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1、(10)申请公布号 CN 103989732 A (43)申请公布日 2014.08.20 CN 103989732 A (21)申请号 201410183257.5 (22)申请日 2012.12.30 201210587958.6 2012.12.30 A61K 36/48(2006.01) C07H 17/07(2006.01) A61K 31/7048(2006.01) A23L 1/29(2006.01) A61P 19/10(2006.01) (71)申请人 中国人民解放军第二军医大学 地址 200433 上海市杨浦区翔殷路 800 号 (72)发明人 郑承剑 秦路平 马学琴 张巧。
2、艳 韩婷 张宏 (74)专利代理机构 上海德昭知识产权代理有限 公司 31204 代理人 丁振英 (54) 发明名称 山蚂蝗提取物及从中分离的总黄酮和山萘苷 及其医药用途 (57) 摘要 本发明涉及医药技术领域， 是圆菱叶山蚂蝗 提取物以及从中分离到的圆菱叶山蚂蝗总黄酮和 山萘苷单体化合物在制备防治骨质疏松药物或食 品中的应用。本发明以圆菱叶山蚂蝗干燥全草为 原料进行了提取分离， 得到了圆菱叶山蚂蝗提取 物， 由圆菱叶山蚂蝗提取物制备圆菱叶山蚂蝗总 黄酮并分离到山萘苷单体化合物。 经体内外实验， 表明圆菱叶山蚂蝗提取物、 圆菱叶山蚂蝗总黄酮 或山萘苷单体化合物都具有良好的抗骨质疏松的 生物活性。
3、， 因此可用于制备防治骨质疏松的药物 或食品。 本发明制备方法简单， 为抗骨质疏松提供 了新的药物来源。 (62)分案原申请数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103989732 A CN 103989732 A 1/1 页 2 1. 山萘苷单体化合物， 制备方法如下 ： 1) 将干燥圆菱叶山蚂蝗全草用水或体积百分比不超过 95的乙醇水溶液按常规水煎 煮或回流提取， 将提取液减压浓缩至无醇味的浸膏， 得圆菱叶山蚂蝗提取物 ； 2。
4、) 将上述提取物用水溶解成混悬液后， 依次用石油醚、 二氯甲烷、 乙酸乙酯和正丁醇萃 取， 将正丁醇萃取液减压浓缩成流浸膏状， 用硅胶 (100 200 目 ) 拌样， 干法上柱， 以二氯 甲烷 ： 甲醇为10111的不同比例进行洗脱， 收集二氯甲烷 ： 甲醇为10151 的洗脱液， 减压浓缩， 用少量甲醇溶解后即析出黄色晶体， 用甲醇清洗后得黄色粉末， 即山 萘苷单体化合物， 其化学结构式如下 ： 其中 rha 为鼠李糖。 2. 权利要求 1 所述的山萘苷单体化合物在制备防治骨质疏松药物或食品中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103989732 A 2 1/7 页 3 山蚂蝗提取物及从中。
5、分离的总黄酮和山萘苷及其医药用途 技术领域 0001 本发明涉及医药技术领域， 是圆菱叶山蚂蝗提取物以及从中分离到的圆菱叶山蚂 蝗总黄酮和山萘苷单体化合物在制备防治骨质疏松药物或食品中的应用。 本申请是专利申 请号为 201210587958.6 的分案申请。 背景技术 0002 骨质疏松症 (Osteoporosis,OP) 是一种常见病多发病。目前， 全世界约有 2 亿人 患骨质疏松症， 其发病率已经跃居世界各种常见症的第 7 位。目前， 治疗骨质疏松症的化学 药主要使用雌激素类骨吸收抑制剂或雄性激素类等骨形成刺激剂， 长期服用具有较大的副 作用。从天然的植物中寻找治疗骨质疏松疾病且副作用。
6、小的有效提取物、 有效部位及单体 化合物成为研究热点。 0003 圆 菱 叶 山 蚂 蝗 Podocarpium podocarpum(DC.)Yang et Huang 或 Desmodium podocarpum DC. 是豆科蝶形花亚科 (Papilionaceae， Leguminosae) 山蚂蝗属或长柄 山蚂蝗属植物， 生于海拔 700 1000 米山谷密林中或溪边， 我国东部和西南部地区 有分布。圆菱叶山蚂蝗以根、 叶及全草入药， 具有发表散寒， 止血功能， 主治急性风湿 痹痛、 跌打损伤， 刀伤等 ( 国家中医药管理局 中华本草编委会 . 中华本草 M. 上 海科学技术出版社，。
7、 3341-3343.)。现代药理学研究表明， 圆菱叶山蚂蝗具有镇痛、 解 热 和 抗 炎 作 用 (Zhu,Z.Z.,Ma,K.J.,Ran,X.,Zhang,H.,Zheng,C.J.,Han,T.,Zhang,Q. Y.,Qin,L.P.,2010.Analgesic,anti-inflammatory and antipyretic activities of the petroleum ether fraction from the ethanol extract of Desmodium podocarpum. Journal of ethnopharmacology133,112。
8、6-1131.)。目前， 仅有文献报道从长柄山蚂蝗的变 种尖叶长柄山蚂蝗 (Podocarpium podocarpum(DC.)Yang et Huang var.oxyphyllum(DC.) Yang et Huang) 分离得到 5 个化合物 ： - 谷甾醇、 正三十烷醇、 木栓酮、 齐墩果酸和脱 镁 叶 绿 素 甲 酯 (Ma,X.Q.,Zheng,C.J.,Hu,C.L.,Rahman,K.,Qin,L.P.,2011.The genus Desmodium(Fabaceae)-traditional uses in Chinese medicine,phytochemistry 。
9、and pharmacology.J. Ethnopharmacol.138,314-332.)。 至今未见有关圆菱叶山蚂蝗提取物、 圆 菱叶山蚂蝗总黄酮或山萘苷单体化合物具有防治骨质疏松症的报道。 发明内容 0004 本发明提供一种圆菱叶山蚂蝗提取物以及从中分离到的圆菱叶山蚂蝗总黄酮和 山萘苷单体化合物， 以及圆菱叶山蚂蝗提取物、 圆菱叶山蚂蝗总黄酮或山萘苷单体化合物 在制备防治骨质疏松药物或食品中的应用。 0005 本发明以圆菱叶山蚂蝗干燥全草为原料进行了提取分离， 得到了圆菱叶山蚂蝗提 取物， 由圆菱叶山蚂蝗提取物制备圆菱叶山蚂蝗总黄酮并分离到山萘苷单体化合物。制备 方法如下 ： 000。
10、6 1、 制备圆菱叶山蚂蝗提取物 说 明 书 CN 103989732 A 3 2/7 页 4 0007 将干燥圆菱叶山蚂蝗全草用水或体积百分比不超过 95的乙醇水溶液按常规水 煎煮或回流提取， 优选为 60 80乙醇， 最佳为 80乙醇， 将提取液减压浓缩至无醇味的 浸膏， 得圆菱叶山蚂蝗提取物。 0008 2、 制备圆菱叶山蚂蝗总黄酮 0009 将上述制得的圆菱叶山蚂蝗提取物采用大孔吸附树脂或聚酰胺柱层析纯化， 优选 大孔吸附树脂， 先用水和20乙醇水溶液洗脱， 弃洗脱液， 再用3080乙醇洗脱， 收集洗 脱液， 优选收集3060乙醇的洗脱液， 减压浓缩干燥， 得圆菱叶山蚂蝗总黄酮。 以山。
11、萘苷 为对照采用紫外分光光度法 (341nm) 测定其中总黄酮含量在 52 65。 0010 3、 制备山萘苷单体化合物 0011 将上述制备的圆菱叶山蚂蝗提取物用水溶解成混悬液后， 依次用石油醚、 二氯甲 烷、 乙酸乙酯和正丁醇萃取， 将正丁醇萃取液减压浓缩成流浸膏状， 用硅胶 (100 200 目 ) 拌样， 干法上柱， 以二氯甲烷 ： 甲醇为 10 1 1 1 的不同比例进行洗脱， 收集二氯甲烷 ： 甲醇为 10 1 5 1 的洗脱液， 减压浓缩， 用少量甲醇溶解后即析出黄色晶体， 用甲醇清 洗后得黄色粉末， 即山萘苷单体化合物， HPLC 测定含量为 95 99。山萘苷单体化合物的 化。
12、学结构式如下 ： 0012 0013 其中 rha 为鼠李糖。 0014 经过体内外药理试验， 表明圆菱叶山蚂蝗提取物、 圆菱叶山蚂蝗总黄酮或山萘苷 单体化合物均具有抗骨质疏松的效果。因此可用于制备防治骨质疏松药物或食品。 0015 本发明圆菱叶山蚂蝗提取物、 圆菱叶山蚂蝗总黄酮或山萘苷单体化合物制备方法 简单， 抗骨质疏松效果明显， 因此可用于制备防治骨质疏松的药物或食品。 本发明为抗骨质 疏松提供了新的药物来源。 附图说明 0016 图 1 是各组动物骨密度 BMD， 其中 vs 模型对照组， *P0.05， *P 0.05 0017 图 2 是各组动物血清中 ALP 活性， 其中 vs 。
13、模型对照组， *P0.05 0018 图 3 是各组动物血清中 TRAP 活性， 其中 vs 模型对照组， *P 0.05， 0019 *P 0.01， *P 0.001。 具体实施方式 0020 现结合附图和实施例对本发明作详细描述， 本发明的保护范围不限于实施例。 说 明 书 CN 103989732 A 4 3/7 页 5 0021 实施例 1 制备圆菱叶山蚂蝗提取物和山萘苷单体化合物 0022 圆菱叶山蚂蝗全草 20 kg， 粉碎。按常规水煎煮， 料液比为 1 15(v/v)， 提取时间 为 2 小时， 提取次数为 3 次。将提取液热过滤， 滤液合并后减压蒸干， 得提取物浸膏 3kg，。
14、 提 取物得率为 15。将提取物浸膏以 1 倍量水 (3L) 混悬， 依次用石油醚 (3L3)、 二氯甲烷 (3L3)、 乙酸乙酯 (3L3) 和正丁醇 (3L3) 等体积萃取， 取正丁醇萃取液减压浓缩成流 浸膏， 加入1.5倍柱层析硅胶拌匀， 干法上样， 以二氯甲烷 ： 甲醇为10 ： 15 ： 1的洗脱液 洗 脱， 收集洗脱液， 蒸干后以少量甲醇溶解， 常温放置过夜析晶， 滤出结晶， 再用甲醇重结晶， 得山萘苷 14g， HPLC 测定山萘苷纯度为 98.5。 0023 实施例 2 制备圆菱叶山蚂蝗总黄酮 0024 圆菱叶山蚂蝗干燥全草 15kg， 粉碎， 加 8 倍体积量 95乙醇， 回。
15、流提取， 提取时间 为 3 小时， 提取次数为 3 次。将提取液热过滤， 滤液合并后减压浓缩至流浸膏状， 此为圆菱 叶山蚂蝗提取物。将圆菱叶山蚂蝗提取物加入至预先处理好的 AB-8 大孔吸附树脂， 其中大 孔树脂与原药材生药重量比为 1 ： 1。先以 5 倍柱体的水进行洗脱至无色， 再依次以 20乙 醇、 30乙醇、 60乙醇、 80乙醇进行洗脱， 收集 30 60部位的洗脱液， 将洗脱液蒸干， 得圆菱叶山蚂蝗总黄酮 18.1g。以实施例 1 制备的山萘苷为对照， 紫外分光光度法 (341nm) 测定圆菱叶山蚂蝗总黄酮中总黄酮含量为 58.4。 0025 实施例 3 制备圆菱叶山蚂蝗提取物和圆。
16、菱叶山蚂蝗总黄酮 0026 圆菱叶山蚂蝗干燥全草 15kg， 粉碎， 加 8 倍体积量 80乙醇， 回流提取， 提取时间 为3小时， 提取次数为3次。 热过滤， 滤液合并后减压浓缩至流浸膏状， 此为圆菱叶山蚂蝗提 取物。将圆菱叶山蚂蝗提取物加入至预先处理好的 60 100 目聚酰胺树脂， 其中树脂与原 药材生药重量比为1 ： 1。 先用水洗脱至无色， 再依次以10乙醇、 30乙醇、 60乙醇、 80 乙醇进行洗脱， 分别收集 30乙醇、 60乙醇、 80乙醇洗脱的洗脱液， 以山萘苷为对照， 分 别用紫外分光光度法 (341nm) 测定总黄酮含量， 结果表明 30、 60、 80乙醇洗脱部位的 。
17、总黄酮含量依次为 56.6、 42.3和 40.5。将 60 80乙醇洗脱部位的洗脱液浓缩后 再次用聚酰胺树脂富集， 先以5倍柱体积的10乙醇洗脱除杂后， 再以30乙醇洗脱， 收集 后紫外分光光度法 (341nm) 测定总黄酮含量为 62.4。 0027 体内外抗骨质疏松活性实验 0028 一、 体外细胞实验 0029 1、 成骨细胞 (Osteoblast,OB) 实验 0030 动物 ： 新生 1 天 SD 大鼠 ( 同窝 )， 由第二军医大学实验动物中心提供。 0031 药物 ： 圆菱叶山蚂蝗提取物、 圆菱叶山蚂蝗总黄酮和山萘苷单体化合物由实施例 1、 2、 3 制备。配制溶液如下 ： 。
18、0032 将圆菱叶山蚂蝗提取物， 用 DMSO 溶解配制成浓度为 1mg/mL 的溶液， 临用前用含 10胎牛血清的 -MEM 稀释成 400,100,25g/mL ； ( 简称含提 取物培养基 ) ； 0033 将圆菱叶山蚂蝗总黄酮， 用 DMSO 溶解配制成浓度为 1mg/mL 的溶液， 临用前用含 10胎牛血清的 -MEM 稀释成 10,1,0.1g/mL ； ( 简称含总黄酮培养基 ) ； 0034 将山萘苷单体化合物， 用 DMSO 溶解配制成浓度为 10-2mol/L 的溶液， 临用前用含 10胎牛血清的 -MEM 稀释成 10-8,10-9,10-10mol/L。( 简称含山萘苷。
19、培养基 )。 0035 主要试剂 ： 说 明 书 CN 103989732 A 5 4/7 页 6 0036 -MEM 培养基、 型胶原酶、 特级胎牛血清、 胰蛋白酶， 为美国 Gibco 公司产品 ； 0037 地塞米松购自美国 Sigma 公司 ； 0038 NaCl、 Na2HPO4、 NaH2PO4、 NaHCO3等试剂均为国产分析纯。 0039 实验方法 ： 0040 1) 制备成骨细胞 ： 0041 新生1天的SD大鼠5只， 取其颅顶盖骨， 剪碎， 0.25的胰蛋白酶37消化30min， 再用0.05胰蛋白酶及3mg/mL的II型胶原酶37消化1h， 收集上清液， 经尼龙网过滤， 。
20、收 集滤液， 1000rpm 离心 10min， 弃上清， 收集细胞， 即为新鲜的成骨细胞， 按常规用含 10胎 牛血清的 -MEM 培养基置 37培养， 24h 后换液， 以后每 3 天换一次培养基。 0042 2) 成骨细胞增殖试验 ： 0043 实验分 11 组， 即阴性对照组， 阳性对照组， 提取物高、 中、 低剂量组， 总黄酮高、 中、 低剂量组和山萘苷高、 中、 低剂量组。 0044 按常规取96孔培养板一块， 将浓度为2104个/mL的成骨细胞悬液以100L/孔 接种于96孔培养板， 置37培养24h， 吸除各孔的培养基， 阴性对照组加入含10胎牛血清 的 -MEM 培养基 10。
21、0L/ 孔 ； 阳性对照组加入浓度为 10-8mol/L 染料木素的含 10胎牛血 清的 -MEM 培养基 100L/ 孔 ； 提取物高、 中、 低剂量组分别加入浓度为 400,100,25g/ mL 的提取物培养基 100L/ 孔 ； 总黄酮高、 中、 低剂量组分别加入浓度为 10,1,0.1g/mL 的总黄酮培养基 100L/ 孔 ； 山萘苷高、 中、 低剂量组分别加入浓度为 10-10， 10-9， 10-8mol/L 的山萘苷培养基 100L/ 孔， 每组各孔设有 5 个复孔， 继续置 37培养箱培养， 观察药物作 用 24h 对细胞增殖的影响。在检测前 4h 时， 每孔加入 20L 。
22、MTT 溶液， 放入培养箱中继续 孵育 4h， 取出培养板， 弃去上清液， 每孔加入 150L 二甲亚砜 (DMSO)， 震荡 5-10 分钟， 用酶 标仪于 570nm 处检测 OD 值。结果见表 1。由表 1 可见， 与阴性对照组相比， 提取物、 总黄酮 以及山萘苷的高、 中、 低剂量组均能显著促进成骨细胞增殖 (P0.05)。 0045 3) 成骨细胞碱性磷酸酶 (ALP) 活性试验 ： 0046 实验分 11 组， 即阴性对照组， 阳性对照组， 提取物高、 中、 低剂量组， 总黄酮高、 中、 低剂量组和山萘苷高、 中、 低剂量组。 0047 取成骨细胞以浓度为 2104个 /mL 的细。
23、胞悬液 100L/ 孔接种于 96 孔培养板 置 37培养 24h， 吸除各孔的培养基， 阴性对照组加入含 10胎牛血清的 -MEM 培养基 100L/ 孔 ； 阳性对照组加入浓度为 10-8mol/L 染料木素的含 10胎牛血清的 -MEM 培 养基 100L/ 孔 ； 提取物高、 中、 低剂量组分别加入浓度为 400,100,25g/mL 的提取物 培养基 100L/ 孔 ； 总黄酮高、 中、 低剂量组分别加入浓度为 10,1,0.1g/mL 的总黄酮 培养基 100L/ 孔 ； 山萘苷高、 中、 低剂量组分别加入浓度为 10-10， 10-9， 10-8mol/L 的山萘 苷培养基 10。
24、0L/ 孔， 每组各孔设有 5 个复孔， 继续置 37培养箱培养， 第 4 天再换含相 应药物的培养基一次， 培养至第 6 天， 各孔去培养基后加入浓度为 50mmol/L 的二乙醇胺 100L， 2.5mmol/L 的对硝基苯酚磷酸二钠 50L， 37反应 30 分钟后， 再用 0.3mol/L 的 NaOH100L/孔终止反应， 用酶标仪于波长405nm处测得OD值。 以不同浓度的对硝基苯酚溶 液在 405nm 处的 OD 值作标准曲线， 由标准曲线得出每孔释放的对硝基苯酚的 nmol 数， 每孔 释放的对硝基苯酚的 nmol 数表示 ALP 的活性 ( 见表 1)。由表 1 可见， 与阴。
25、性对照组相比， 圆菱叶山蚂蝗提取物高剂量组、 圆菱叶山蚂蝗总黄酮高剂量组以及山萘苷高中剂量组均具 说 明 书 CN 103989732 A 6 5/7 页 7 有提高成骨细胞 ALP 活性的作用 (P 0.05)。 0048 2、 破骨细胞 (Osteoclast,OC) 实验 0049 动物 ： 新生 3 天 SD 大鼠 ( 同窝 )， 由第二军医大学实验动物中心提供。 0050 药物 ： 同上。 0051 主要试剂 ： 0052 -MEM 培养基、 型胶原酶、 特级胎牛血清、 胰蛋白酶为美国 Gibco 公司产品 ； 0053 1,25- 双羟基维生素 D3(1,25-(OH)2Vitam。
26、inD3)、 地塞米松购自美国 Sigma 公司 ； 0054 酒石酸钾钠等均为国产分析纯试剂为国产分析纯。 0055 破骨细胞诱导培养基 ： 此为含 10-8mol/L1,25-(OH)2-VD3、 10-7mol/L 地塞米松及 10胎牛血清的 -MEM 培养基。 0056 将圆菱叶山蚂蝗提取物， 用DMSO溶解配制成浓度为1mg/mL的溶液， 临用前用破骨 细胞诱导培养基稀释成 400,100,25g/mL ； ( 简称提取物破骨细胞诱导培养基 ) ； 0057 将圆菱叶山蚂蝗总黄酮， 用DMSO溶解配制成浓度为1mg/mL的溶液， 临用前用破骨 细胞诱导培养基稀释成 10,1,0.1g。
27、/mL ； ( 简称总黄酮破骨细胞诱导培养基 ) ； 0058 将山萘苷单体化合物， 用DMSO溶解配制成浓度为10-2mol/L的溶液， 临用前用破骨 细胞诱导培养基稀释成 10-8,10-9,10-10mol/L。( 简称山萘苷破骨细胞诱导培养基 )。 0059 实验方法 ： 0060 1) 制备破骨细胞 ： 0061 选取新生 3 天的 SD 大鼠 5 只， 分离胫骨， 用破骨细胞诱导培养基冲洗骨髓腔， 将骨 髓内的细胞冲出， 收集冲洗液， 离心弃上清， 将细胞用PBS缓冲液洗2次， 即得新鲜的骨髓细 胞， 其为骨髓单核细胞。将新鲜的骨髓细胞与第 3 代成骨细胞共同悬浮于破骨细胞诱导培 。
28、养基中成为细胞悬液， 其中成骨细胞的浓度为1105个/mL， 骨髓单核细胞的浓度为1106 个 /mL， 将细胞悬液接种于 96 孔培养板， 每孔 100L， 于 37， 5 CO2培养箱中培养， 每 3 天换一次液， 8 天后， 骨髓细胞分化为成熟的破骨细胞。 0062 2) 破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP) 活性试验 ： 0063 实验分 11 组， 即阴性对照组， 阳性对照组， 提取物高、 中、 低剂量组， 总黄酮高、 中、 低剂量组和山萘苷高、 中、 低剂量组。 0064 将上述 96 孔板中成熟破骨细胞各孔的培养基吸除， 阴性对照组加入破骨细胞诱 导培养基 100L/ 孔 ；。
29、 阳性对照组加入浓度为 10-8mol/L 染料木素的破骨细胞诱导培养基 100L/ 孔 ； 提取物高、 中、 低剂量组分别加入浓度为 400,100,25g/mL 的提取物破骨细 胞诱导培养基 100L/ 孔 ； 总黄酮高、 中、 低剂量组分别加入浓度为 10,1,0.1g/mL 的总 黄酮破骨细胞诱导培养基 100L/ 孔 ； 山萘苷高、 中、 低剂量组分别加入浓度为 10-10， 10-9， 10-8mol/L 的山萘苷破骨细胞诱导培养基 100L/ 孔， 每组各设 5 个复孔， 继续置 37培养 箱 培养， 培养 48h 后， 各孔弃培养基， 加入 20L0.1 Triton X-10。
30、0 室温破碎细胞 15min， 再加入 100L 反应液 (0.4g 对硝基苯基磷酸二钠， 去离子水溶解后加入 2.0g 酒石酸钾钠， 加水溶解至 150mL， HCl 调节 pH 至 3.5， 再加水定容至 200mL)， 于 37反应 30min， 迅速加 入 1mol/L 的 NaOH100L 终止反应， 用酶标仪于波长 405nm 处测定其 OD 值。以不同浓度的 对硝基苯酚溶液在405nm处的OD值作标准曲线， 由标准曲线得出每孔释放的对硝基苯酚的 nmol 数， TRAP 活性用每孔破骨细胞生成的对硝基苯酚的 nmol 数表示。结果见表 1。由表 说 明 书 CN 10398973。
31、2 A 7 6/7 页 8 1 可见， 与阴性对照组相比， 25 400g/mL 的圆菱叶山蚂蝗提取物， 0.1 10g/mL 的圆 菱叶山蚂蝗总黄酮以及 10-8 10-10mol/L 的山萘苷均具有抑制破骨细胞 TRAP 酶活性的作 用 (P 0.05 0.001)。 0065 表 1 圆菱叶山蚂蝗提取物和总黄酮及山萘苷对 OB 和 OC 细胞的作用 (n 5) 0066 0067 *P0.001,*P0.01,*P0.05, 与阴性对照组相比。 0068 二、 动物试验 0069 动物 ： 0070 3 月龄 SD 雌性大鼠， 体重 30020g。购自上海斯莱克实验动物有限公司。许可证 。
32、号 ： SCXK( 沪 )2012-0002。 0071 药物及试剂 ： 0072 圆菱叶山蚂蝗提取物、 山萘苷、 圆菱叶山蚂蝗总黄酮由实施例 1、 2、 3 制备。 0073 阳性对照药 ： 戊酸雌二醇片 ( 补佳乐 )， 法国 DELPHARM Lille S.A.S. 拜耳医药保 健有限公司广州分公司， 批号 ： (224A2)。 0074 实验方法 ： 0075 取 SD 大鼠 72 只， 随机分为 9 组， 每组 8 只， 即 ： 0076 假手术组 (SHam) ； 0077 模型对照组 (OVX) ； 0078 戊酸雌二醇阳性对照组 (E2,1mg/kg/d) ； 0079 圆菱。
33、叶山蚂蝗提取物高剂量组 (PEH， 300mg/kg/d) ； 0080 圆菱叶山蚂蝗提取物低剂量组 (PEL， 100mg/kg/d) ； 0081 圆菱叶山蚂蝗总黄酮高剂量组 (PFH,100mg/kg/d) ； 0082 圆菱叶山蚂蝗总黄酮低剂量组 (PFL， 30mg/kg) ； 0083 山萘苷高剂量组 (PH,30mg/kg/d) ； 0084 山萘苷低剂量组 (PL,8mg/kg/d)。 0085 大鼠以 10水合氯醛 0.3mL/kg 腹腔注射麻醉后腹部切口， 除假手术组外， 其余 8 组在无菌条件下摘除双侧卵巢作为骨质疏松症模型大鼠， 假手术组只切开腹部但不摘除卵 说 明 书。
34、 CN 103989732 A 8 7/7 页 9 巢。按上述给药剂量将药物溶于 0.5 CMC-Na 后灌喂给药 (10mL/kg)， 连续给药 12 周， 假 手术组和模型对照组灌喂等体积 0.5 CMC-Na。 0086 1、 骨指标测定 0087 大鼠处死后， 迅速剥离右侧股骨， 利用双能 X 射线骨密度仪测定右侧股骨的总骨密 度 (t-BMD)， 检测数据均用表示， 统计分析用 spss l6.0 软件进行单因素方差分析。显 著性差异表示为 *p0.05， *p0.01 和 *p0.001。各组动物骨密度 BMD 检测结果见图 1。 0088 由图 1 可见， 除菱叶山蚂蝗提取物低剂。
35、量组外， 其它各给药组与模型对照组相比， 均能显著提高骨密度 (p0.05， p0.01)。 0089 2、 血清生化指标测定 0090 最后一次灌胃给药后， 将大鼠禁食 12 小时 ( 不禁水 )， 之后将大鼠麻醉， 股动脉取 血， 测量血清 TRAP 和 ALP 含量， 结果见图 2 和图 3， 图 2 表示各组动物血清中 ALP 活性， 图 3 表示各组动物血清中 TRAP 活性。 0091 由图2可见， 给药12周后， 模型对照组与假手术组相比， ALP含量提高， 这是高转换 骨质疏松的特征。与假手术组相比， 总黄酮高剂量组 (PFH) 和山萘苷高剂量组 (PH) 的 ALP 含量显著。
36、提高 (p0.05)， 说明促进了骨形成 ； 由图 3 可见， 与模型对照组相比， 各给药组均 能显著抑制去卵巢大鼠 TRAP 酶活性 (p0.05 p0.001)， 说明均能抑制骨吸收。 0092 3、 尿液生化指标测定大鼠最后一次给药后， 禁食不禁水， 收集 12h 尿液， 测定 Ca、 P 和 Cr 含量， 结果见下表 2。 0093 表 2 各给药组对去卵巢大鼠尿液生化指标的影响 0094 如表 2 所示， 大鼠去卵巢后， 尿液中 Ca/Cr 水平显著升高， 骨钙丢失严重。与模型对照组比 较， 假手术组和各给药组尿液 Ca/Cr 水平显著降低 (p0.001)， 阻止去卵巢大鼠骨组织中钙 的流失 ； 圆菱叶山蚂蝗总黄酮高低剂量及山萘苷高低剂量均能显著降低去卵巢大鼠尿液中 P/Cr 水平， 阻止去卵巢大鼠骨组织中磷的流失。 0095 上述实验表明， 本发明圆菱叶山蚂蝗提取物、 圆菱叶山蚂蝗总黄酮或山萘苷单体 化合物均具有抗骨质疏松的活性， 因此可用于制备防治骨质疏松的药物或食品。 说 明 书 CN 103989732 A 9 1/1 页 10 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103989732 A 10 。