一种高效价尿促性素的提取及纯化方法技术领域
本发明涉及蛋白质纯化和生物医药领域，具体而言，本发明涉及高效价尿促性素的提取及纯化方法。
背景技术
尿促性素（HMG）是由人脑下垂体前叶部分分泌的一种糖蛋白促性腺激素，一般是从绝经期或绝经期后妇女的尿液中经提取纯化而制得。妇女在行经期间HMG的含量有所波动，但较低，只有妇女进入绝经期或之后的十几年中，其尿中HMG的含量方达到高峰（60-100iu/L尿），并能维持在一个稳定的水平上，HMG含有卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素（LH），其所含比例近似1：1。临床主要用于治疗妇女因功能性不排卵所致的不育症；男性因激素水平低下所引起的精子过少或活力不足。另外，还用于治疗诸如妇女闭经、月经不调、男女之性机能失调等症。
1928年Ascbheim首先报道了从更年期妇女尿液中发现了活性物质，之后报道虽不少，但真正对HMG的了解和制备，是从20世纪60年代的Donimi开始，并逐渐形成比较规范化的工艺来制备的。我国从20世纪70年代开始研究，80年代正式进入临床试验阶段，90年代开始大量生产。
目前，比较经典的制备工艺是高岭土-乙醇法制备HMG粗制品，再用各种纯化方法进行纯化。国内目前常用的纯化方法收率偏低（一般小于50%），成品效价在100iu/mg左右。中国专利CN101792482A介绍了“一种促性腺激素的纯化方法”，该方法采用硅酸铝粉末作为吸附剂提取纯化HMG，但其效价仅能达到150iu/mg。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效价HMG的提取及纯化方法，与传统的分离纯化方法相比，此方法突破了吸附分离杂蛋白技术难点，使HMG效价可稳定达到500iu/mg以上。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
1、粗品提取
1.1吸附，按尿量：高岭土=100:0.7比例投料。
取醋酸调尿液pH至3.8-4.8，加高岭土搅拌2小时，静置，离心取干吸附物。
1.2脱附，洗脱液配比为尿液：水：氨水=1000:14:1.5。
1.2.1在干吸附物中加洗脱液适量，调pH至10左右，搅拌2小时，离心取上清液。
1.2.2上清液用醋酸调pH5.5，加2倍量乙醇，搅拌均匀，静置沉淀，将沉淀物用五氧化二磷干燥，得粗品。
2.HMG中间体提取
2.1将粗品慢慢投入1:30比例的乙酸铵提取液中，在低温下搅拌2小时，离心取上清液。
2.2上清液加3倍量95%乙醇，搅拌2小时静置，离心弃去上清液。
2.3沉淀物加适量乙醇脱水，再离心弃去上清液，沉淀物用五氧化二磷干燥即得HMG中间体
3.HMG精品提取
3.1协和工序
3.1.1吸附
将HMG中间体用100倍量醋酸钠缓冲液在低温下溶解，离心取上清液。上清液加10倍量协和树脂搅拌2小时，离心弃去上清液。树脂用醋酸钠缓冲液反复洗涤，至280nmOD值小于0.25为止。
3.1.2洗脱，洗脱液为10%乙酸铵-40%乙醇溶液
吸附好的树脂柱加5倍量洗脱液洗脱，流出液加4倍量95%乙醇，静置，离心取沉淀物。沉淀物用无水乙醇脱水，离心再取沉淀物，用五氧化二磷干燥即得协和干粉。
3.2DEAE-Cellulose柱层析工序
3.2.1DEAE-Cellulose树脂处理
3.2.1.1将柱中的DEAE-Cellulose树脂用纯化水反冲下来，装入桶中，用纯化水浸没搅匀，静置，倾去上清液及细小颗粒，反复三次，纯化水浸没静置。
3.2.1.2将DEAE-Cellulose树脂滤干，用少量纯化水洗涤，滤干后，装入桶中，用0.5MHCl浸没，搅拌，过滤，用纯化水洗至中性，再分别用0.5MNaOH浸泡，搅拌，过滤，再用纯化水洗至中性。
3.2.1.3将树脂滤干，用0.05MTris-HCl缓冲液(pH7.5)反复平衡到pH7.5后，用缓冲液浸没，待用；
3.2.1.4将上述平衡好的树脂装入柱内，柱装好后，再用0.05MTris-HCl（pH7.5）缓冲液走柱，以流出液的pH近7.5为标准。
3.2.2上样
3.2.2.1将协和干粉按1：100倍比例溶解于0.05MTris-HCl（pH7.5）缓冲液中搅拌溶解；
3.2.2.2上样，流速控制在50-60ml/min。
3.2.3洗涤
上样结束后，用0.05MTris-HCl（pH7.5）缓冲液洗涤至流出液OD值在0.25以下，流速控制在60ml/min左右。
3.2.4洗脱
用0.2MTris-HCl缓冲液（pH7.5）洗脱，流速控制在70ml/min左右，洗脱至流出OD值在0.35以上，滴加乙醇变浑浊后，开始收集流出液，直到OD值在0.35以下，停止收集流出液。
3.2.5沉淀
计量流出收集液体积，转入桶内，加入5倍量（V/V）95%乙醇，搅拌均匀，然后静置。
3.2.6干燥
3.2.6.1弃去桶内的上清液，沉淀物离心，弃去上清液；
3.2.6.2沉淀物用适量的无水乙醇脱水，离心弃去上清液，重复二次；
3.2.6.3最后，将沉淀物用五氧化二磷干燥即得HMG精品。
4.注射级HMG提取
4.1取精品HMG加入25倍量（ml）纯化水，搅拌溶解。
4.2溶解液加等体积乙醇，再加总体积8%的醋酸铵溶液，搅拌充分
4.3在不断搅拌下分别加入精品HMG12倍的0.2M磷酸钠溶液，纯品HMG12倍的0.3M醋酸钙溶液。
4.4用5M氢氧化钠溶液调pH至8.5，搅拌2小时，离心取上清液。
4.5上清液用5M盐酸调pH至6.5-7.0，加10倍量95%乙醇，静置，离心弃去上清液，沉淀物用无水乙醇洗涤，再离心弃去上清液，沉淀物用五氧化二磷干燥即得注射级HMG。
本发明提供的提取及纯化方法获得的以FSH和LH为主要成分的尿促性素具有更高的效价，可达300iu/mg以上。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例：
1、粗品提取
1.1吸附
采集绝经期妇女尿液1000kg，用醋酸调pH值，并用pH3.8-5.4精密试纸测定，调节尿液pH到3.8-4.8之间，加7kg高岭土，搅拌2小时，静置，离心取得干吸附物10kg。
1.2脱附
1.2.1干吸附物加水14L，25%氨水6L溶解，继续加氨水调pH至10左右，搅拌2小时，离心取上清液。
1.2.2上清液用醋酸调pH5.5，加2倍量乙醇，搅拌均匀，静置沉淀，将沉淀物用五氧化二磷干燥，得粗品40g。
2、HMG中间体提取
2.1将粗品慢慢投入1:30比例的2L乙酸铵提取液中，在低温下搅拌2小时，离心取上清液。
2.2上清液加95%乙醇6L，搅拌2小时静置，离心弃去上清液。
2.3沉淀物加适量乙醇脱水，再离心弃去上清液，沉淀物用五氧化二磷干燥即得HMG中间体12g。
3、HMG精品提取
3.1协和工序
3.1.1吸附
将HMG中间体用1.2L醋酸钠缓冲液在低温下溶解，离心取上清液。上清液加0.12kg协和树脂搅拌2小时，离心弃去上清液。树脂用醋酸钠缓冲液反复洗涤，至280nmOD值小于0.25为止。
3.1.2洗脱，洗脱液为10%乙酸铵-40%乙醇溶液
吸附好的树脂柱加6kg洗脱液洗脱，流出液加24L95%乙醇，静置，离心取沉淀物。沉淀物用无水乙醇脱水，离心再取沉淀物，用五氧化二磷干燥即得协和干粉1.8g。
3.2DEAE-Cellulose柱层析工序
3.2.1DEAE-Cellulose树脂处理
3.2.1.1将柱中的DEAE-Cellulose树脂用纯化水反冲下来，装入桶中，用纯化水浸没搅匀，静置，倾去上清液及细小颗粒，反复三次，纯化水浸没静置。
3.2.1.2将DEAE-Cellulose树脂滤干，用少量纯化水洗涤，滤干后，装入桶中，用0.5MHCl浸没，搅拌，过滤，用纯化水洗至中性，再分别用0.5MNaOH浸泡，搅拌，过滤，再用纯化水洗至中性。
3.2.1.3将树脂滤干，用0.05MTris-HCl缓冲液(pH7.5)反复平衡到pH7.5后，用缓冲液浸没，待用；
3.2.1.4将上述平衡好的树脂装入柱内，柱装好后，再用0.05MTris-HCl（pH7.5）缓冲液走柱，以流出液的pH近7.5为标准。
3.2.2上样
3.2.2.1将协和干粉按1：100倍比例溶解于0.05MTris-HCl（pH7.5）缓冲液中搅拌溶解；
3.2.2.2上样，流速控制在50-60ml/min。
3.2.3洗涤
上样结束后，用0.05MTris-HCl（pH7.5）缓冲液洗涤至流出液OD值在0.25以下，流速控制在60ml/min左右。
3.2.4洗脱
用0.2MTris-HCl缓冲液（pH7.5）洗脱，流速控制在70ml/min左右，洗脱至流出OD值在0.35以上，滴加乙醇变浑浊后，开始收集流出液，直到OD值在0.35以下，停止收集流出液。
3.2.5沉淀
计量流出收集液体积，转入桶内，加入5倍量（V/V）95%乙醇，搅拌均匀，然后静置。
3.2.6干燥
3.2.6.1弃去桶内的上清液，沉淀物离心，弃去上清液；
3.2.6.2沉淀物用适量的无水乙醇脱水，离心弃去上清液，重复二次；
3.2.6.3最后，将沉淀物用五氧化二磷干燥即得HMG精品0.9g。
4、注射级HMG提取
4.1取精品HMG加入22.5ml纯化水，搅拌溶解。
4.2溶解液加22.5ml乙醇，再加8%的醋酸铵溶液3.6ml，搅拌充分
4.3在不断搅拌下分别加入11ml的0.2M磷酸钠溶液，11ml的0.3M醋酸钙溶液。
4.4用5M氢氧化钠溶液调pH至8.5，搅拌2小时，离心取上清液。
4.5上清液用5M盐酸调pH至6.5-7.0，加280ml95%乙醇，静置，离心弃去上清液，沉淀物用无水乙醇洗涤，再离心弃去上清液，沉淀物用五氧化二磷干燥即得注射级HMG0.85g。
照《中国药典》二部，2010，第378页，尿促性素质量标准，产品符合要求。照附录XIE,XIIM测得LSH,LH效价分别为584iu/mg和548iu/mg，HMG效价达到500iu/mg以上。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。