小麦耐盐、抗旱基因TAWRKY79及其应用.pdf

本发明属于基因工程技术领域，涉及小麦耐盐、抗旱WRKY转录因子基因TaWRKY79的克隆及其应用。本发明公开了一种小麦耐盐、抗旱WRKY转录因子基因TaWRKY79及其在培育耐盐、抗旱植物中的应用。实验证明，本发明所述转基因植株的耐盐、抗旱能力明显提高。本发明的基因在培育耐盐、抗旱植物（特别是作物）中具有重要作用。

1.   一种小麦耐盐、抗旱基因TaWRKY79，其特征在于：所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.   如权利要求1所述的一种小麦耐盐、抗旱基因TaWRKY79，其特征在于：所述转录因子基因编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

3.   如权利要求1所述一种小麦耐盐、抗旱基因TaWRKY79在培育耐盐、抗旱植物中的应用。

4.   如权利要求3所述的一种小麦耐盐、抗旱基因TaWRKY79的应用，其特征在于：所述植物是普通小麦、玉米和水稻。

小麦耐盐、抗旱基因TaWRKY79及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及小麦耐盐、抗旱WRKY转录因子基因TaWRKY79的克隆及其应用。
背景技术
近年来土壤盐渍化及水资源短缺是制约农业生产的一个全球性问题。盐害与干旱不仅严重影响植物的生长发育，造成作物减产，而且使生态环境日益恶化（Saibo et al., Annals of Botany, 2009, 103 (4):609‑623）。因此，提高作物的抗旱和/或耐盐能力已经成为现代作物育种工作急需解决的关键问题之一。分离克隆耐盐基因，培育耐盐新品种已成为全世界的研究热点之一。小麦是重要的农作物，克隆耐盐、抗旱基因，培育耐盐、抗旱小麦新品种已成为当前一个十分迫切的任务。
目前利用基因工程技术开展植物耐盐、抗旱方面的研究已取得了较大的的进展。一些实验表明，将植物本身以及其他生物中与耐盐相关的基因转入植物中，可以使转基因植物的抗盐能力提高(Chinnusamy et al., Crop science, 2005, 45:437‑448.)。
转录因子在基因表达和环境胁迫响应中起着关键的调控作用。目前，已发现了一些能显著提高植物耐盐能力的转录因子。研究表明，将这些基因转化到植物中，可以明显提高植物的耐盐能力 (Nakashima K., Plant Physiology, 2009, 149: 88–95.)。
WRKY是一个转录因子家族，其成员广泛参与植物的正常生长发育和对各种环境胁迫的响应过程。转基因研究实验表明过表达一些WRKY转录因子基因可提高转基因植株的耐盐和耐旱性。例过表达大豆的GmWRKY54基因可使转基因拟南芥的耐盐和耐旱性提高(Zhou et al., Plant Biotechnology Journal, 2008,6,486‑503.)。将大麦的HvWRKY38转入牧草可提高转基因牧草的生物量和耐旱性(Xiong et al., Molecular Breeding, 2010, 25: 419–432.)。AtWRKY25、AtWRKY33过表达拟南芥也增加了对盐胁迫的耐受性。目前有关小麦WRKY转录因子在耐盐方面的研究还非常有限，Niu et al研究表明过表达TaWRKY2和TaWRKY19可提高转基因拟南芥的耐盐和耐旱性(Niu et al., Plant cell and environment, 2012)。进一步克隆小麦耐盐、旱相关基因，通过基因工程培育小麦耐盐、耐旱新品种非常重要。
发明内容
本发明的目的在于，提供了一种首次从小麦中分离出一个耐盐、抗旱的WRKY转录因子基因，命名为TaWRKY79。将该基因连接到过表达载体pCAMBIA super 1300上，利用农杆菌浸染法转化拟南芥，获得的转基因拟南芥植株的生物量、耐盐性、抗旱能力均比未转基因对照植株提高。
本发明的技术方案为：一种小麦耐盐、抗旱基因TaWRKY79，TaWRKY79基因的cDNA序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
   本发明小麦耐盐、抗旱基因TaWRKY79的制备方法：首先根据小麦的基因芯片表达谱数据选出在小麦幼苗根中受盐胁迫显著上调表达的WRKY转录因子基因（探针），然后根据探针序列设计基因特异性引物，进一步从小麦根的全长cDNA文库中克隆其全长cDNA，最后构建过表达载体转化到拟南芥中进行功能研究。
1．引物设计
根据芯片探针序列设计基因特异性的下游引物Wrky1‑1:5′‑GCTGCATCCACTCTAGAATGTCG‑3′，与文库的5′端锚定引物NT3：5’‑ACTAAAGggaACAAAAGCTGG AG‑3’进行配对，以小麦幼苗根的全长cDNA文库为模板扩增基因的全长cDNA。
2．PCR 反应体系（50μL）及程序
2×GC bufferⅠ          25μl
模板cDNA文库          1ul
dNTPs（10mM each）    1μl
Primer1 (10μM)          1μl
Primer2(10μM)           1μl
LA Taq(TaKaRa)        0.5ul
ddH₂O                 加至终体积50μl
94℃ 预变性3min；94℃变性45sec，58℃复性1min，72℃延伸2min，循环35 次；72℃延伸5min。
3．1％琼脂糖凝胶电泳
PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后发现在1000bp处有一条目的条带（图1）。
4．扩增片段的回收、与T载体的链接
对扩增条带采用Tiangen公司的琼脂糖胶回收试剂盒，步骤按说明书进行。PCR产物与pGEM‑T (Promega)载体连接，连接体系为：
       回收的PCR产物                 7µl
10×T4连接酶缓冲液              1µl
pGEM‑T载体(50ng/μl)            1µl
T4DNA连接酶（3U/μl）(Takara)   1µl
于4℃冰箱连接过夜。
5．回收片段的克隆与测序
用CaCl₂法制备大肠杆菌DH5a（购自天为时代生物公司）感受态细胞，42℃水浴热激法进行转化。向转化后培养1h的菌液中加入X‑gal和IPTG，混匀，用涂布器将其均匀涂到含有氨苄青霉素的平板上，37℃恒温倒置培养过夜，待出现明显单菌落时将平板拿出。
根据所用pGEM‑T载体克隆位点两端的T7启动子和SP6启动子序列设计通用引物T7，SP6对重组克隆进行PCR鉴定。
PCR程序：94℃ 预变性10min；94℃变性1min，58℃复性1min，72℃延伸1min，循环35 次；72℃延伸5min；
PCR扩增产物用1％琼脂糖电泳检测，取阳性克隆的菌液送公司进行测序。测序结果见SEQ ID No.1。
本发明还提供小麦耐盐、抗旱基因TaWRKY79在培育耐盐、抗旱植物中的应用。尤其是在普通小麦、玉米和水稻植物中的应用。
本发明的有益效果是：本发明首次克隆得到了小麦WRKY转录因子基因TaWRKY79，将该基因连接到过表达载体pCAMBIA super 1300上，利用农杆菌浸染法转化拟南芥，获得的转基因拟南芥植株的生物量、耐盐性、抗旱能力均比未转基因对照植株明显提高。
附图说明
图1 TaWRKY79基因全长cDNA 序列的扩增结果。M：DNA分子量marker。
图2  不同处理条件下TaWRKY79基因在小麦山融3号幼苗根和叶中的RT‑PCR表达分析。TaActin为内参；leaf：叶；root：根。
图3 构建的植物表达载体pCAMBIA‑super1300/TaWRKY79的酶切验证结果。
图4 转基因拟南芥的PCR鉴定。1，2，6：不同的转基因拟南芥株系，Col‑0野生型拟南芥。
图5 转基因拟南芥株系的表型鉴定。
A、B：正常生长条件下对照和转基因株系的表型。 
C：不同处理条件下植株的表型。
D‑H：不同处理条件下对照及转基因株系植株根长统计结果。
I：野生型拟南芥和TaWRKY79转基因拟南芥不同株系干旱2周、复水3天后的表型。
具体实施方式
实施例1、TaWRKY79基因cDNA序列的克隆
1．引物设计
根据芯片探针序列设计基因特异性的下游引物Wrky1‑1:5′‑GCTGCATCCACTCTAGAATGTCG‑3′，与文库的5′端锚定引物NT3：5’‑ACTAAAGggaACAAAAGCTGG AG‑3’进行配对，以小麦幼苗根的全长cDNA文库为模板扩增基因的全长cDNA。
2．PCR 反应体系（50μL）及程序
2×GC bufferⅠ          25μl
模板cDNA文库          1ul
dNTPs（10mM each）    1μl
Primer1 (10μM)          1μl
Primer2(10μM)           1μl
LA Taq(TaKaRa)        0.5ul
ddH₂O                 加至终体积50μl
94℃ 预变性3min；94℃变性45sec，58℃复性1min，72℃延伸2min，循环35 次；72℃延伸5min。
3．1％琼脂糖凝胶电泳
PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后发现在1000bp处有一条目的条带（图1）。
4．扩增片段的回收、与T载体的链接
对扩增条带采用Tiangen公司的琼脂糖胶回收试剂盒，步骤按说明书进行。PCR产物与pGEM‑T (Promega)载体连接，连接体系为：
       回收的PCR产物                 7µl
10×T4连接酶缓冲液              1µl
pGEM‑T载体(50ng/μl)            1µl
T4DNA连接酶（3U/μl）(Takara)   1µl
于4℃冰箱连接过夜。
5．回收片段的克隆与测序
用CaCl₂法制备大肠杆菌DH5a（购自天为时代生物公司）感受态细胞，42℃水浴热激法进行转化。向转化后培养1h的菌液中加入X‑gal和IPTG，混匀，用涂布器将其均匀涂到含有氨苄青霉素的平板上，37℃恒温倒置培养过夜，待出现明显单菌落时将平板拿出。
根据所用pGEM‑T载体克隆位点两端的T7启动子和SP6启动子序列设计通用引物T7，SP6对重组克隆进行PCR鉴定。
PCR程序：94℃ 预变性10min；94℃变性1min，58℃复性1min，72℃延伸1min，循环35 次；72℃延伸5min；
PCR扩增产物用1％琼脂糖电泳检测，取阳性克隆的菌液送公司进行测序。测序结果见SEQ ID No.1。
实施例2、不同处理条件下TaWRKY79 基因的表达分析
1．材料处理
小麦山融3号的种子室温萌发，1周后去掉胚乳，用Hangload液体培养基继续培养1周进行胁迫处理。
盐胁迫：在Hangload液体培养基中添加NaCl 至终浓度为200mM；
渗透胁迫：培养基中添加PEG至终浓度为18％；
ABA处理：培养基中添加ABA至终浓度为100μM；
4℃冷处理：将液体培养的小麦幼苗移至4℃光照培养箱培养；
不同条件下处理0、0.5、3、12、24，48小时后分别取幼苗的叶片和根系，提取各种材料的总RNA。
2．小麦总RNA提取
Trizol法提取RNA。1%Agrose凝胶电泳检测提取的RNA质量，紫外分光光度计检测提取的RNA浓度。
3．第一链cDNA的合成
   采用PrimeScript^TM RT‑PCR Kit，反应步骤按操作手册进行。
4．RT‑PCR 反应及电泳
1．以cDNA 为模板，进行PCR 反应。引物如下
TaAct‑S: 5′‑ GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC ‑3′
TaAct‑A: 5′‑ GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC ‑3′
WRKYrt‑1: 5′‑AAGGCTCTGGCGGCAGGAAG‑3′
WRKYrt‑2: 5′‑GCTGCATCCACTCTAGAATGTCG‑3′
2．PCR 体系
ddH₂O                      4.7μl
10× buffer                   2μl
Primer1（2μM）             1μl
Primer2（2μM）             1μl
dNTP（10mM each）        0.2μl
rTaq polymerase（5U/μl）    0.1μl
逆转录cDNA 模板           1μl
Total Volume               10μl
3．PCR 程序
94℃ 5min；根据基因表达量不同设置25～30 cycles，94℃ 20s，57℃ 60s，72℃ 45s；72℃ 5min。
4．1％琼脂糖凝胶电泳。结果见图2。
实施例3、TaWRKY79过表达植物表达载体的构建
植物表达载体pCAMBIA‑super1300是含有35S 启动子和NPTⅡ基因的双元载体，在其多克隆位点上含有限制性内切酶XbaI位点。根据基因TaWRKY79的cDNA序列，设计包含完整ORF的基因特异性引物Wrkyo5: 5′‑GCTCTAGAATGGACGAGCAGTGGATGATC‑3′(XbaI) 和 Wrkyo3:5′‑GCTCTAGACGCTCGCTTGATCAACTATCG‑3′(XbaI)。用该对引物扩增TaWRKY79的cDNA序列。然后用限制性内切酶XbaI酶切载体pCAMBIA‑super1300和扩增的目的基因TaWRKY79序列。完全酶切的载体和目的基因经1%琼脂糖凝胶电泳分离后回收，连结，转化大肠杆菌DH5α，PCR检测阳性克隆，提取阳性克隆的质粒，酶切验证插入方向的正确性，构建获得植物表达载体pCAMBIA‑super1300/TaWRKY79。步骤如下：
（1） 质粒pCAMBIA‑super1300空载体和目的基因片断XbaI单酶切
酶切体系如下：
XbaI                          2 μl
pCAMBIA‑super1300载体       
(或目的基因片段)              10 μl
10×Buffer M                   2 μl
ddH₂O To                     40 μl
于37℃恒温水浴锅酶切3 小时以上。
（2）酶切产物的电泳与回收
酶切完成后，以1×TAE 为电泳缓冲液，将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。在紫外透射仪下用洁净刀片切下经酶切的pCAMBIA‑super1300载体大片段和目的基因片段，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带。
（3） 连接
    经酶切的pCAMBIA‑super1300载体片段和目的基因片段以摩尔比1:4 的比例进行4℃连接过夜。
（4） 转化
连接产物热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化菌在含Kan 50μg/ml 的LB 固体平板上37℃培养16 小时左右。
（5） 重组子的鉴定
PCR检测阳性克隆，提取质粒，选择基因内的BamHI单酶切位点和载体上的BamHI酶切位点对质粒进行单酶切鉴定目标片段插入方向。酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，根据切下的目的条带的大小判断目的基因插入载体中的方向，选取正向插入克隆的质粒，完成载体构建（图3）。将构建好的载体pCAMBIA‑super1300/TaWRKY79转化农杆菌菌株GV3101，转化拟南芥进行基因功能分析。
实施例4、基因的功能分析——拟南芥转化、筛选及表型分析
（1） 拟南芥的种植
将野生型拟南芥种子用7.5%次氯酸钠溶液（包括7.5%次氯酸钠和0.01% Triton‑X 100）消毒15分钟，然后用无菌水漂洗5‑6次，点播于MS平板上，于4°C 春化2‑3天。然后移植到营养钵中（营养土与蛭石按等比例混合），23°C 培养，16/8 h 光周期，光强30‑40μmol•m‑2 • s‑1；待植株开花后，剪去其主枝顶端，促进侧枝发展。在剪枝后的4‑6 天内，进行农杆菌转化。
（2） 拟南芥转化
把200 ml 菌液倒入浅盘中。将修剪好的拟南芥倒扣并使所有花序浸入悬浮菌液中，轻轻搅动沾花30 sec‑1 min。取出花盆侧放于托盘中，用保鲜袋包裹以保湿。将托盘置暗处培养24 h。然后取出营养钵并直立放置，恢复光照，继续培养植株至成熟。
（3） 阳性植株的筛选：T0 代种子用7.5%次氯酸钠溶液（包括7.5%次氯酸钠和0.01% Triton‑X100）消毒后，点播在MS选择培养板(30 mg/L 潮霉素)上。于4℃下春化2‑3天。移入培养室中培养。大约10天左右，挑选潮霉素抗性植株（长出真叶1‑2 对，根伸长至培养基中）并移栽到营养钵中。培养直至种子成熟。同样方法筛选T1 代种子得到T2 代植株。并在T2 代植物中挑选抗性比为3:1 的单拷贝插入独立株系，并获得纯合T3代株系进行转基因拟南芥的分子检测和表型鉴定。
（4） 转基因拟南芥的PCR鉴定
   拟南芥基因组DNA的提取
CTAB法提取野生型和转基因拟南芥株系的基因组DNA。
扩增
以上面提取的拟南芥基因组DNA 为模板，用基因特异性引物Wrkyo5，Wrkyo3（序列同实施例3）进行PCR扩增。
PCR 体系及程序同实施例1。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到在转基因拟南芥植株中扩增出一条1000bp左右的目的条带，在未转基因对照植株中未见扩增条带（图4）。 
 （5）转基因拟南芥的表型鉴定
  ①拟南芥的种植
   T3代单拷贝纯合拟南芥株系的种子用7.5%次氯酸钠溶液（包括7.5%次氯酸钠和0.01% Triton‑X 100）消毒15分钟，然后用无菌水漂洗5‑6次，点播于MS平板上，于4°C 春化2‑3天，然后移植到营养钵中（营养土与蛭石按等比例混合），23°C 培养，16/8 h 光周期，光强30‑40μmol•m‑2 • s‑1。
  ②胁迫处理
将萌发5天的拟南芥幼苗（对照及转基因株系）小心移栽到营养土中，或转移到分别含有100mM NaCl、100mM甘露醇、10mM LiCl、2μM ABA、0.75μM NAA和对照MS培养基平板上，竖直培养一周观察表型。结果表明：正常培养条件下TaWRKY79转基因拟南芥比未转基因对照具有较好的生长势，生物量增加 （图5A, B）。在不同处理条件下，转TaWRKY79基因的拟南芥植株的根系明显长于未转基因对照株系（图5C‑H）。
干旱处理：将萌发一周的拟南芥幼苗（对照及转基因株系）移载至培养土中，培养1周后开始控水（不浇水）干旱处理。干旱处理2周后观察表型。结果表明干旱处理2周后，未转基因的对照拟南芥植株开始萎蔫，而转化TaWRKY79外源基因的拟南芥植株长势旺盛(图5 I)。复水处理3天后再次观察表型，发现转化TaWRKY79基因的拟南芥植株长势良好，抽薹开花，生长明显好于未转基因对照植株（图5 I）。