技术领域
本发明是关于通式(I)所示的N-(2-芳基-丙酰基)-磺酰胺在制备治疗 脊髓损伤药物中的用途，
其中
R2是芳基，
R是直链或支链C1-C6烷基、三氟甲基、环已基、邻-甲苯基、3-吡啶 基、2-吡啶基-乙基、对-氰基-苯甲基、对-氨基苯甲基、3-氰基-1-丙基、4- 氨基丁基、烷氧基乙烯基CH3-(CH2)ni-(OCH2CH2)mi基，其中ni是0或1， mi是1-3的一个整数、或基团P1P2N-CH2-CH2，其中P1和P2各自是H、 C1-C3烷基、苄氧基-羰基、α-，β-或α吡啶并羰基、羧基羰基或烷氧羰 基羰基、或当P1、P2连接N原子时它们与N原子相连形成苯二甲酰亚氨基、 哌啶子基、吗啉代残基；
R’是H或直链或支链C1-C3烷基，优选氢。
发明背景
脊髓损伤(SCI)是神经学和医学上最令人沮丧的疾病之一。绝大多 数SCI病人是年轻人，严重损伤的大多数存活者面临康复有限和永久性残 疾的前景。SCI新病例的发生率高，美国每年新发生的截瘫或四肢瘫痪病 例超过12000人(Sekhon等，Spine 26：S2-S12，2001)。随着治疗的改进，SCI 的病死率稳定下降。结果仅美国SCI残疾病人数现已接近200,000。目前 特别需要有效的紧急干预来限制永久损伤的病人数目和给予新受伤者真 正的希望。
当前SCI治疗局限于高剂量糖皮质激素治疗，此法只用于损伤后数小 时内给药(Bracken M B等，The England Journal of Medicine. 322：1405-11，1990)。类固醇发挥其适中有效作用的机制仍不清楚，虽然它 们一般能促进对脂质过氧化的保护作用。甲基强的松的确能通过抑制受损 脊髓中的脂质过氧化而抑制膜和神经微丝的破裂(Braughler J M等，J Neurosurg 67：102-05，1987)。尽管高剂量糖皮质激素治疗有很多缺点，但仍 是SCI唯一可得到的治疗方法。
现知SCI的病理发生涉及细胞因子，特别是肿瘤坏死因子(TNF)，其 表达导致SCI后神经死亡(Beattie M S等，Progress in Brain Reseach 137：37-47，2002)和白细胞浸润。SCI导致的原发性损伤特征是神经和血管 结构破坏，和继发性级联反应共同导致组织的额外损伤。认为以活化的小 神经胶质细胞和白细胞聚集为特征的创伤后炎症促进了继发的病理改变 (Mautes A E M等，Physical Therapy 80：673-87，2000)。阻断中性白细胞或 巨噬细胞流入和抑制损伤脊髓中巨噬细胞吞噬和分泌活性为目标的策略 导致了神经保护作用和运动功能改善(古Giulian D等，Ann Neurol 27：33-42，1990；Taoka Y等，Neuroscience 78：1177-82，1997)。
的确，按照现有的知识，选择性抑制白介素-8(CXCL-8)诱导的趋化 性不能充分保护SCI。事实上，科学文献已鉴定到参与SCI病因的许多因 子，其中因子CXCL-8不能肯定是最重要的因子之一：例如Taoka等(Journal of Neurotrama 18：533-43，2001)报道给予抗P-选择素单克隆抗体作为 白细胞粘附特异性阻断剂来抑制白细胞的募集，显著降低了SCI后观察到 的运动失调。此外，近年研究证明，在长期SCI病人中，炎症介导剂，包 括自介素-2、白介素-6、可溶性白介素-2受体和胞内粘附分子-1(ICAM-1) 的血浆水平升高，这些可能是功能恢复缓慢的病理因素(Segal J L等，Arch Phys Med Rehabil 78：44-47，1997)。美国专利US 2001/0016195公开了用拮 抗剂(如抗各种细胞因子包括IL-1、IL-6和IL-8的抗体)治疗许多不同的 疾病，包括SCI。该文献并未将SCI与IL-8抑制相联系。随后从该文献资 料中得出，炎症应答反应(或至少白细胞募集)的特异性抑制剂看来是抑 制SCI所必须的。
通式(I)的N-(2-芳基-丙酰基)-磺酰胺已公开于EP 1123276和欧洲专 利申请EP 04101202.2中。据报告文中所述的磺酰胺可用于例如预防和治 疗炎症部位多形核中性白细胞(PMN白细胞)募集加剧所导致的组织损伤。
发明内容
本发明人令人惊奇地发现所述的通式(I)磺酰胺，特别是下式(Ia) 所示的磺酰胺能有效保护免发生SCI的脊髓功能损伤，
其中，R代表1-3个取代基，可以相同或不同地选自：氢、卤原子、 C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、羟基、C1-C7酰氧基、氰基、硝基、氨基、C1-C3酰氨基、卤代C1-C3烷基、卤代C1-C3烷氧基、苯甲酰基、4-(2-甲基-丙 基)-苯基、3-苯氧基-苯基、2-[4-(1-氧代-2-异二氢吲哚基)苯基]、5-苯甲酰 基-噻吩-2-基、4-噻吩酰基-苯基、C1-C2-卤代烷基磺酰氧基。
通式(Ia)化合物中，R较佳为代表氢、4-异丁基、3-苯甲酰基、4- 三氟甲磺酰氧基。
在大鼠实验模型中已证明(详述见后)，采用两种代表性通式(I)化 合物，即通式(II)化合物及其赖氨酸盐(L-赖氨酸或DL-赖氨酸)和通 式(III)化合物，能保护免受SCI的功能损伤。这两种化合物被发现在体 内模型中活性均很高。
(R)-布洛芬甲磺酰胺 R-2-[(4’-三氟甲磺酰氧基)苯基]
-N-甲磺酰基丙酰胺
通过对创伤后空洞延伸和少突神经胶质细胞凋亡及白细胞浸润的评 价，通式(II)化合物和通式(III)化合物也减少了组织损伤。
本发明通过以下实施例进行阐述。
附图说明
图1所示为(R)-布洛芬甲磺酰胺对大鼠在SCI后不同时间功能恢复 (运动评分)的作用。
图2所示为R-2-[(4’-三氟甲磺酰氧基)苯基]-N-甲磺酰基丙酰胺对大 鼠在SCI后不同时间功能恢复(运动评分)的作用。
图3所示为(R)-布洛芬甲磺酰胺皮下连续灌注后对大鼠功能恢复的 作用，其中该化合物的灌注速度为2.5mg/kg/h或5mg/kg/h或10mg/kg/h， 直至SCI后14天。
图4所示为(R)-布洛芬甲磺酰胺皮下连续灌注后对大鼠功能恢复的 作用，其中该化合物在SCI后24小才开始给予，灌注速度为10mg/kg/h， 直至SCI后14天。
具体实施方式
实施例
将体重240-260g的成年Sprague-Dawley大鼠(雌)在标准饲养条件 (22±2℃，65％湿度、6点至20点人工光照)下的动物设施中进行饲养。 自由进食标准的干食料和水。
按前述报导(Gorio A等，Proc Natl Acad Sci USA 99：9450-9455，2002)， 给大鼠进行SCI。损伤装置用计算机控制，不受重力影响。施加的力为每 秒1N。
SCI后24小时、4、7、11、15、19和27天，进行“自由活动试验” 评价后肢残疾的恢复。
“自由活动试验”可检测脚的定位感和关节转动。功能恢复的质量按 照俄亥俄大学开发的“BBB评分”定量表示。该试验通过观察大鼠后肢在 无障碍的自由开放空间中的运动评定该肢体的自由运动缺陷：
0分：受损大鼠二后肢不能活动
1分：髋或膝关节有少许运动，
2-6分：三个关节的伸展运动逐渐有所进展
7分：三关节活动良好
8分：动物行走不用跖肌支撑体重，
9-11分：动物从偶尔到逐渐地经常性用跖肌支撑体重行走
12分：行走时前肢和后肢偶尔协同
13-14分：前肢渐进地协同运动
15分：行走时始终用跖肌支撑体重，动作协同；向前运动时脚趾偶尔 有活动
16-18分：脚趾活动倾向是渐进的，行走时脚与身体主要处于平行状 态
19分：行走时脚的位置与身体为正确的平行状态，尾保持在低处
20分：运动时侧向摇摆和不稳
21分：正常状态
SCI后28天采用末端脱氧核苷酸基转移酶介导的dUTP和标记 (TUNEL)方法，测定脊髓薄束和楔束(距离挫伤部位神经束突出部3mm) 水平上少突神经胶质细胞的凋亡。
用CD68阳性细胞定量测定SCI后一天和七天的白细胞浸润。
SCI后28天用经典组织学技术进行创伤后脊髓空洞延伸。
考虑设立以下动物实验组：
组1(n＝28)SCI后用盐水溶液治疗的大鼠，
组2(n＝28)SCI后用通式(II)化合物治疗的大鼠，
组3(n＝28)SCI后用通式(III)化合物治疗的大鼠。
SCI后30分钟内静脉注射(15mg/kg)，以后6小时内每2小时皮下 注射盐水或通式(II)化合物治疗动物，第二天起每天上午8点和下午5 点皮下注射治疗动物直到SCI第七天。SCI后30分钟内静脉注射(8mg/kg)， 然后24小时内皮下注射通式(III)化合物治疗动物，第二天后每36小时 皮下注射治疗动物直到SCI第七天。
此外，评价了通式(II)化合物皮下连续灌注治疗对后肢残疾恢复的 效力。在大鼠皮下植入灌注泵。在肩胛骨之间皮肤作小切口，采用止血剂， 撑开皮下结缔组织形成一个袋，将泵插入此袋中使流速调节器背向切口。 用伤口夹钳闭合皮肤切口。SCI后24小时、4、7、11、14、24和27天评 价功能恢复情况。考虑设立以下动物实验组：
组1(n＝8)SCI后30分钟内开始皮下灌注盐水溶液治疗的大鼠，
组2(n＝8)SCI后30分钟内开始用通式(II)化合物治疗的大鼠， 灌注速度2.5mg/kg//h，
组3(n＝8)SCI后30分钟内开始用通式(II)化合物治疗的大鼠，灌 注速度5mg/kg/h，
组4(n＝8)SCI后30分钟内开始用通式(II)化合物治疗的大鼠，灌 注速度10mg/kg/h，
组5(n＝8)SCI后24小时开始用通式(II)化合物治疗的大鼠，灌注 速度10mg/kg/h，
动物用盐水或通式(II)化合物皮下灌注治疗直到SCI后第七天。
用ANOVA按Dunnett的t检验分析数据。P＜0.05有统计学意义。
结果
评价了SCI后不同时间以“BBB评分”定量表示的通式(II)化合物 和通式(III)化合物对功能恢复(运动评分)的作用。图(1)是(R)- 布洛芬甲磺酰胺的作用，图(2)是R-2-[(4’-三氟甲磺酰氧基)苯基]-N- 甲磺酰基丙酰胺的作用。所有进行SCI的动物在创伤后立即受到深度累及 (所有组运动评分为0)，载体(盐水)治疗组直到SCI后第七天未见明显 恢复。用通式(II)化合物和通式(III)化合物治疗显著促进了SCI后的 后肢功能恢复。这种恢复是进行性的，在SCI后第4-11天之间最有效。
用免疫组织学方法评价了SCI后一天和七天时白细胞的浸润。如表1 所示，通式(II)化合物在SCI后24小时和七天显著地减少了白细胞浸润 (抑制率80％)。用通式(III)化合物治疗的大鼠也观察到白细胞募集的 类似抑制作用(数据未显示)。
人们熟知少突神经胶质细胞的凋亡是脊髓创伤后早期的重要病变，神 经学恢复的延伸也取决于如何逆转或减弱此过程。少突神经胶质细胞死亡 引起病灶中遗留的神经轴突脱髓鞘，导致其不能传导电脉冲通过病损部 位。利用药物来减轻少突神经胶质细胞凋亡是促进SCI后恢复的任何药物 治疗的主要目标。如表2所示，在SCI后28天测定，用通式(II)化合物 和通式(III)化合物治疗，阻断了少突神经胶质细胞的凋亡[用(R)-布洛 芬甲磺酰胺和R-2-[(4’-三氟甲磺酰氧基)苯基]-N-甲磺酰基丙酰胺治疗大 鼠后分别抑制了85％和65％]。
最后，研究了通式(II)化合物和通式(III)化合物对SCI诱导的组 织损伤的作用。如表3所示，SCI后28天用上述两种化合物治疗显著减少 了病损部位的组织损伤和创伤后脊髓空洞的扩展。
接着我们评价了通式(II)化合物皮下连续灌注后对功能恢复的作用。 如图(3)所示，用通式(II)化合物以5mg/kg/h或10mg/kg/h的灌注速度 治疗直至SCI后14天的评估，表明它们显著促进SCI后后肢功能的恢复。 此外，通式(II)化合物以10mg/kg/h的灌注速度皮下灌注给药显著促进 了后肢功能的恢复，即使在SCI后24小时才开始给予化合物。如图(4) 所示，这种恢复进展最有效的时期在SCI后7-14天之间。
结论是，以上报告的数据清楚证明在医疗实践中，通式(II)化合物 和通式(III)化合物可优选用于促进SCI后的功能恢复。
表1浸润白细胞的数量(平均值±SE；n＝8) SCI后时间 第一天 第七天 盐水 通式(II)化合物 盐水 通式(II)化合物 病灶中心 125±36 24±3*** 235±54 19±3*** 病灶周围 56±13 3±1*** 99±32 4±2***
***P＜0.001 (R)-布洛芬甲磺酰胺治疗的动物与盐水治疗动物相比。
表2少突神经胶质细胞凋亡细胞核的数量(平均值±SE；n＝12) 治疗 盐水 14.9±2 (R)-布洛芬甲磺酰胺 2.1±1.2* R-2-[(4’-三氟甲磺酰氧基)苯基]-N-甲磺酰基丙酰胺 5.2±3.8*
*P＜0.05和***P＜0.001 药物治疗动物与盐水治疗动物相比。
表3 病灶部位遗留组织的百分比(平均值±SE；n＝12) 治疗 病灶中心 空洞体积 盐水 39.8±3.9 46.6±3.1 (R)-布洛芬甲磺酰胺 48.9±3.0** 58.2±2.9** R-2-[(4’-三氟甲磺酰氧基)苯基]-N-甲磺酰 基丙酰胺 49.7±4.2** 60.4±4.36**
**P＜0.01药物治疗动物与盐水治疗动物相比。
可采用“雷明顿药物科学手册”Mack Publishing Co.，New York，18版， 1990中所述的常规技术和赋形剂制备用于治疗目的的合适的药物组合物。
鉴于所治疗疾病的紧急特性，本发明的组合物优选经肌肉内、静脉内 以整量给药，但不排除其它给药途径，如口服途径。
平均日剂量取决于各种因素，如疾病的严重程度和病人状况(年龄、 性别和体重)。该剂量一般在每日1毫克或数毫克到1500毫克化合物不等， 任选分成多个剂量给予。由于本发明化合物毒性低也可给予较高剂量，甚 至作长时间治疗。