技术领域 本发明涉及几种植物油月见草油、紫苏仔油、麦胚芽油、核桃油、红花油在制 备用于防治骨质疏松症及皮肤衰老及保健美容的药物制剂中的应用。
背景技术 健康和长寿是生命科学永恒的主题。随着世界人口的加速老龄化，抗衰老研究已 成为迅速崛起的一门应用科学。人体衰老的最早部位是骨组织和皮肤。医学研究证明：人在 20岁以后骨的衰老就慢慢开始了，直到50岁以后，骨质疏松症大大加快，并容易造成骨折。 骨质疏松症使衰老的重要标志之一，另一个就是皮肤衰老，皮肤老化是机体老化的一部分， 机体的老化在皮肤上表现得最为清楚。防治骨质疏松症与皮肤老化已成为医学科学研究的热 点，但很少有人把这两者联系起来。我们在抗衰老及抗骨质疏松的研究过程中，发现几种 植物油具有良好的预防骨质疏松的作用，同时也有很好的预防皮肤衰老的功能，这几种植物 油是月见草油、紫苏仔油、麦胚芽油、核桃油、红花油。
发明内容 本项目研究组发现几种植物油月见草油、紫苏仔油、麦胚芽油、核桃油、红花油 具有防治骨质疏松症的作用，同时，又具有预防皮肤衰老的作用，可用于制备防治骨质疏松 症的药物制剂，也可用于制备预防皮肤衰老的制剂。
此外，进一步的研究发现，花生油，芝麻油，山茶油，大豆油，沙棘油，紫草油也有一 定的抗骨质疏松及防治皮肤衰老的作用。
上述植物油可制成片剂，胶囊剂，颗粒剂，冲剂，口服液，外用制剂，注射剂和任何可 供临床应用的的药物制剂。
具体实施方式：实施例一
1.实验方法
1.1实验动物及饲养条件
三月龄普通级Sprangue-Dawley(SD)雌性大鼠70只(广东医学院实验动物中心提供)，体 重225±12g。饲养条件：饲养室内温度保持24℃~28℃，湿度在50％~60％。分笼普通喂养。 每笼两只，自由摄食摄水，专室饲养，专人负责，每周称体重一次。动物饲养及实验共三个 月。
1.2研究药物及配制方法
(1)己烯雌酚：广东彼迪药业有限公司；配制方法：己烯雌酚2mg，蒸馏水1000ml，加温 溶解即可。
(2)四种植物油
精制月见草油，精制紫苏仔油，精制麦胚芽油，精制核桃油均购于大连浓华生物工程有限公 司，这几种油的主要组成成分见表1：
表1：几种油的主要组成成分的含量 油类 α-亚麻酸 γ-亚麻酸 亚油酸 维生素E 月见草油 紫苏仔油 麦胚芽油 核桃油 - 83.84％ - 9.2％ - - 13.4％ 74.1％ 8.2％ 60％ 62.2％ 0.093mg/g - 0.677mg/g -
1.3.实验方法
用卵巢切除法建立雌激素缺乏的老年性骨质疏松与皮肤衰老的大鼠动物模型，对照大鼠 采用假手术方法，即实验时同样做手术，但不切除卵巢，作为实验对照。实验分组给药情况 见表1：
表1：药物抗骨质疏松与皮肤衰老研究实验分组及给药情况 组别 例数 给药方法 给药方案 假手术组 卵巢切除组 己烯雌酚组 月见草油组 紫苏仔油组 麦胚芽油组 核桃油组 10 10 10 10 10 10 10 口服灌喂 口服灌喂 口服灌喂 口服灌喂 口服灌喂 口服灌喂 口服灌喂 生理盐水5ml*kg-1d-1 生理盐水5ml*kg-1d-1 己烯雌酚10ug*kg-1d-1 月见草油5ml*kg-1d-1 紫苏仔油5ml*kg-1d-1 麦胚芽油5ml*kg-1d-1 核桃油5ml*kg-1d-1
1.4.动物的去势和给药
动物的去势：除假手术组大鼠外，余各组大鼠用3％戊巴比妥麻醉(0.12ml/kg)，在严格 消毒条件下，行大鼠去卵巢手术，一星期后拆线。假手术组大鼠在相同部位(两侧腹部)打开 腹腔不摘除卵巢立即缝合。
给药：假手术组和卵巢切除组每天经口灌喂生理盐水5ml*kg-1*d-1，己烯雌酚组每天 经口灌喂己烯雌酚10ug kg-1*d-1；月见草油组、紫苏仔油组、麦胚芽油组、核桃油组每天 经口分别灌喂月见草油、紫苏仔油、麦胚芽油、核桃油5ml*kg-1*d-1。连续给药三个月。
1.5.取材
连续给药三个月后，在3％戊巴比妥麻醉下，右心室抽血处死大鼠，分离血清作血清Ca测定。取左侧尺骨，除净肌肉和软组织，80℃烘烤48h至恒重得骨干重，然后于6mol·L-1HCl， 108℃温度下消化16h后过滤取过滤液，用ICP(电感偶合等离子体直读光谱仪)测定骨中钙 (Ca)、磷(P)含量，以及骨羟脯氨酸(Hyp)含量(羟脯氨酸试剂盒为南京建成生物工程公司 产品)。分离右侧胫骨，用慢速锯在近端作矢状打开髓腔，放入10％福尔马林缓冲液固定，然 后脱水，脱脂作塑料包埋。用硬组织切片机分别切下不脱钙4μm和8μm切片，4μm切片用 Goldner’s Trichrome染色封片，进行骨计量学静态参数(static parameters)测量。8μm 切片不染色封片作荧光观察进行骨计量学动态参数(dynamic parameters)测量。此外，动物 处死当时即取背部正中皮肤，用脱毛剂脱去鼠毛，取一1cm×1cm大小皮肤迅速放入10％中性 甲醛液中固定，拟作组织切片进行组织形态学观察及定量分析；另取余部位背部皮肤迅速冰 冻保存，拟作皮肤组织匀浆测皮肤SOD、羟脯氨酸及MDA含量。
1.6.皮肤组织制备
(1)10％皮肤匀浆的制备
①取脱毛后的皮肤组织块0.5g左右，经冷生理盐水漂洗，除去皮下脂肪和其它结缔组织， 滤纸拭干，称重，放入10ml的小烧杯中。
②用量筒取该组织块重量9倍的预冷的生理盐水，取2/3倒入装有组织块的烧杯中，用眼科 小剪尽快剪碎组织块，然后倒入匀浆管中将剩余的1/3生理盐水冲洗残留在烧杯中的组织块， 一起倒入匀浆管，用内切式组织匀浆机搅拌制成10％组织匀浆(匀浆时间10次/秒，间歇3秒， 连续7~10次，在冰水中进行)。
③取少量组织匀浆直接涂片，在显微镜下观察细胞的破碎情况，若破碎不全，则反复冻溶三 次，使其完全破碎，使胞内容物完全游离在液相中。
(2)组织切片染色
弹力纤维染色 采用Weigert间苯二酚-碱性品红染色法
操作方法：
①石蜡切片，脱蜡至水，蒸馏水洗。
②0.25％高锰酸钾氧化10分钟。
③0.5％草酸漂白为止。
④蒸馏水洗后95％酒精洗一次。
⑤直接浸入Weigert溶液20~60分钟。
⑥0.5％盐酸酒精分化，观察背景无色弹力纤维清楚为好。
⑦水洗，快洗后进二甲苯透明，中性树胶封固。
(结果：弹力纤维呈黑蓝色。)
胶原纤维染色：采用Van Gieson染色法，操作方法如下：
①组织固定10％福尔马林液，常规脱水包埋。
②切片脱落至蒸馏水。
③用Weigert铁苏木素液染10~20分钟。
④流水稍冲洗。
⑤1％盐酸酒精迅速分化。
⑥流水冲洗后蒸馏水冲洗。
⑦用Van Gieson液染3~5分钟。
⑧倾去染液，直接用95％酒精分化和脱水。
⑨无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
(结果：胶原纤维呈红色，肌纤维、胞质及红细胞呈黄色，细胞核呈蓝黑色。)
表皮细胞染色：采用HE染色法染色。操作方法略。
1.7、统计学分析
运用SAS软件进行单因素分析，先采用SAS中的UNIVARIATE过程检验方差齐性， 若方差相等采用方差分析，组间比较再采用SNK-q检验；若方差不齐则采用Kruskal-Wallis 秩和检验，再用Nemenyi检验比较两组间差别。
2.实验结果
2.1去卵巢大鼠皮肤衰老的结果
2.1.1去卵巢大鼠皮肤组织病理学形态变化及计算机图像定量分析
(1)表皮结构的变化
去卵巢大鼠与假手术大鼠表皮结构的皮肤组织病理学形态变化具有明显的不同特点，卵 巢切除大鼠的皮肤表皮厚度明显变薄，细胞层数减少，基底细胞排列散乱，细胞大小不一。 对照组(假手术组)表皮厚度较厚，由3～5层细胞组成，棘细胞散在分布，基底细胞呈立方 形，排列整齐。大鼠皮肤表皮厚度计算机图像分析系统定量分析结果见表2
表2：大鼠皮肤表皮厚度计算机图像分析系统定量分析结果 组别 例数 表皮厚度(μm) 变化比例 假手术组 卵巢切除组 10 10 25.2±1.1 19.6±1.3* -22％
注：*P＜0.01
从表2可见，卵巢切除组表皮厚度较假手术组减少了22％，差别有显著性(P＜0.01)。 (2)去卵巢大鼠真皮弹力纤维形态学观察
去卵巢大鼠真皮弹力纤维Weigert间苯二酚-碱性品红染色形态学观察可见，卵巢切除组 弹力纤维变短、减少，排列散乱。假手术组弹力纤维较细长，有轻微弯曲度，排列相对有序， 缠绕在胶原束中间，毛囊周围呈环形排列。大鼠皮肤弹力纤维面积计算机图像分析系统定量 分析结果见表3：
表3：大鼠皮肤弹力纤维面积计算机图像分析系统定量分析结果 组别 例数 弹力纤维总面积(μm2) 变化比例 假手术组 10 3637.2±105.3
卵巢切除组 10 2579.2±199.9* -29％
注：*P＜0.01
从表3可见，卵巢切除组弹力纤维面积较假手术组减少了29％，差别有显著性(P＜0.01)。
(3)去卵巢大鼠真皮胶原纤维形态学观察
真皮胶原纤维Van Gieson染色法形态学观察可见，卵巢切除组皮肤胶原层厚度变薄，胶 原束断裂甚至破碎，走向平直，排列疏松且紊乱。假手术组胶原纤维束细长，胞体丰富，呈 束状排列，走向与皮面平行，呈波纹状，在毛囊周围纤维纤细且排列疏松。
(4)去卵巢大鼠皮肤生化指标的检测
①大鼠皮肤组织MDA含量的检测见表4：
表4：大鼠皮肤组织MDA含量 组别 例数 MDA(nmol/毫克蛋白) 变化比例 假手术组 卵巢切除组 10 10 10.3±1.3 13.9±0.7* 35％
注：*P＜0.01
从表4可见，卵巢切除组MDA含量较假手术组升高了35％，差别有显著性(P＜0.01)。
②大鼠皮肤组织中SOD活性的检测见表5
表5：大鼠皮肤组织中SOD活性 组别 例数 SOD 变化比例 假手术组 卵巢切除组 10 10 110.5±8.2 90.3±6.5* -18％
注：*P＜0.01
从表5可见，卵巢切除组SOD活性较假手术组降低了18％，差别有显著性(P＜0.01)。
③大鼠皮肤组织羟脯氨酸含量的检测见表6
表6：大鼠皮肤组织羟脯氨酸含量检测结果 组别 例数 羟脯氨酸(ug/毫克蛋白) 变化比例 假手术组 卵巢切除组 10 10 1.61±0.12 1.02±0.1* -37％
注：*P＜0.01
从表6可见，卵巢切除组羟脯氨酸含量较假手术组降低了37％，差别有显著性(P＜0.01)。
2.1.2小结
正常3月龄大鼠行卵巢切除后，可造成雌性大鼠皮肤SOD活力降低、羟脯氨酸含量减 少、MDA含量增加；表皮层厚度变薄，弹力纤维减少。说明了采用卵巢切除术建立雌激素缺 乏大鼠皮肤衰老模型是可行的。
2.2五种药物抗皮肤衰老的结果
3.2.1药物对大鼠皮肤组织病理形态学的影响及计算机图像定量分析
(1)表皮结构的变化
表皮结构的皮肤组织病理学形态变化可见，己烯雌酚组表皮较假手术组和卵巢切除组明 显增厚，细胞层数增多，排列相对有序，基底细胞胞体大，排列规整。月见草油组、紫苏仔 油组、麦胚芽油组、核桃油组表皮较假手术组和卵巢切除组显著增厚，细胞层数增多，排列 有序，胞间基质丰富，基底细胞胞体大，排列更加规整。计算机图像定量分析见表7。
表7：大鼠皮肤表皮厚度计算机图像分析系统定量分析结果 组别 例数 表皮厚度(μm) 变化比例1 变化比例2 变化比例3 假手术组 卵巢切除组 己烯雌酚组 月见草油组 紫苏仔油组 麦胚芽油组 核桃油组 10 10 10 10 10 10 10 25.2±1.1 19.6±1.3* 30.0±1.5* 38.5±1.3* 38.9±1.2* 39.9±1.2* 38.8±1.1* -22％ 19％ 53％ 54％ 58％ 54％ 53％ 96％ 98％ 104％ 98％ 28％ 30％ 33％ 29％
注：(1)*P＜0.01；(2)变化比例1与假手术组比较，变化比例2与卵巢切除组比较， 变化比例3与己烯雌酚组比较。
(2)真皮弹力纤维染色形态学观察
真皮弹力纤维Weigert间苯二酚-碱性品红染色形态学观察可见，己烯雌酚组弹力纤维较 假手术组和卵巢切除组明显增多，弹力纤维细长。月见草油组、紫苏仔油组、麦胚芽油组、 核桃油组弹力纤维较假手术组和卵巢切除组显著增多，弹力纤维细长。计算机图像定量分 析见表8。
表8：大鼠皮肤弹力纤维面积计算机图像分析系统定量分析结果 组别 例数 弹力纤维总面积(μm2) 变化比例1 变化比例2 变化比例3 假手术组 卵巢切除组 己烯雌酚组 月见草油组 紫苏仔油组 麦胚芽油组 核桃油组 10 10 10 10 10 10 10 3637.2±105.3 2579.2±199.9* 3939.9±118.0* 4316.3±84.3* 4294.9±122.9* 4361.3±83.2* 4213.1±109.5* -29％ 8％ 19％ 18％ 20％ 16％ 53％ 67％ 67％ 69％ 63％ 10％ 9％ 11％ 7％
注：(1)*P＜0.01；(2)变化比例1与假手术组比较，变化比例2与卵巢切除组比较， 变化比例3与己烯雌酚组比较。
(3)真皮胶原纤维形态学观察
真皮胶原纤维Van Gieson染色法形态学观察可见，己烯雌酚组胶原纤维较假手术组和卵 巢切除组排列致密、规整，呈波浪状，与皮面平行。月见草油组、紫苏仔油组、麦胚芽油组、 核桃油组较假手术组和卵巢切除组胶原纤维明显增厚，胶原束排列规整、更为致密。
(4)皮肤生化指标的检测
①大鼠皮肤组织MDA含量的检测见表9：
表9：大鼠皮肤组织MDA含量检测结果 组别 例数 MDA(nmol/毫克蛋白) 变化比例1 变化比例2 变化比例3 假手术组 卵巢切除组 己烯雌酚组 月见草油组 紫苏仔油组 麦胚芽油组 核桃油组 10 10 10 10 10 10 10 10.3±1.3 13.9±0.7*7.3±0.9*5.7±0.9*5.6±0.8*5.5±1.2*5.9±0.9* 35％ -29％ -45％ -46％ -47％ -43％ -47％ -59％ -60％ -60％ -58％ -22％ -23％ -25％ -19％
注：(1)*P＜0.01；(2)变化比例1与假手术组比较，变化比例2与卵巢切除组比较， 变化比例3与己烯雌酚组比较。
②大鼠皮肤组织羟脯氨酸含量的检测见表10：
表10：大鼠皮肤组织羟脯氨酸含量检测结果
组别 例数 羟脯氨酸(ug/毫克蛋白) 变化比例1 变化比例2 变化比例3
假手术组 10 1.61±0.12
卵巢切除组 10 1.02±0.1* -37％
己烯雌酚组 10 1.92±0.17* 19％ 88％
月见草油组 10 2.49±0.09* 55％ 144％ 30％
紫苏仔油组 10 2.45±0.08* 52％ 140％ 28％
麦胚芽油组 10 2.5±0.08* 55％ 145％ 30％
核桃油组 10 2.4±0.05* 49％ 135％ 25％
注：(1)*P＜0.01；(2)变化比例1与假手术组比较，变化比例2与卵巢切除组比较， 变化比例3与己烯雌酚组比较。
③大鼠皮肤组织SOD含量的检测见表11：
表11：大鼠皮肤组织SOD含量检测结果 组别 例数 SOD 变化比例1 变化比例2 变化比例3 假手术组 卵巢切除组 己烯雌酚组 月见草油组 紫苏仔油组 麦胚芽油组 核桃油组 10 10 10 10 10 10 10 110.5±8.2 90.3±6.5* 123.7±7.1* 139.6±9.2* 138.6±4.8* 142.2±4.9* 135.1±3.1* -18％ 12％ 26％ 25％ 29％ 22％ 37％ 55％ 53％ 57％ 50％ 13％ 12％ 15％ 9％
注：(1)*P＜0.01；(2)变化比例1与假手术组比较，变化比例2与卵巢切除组比较， 变化比例3与己烯雌酚组比较。
2.2小结
己烯雌酚组大鼠表皮层厚度增厚，弹力纤维明显增多；己烯雌酚组皮肤SOD活性增强、 皮肤羟脯氨酸含量增加及皮肤MDA含量下降。月见草油组、紫苏仔油组、麦胚芽油组、 核桃油组大鼠表皮层厚度增厚，弹力纤维明显增多；月见草油组、紫苏仔油组、麦胚芽油 组、核桃油组皮肤SOD活性增强、皮肤羟脯氨酸含量增加及皮肤MDA含量下降。实验结 果显示：己烯雌酚、月见草油、麦胚芽油、紫苏仔油及核桃油均具有抗卵巢切除引起的皮 肤衰老的作用，且月见草油、麦胚芽油、紫苏仔油及核桃油作用优于己烯雌酚。
2.3骨计量学参数的测量：
骨计量学静态参数的结果可见，去卵巢大鼠与对照大鼠相比，90天后骨量明显丢失， 骨小梁数目降低(P＜0.01)，骨小梁分离度增加(P＜0.01)，破骨细胞数目增加(P＜0.01)。己 烯雌酚使去卵巢大鼠的骨量及骨小梁数目明显增加(P＜0.01)、骨小梁分离度及破骨细胞数 目明显减少。月见草油，紫苏仔油，麦胚芽油，核桃油均可使去卵巢大鼠的骨量有增加 (P＜0.05)，但与己烯雌酚组无差别。
骨计量学动态参数的结果可见，去卵巢组大鼠骨形成指标明显增加：矿化沉积率增加 (P＜0.05)、骨形成率BFR/BV增加(P＜0.05)。己烯雌酚能抑制去卵巢大鼠的骨形成率 (BFR/BV，P＜0.05)。月见草油，紫苏仔油，麦胚芽油，核桃油均对去卵巢大鼠骨形成指标 无明显影响。
以上研究表明，月见草油，紫苏仔油，麦胚芽油，核桃油对实验性动物骨质疏松有明 显的防治作用。
实施例二
用上述的研究方法，对红花油，花生油，芝麻油，山茶油，大豆油，沙棘油，紫草油进行了 实验研究，发现红花油，花生油，芝麻油，山茶油，大豆油，沙棘油，紫草油也有一定的抗 骨质疏松作用及防治皮肤衰老的作用。