1ml Hoescht染料(0.5μg/ml Hoescht 33258，在PBS中)之前，将细胞空气干燥4分钟。在暗处温 育10分钟后，抛弃染色溶液，用去离子水洗涤载玻片3次进行1分钟。 洗涤后，给细胞加入1ml McIlvaine氏缓冲液(0.021M柠檬酸，0.058 M Na2HPO4·7H2O；pH 5.6)，将它们在暗处温育20分钟。抛弃缓冲液， 在暗处将细胞空气干燥5分钟，去除分隔培养载玻片各孔的室。向载 玻片加几滴用于荧光的Vectashield封固剂(Vector Laboratories)，覆盖上盖玻片。使用紫外线滤色片，在荧光显微镜下 观察染色的细胞。将具有明亮地染色的或碎裂的核的细胞记作细胞凋 亡的。
膜联蛋白V-Cy3染色
使用膜联蛋白V-Cy3细胞凋亡检测试剂盒(Sigma)来荧光地标记在 细胞凋亡细胞上的外化的磷脂酰丝氨酸。根据生产商的方案、但进行 了下述修改，使用试剂盒。简而言之，用PBS洗涤在4室培养载玻片 上生长的转染的COS-7细胞2次，用1×结合缓冲液洗涤3次。加入 150μl染色溶液(1μg/ml AnnCy3，在1×结合缓冲液中)，在暗处温 育细胞10分钟。然后去除染色溶液，用1×结合缓冲液洗涤细胞5次。 从培养载玻片去除室壁，给细胞加几滴1×结合缓冲液，覆盖盖玻片。 使用绿色滤色片，以使阳性染色的(细胞凋亡的)细胞的红荧光可视 化，在荧光显微镜下分析染色的细胞。通过在可见光下计数细胞数目， 确定总细胞群体。
实施例3
本实施例示范了用细胞凋亡-特异性的eIF-5A和DHS调节细胞凋 亡。
使用在前面实施例所述的一般过程和方法，图23是说明瞬时转染 COS-7细胞的过程的流程图，其中将无血清培养基中的细胞在质粒DNA (在lipofectAMINE中)中温育4小时，加入血清，将细胞再温育40 小时。然后，在分析前在含有血清的正常培养基中温育细胞另外48小 时(即没有进一步的处理)，在分析前除去血清48小时以诱导细胞凋 亡，或者在分析前用放线菌素D处理细胞48小时以诱导细胞凋亡。
图22是说明在用pHM6转染后外源蛋白在COS-7细胞中瞬时表达 的蛋白印迹。在假转染、用pHM6-LacZ、pHM6-反义3′rF5A(pHM6- 反义3′UTR大鼠细胞凋亡eIF-5A)或pHM6-有义rF5A(pHM6-全长大鼠 细胞凋亡eIF-5A)转染后48小时，从COS-7细胞分离出了蛋白。通过 SDS-PAGE，将来自每个样品的5μg蛋白分级分离，转移到PVDF膜上， 用抗-[HA]-过氧化物酶进行蛋白印迹。通过化学发光检测了结合的抗 体，并暴光于x-射线胶片30秒。LacZ(泳道2)和有义大鼠细胞凋亡 eIF-5A(泳道4)的表达清晰可见。
如上所述，假转染了COS-7细胞，或者用pHM6-有义rF5A(pHM6- 全长大鼠eIF-5A)进行了转染。转染后40小时，通过撤去血清48小 时，诱导细胞发生细胞凋亡。使用荧光均质的天冬氨酸特异性半胱氨 酸蛋白酶测定试剂盒(Roche Diagnostics)，测量了转染的细胞提取 物中的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶蛋白水解活性。还使用FragEL DNA断裂细胞凋亡检查试剂盒(Oncogene)，测量了DNA断裂，该试剂 盒能用荧光素标记的脱氧核苷酸标记暴露的DNA片段的3′-OH端。
假转染了或用pHM6-有义rF5A(pHM6-全长大鼠eIF-5A)转染了其 它的COS-7细胞。转染后40小时，使细胞在含有血清的正常培养基中 生长另外的48小时(无进一步的处理)，通过撤去血清48小时诱导发 生细胞凋亡，或者通过用0.5μg/ml放线菌素D处理48小时诱导发 生细胞凋亡。细胞用Hoescht 33258染色，它说明了伴随细胞凋亡的 核碎裂，或者用膜联蛋白V-Cy3染色，它说明了伴随细胞凋亡的磷脂 酰丝氨酸暴露。还使用绿色滤色片，通过荧光显微镜观察了染色的细 胞，进行计数，以确定发生细胞凋亡的细胞的百分比。在可见光下计 数了总细胞群体。
图25说明了当用在有义方向含有全长大鼠细胞凋亡-诱导的eIF- 5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞时，如通过提高的天冬氨酸特异性半 胱氨酸蛋白酶活性反映的增强的细胞凋亡。大鼠细胞凋亡-诱导的 eIF-5A的表达导致天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活性提高了60％。
图26说明了当用在有义方向含有全长大鼠细胞凋亡-诱导的eIF- 5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞时，如通过提高的DNA断裂反映的增 强的细胞凋亡。大鼠细胞凋亡-诱导的eIF-5A的表达导致DNA断裂提 高了273％。图27说明了当用在有义方向含有全长大鼠细胞凋亡-诱导 的eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞时，如通过提高的核碎裂反映 的细胞凋亡的检测。能表达大鼠细胞凋亡-诱导的eIF-5A的细胞中， 存在更高的碎裂的核的发生率。图28说明了当用在有义方向含有全长 大鼠细胞凋亡-诱导的eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞时，如通过 提高的核碎裂反映的增强的细胞凋亡。大鼠细胞凋亡-诱导的eIF-5A 的表达导致核碎裂分别比无血清饥饿的和血清饥饿的对照样品提高了 27％和63％。
图29说明了当用在有义方向含有全长大鼠细胞凋亡-诱导的eIF- 5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞时，如通过磷脂酰丝氨酸暴露反映的 细胞凋亡的检测。图30说明了当用在有义方向含有全长大鼠细胞凋亡 -诱导的eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞时，如通过提高的磷脂酰 丝氨酸暴露反映的增强的细胞凋亡。大鼠细胞凋亡-诱导的eIF-5A的 表达导致磷脂酰丝氨酸暴露分别比无血清饥饿的和血清饥饿的对照样 品提高了140％和198％。
图31说明了当用在有义方向含有全长大鼠细胞凋亡-诱导的eIF- 5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞时，如通过提高的核碎裂反映的增强 的细胞凋亡。大鼠细胞凋亡-诱导的eIF-5A的表达导致核碎裂分别比 未处理的和处理的对照样品提高了115％和62％。图32对比了特定条件 下的增强的细胞凋亡，其中对用在有义方向含有全长大鼠细胞凋亡-诱 导的eIF-5A的pHM6瞬时转染的COS-7细胞没有进行进一步的处理， 或者进行处理以诱导细胞凋亡。
实施例4
本实施例示范了施用细胞凋亡-特异性的eIF-5A和DHS后，对细 胞凋亡活性的调节。
此外，假转染了、用pHM6-LacZ转染了、或用pHM6-有义rF5A (pHM6-全长大鼠eIF-5A)转染了COS-7细胞，并温育40小时。通过 SDS-PAGE，将来自每个样品的5μg蛋白提取物样品分级分离，转移到 PVDF膜上，用能识别Bcl-2的单克隆抗体进行蛋白印迹。使用与过氧 化物酶缀合的兔抗-小鼠IgG作为第二抗体，通过化学发光检测了结合 的抗体，并暴光于x-射线胶片。结果如图32所示。与用pHM6-LacZ 转染的细胞相比，在用pHM6-有义rF5A转染的细胞中存在更少的可检 测的Bcl-2；因此，Bcl-2是下调的。
假转染了、用pHM6-反义3′rF5A(pHM6-大鼠细胞凋亡-特异性的 eIF-5A的反义3′UTR)转染了或用pHM6-有义rF5A(pHM6-全长大鼠 细胞凋亡-特异性的eIF-5A)转染了其它的COS-7细胞。转染后40小 时，通过撤去血清48小时诱导细胞发生细胞凋亡。通过SDS-PAGE， 将来自每个样品的5μg蛋白提取物样品分级分离，转移到PVDF膜上， 用能识别Bcl-2的单克隆抗体进行蛋白印迹。使用与过氧化物酶缀合 的兔抗-小鼠IgG作为第二抗体，通过化学发光检测了结合的抗体，并 暴光于x-射线胶片。
另外，假转染了、用pHM6-LacZ转染了或用pHM6-有义rF5A(pHM6- 全长大鼠eIF-5A)转染了COS-7细胞，并温育40小时。通过SDS-PAGE， 将来自每个样品的5μg蛋白提取物样品分级分离，转移到PVDF膜上， 用能识别p53的单克隆抗体进行蛋白印迹。使用与碱性磷酸酶缀合的 山羊抗-小鼠IgG作为第二抗体，通过化学发光检测了结合的抗体。
最后，假转染了、用pHM6-LacZ转染了或用pHM6-有义rF5A(pHM6- 全长大鼠eIF-5A)转染了COS-7细胞，并温育40小时。通过SDS-PAGE， 将来自每个样品的5μg蛋白提取物样品分级分离，转移到PVDF膜上， 用能识别p53的单克隆抗体进行探测。使用抗-[HA]-过氧化物酶探测 了对应的蛋白印迹，以确定大鼠细胞凋亡-特异性的eIF-5A的表达水 平。使用与碱性磷酸酶缀合的山羊抗-小鼠IgG作为第二抗体，通过化 学发光检测了结合的抗体。
图33说明了当用在有义方向含有全长大鼠细胞凋亡-诱导的eIF- 5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞时Bcl-2的下调。上图说明了考马斯 蓝染色的蛋白印迹；下图说明了对应的蛋白印迹。与用pHM6-LacZ转 染的细胞相比，在用pHM6-有义rF5A转染的细胞中存在更少的可检测 的Bcl-2。
图34说明了当用在反义方向含有全长大鼠细胞凋亡-诱导的eIF- 5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞时Bcl-2的上调。上图说明了考马斯 蓝染色的蛋白印迹；下图说明了对应的蛋白印迹。与假转染的或用 pHM6-有义rF5A转染的细胞相比，在用pHM6-反义3′rF5A转染的细 胞中存在更多的可检测的Bcl-2。
图35说明了当用在有义方向含有全长大鼠细胞凋亡-诱导的eIF- 5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞时c-Myc的上调。上图说明了考马斯 蓝染色的蛋白印迹；下图说明了对应的蛋白印迹。与用pHM6-LacZ转 染的细胞或假转染的对照细胞相比，在用pHM6-有义rF5A转染的细胞 中存在更多的可检测的c-Myc。
图36说明了当用在有义方向含有全长大鼠细胞凋亡-诱导的eIF- 5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞时p53的上调。上图说明了考马斯蓝 染色的蛋白印迹；下图说明了对应的蛋白印迹。与用pHM6-LacZ转染 的细胞或假转染的对照细胞相比，在用pHM6-有义rF5A转染的细胞中 存在更多的可检测的p53。
图37说明了COS-7细胞中的p53上调对pHM6-全长大鼠细胞凋亡- 诱导的eIF-5A的表达的依赖性。在用抗-[HA]-过氧化物酶探测的蛋白 印迹中，上图说明了考马斯蓝染色的蛋白印迹，下图说明了对应的蛋 白印迹。与第二次转染相比，第一次转染中存在更多的可检测的大鼠 细胞凋亡-诱导的eIF-5A。在用抗-p53探测的蛋白印迹中，A中的上 图说明了对应的考马斯蓝染色的蛋白印迹，下图说明了应用p53的蛋 白印迹。关于第一次转染，与用pHM6-LacZ转染的细胞或假转染的对 照细胞相比，在用pHM6-有义rF5A转染的细胞中存在更多的可检测的 p53。关于第二次转染，其中更少地表达大鼠细胞凋亡-诱导的eIF-5A， 用pHM6-有义rF5A、pHM6-LacZ转染的细胞或假转染的对照细胞之间 没有可检测的p53水平的差异。
实施例5
本实施例证实了细胞凋亡-特异性的eIF-5A可以在含有有活性的 p53的细胞(RKO细胞)中和在不含有有活性的p53的细胞(RKO-E6细胞) 中诱导细胞凋亡，表明细胞凋亡-特异性的eIF-5A可以通过除p53途 径之外的途径启动细胞凋亡。这也支持了我们的观点，即其在上游发 挥作用，且可能杀死广范围的不同类型的癌症。
本实施例也表明，eIF-5A1的活性位点是蛋白的羧基末端(即，参 见，用截短的eIF-5A1进行的实验)，其最可能含有RNA结合结构域。
而且，本实施例也证实了，人eIF-5A2最可能是增殖的eIF-5A， 因为它不能诱导细胞凋亡。因而，认为在人数据库的2个eIF-5A基因 中，细胞凋亡-特异性的eIF-5A1是细胞凋亡基因，eIF-5A2是增殖基 因。
RKO和RKO-E6细胞的培养
在基于转染的实验中使用了RKO(美国典型培养物保藏中心CRL- 2577)(表达野生型p53的人结肠癌细胞系)和RKO-E6(美国典型培 养物保藏中心CRL-2578)(源自RKO的细胞系，其含有稳定地整合的 人乳头瘤病毒E 6癌基因，它能造成正常的p53水平和功能的降低)。 在含有非必需氨基酸、Earle氏盐和L-谷氨酰胺的最小必需培养基 (Minimum Essential Medium)Eagle(MEM)中培养了RKO和RKO-E6 细胞。培养基补充了10％胎牛血清(FBS)和100单位青霉素/链霉素。 细胞在5％CO2和95％空气的湿润环境下，在37℃生长。通过用0.25％ 胰蛋白酶和1mM EDTA的溶液使贴壁细胞脱附，每3至4天传代培养 细胞一次。以1∶10至1∶12的分离比，将脱附的细胞分散在含有新 鲜培养基的新培养皿中。
人eIF5A2的克隆
使用可以从GenBank(ACCESSION XM_113401)得到的人eIF5A2 序列设计的引物，通过RT-PCR，从由RKO细胞分离出的RNA分离了人 eIF5A2。图38提供了从RKO细胞分离的人eIF-5A和人eIF-5A2的序 列的比对。使用GenElute哺乳动物总RNA Miniprep试剂盒(Sigma)， 从RKO细胞分离出了RNA。用于扩增eIF5A2的正向引物具有序列 5′AAACTACCATCTCCCCTGCC 3′(SEQ ID NO：25)，反向引物具有序 列5′TGCCCTACACAGGCTGAAAG 3′(SEQ ID NO：26)。将得到的936 碱基对的PCR产物亚克隆进pGEM-T Easy载体(Promega)中，并测序。
然后将pGEM-T Easy-eIF5A2构建体用作模板，生成要在框内亚克 隆进哺乳动物表达载体pHM6(Roche)的eIF5A2 PCR片段。用于扩增 人eIF5A2的正向引物是5′ATCAAGCTTGCCCACCATGGCAGACG 3′(SEQ ID NO：27)，反向引物是5′AACGAATTCCATGCCTGATGTT TCCG 3′(SEQ ID NO：28)。用Hind 3和EcoRI消化得到的505碱基对的PCR产物， 并亚克隆进pHM6的Hind 3和EcoRI位点。
pHM6-截短的eIF5A1的构建
为了确定eIF5A1的羧基末端区域对于其诱导细胞凋亡的活性是否 是重要的，构建了缺失羧基末端的eIF5A1。使用pBS-大鼠eIF5A1作 为模板，通过PCR生成了能编码氨基酸1至127的截短的eIF5A1。正 向PCR引物是5′GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTTGG 3′(SEQ ID NO： 22)，且反向引物是5′TCCGAATTCGTACTTCTGCTCAATC 3′(SEQ ID NO： 29)。用EcoRI和Hind 3消化得到的390碱基对的PCR产物，并亚克 隆进pHM6的EcoRI和Hind 3位点。
转染
在用于Hoescht染色的细胞的8孔室培养载玻片(Falcon)中，或 在用于要通过流式细胞仪分析的细胞的6孔板中，培养了要用在转染 实验中的RKO或RKO-E6细胞。在补充了10％FBS、但是缺少青霉素/链 霉素的MEM培养基中，使细胞生长至70～80％汇合。通过将0.425μg 质粒DNA稀释在22μl无血清的MEM中，并将混合物在室温温育15分 钟，制备了足够8-孔培养载玻片的一个孔的转染培养基。将0.85μl转 染试剂LipofectAMINE(Gibco，BRL)稀释在22μl无血清的MEM中， 在室温温育5分钟。5分钟后，将LipofectAMINE混合物加入DNA混 合物中，在室温温育30至60分钟。在向转染培养基加入44μl MEM 并用其覆盖细胞之前，用无血清的MEM洗涤要转染的细胞一次。将细 胞放回生长室中4小时。温育后，将88μl MEM+20％FBS加入细胞中。 然后再培养细胞44小时，如前所述用Hoescht 33258染色。在另一组 实验中，在转染后24小时，用0.25μg/ml放线菌素D处理在8-孔培 养载玻片中的RKO或RKO-E6细胞，20小时后用Hoescht染色。除了 将所有的试剂提高4.81倍以外，以相同方式在6-孔板中进行了转染。 转染后48小时，收获6孔板中的转染的RKO细胞，并为如下所述的流 式细胞仪分析进行固定。
转染效率的确定
通过用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(X-GAL)对pHM6- LacZ-转染的细胞进行染色，确定了转染效率。染蓝的细胞是能表达 LacZ的转染细胞，用染蓝的细胞的数目除以总细胞数目，计算转染效 率。转染后48小时，对转染的细胞染色。用PBS洗涤细胞2次，然后 在0.5％戊二醛/PBS中，在室温固定10分钟。用1mM MgCl2/PBS洗涤 细胞3次，然后与染色溶液[5mM K4Fe(CN)6.3 H2O，5mM K3Fe(CN)6， 1mM MgCl2，0.1％X-GAL，在PBS中]温育，直到出现染蓝的细胞。
Hoescht染色
使用核染料Hoescht来标记转染的RKO和RKO-E6细胞的核，以基 于核碎裂和凝聚来鉴别细胞凋亡的细胞。在即将使用之前，制备由无 水甲醇和冰醋酸的3∶1混合物组成的固定剂。将等体积的固定剂加入 到在培养载玻片上生长的细胞的培养基中，并温育2分钟。从细胞取 出培养基/固定剂混合物，并抛弃，给细胞加入1ml固定剂。5分钟 后，抛弃固定剂，给细胞加入1ml新鲜的固定剂，并温育5分钟。抛 弃固定剂，在加入1ml Hoescht染料(0.5μg/ml Hoescht 33258， 在PBS中)之前，将细胞空气干燥4分钟。在暗处温育10分钟后，抛 弃染色溶液，用去离子水洗涤载玻片3次进行1分钟。洗涤后，给细 胞加入1ml McIlvaine氏缓冲液(0.021M柠檬酸，0.058M Na2HPO4·7H2O；pH 5.6)，将它们在暗处温育20分钟。抛弃缓冲液， 在暗处将细胞空气干燥5分钟，去除分隔培养载玻片各孔的室。向载 玻片加几滴用于荧光的Vectashield封固剂(Vector Laboratories)，覆盖上盖玻片。使用紫外线滤色片，在荧光显微镜下 观察染色的细胞。将具有明亮地染色的或碎裂的核的细胞记作细胞凋 亡的。
通过流式细胞仪检测DNA断裂
使用荧光素-FragELTM DNA断裂检测试剂盒(Oncogene Research Products)，用荧光素标记的脱氧核苷酸标记了在细胞凋亡过程中产生 的DNA片段。根据生产商的说明书，转染后48小时，通过胰蛋白酶消 化处理收获在6孔培养板中的转染了各种构建体的细胞，并固定和标 记。简而言之，在4℃、1000×g沉淀细胞5分钟，在PBS(8g/L NaCl， 0.2g/L KCl，1.44g/L Na2HPO4和0.24g/L KH2PO4)中洗涤一次。 将细胞重新悬浮在4％甲醛/PBS中，在室温温育10分钟。再次沉淀细 胞，重新悬浮在1ml 80％乙醇中，在4℃储存。在分析的那天，将1ml 固定的细胞(以1×106细胞/ml)转移到微量离心管中，在1000×g离心 沉淀细胞5分钟。将沉淀的细胞重新悬浮在200μl 1×TBS(20mM Tris pH 7.6，140mM NaCl)中，在室温温育10至15分钟。然后再次沉淀 细胞，并重新悬浮在100μl 20μg/ml蛋白酶K中，在室温温育5分 钟。沉淀细胞，并重新悬浮在100μl 1×TdT平衡缓冲液中，在室温 温育10至30分钟。然后通过离心沉淀细胞，重新悬浮到60μl TdT标 记反应混合物中，在暗处温育1至1.5小时。温育后，通过离心沉淀 细胞，在200μl 1×TBS中洗涤2次。将细胞重新悬浮到0.5ml终 体积的1×TBS中，在安装有488nm氩离子激光源的流式细胞仪上分 析。
蛋白提取和蛋白印迹
通过在PBS中洗涤细胞2次，然后加入150μl热SDS凝胶加载缓 冲液(50mM Tris-HCl pH 6.8，100mM二硫苏糖醇，2％SDS，0.1％ 溴酚蓝和10％甘油)，从转染的细胞中分离了用于蛋白印迹的蛋白。将 细胞裂解物收集到微量离心管中，在95℃加热10分钟，然后在13,000 ×g离心10分钟。将上清液转移到新的微量离心管中，在-20℃储存至 准备使用。
对于蛋白印迹，在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离了5μg或10μ g总蛋白。将分离的蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上。然后将膜在封闭溶 液(5％脱脂奶粉，0.02％叠氮化钠，在PBS中)中温育1小时，在 PBS-T(PBS+0.05％Tween-20)中洗涤3次进行15分钟。将膜在PBS-T 中、在4℃储存过夜。次日，升至室温后，将膜在1μg/ml聚乙烯醇 中封闭30秒。在去离子水中冲洗膜5次，然后在5％牛奶的PBS溶液中 封闭30分钟。在与膜温育之前，将第一抗体在5％牛奶的PBS/0.025％ Tween-20溶液中预温育30分钟。
将膜用能识别p53(Ab-6)的来自Oncogene的单克隆抗体进行印 迹，或者用针对合成肽(氨基-CRLPEGDLGKEIEQKYD-羧基)(SEQ ID NO： 30)(与在鸡中产生的人eIF5A1的c-末端同源)的多克隆抗体进行印 迹。以0.1μg/ml的稀度使用p53的单克隆抗体，以1∶1000的稀度 使用eIF5A1的抗体。与第一抗体温育60至90分钟后，在PBS-T中洗 涤膜3次进行15分钟。然后在1％牛奶的PBS/0.025％Tween-20溶液中 稀释第二抗体，与膜温育60至90分钟。当p53(Ab-6)用作第一抗体 时，使用的第二抗体是1∶1000稀度的山羊抗-小鼠IgG，其与碱性磷 酸酶(Rockland)缀合。当抗-eIF5A1用作第一抗体时，以1∶10000 的稀度使用与过氧化物酶(Gallus Immunotech)缀合的兔抗-鸡IgY。 与第二抗体温育后，在PBS-T中洗涤膜3次。
使用2种检测方法来对印迹显影，一种比色方法和一种化学发光方 法。只有当p53(Ab-6)用作与碱性磷酸酶-缀合的第二抗体相结合的 第一抗体时，才使用比色方法。通过在黑暗中、在0.33mg/mL氮蓝四 唑、0.165mg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸、100mM NaCl、5 mM MgCl2和100mM Tris-HCl(pH 9.5)的溶液中温育印迹，使结合的抗体可视 化。通过在2mM EDTA的PBS溶液中温育印迹，终止颜色反应。化学 发光检测方法用于所有其它的第一抗体，包括抗-[HA]-过氧化物酶和 抗-eIF5A1。ECL Plus蛋白印迹检测试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)用于检测过氧化物酶-缀合的结合抗体。简而言之，轻轻地吸 干膜，然后在暗处与试剂A和试剂B的40∶1混合物温育5分钟。吸 干膜，置于醋酸盐层之间，暴光于X-射线胶片10秒至30分钟。
图39中的图说明了瞬时转染后，在RKO和RKO-E6细胞中发生的 细胞凋亡的百分比。用pHM6-LacZ或pHM6-eIF5A1瞬时转染了RKO和 RKO-E6细胞。24小时后，用0.25μg/ml放线菌素D或用等体积的甲 醇(对照)处理了细胞。20小时后用Hoescht对细胞染色，使用紫外 线滤色片在荧光显微镜下观察。将由于染色质凝聚而明亮地染色的细 胞记作细胞凋亡的。上述实验表明，与用pHM6-LacZ转染的但是未用 放线菌素D处理的细胞相比，用放线菌素D处理的和用pHM6-eIF5A1 转染的RKO细胞的细胞凋亡增加了240％。用放线菌素D处理的和用 pHM6-eIF5A1转染的RKO-E6细胞的细胞凋亡比用pHM6-LacZ转染的但 是未用放线菌素D处理的细胞增加了105％。
图40中的图说明了瞬时转染后，在RKO细胞中发生的细胞凋亡的 百分比。用pHM6-LacZ，pHM6-eIF5A1，pHM6-eIF5A2或pHM6-截短的 eIF5A1瞬时转染了RKO细胞。44小时后用Hoescht对细胞染色，使用 紫外线滤色片在荧光显微镜下观察。将由于染色质凝聚而明亮地染色 的细胞记作细胞凋亡的。用pHM6-eIF5A1转染的细胞的细胞凋亡比用 pHM6-LacZ转染的对照细胞增加了25％。用pHM6-eIF5A2或pHM6-截短 的eIF5A1转染的细胞没有明显的增加。
图4 1中的图说明了瞬时转染后，在RKO细胞中发生的细胞凋亡的 百分比。RKO细胞未转染，或者用pHM6-LacZ或pHM6-eIF5A1进行了 瞬时转染。44小时后用Hoescht对细胞染色，使用紫外线滤色片在荧 光显微镜下观察。将由于染色质凝聚而明亮地染色的细胞记作细胞凋 亡的。校正转染效率后，60％的用pHM6-eIF5A1转染的细胞是细胞凋亡 的。
图42提供了瞬时转染后RKO细胞凋亡的流式细胞仪分析结果。RKO 细胞未转染，或者用pHM6-LacZ，pHM6-eIF5A1，pHM6-eIF5A2或pHM6- 截短的eIF5A1进行了瞬时转染。48小时后，收获并固定细胞。用荧 光素-缀合的脱氧核苷酸标记能反映细胞凋亡的断裂的DNA，并在安装 有488nm氩离子激光源的流式细胞仪上分析。方式E中产生的荧光来 自未细胞凋亡的细胞，方式F中产生的荧光来自经历细胞凋亡的细胞。 该表说明了基于每种方式的峰下面积计算出的经历细胞凋亡的细胞的 百分比。对未转染细胞中的背景细胞凋亡和转染效率进行校正后，80％ 的用pHM6-eIF5A1转染的细胞表现出细胞凋亡。用pHM6-LacZ， pHM6-eIF5A2或pHM6-截短的eIF5A1转染的细胞仅仅表现出背景水平 的细胞凋亡。
图43提供了从用0.25μg/ml放线菌素D处理0、3、7、24和48 小时的RKO细胞提取出的蛋白的蛋白印迹。在12％SDS-聚丙烯酰胺凝 胶上，分离了5μg(针对抗-eIF5A1)或10μg(针对抗-p53)总蛋白， 并转移到聚偏二氟乙烯膜上。上图说明了使用抗-p53作为第一抗体的 蛋白印迹。中图说明了使用抗-eIF5A1作为第一抗体的蛋白印迹。下 图说明了化学发光检测证实相同加载后用于考马斯蓝染色的抗- eIF5A1印迹的膜。p53和eIF5A1都通过放线菌素D处理来上调。
实施例6
图47说明了在心脏组织上进行的实验，以模仿人心脏的搏动，和 随后诱导的心脏病发作。图49显示了实验台装置。将在瓣膜换置术过 程中取出的人心脏组织切片钩到电极上。将小砝码连接到心脏组织 上，以使得对心脏搏动强度的测量较容易。电极提供电刺激，以使组 织开始搏动。在诱导局部缺血之前，测量心脏组织中细胞凋亡-特异性 的eIF-5A(eIF-5a)和增殖的eIF-5A(eIF5b)的基因表达水平。见图 46。在局部缺血前的心脏组织中，生成了低水平eIF-5a和5eIFb，它 们的水平相对平衡。在这个阶段中，将氧和二氧化碳分别在缓冲液中 以92.5％和7.5％输送给心脏。然后，降低氧水平，并增加氮水平，以 诱导局部缺血，和最后的“心脏病发作”。心脏组织停止搏动。然后将 氧水平恢复至正常，用电刺激再次使心脏组织产生脉动，以使心脏再 次开始搏动。“心脏病发作”后，再次测量细胞凋亡-特异性的eIF-5a 和增殖的eIF-5A(eIF5b)的表达水平。这时，细胞凋亡-特异性的 eIF-5A的表达水平有了显著提高，而增殖的eIF-5A(eIF5b)的表达 水平的提高则显著较小。见，图46。
“心脏病发作”后，心脏搏动不能象更少所附砝码的压迫/运动所 示那样有力，这表明由于细胞凋亡-特异性的eIF-5A的存在，迅速杀 死了心脏组织细胞。
EKG结果如图48所示。在图的左侧，显示了正常心脏(局部缺血前 的心脏组织)的搏动。“心脏病发作”(直线)和重新启动心脏搏动后， 由于肌细胞的死亡，EKG表现出降低的活性。EKG证实了心脏搏动强度 的相对损失。
序列表
<110>THOMPSON，JOHN E.
TAYLOR，CATHERINE
CLICHE，DOMINIC
DINARELLO，CHARLES
REZNIKOV，LEONID
POMERANTZ，BENJAMIN
<120>核酸、多肽和调节细胞调亡的方法
<130>10799/100
<140>
<14>2003-10-22
<150>10/277,969
<151>2002-10-23
<160>30
<170>Patentln Ver.2.1
<210>1
<211>1139
<212>DNA
<213>大鼠属物种
<220>
<221>CDS
<222>(33)..(494)
<400>1
caggtctaga gttggaatcg aagcctctta aa atg gca gat gat ttg gac ttc 53
Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe
1 5
gag aca gga gat gca ggg gcc tca gcc acc ttc cca atg cag tgc tca 101
Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser
10 15 20
gca tta cgt aag aat ggt ttt gtg gtg ctc aag ggc cgg cca tgt aag 149
Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys
25 30 35
atc gtc gag atg tct act tcg aag act ggc aag cat ggc cat gcc aag 197
Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys
40 45 50 55
gtc cat ctg gtt ggt att gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat 245
Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp
60 65 70
atc tgc ccg tcg act cat aac atg gat gtc ccc aac atc aaa agg aat 293
Ile Gys Pro Ser Thr His Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn
75 80 85
gat ttc cag ctg att ggc atc cag gat ggg tac cta tcc ctg ctc cag 341
Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln
90 95 100
gac agt ggg gag gta cga gag gac ctt cgt ctg cct gag gga gac ctt 389
Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu
105 110 115
ggc aag gag att gag cag aag tat gac tgt gga gaa gag atc ctg atc 437
Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile
120 125 130 135
aca gtg ctg tcc gcc atg aca gag gag gca gct gtt gca atc aag gcc 485
Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala
140 145 150
atg gca aaa taactggctt ccagggtggc ggtggtggca gcagtgatcc 534
Met Ala Lys
atgagcctac agaggcccct cccccagctc tggctgggcc cttggctgga ctcctatcca 594
atttatttga cgttttattt tggttttcct caccccttca aactgtcggg gagaccctgc 654
ccttcaccta gctcccttgg ccaggcatga gggagccatg gccttggtga agctacctgc 714
ctcttctctc gcagccctga tgggggaaag ggagtgggta ctgcctgtgg tttaggttcc 774
cctctccctt tttcttttta attcaatttg gaatcagaaa gctgtggatt ctggcaaatg 834
gtcttgtgtc ctttatccca ctcaaaccca tctggtcccc tgttctccat agtccttcac 894
ccccaagcac cactgacaga ctggggacca gcccccttcc ctgcctgtgt ctcttcccaa 954
acccctctat aggggtgaca agaagaggag ggggggaggg gacacgatcc ctcctcaggc 1014
atctgggaag gccttgcccc catgggcttt accctttcct gtgggctttc tccctgacac 1074
atttgttaaa aatcaaacct gaataaaact acaagtttaa tatgaaaaaa aaaaaaaaaa 1134
<210>2
<211>154
<212>PRT
<213>大鼠属物种
<400>2
Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Set Ala
1 5 10 15
Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Ash Gly Phe Val Val
20 25 30
LPu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Set Thr Set Lys Thr
35 40 45
Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asd Ile Phe
50 55 60
Thr Gly Lys Lys Lys Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp
65 70 75 80
Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ilt Gly Ile Gln Asp
85 90 95
Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu
100 105 110
Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp
115 120 125
Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Set Ala Met Thr Glu Glu
130 135 140
Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys
145 150
<210>3
<211>462
<212>DNA
<213>智人
<400>3
atggcagatg acttggactt cgagacagga gatgcagggg cctcagccac cttcccaatg 60
cagtgctcag cattacgtaa gaatggcttt gtggtgctca aaggccggcc atgtaagatc 120
gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag cacggccacg ccaaggtcca tctggttggt 180
cttgacatct ttactgggaa gaaatatgaa gatatctgcc cgtcaactca taatatggat 240
gtccccaaca tcaaaaggaa tgacttccag ctgattggca tccaggatgg gtacctatca 300
ctgctccagg acagcgggga ggtacgagag gaccttcgtc tccctgaggg agaccttggc 360
aaggagattg agcagaagta cgactgtgga gaagagatcc tgatcacggt gctgtctgcc 420
atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaag gccatggcaa aa 462
<21>4
<211>462
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>modified base
<222>(455)..(456)
<223>a，t，c或g
<400>4
atggcagacg aaattgattt cactactgga gatgccgggg cttccagcac ttaccctatg 60
cagtgctcgg ccttgcgcaa aaacggcttc gtggtgctca aaggacgacc atgcaaaata 120
gtggagatgt caacttccaa aactggaaag catggtcatg ccaaggttca ccttgttgga 180
attgatattt tcacgggcaa aaaatatgaa gatatttgtc cttctactca caacatggat 240
gttccaaata ttaagagaaa tgattatcaa ctgatatgca ttcaagatgg ttacctttcc 300
ctgctgacag aaactggtga agttcgtgag gatcttaaac tgccagaagg tgaactaggc 360
aaagaaatag agggaaaata caatgcaggt gaagatgtac aggtgtctgt catgtgtgca 420
atgagtgaag aatatgctgt agccataaaa ccctnngcaa at 462
<210>5
<211>462
<212>DNA
<213>大鼠属物种
<400>5
atggcagatg atttggactt cgagacagga gatgcagggg cctcagccac cttcccaatg 60
cagtgctcag cattacgtaa gaatggtttt gtggtgctca aaggccggcc atgtaagatc 120
gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag catggccatg ccaaggtcca tctggttggc 180
attgacattt ttactgggaa gaaatatgaa gatatctgcc cgtcgactca taatatggat 240
gtccccaaca tcaaacggaa tgacttccag ctgattggca tccaggatgg gtacctatcc 300
ctgctccagg acagtgggga ggtacgagag gaccttcgtc tgcctgaagg agaccttggc 360
aaggagattg agcagaagta tgactgtgga gaagagatcc tgatcacagt gctgtctgcc 420
atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaag gccatggcaa aa 462
<210>6
<211>606
<212>DNA
<213>大鼠属物种
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(453)
<400>6
gct gtg tat tat tgg gcc cat aag aac cac ata cct gtg ctg agt cct 48
Ala Val Tyr Tyr Trp Ala His Lys Asn His Ile Pro Val Leu Ser Pro
1 5 10 15
gca ctc aca gac ggc tca ctg ggt gac atg atc ttt ttc cat tcc tat 96
Ala Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Ile Phe Phe His Ser Tyr
20 25 30
aaa aac cca ggc ttg gtc ctg gac atc gtt gaa gac ctg cgg ctc atc 144
Lys Asn Pro Gly Leu Val Leu Asp Ile Val Glu Asp Leu Arg Leu Ile
35 40 45
aac atg cag gcc att ttc gcc aag cgc act ggg atg atc atc ctg ggt 192
Asn Met Gln Ala Ile Phe Ala Lys Arg Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly
50 55 60
gga ggc gtg gtc aag cac cac atc gcc aat gct aac ctc atg cgg aat 240
Gly Gly Val Val Lys His His Ile Ala Asn Ala Asn Leu Met Arg Asn
65 70 75 80
gga gct gac tac gct gtt tat atc aac aca gcc cag gag ttt gat ggc 288
Gly Ala Asp Tyr Ala Val Tyr Ile Asn Thr Ala Gln Glu Phe Asp Gly
85 90 95
tca gac tca gga gcc cgg cca gat gag gct gtc tcc tgg ggc aag atc 336
Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile
100 105 110
cgg atg gat gca cag cca gta aag gtc tat gct gat gca tct ctg gtt 384
Arg Met Asp Ala Gln Pro Val Lys Val Tyr Ala Asp Ala Ser Leu Val
115 120 125
ttc ccc ttg ctg gtg gct gag aca ttc gcc caa aag gca gat gcc ttc 432
Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Gln Lys Ala Asp Ala Phe
130 135 140
aga gct gag aag aat gag gac tgagcagatg ggtaaagacg gaggcttctg 483
Arg Ala Glu Lys Asn Glu Asp
145 150
ccacaccttt atttattatt tgcataccaa cccctcctgg gccctctcctt ggtcagcag 543
catcttgaga ataaatggcc tttttgttgg tttctgtaaa aaaaggactt taaaaaaaaa 603
aaa 606
<210>7
<211>151
<212>PRT
<213>大鼠属物种
<400>7
Ala Val Tyr Tyr Trp Ala His Lys Asn His Ile Pro Val Leu Ser Pro
1 5 10 15
Ala Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Ile Phe Phe His Ser Tyr
20 25 30
Lys Asn Pro Gly Leu Val Leu Asp Ile Val Glu Asp Leu Arg Leu Ile
35 40 45
Asn Met Gln Ala Ile Phe Ala Lys Arg Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly
50 55 60
Gly Gly Val Val Lys His His Ile Ala Asn Ala Asn Leu Met Arg Asn
65 70 75 80
Gly Ala Asp Tyr Ala Val Tyr Ile Asn Thr Ala Gln Glu Phe Asp Gly
85 90 95
Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile
100 105 110
Arg Met Asp Ala Gln Pro Val Lys Val Tyr Ala Asp Ala Ser Leu Val
115 120 125
Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Gln Lys Ala Asp Ala Phe
130 135 140
Arg Ala Glu Lys Asn Glu Asp Asn
145 150
<210>8
<211>453
<212>DNA
<213>智人
<400>8
tccgtgtatt actgggccca gaagaaccac atccctgtgt ttagtcccgc acttacagac 60
ggctcgctgg gcgacatgat cttcttccat tcctacaaga acccgggcct ggtcctggac 120
atcgttgagg acctgaggct catcaacaca caggccatct ttgccaagtg cactgggatg 180
atcattctgg gcgggggcgt ggtcaagcac cacattgcca atgccaacct catgcggaac 240
ggggccgact acgctgttta catcaacaca gcccaggagt ttgatggctc tgactcaggt 300
gcccgaccag acgaggctgt ctcctggggc aagatccggg tggatgcaca gcccgtcaag 360
gtctatgctg acgcctccct ggtcttcccc ctgcttgtgg ctgaaacctt tgcccagaag 420
atggatgcct tcatgcatga gaagaacgag gac 453
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<220>
<221>modified_base
<222>12
<223>a，t，c或g
<400>9
tcsaarachg gnaagcaygg 20
<210>10
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>10
gcgaagcttc catggctcga gttttttttt tttttttttt tt 42
<210>11
<211>972
<212>DNA
<213>大鼠属物种
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(327)
<400>11
tcg aag acc ggt aag cac ggc cat gcc aag gtc cat ctg gtt ggt att 48
Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile
1 5 10 15
gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat atc tgc ccg tcg act cat 96
Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His
20 25 30
aac atg gat gtc ccc aac atc aaa agg aat gat ttc cag ctg att ggc 144
Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly
35 40 45
atc cag gat ggg tac cta tcc ctg ctc cag gac agt ggg gag gta cga 192
Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg
50 55 60
gag gac ctt cgt ctg cct gag gga gac ctt ggc aag gag att gag cag 240
Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln
65 70 75 80
aag tat gac tgt gga gaa gag atc ctg atc aca gtg ctg tcc gcc atg 288
Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met
85 90 95
aca gag gag gca gct gtt gca atc aag gcc atg gca aaa taactggctt 337
Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys
100 105
ccagggtggc ggtggtggca gcagtgatcc atgagcctac agaggcccct cccccagctc 397
tggctgggcc cttggctgga ctcctatcca atttatttga cgttttattt tggttttcct 457
caccccttca aactgtcggg gagaccctgc ccttcaccta gctcccttgg ccaggcatga 517
gggagccatg gccttggtga agctacctgc ctcttctctc gcagccctga tgggggaaag 577
ggagtgggta ctgcctgtgg tttaggttcc cctctccctt tttcttttta attcaatttg 637
gaatcagaaa gctgtggatt ctggcaaatg gtcttgtgtc ctttatccca ctcaaaccca 697
tctggtcccc tgttctccat agtccttcac ccccaagcac cactgacaga ctggggacca 757
gcccccttcc ctgcctgtgt ctcttcccaa acccctctat aggggtgaca agaagaggag 817
ggggggaggg gacacgatcc ctcctcaggc atctgggaag gccttgcccc catgggcttt 877
accctttcct gtgggctttc tccctgacac atttgttaaa aatcaaacct gaataaaact 937
acaagtttaa tatgaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 972
<210>12
<211>109
<212>PRT
<213>大鼠属物种
<400>12
Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile
1 5 10 15
Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His
20 25 30
Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly
35 40 45
Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg
50 55 60
Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln
65 70 75 80
Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met
85 90 95
Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys
100 105
<210>13
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>13
caggtctaga gttggaatcg aagc 24
<210>14
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>14
atatctcgag ccttgattgc aacagctgcc 30
<210>15
<211>489
<212>DNA
<213>大鼠属物种
<220>
<221>CDS
<222>(33)..(485)
<400>15
caggtctaga gttggaatcg aagcctctta aa atg gca gat gat ttg gac ttc 53
Met Asp Asp Asp Leu Asp Phe
1 5
gag aca gga gat gca ggg gcc tca gcc acc ttc cca atg cag tgc tca 101
Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser
10 15 20
gca tta cgt aag aat ggt ttt gtg gtg ctc aag ggc cgg cca tgt aag 149
Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys
25 30 35
atc gtc gag atg tct act tcg aag act ggc aag cat ggc cat gcc aag 197
Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys
40 45 50 55
gtc cat ctg gtt ggt att gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat 245
Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp
60 65 70
atc tgc ccg tcg act cat aac atg gat gtc ccc aac atc aaa agg aat 293
Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn
75 80 85
gat ttc cag ctg att ggc atc cag gat ggg tac cta tcc ctg ctc cag 341
Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln
90 95 100
gac agt ggg gag gta cga gag gac ctt cgt ctg cct gag gga gac ctt 389
Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu
105 110 115
ggc aag gag att gag cag aag tat gac tgt gga gaa gag atc ctg atc 437
Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile
120 125 130 135
aca gtg ctg tcc gcc atg aca gag gag gca gct gtt gca atc aag gct 485
Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala
140 145 150
cgag 489
<210>16
<211>151
<212>PRT
<213>大鼠属物种
<400>16
Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala
1 5 10 l5
Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val
20 25 30
Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr
35 40 45
Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe
50 55 60
Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp
65 70 75 80
Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp
85 90 95
Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu
100 105 110
Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp
115 120 125
Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu
130 135 140
Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala
145 150
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>17
gtctgtgtat tattgggccc 20
<210>18
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>18
gcgaagcttc catggctcga gttttttttt tttttttttt tt 42
<210>19
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>19
ttgaaggggt gaggaaaa 18
<210>20
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>20
ttgagtgggat aaag 15
<210>21
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>21
aatcatctgc cattttaa 18
<210>22
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>22
gccaagctta atggcagatg atttgg 26
<210>23
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>23
ctgaattcca gttattttgc catgg 25
<210>24
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>24
aatgaattcc gccatgacag aggaggc 27
<210>25
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>25
aaactaccac ctcccctgcc 20
<210>26
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>26
tgccctacac aggctgaaag 20
<210>27
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>27
atcaagcttg cccaccatgg cagacg 26
<210>28
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>28
aacgaattcc atgcctgatg tttccg 26
<210>29
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>29
tccgaattcg tacttctgct caatc 25
<210>30
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
<400>30
Cys Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr
1 5 10 15
Asp