技术领域
本发明属于中药研发技术领域，具体涉及一种含有延胡索总生物碱有 效部位的中药组合物及其制备方法和在制备治疗冠心病药物中的应用。
背景技术
延胡索，又名元胡，收载于《中华人民共和国药典》(2005版)一部， 为罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W.T.Wang的干燥块茎。夏初茎 叶枯萎时采挖，除去须根，洗净，置沸水中煮至恰无白心时，取出，晒干。 味辛、苦，性温。归肝、脾经。活血，利气，止痛。用于胸胁、脘腹疼痛， 经闭痛经，产后瘀阻，跌扑肿痛，为止痛良药。现代研究表明，延胡索具 有镇痛、抗心肌缺血、抗心律失常、降压、抗血栓、扩张冠状动脉、增加 冠脉流量、改善心肌供氧等药理作用，具有治疗冠心病、心绞痛的功效。 (吕清文，丛雅勤，延胡索药理作用及临床应用浅议，内蒙古中医药，2005 年第1期，p26)。
延胡索中主要含有生物碱类化合物，其中属叔胺类者含量约0.65％， 属季胺类者约0.3％，已分离得近20个生物碱，包括延胡索甲素(延胡索 碱，d-Corydaline)、延胡索乙素(d1-四氢掌叶防己碱，d1- Tetrahydropalmatine)、延胡索丙素(原阿片碱，Protopine)、延胡索 丁素(1-四氢黄连碱，1-Tetrahydrocoptisine)、延胡索戊素(d1-四 氢黄连碱)、延胡索己素(1-四氢古伦胺碱，1-Tetrahydrocolumbamine)、 延胡索庚素(延胡索球碱，Crybulbine)、延胡索辛素(Corydalis H)、 延胡索壬素(Corydalis I)、延胡索癸素(Corydalis J)、延胡索子素 (Corydalis K)、延胡索丑素(Corydalis L)、延胡索寅素(α-别隐 品碱，α-Allocryptopine，β-Homochelidonine)、黄连碱(Coptisine)、 去氢延胡索甲素(去氢延胡索碱，Dehydrocorydaline)、延胡索胺碱 (Corydalmine)、去氢延胡索胺碱(Dehydrocorydalmine)和古伦胺碱 (Columbamine)。在乙醇热提浸膏中，又分得3个生物碱：狮足草碱 (Leonticine)、二氢血根碱(Dihydrosanguinarine)和去氢南天竹啡碱 (Dehydronanteine)。另含大量淀粉及少量粘液质、树脂、挥发油等。
有文献报道采用正交法对延胡索总生物碱的提取方法、提取溶媒、酸 碱度等因素进行考察，比较了延胡索总生物碱的提取工艺(桑彤，谢培德， 延胡索渗漉提取工艺的优选，基层中药杂志，2000，14(3)，35～36；邱 蓉丽，李祥，陈建伟等，延胡索总生物碱提取方法研究，中医药研究，2000， 16(5)，50～51)。但其均以延胡索乙素的含量或其得率为考察指标，延 胡索乙素的含量低于0.3％，得率也不高，不能以此代表总碱，因此，由 此得到的最佳提取工艺方法并不能作为延胡索总生物碱的最佳提取工艺。
另有报道对延胡索总生物碱的工艺路线进行筛选，以延胡索乙素的含 量为考察指标，最终确定以二氧化碳超临界萃取法提取延胡索总生物碱较 其他方法好(刘龙忠，遵义医学院学报，2004，27(6)，595～596)。但 研究中也未涉及总碱的含量，单纯的选用延胡索乙素单体为考察指标，不 具代表性。同时超临界萃取法并未广泛应用，其成本较高，设备耗能大， 所制备的延胡索总生物碱含量不明，杂质仍较多，不能作为人体药用。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种治疗冠心病的中药组合物， 其有效成分是延胡索中的生物碱类成分，亦称延胡索总生物碱，并提供了 延胡索总生物碱的制备方法。
本发明所要解决的另一个技术问题在于提供了该中药组合物的药物制 剂及其在制备治疗冠心病药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明研究制定了如下技术方案。
本发明提供的中药组合物，其有效成分是延胡索总生物碱，是以传统 中药延胡索(罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W.T.Wang的干燥 块茎)为原料，通过溶剂提取和树脂纯化方法制备获得。延胡索总生物碱 中主要成分为延胡索乙素，其结构式为：
延胡索乙素
本发明还进一步提供了该中药组合物的制备方法，尤其是延胡索总生 物碱的制备方法，具体是以传统中药延胡索为原料，通过溶剂提取和树脂 纯化方法制备获得，其中溶剂提取方法可以是水或30％～95％乙醇回流提 取，也可以是酸水渗漉提取；树脂纯化方法包括苯乙烯、二乙烯苯、丙烯 酸酯或甲基丙烯酸酯中的任意一种或几种为骨架材料的极性、中极性、弱 极性、非极性大孔吸附树脂或离子交换树脂等进行纯化的方法。
延胡索药材一般夏初茎叶枯萎时采挖，除去须根，洗净，置沸水中煮 至恰无白心时，取出，晒干。用于提取前应先粉碎，通常要求通过20～40 目筛，以利于其中有效成分被充分提取。从生产角度考虑，本发明选用的 延胡索药材中，包括了上述各种延胡索总生物碱化合物的生物碱含量应该 不低于1.0％。
根据本发明的比较优选的实施方案，含有延胡索总生物碱的中药组合 物可以通过以下方法制备得到：
(1)提取：延胡索粗粉可以用水、酸水或30～95％乙醇中任意一种溶 剂提取；
(2)除杂：提取液经树脂吸附依次用水、10～40％乙醇洗脱除杂；
(3)洗脱：用50～90％乙醇洗脱吸附于树脂上的总生物碱；
(4)浓缩：洗脱液减压浓缩，干燥，粉碎，得含有延胡索总生物碱有 效部位的中药组合物。
为了增加总生物碱的提取率，考虑到生物碱类化合物的碱性，上述步 骤中优选为用酸水作为提取溶剂，再以渗漉方式提取。其中的酸水可以是 0.5％盐酸、1％盐酸或0.5％硫酸。所用的树脂包括苯乙烯、二乙烯苯、丙烯 酸酯或甲基丙烯酸酯中的任意一种或几种为骨架材料的大孔吸附树脂或离 子交换树脂，例如D101、Dm103、AB-8或732阳离子交换型树脂等。制备 方法中所述的干燥为真空干燥、冷冻干燥或喷雾干燥。
本发明制备得到的有效成分含量非常高，其中延胡索总生物碱的含量 在60％以上，最高含量能达到85％以上。用于检测所述总生物碱的方法可 以借助于任何可行的检测手段和公知的方法，本发明在此提供一套可行的 总生物碱含量检测方法。该方法克服了单纯选用延胡索乙素单体为考察指 标代表总生物碱含量的方法，利用HPLC法测定延胡索乙素的单体含量；利 用甲基橙染色法测定延胡索总生物碱的含量，此方法可有效、准确地测定 总生物碱的含量。具体如下：
1.单体延胡索乙素含量测定的方法
1.1色谱条件
色谱柱：RP-C18柱(250×4.6mm，0.5μm)；流动相：乙腈- 0.05mol/LNaH2PO4溶液(26∶74)；流速：1.0ml/min；波长：282nm；灵敏 度：1.000AUFS，进样量10μl。
1.2对照品溶液的制备
精密称取延胡索乙素对照品约7.52mg，置于50ml量瓶中，加适量甲 醇超声溶解后，用甲醇定容至刻度，摇匀，得对照品储备液(0.1504mg/ml)。
1.3供试品溶液的制备
取延胡索药材细粉约1g，精密称定，置于索氏提取器中，加浓氨水约 2.5ml，浸润1h后加氯仿200ml，加热回流约6h，将提取液蒸干，残渣用 甲醇定量转移至25ml量瓶中，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶 液。
1.4测定法
取对照品溶液和供试品溶液各10μl，进液相色谱仪，记录延胡索乙素 峰面积，用外标一点法计算延胡索药材中延胡索乙素的含量。
2总生物碱含量测定的方法
2.1对照品溶液的配制
精密称取延胡索乙素对照品6.01mg，置于50ml量瓶中，加适量 0.1mol/mlHCl超声溶解后，再加0.1mol/mlHCl稀释至刻度，摇匀，即得 对照品储备液(0.1202mg/ml)。
2.2供试品溶液的制备
取延胡索药材细粉约1g，精密称定，置于索氏提取器中，加浓氨水约 2.5ml，浸润1h后加氯仿200ml，加热回流约6h，将提取液蒸干，残渣用 甲醇定量转移至25ml量瓶中，再加甲醇稀释至刻度，摇匀后过滤，取续滤 液置25ml量瓶中，即得供试品溶液。
2.3测定法
取对照品比色溶液和供试品比色溶液，以试剂空白作对照，在波长 420nm处分别测其吸光度值，用外标一点法计算延胡索药材中总生物碱的 含量。
本发明所得到的延胡索总生物碱有效部位可以和药剂学上接受的辅料 制备成各种临床用药物制剂。所用的辅料选自淀粉、蔗糖、乳糖、糖粉、 葡萄糖、甘露醇、木糖醇、聚乙二醇、异丙醇、土温-80、甘油、丙二醇、 微晶纤维素钠、糊精、氯化钠、维生素C、半胱氨酸、柠檬酸、硫代硫酸 钠、亚硫酸钠和明胶中的任意一种或几种。所述的药物制剂是口服制剂或 者注射剂。口服制剂可以是片剂、丸剂、滴丸剂、胶囊剂、软胶囊剂或颗 粒剂。注射剂可以是注射液或冻干粉针剂。
上述药物制剂可以按照药剂学领域的常规生产方法制备，如将该有效 部位和一种或多种载体混合，然后制成相应的药物剂型。
本发明所得到的延胡索总生物碱有效部位具有很好的抗心肌缺血、增 加冠脉流量等药理作用，可用于冠心病的治疗。
本发明的优点是：本发明提供的延胡索总生物碱有效部位，其制备方 法简单，含量高(总生物碱的含量在85％以上)，安全，易于操作，不需要 高温高压及特殊设备，适合于工业化大生产。
具体实施例
以下通过实施例详细说明本发明技术方案，但不应以此限定本发明的 实施范围。
实施例1 延胡索总生物碱的优选制备方法及其在制备治疗冠心病药物中 的应用
取延胡索药材，粉碎成过20目筛的粗粉，用16倍药材重量的0.5％盐 酸溶液浸泡24小时后渗漉，渗漉液经过732阳离子交换树脂柱吸附，先用 10倍树脂体积的水洗脱，再用3倍树脂体积的10％乙醇洗脱除杂，最后用 12倍树脂体积的50％乙醇洗脱，收集洗脱液，60℃下减压浓缩至相对密度 为1.10～1.20的浸膏，喷雾干燥，粉碎，即得延胡索总生物碱有效部位。 总生物碱的含量为85％。
所得到延胡索总生物碱有效部位进行以下药理试验，即延胡索总生物 碱有效部位对垂体后叶素所致大鼠急性心肌缺血影响试验：
将Wistar大鼠42只，雌雄各半随机分为7组，每组6只：正常组， 模型组，延胡索总生物碱有效部位剂量组(5mg/kg、15mg/kg、45mg/kg，135 mg/kg)，维拉帕米组(25mg/kg)。每只鼠连续口服灌胃给药七天，正常和 模型组按1ml/100g予以蒸馏水灌胃，最后一天给药1h后腹腔注射戊巴比 妥钠麻醉(50mg/kg)，并测ECG1min，作为给药前的ECG，然后舌下静脉注 射垂体后叶素(0.7u/kg)，正常组注射同体积的生理盐水，再测ECG15min， 为给药后的ECG。每只鼠给药后的ECG同给药前ECG比较T波变化及心率 变化率。
统计学处理，数据以T波变化值及心率变化率，进行t检验，比较各 组大鼠注射垂体后叶注射液前后15s、30s、1min、5min、10min、15min T 波和心率的变化情况。P＜0.05为统计学有显著差异。实验结果见表1、表 2。
表1延胡索总生物碱有效部位对心肌缺血大鼠T波的影响( x±s) 组别 剂量 mg/k g 造模后各时间点T波变化(mv) 15s 30s 1min 5min 10min 15min 正常 组 模型 组 阳性 组 5mg/ kg 15mg /kg 45mg /kg 135m g/kg 25 5 15 45 135 0.017±0.013 0.123±0.054# 0.037±0.040* 0.028±0.012* 0.046±0.030* 0.010±0.006* 0.020±0.014* 0.014±0.006 0.117±0.040# 0.038±0.011** 0.078±0.046 0.037±0.029* 0.045±0.025* 0.066±0.019* 0.012±0.010 0.081±0.032# 0.070±0.024 0.069±0.030 0.044±0.030* 0.044±0.030* 0.041±0.037* 0.01±0..011 0.059±0.037 0.036±0.023 0.058±0.024 0.038±0.025 0.016±0.005 0.024±0.015 0.014±0.008 0.043±0.054 0.023±0.010 0.063±0.066 0.027±0.016 0.035±0.048 0.052±0.055 0.014±0.008 0.033±0.036 0.030±0..020 0.031±0.027 0.020±0.020 0.019±0.020 0.033±0.028
注：模型组同正常组比较#P＜0.05
给药组同模型组比较*P＜0.05 **P＜0.01
由表1看出，在15s和30s时间点，阳性组，延胡索总生物碱有效 部位各给药组同模型组比较，均有显著差异或非常显著性差异。
表2延胡索总生物碱有效部位对心肌缺血大鼠心率的影响( x±s) 组别 剂量 mg/kg 造模后各时间点心率变化 15s 30s 60s 5min 10min 15min 正常 组 模型 组 阳性 组 5mg/k g 15mg/ kg 45mg/ kg 135mg /kg 25 5 15 45 135 8.11±4.90 39.4±37.9 85.5±92.4 32.0±20.4 43.3±28.4 27.1±26.2 37.1±13.3 4.65±3.79 44.2±33.5 70.4±43.4 54.3±29.7 60.0±55.5 24.3±25.7 44.1±17.1 10.0±2.76 61.9±31.2# 69.5±38.0 73.0±39.9 55.6±48.4 24.9±26.2 62.3±32.1 17.8±12.4 70.2±59.8 88.9±62.3 111.9±21.5 88.7±29.3 67.1±7.66 95.3±27.4 29.0±17.7 65.8±52.4 97.6±48.8 109.9±6.04 88.2±36.1 77.5±19.1 99.7±34.4 45.0±9.36 85.1±45.6 94.0±36.9 115.3±9.35 89.5±32.8 82.8±18.2 103.5±37.8
注：模型组同正常组比较#P＜0.05
由表2看出，延胡索总生物碱有效部位没有改变心率的作用。
综上试验结果说明：延胡索总生物碱有效部位在适当剂量对心肌缺血 具有改善作用。
实施例2 延胡索总生物碱的优选制备方法
取延胡索药材，粉碎成过20目筛的粗粉，用16倍药材重量的0.5％硫 酸溶液浸泡24小时后渗漉，渗漉液经过D101大孔吸附树脂柱吸附，先用 8倍树脂体积的水洗脱，再用4倍树脂体积的20％乙醇洗脱除杂，最后用 10倍树脂体积的70％乙醇洗脱，收集洗脱液，60℃下减压浓缩至相对密度 为1.10～1.20的浸膏，真空干燥，粉碎，即得延胡索总生物碱有效部位。 总生物碱的含量为80％。
实施例3 延胡索总生物碱的优选制备方法
取延胡索药材，粉碎成过20目筛的粗粉，用14倍药材重量的1％盐酸 溶液浸泡12小时后渗漉，渗漉液经过Dm301大孔吸附树脂柱吸附，先用6 倍树脂体积的水洗脱，再用2倍树脂体积的40％乙醇洗脱除杂，最后用6 倍树脂体积的90％乙醇洗脱，收集洗脱液，60℃下减压浓缩至相对密度为 1.10～1.20的浸膏，冷冻干燥，粉碎，即得延胡索总生物碱有效部位。总 生物碱的含量为62％。
实施例4 延胡索总生物碱的优选制备方法
取延胡索药材，粉碎成过20目筛的粗粉，用10倍药材重量的水回流 提取4小时，提取液经过AB-8型树脂柱吸附，先用6倍树脂体积的水洗脱， 再用4倍树脂体积的30％乙醇洗脱除杂，最后用7倍树脂体积的80％乙醇 洗脱，收集洗脱液，60℃下减压浓缩至相对密度为1.10～1.20的浸膏，真 空干燥，粉碎，即得延胡索总生物碱有效部位。总生物碱的含量为55％。
实施例5 延胡索总生物碱的优选制备方法
取延胡索药材，粉碎成过20目筛的粗粉，用8倍药材重量的30％乙醇 溶液回流提取4小时，提取液经过D101大孔吸附树脂柱吸附，先用14倍 树脂体积的水洗脱，再用3倍树脂体积的20％乙醇洗脱除杂，最后用12 倍树脂体积的60％乙醇洗脱，收集洗脱液，60℃下减压浓缩至相对密度为 1.10～1.20的浸膏，喷雾干燥，粉碎，即得延胡索总生物碱有效部位。总 生物碱的含量为70％。
实施例6 延胡索总生物碱的优选制备方法
取延胡索药材，粉碎成过20目筛的粗粉，用8倍药材重量的50％乙醇 溶液回流提取4小时，提取液经过732阳离子交换树脂柱吸附，先用5倍 树脂体积的水洗脱，再用2倍树脂体积的30％乙醇洗脱除杂，最后用11 倍树脂体积的70％乙醇洗脱，收集洗脱液，60℃下减压浓缩至相对密度为 1.10～1.20的浸膏，真空干燥，粉碎，即得延胡索总生物碱有效部位。总 生物碱的含量为76％。
实施例7 延胡索总生物碱的优选制备方法
取延胡索药材，粉碎成过20目筛的粗粉，用5倍药材重量的95％乙醇 溶液回流提取4小时，提取液经过Dm103大孔吸附树脂柱吸附，先用5倍 树脂体积的水洗脱，再用5倍树脂体积的10％乙醇洗脱除杂，最后用6倍 树脂体积的60％乙醇洗脱，收集洗脱液，60℃下减压浓缩至相对密度为 1.10～1.20的浸膏，真空干燥，粉碎，即得延胡索总生物碱有效部位。总 生物碱的含量为65％。
实施例8 延胡索总生物碱片剂
取实施例6方法制备的延胡索总生物碱100g，与淀粉200g，微晶纤维 素100g混合，用30％乙醇制粒，压片，得含有延胡索总生物碱的片剂。
实施例9 延胡索总生物碱冻干粉针剂
取实施例2方法制备的延胡索总生物碱100g与100g甘露醇投料，加 注射用水5L使溶解，其中延胡索总生物碱的浓度为20mg/ml，甘露醇的用 量为2％；溶液分级过滤(0.45μm，0.22μm)，分装，冷冻干燥，得延胡 索总生物碱冻干粉针剂。
实施例10 延胡索总生物碱的胶囊剂
取实施例1方法制备的延胡索总生物碱100g，粉碎过80目筛，加入 50g药用淀粉，搅拌使混合均匀，喷入10％的聚维酮K30稀乙醇溶液，制软 材，过40目筛制粒，60℃干燥，分装于3#胶囊中，质检，包装，即得含有 延胡索总生物碱的胶囊制剂。