一种烟草甾醇合成相关转录因子bHLH93基因及应用技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一个烟草甾醇合成相关转录因子bHLH93
基因及应用。
背景技术
植物甾醇是生物膜系统的重要组成成分，其除了调控植物的生长发育，还能响应多种生
物和非生物胁迫。烟草中常见的甾醇类物质主要有胆甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇等。
植物甾醇经由异戊二烯代谢途径合成，目前烟草中对于甾醇调控的研究主要集中在异戊二烯
代谢途径中编码关键酶的基因上，对于调控甾醇合成相关的转录因子研究的较少。所以探寻
烟草中甾醇合成相关转录因子，对于进一步研究甾醇合成的转录调控有着重要的意义。
目前研究植物功能基因主要方法有通过根癌农杆菌稳定的遗传转化和通过RNA病毒介
导瞬时基因沉默系统(VIGS)。由于稳定表达系统周期较长，并且获得的转基因植株往往含
有一个或多个的外源基因拷贝，所以通过农杆菌介导的稳定遗传的方法获得的转基因植株外
源基因的表达往往不稳定。利用病毒介导VIGS技术是近年来发现的转录后基因沉默技术，
其可以快速高效的对目的基因进行沉默。目前由烟草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus，TRV)
介导的VIGS在马铃薯、棉花及烟草等草本植物中都有广泛的应用。烟草作为重要的模式植
物，甾醇合成的研究对于其他植物也具有重要的借鉴意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种烟草甾醇合成相关转录因子bHLH93基因及其在调控叶片中甾
醇含量的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种烟草甾醇合成相关转录因子bHLH93基因，所述bHLH93基因的核苷酸序列如SEQ
IDNO：1所示。
所述bHLH93基因是通过同源克隆的方法得到的。
一种烟草甾醇合成相关转录因子bHLH93基因在调控烟草甾醇含量中的应用，基于
bHLH93基因序列，根据干扰载体引物设计原则设计引物，构建烟草bHLH93基因干扰载体，
并通过VIGS(virusinducedgenesilencing)实验鉴定该转录因子的功能，发现其可以调控叶片
中甾醇的含量。
所述烟草NtbHLH93基因干扰载体是由酶切后的bHLH93基因PCR片段和TRV2病毒空
载体连接，转化感受态，并测序验证而得。
所述PCR所用引物为：
NtbHLH93-VIGS上游引物如SEQIDNO：2所示；
NtbHLH93-VIGS下游引物如SEQIDNO：3所示。
所述酶为两种限制性内切酶NcoI和SacI。
所述VIGS实验是通过农杆菌介导的病毒侵染实现。
本发明的有益效果是：本发明所述的基因NtbHLH93被沉默后，烟草叶片中甾醇特别是
豆甾醇的含量明显降低，其含量的降低，可作为烟草甾醇调控领域的应用。
附图说明
图1为基因NtbHLH93沉默表型图，其中Con为注射侵染缓冲液的对照，TRV为注射携
带TRV2空载体菌液的对照；NtbHLH93为携带NtbHLH93基因TRV2载体菌液的试验组。
图2为基因NtbHLH93在VIGS体系中基因表达量，其中Con为注射侵染缓冲液的对照；
TRV为注射携带空载体菌液的对照；NtbHLH93为注射携带目的基因菌液的试验组。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制
本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件。
一、烟草总RNA提取和反转录合成cDNA
1.提取移栽后4周的红花大金元叶样品的总RNA用于基因克隆，提取RNA所用的研钵、
药勺等均用95％酒精灼烧后使用。提取RNA所用的离心管和枪头等均是无RNase产品
(AXYGEN)。
总RNA的提取按照GeneAnswerRNA提取试剂盒说明书的提取步骤进行。
(1)取准备好的烟草幼叶样品(100mg)，在预冷的研钵中用液氮研磨彻底，转移到1.5
ml离心管中；
(2)待液氮刚挥发完后，加入500μlRLT和50μlPLANTaid，剧烈涡旋混匀，并在56℃
温育3min；
(3)将裂解液13000rpm离心5-10min，取上清380μL，加入190μL无水乙醇，吹打
混合均匀；将混合液全部转移到吸附柱RA上，13000rpm离心2min；
(4)加入350μLRW1洗脱液，室温放置1min，13000rpm离心1min，弃滤液；
(5)加DNaseI工作液80μL于膜中央，22℃，酶解15min；
(6)加入350μLRW1洗脱液，13000rpm离心1min，弃去收集管；
(7)将离心柱转移到新的2ml收集管上，加入500μLRW液，13000rpm离心30s，弃
滤液；
(8)加入500μLRW液到离心柱上，最大转速离心2min，13000rpm离心1min，弃
滤液，空管13000rpm离心2min；
(9)小心移去离心管，把离心柱连接到新的1.5ml收集管上，加入30μL无RNase水
(70℃)，室温静置2min，10000rpm离心1min，洗脱RNA；-80℃保存提取的RNA。
2.烟草总RNA反转录合成cDNA
使用宝生物Prime![]()
1stStrandcDNASynthesisKit试剂盒反转录合成cDNA第二链，
反应体系如表1所示：
表1反转录体系
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模板RNA与OligodT充分混合70℃变性5分钟，后迅速置于冰上冷却5分钟，并加入
一定体积的5×RTbuffer、dNTP、双蒸H2O和AMV，反应条件：42℃保温1h，放入75℃温
育15分钟灭活AMV逆转录酶，迅速取出置于冰上骤冷，终止cDNA第一链的合成，用于下
一步的PCR反应，剩余的cDNA保存于-20℃备用。
二、bHLH93基因的同源克隆
通过Blast分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)得到两条与拟南芥及番茄bHLH93相
似的烟草EST序列(GenBank登录号：FS420134和AM805227)，并对两条EST序列进行拼
接。根据基因的序列设计3对长度为20bp左右的特异引物(P1、P2、P3)，分别为：
P1上游引物：5'-GATAGAGCCATTGTGGAGGA-3'，
P1下游引物：5'-CTACATCAAACTTTGGAGGG-3'；
P2上游引物：5'-TCTATTCACTTTTTGACGTT-3'，
P2下游引物：5'-GATCTTCACGCAACCTGTG-3'；
P3上游引物：5'-ATGGAGCTCACTCAACAGG-3'，
P3下游引物：5'-GCTCATGCGGCCGCTACAG-3'。
PCR反应体系25μL，包括一定体积的双蒸H2O9.7μL、PremixTaq12.5μL、上游引物
0.4μL、下游引物0.4μL和cDNA2μL。反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃
退火30s，72℃延伸60～90s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保温。
琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，DNA回收试剂盒(TaKaRa公司)回收目的基因。将
回收产物连接到克隆载体pMD19-T(TaKaRa公司)上；转化大肠杆菌(DH5α)感受态细胞
中，37℃培养，菌落PCR鉴定得到阳性克隆。利用小量质粒快速提取试剂盒(GeneAnswer)
提取阳性克隆质粒，然后将质粒酶送至华大基因测序得到三条长度分别为450bp、700bp及
1100bp的序列，对这些序列进行拼接，最终得到长度1254bp的序列，该基因具有1047bp
的开放阅读框，编码349个氨基酸。以bHLH93全长cDNA编码的蛋白质序列在NCBI数据
库中进行Blast比对分析，发现茄科植物番茄、马铃薯bHLH93的序列相似性分别为80％和
76％，与模式植物拟南芥、水稻bHLH93的相似性分别为69％和75％，将该基因命名为
NtbHLH93。
三、TRV2-NtbHLH93载体构建
构建TRV2-NtbHLH93载体：所用引物为NtbHLH93-VIGS上游引物如SEQIDNO：2所
示，下游引物如SEQIDNO：3所示。分别在两条引物上设计NcoI和SacI酶切位点和相应
的保护碱基，以实施例2中测序正确的NtbHLH93-T质粒为模板进行扩增，对回收纯化的PCR
产物和TRV2病毒空载体使用NcoI和SacI进行酶切，酶切后的PCR片段和TRV2病毒空载
体载体连接，转化大肠杆菌DH5α。菌落PCR鉴定阳性克隆，提取质粒，对得到的质粒进行
酶切和测序验证。
四、农杆菌介导的病毒侵染
(1)农杆菌感受态制备：挑取单菌落农杆菌GV3101在2mlLB(含20mg/mLRif)中
28℃培养过夜，取生长良好的菌液2ml(含25mg/LRif)接种于50mlLB液体培养基中，28℃
振荡培养至OD600约等于0.5左右；将菌液转移至50ml离心管，放置冰上30分钟，然后离
心收集菌体(5000rpm/4℃，5分钟)；用10ml0.15M预冷的氯化钠溶液轻悬菌体，离心收集
菌体(5000rpm/4℃，5分钟，)；弃去上清，加入20ml预冷的20mM氯化钙溶液悬浮菌体，
将制好的感受态细胞以100μl/管分装，在液氮中速冻后保存在-80℃备用。
(2)质粒转化农杆菌：分别取1μlTRV1、TRV2和TRV2-NtbHLH93质粒，加入含100μl
的农杆菌感受态的离心管中，冰上放置30分钟；后转入液氮速冻1分钟，然后37℃温育5
分钟；加入1mlLB液体培养基，28℃震荡培养3小时；5000rpm离心1分钟，弃去上清，
加入200μlLB液体培养基，重悬沉淀；取200μl重悬菌液均匀地涂于含20mg/LRif和50mg
/L卡那霉素(Kan)的LB固体平板上，28℃培养2-3天；经菌落PCR鉴定无误后保存菌种。
(3)分别挑取步骤(2)中保存的TRV1、TRV2和TRV2-NtbHLH93菌落接种至2mlLB
培养基(50mg/mlKan，05mg/mlRif)，28℃过夜活化。取生长良好的菌液2ml接种于同样的
50mlLB培养基中，再加入10mM2-N-吗啉基乙磺酸(MES)和20μM乙酰丁香酮(AS)，
28℃过夜培养。低速离心菌液后，用侵染缓冲液(10mMMgCl2，10mMMES，200μMAS)
重悬菌体。使用OD600波长下调整OD值至1.0，室温静置3h后接种。空白对照注射侵染缓
冲液，TRV1&TRV2(TRV)作为阴性对照，TRV1&TRV2-NtbHLH93为实验组，各菌液按
照1:1的比例混合，用无针头的无菌注射器注入烟草的下部叶位叶片中。
五、NtbHLH93基因沉默效果检测
(1)表型观察：病毒载体接种本氏烟草叶片四周后，实验组本氏烟新生叶片和茎出现明
显的白化症状，而且植株明显矮化(图1)。
(2)病毒载体接种本氏烟草叶片后4周，提取烟草叶片的RNA并反转录成cDNA，QPCR
分析NtbHLH93的沉默效果(相对于未接种的烟草对照和接种带有TRV1&TRV2空病毒载
体的烟草)。NtbHLH93沉默效果检测用引物为：上游引物NtbHLH93-F：
5'-TTACTGGGAAATTACAAAGAGC-3'；下游引物NtbHLH93-R：5'-
ACTTGTGGTCGATTGTGGGC-3'。QPCR实验结果表明，叶片中NtbHLH93的表达量明显降
低(图2)。
(3)采用GC-MS分析检测转基因烟草甾醇代谢物的变化，数据真实准确的反应烟草叶
片中胆甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇等的变化。分析条件：称取烟叶冻干样50mg，加
正己烷1.5ml，50ul内标，混匀，抽提；超声20min，离心12000rpm，10min。上清转移到尖
底玻璃瓶，氮气吹干；沉淀加80％甲醇、20％KOH溶液1.2ml，70℃30min；离心12000rpm，
10min，取上清转移至玻璃瓶，加正己烷1.0ml，震荡、静置；取上清，加饱和NaCl1.0ml，
取上清为溶液二，溶液一、二合并，吹干；加氯仿0.5ml，取100ul吹干加50ulMSTFA，37℃，
50min；取液体进行GC/MS分析。气质联用条件：色谱柱DB-5MS(30mx0.25mmx0.25μm)；
进样量1.0μl；分流比10:1；进样口温度280℃；载气He；流速1ml/min；升温程序60℃3min，
15℃/min升至210℃，0.8℃/min升至220℃，15℃/min升至310℃保持20min；质谱条件：
离子源温度230℃；四级杆温度150℃；EI源；采集模式：全扫描(Scan)与选择离子检测(SIM)
同时采集。
表2不同类型甾醇含量
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结果分析：如表2所示，对照植株和转基因植株相比胆固醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、β-
谷甾醇的含量变化差异不明显(P<0.05)，其中豆甾醇的含量较对照相比下降了22％，
NtbHLH93基因RNAi植株总甾醇的含量下降约18％。证明利用VIGS技术将NtbHLH93基
因沉默掉之后烟草叶片中豆甾醇和总甾醇的含量明显降低。
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