一组新型的 HRP5 类似物及其制备方法 技术领域 本发明属于医药领域， 具体而言涉及一组新型的具有广谱抗菌活性的 HRP5 类似 物及其制备方法。
背景技术 自从青霉素发现以来， 抗生素一直是人类治疗病原微生物感染的有力武器， 但 随着传统抗生素的滥用， 越来越多的病原菌开始对传统抗生素产生耐药性， 所以急需寻 找 - 类全新的抗菌药物来替代抗生素进行使用。
阳离子抗菌肽 (cationic antimicrobial peptides) 是植物和动物产生的一般由 12-50 个氨基酸残基组成的阳离子型 ( 富含精氨酸及赖氨酸 ) 多肽， 能够保护宿主不受外界 病原微生物感染。阳离子抗菌肽的抗菌谱比传统抗生素宽， 来自昆虫、 猪、 蛙以及人的阳离 子抗菌肽不仅对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌有抗菌作用， 而且还具有抗真菌及抗病毒活 性。 传统抗生素通过消除微生物生长或生存必不可少的条件， 如使酶变性， 来达到杀菌的目 的， 但细菌只要一种基因突变后就可以抵抗此类抗生素的攻击。而阳离子抗菌肽则通过中 和电荷的方法与细菌细胞膜相互作用， 以此穿透杀死细菌， 极大地减少了细菌产生耐药性 的可能。 但天然的阳离子抗菌肽并非完美无缺， 部分抗菌肽对真核生物有一定的毒性， 对病 原物高杀灭活性的同时往往伴随着对真核生物的溶血作用。 因此如何提高其活性并最大程 度降低其毒性是目前抗菌肽药物开发的难点和希望所在。目前的研究主要将 α- 螺旋的两 性抗菌肽作为研究对象， 围绕阳离子氨基酸以及疏水性氨基酸数量及位置， 对抗菌肽进行 结构改造， 如残基替换、 截取天然抗菌肽的部分序列以及增加肽链的正电荷含量等， 取得了 较大进展。
富 组 蛋 白 (histidine rich protein， HRPs 或 histatins) 是 - 类 存 在 于 灵 长类动物腮腺和颌下腺分泌物中富含组氨酸的阳离子多肽。现已分离出至少 12 种人 HRPs(HRP1-12)， 其中 HRP1、 HRP3 及 HRP5 是主要富组蛋白， 占总 HRPs 的 85％ -90％， 分别由 38， 32， 24 个氨基酸组成。HRP1 和 HRP3 由不同的基因编码， HRP5 是 HRP3 经蛋白酶水解的 产物， 包含在 HRP3 的 N 末端 24 个残基中。编码 HRP1， 3 的基因已被测序且定位于人类第 4 号染色体 q13 上。现有研究表明 ： HRPs 具有多种活跃的生物学功能， 其抗微生物作用尤为 重要， 如抑制、 杀灭变形链球菌和白色念珠菌等。
HRP5 含有 24 个氨基酸残基， 分子量为 3037D。其氨基酸序列为 Asp-Ser-His-Ala -Lys-Arg-His-His-Gly-Tyr-Lys-Arg-Lys-Phe-His-Glu-Lys-His-His-Ser-His-Arg-GlyTyr(SEQ ID NO ： 1)。Raj 等学者认为 HRP5 抗白色念珠菌的特性与其氨基酸序列有关， 他们 分别将 HRP5 及其残基片段 N16(1-16 位氨基酸 )、 C16(9-24 位氨基酸 )、 C14(11-24 位氨基 酸 )、 C12(13-24 位氨基酸 )、 C10(15-24 位氨基酸 ) 和 M10(7-16 位氨基酸 ) 分别与不同浓 度的白色念球菌作用， 检测其抗白色念球菌的能力。试验结果表明 C16 和 C14 有较强的抑 制白色念珠菌生长的能力， 而且 HRP5 与 C16 的抗白色念球菌的活性基本一致， 而同样含有 16 个氨基酸的 N16 抗白色念珠菌的活性远远低于 C16。这一结果提示 HRP5 的抗白色念珠
菌的功能区位于羧基端。为了进一步研究 HRP5 的结构和功能的关系， 许多学者通过残基替 换得到了一系列的变异体， 其中较重要的是 dhvar1、 dhvar2、 dhvar4、 dhvar5。它们是 HRP5 活性区 (11-24 位氨基酸 ) 变异体。 发明内容
多肽或其药用盐， 所述多肽具有如下氨基酸序列 ：
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Leu-Xaa11-Lys-Tyr-Leu-Ar g-Xaa16-Xaa17-Xaa18(SEQ ID NO ： 2)
其中 Xaa1 为 Cys 或缺失 ；
Xaa2 为 Lys、 D-Lys、 Arg、 D-Arg、 HoR 或缺失 ；
Xaa3 为 Leu、 Ile、 Nle、 Val、 Trp、 Phe、 D-Phe、 Thi 或缺失 ；
Xaa4 为 Lys、 D-Lys、 Arg、 D-Arg、 Aib 或 HoR ；
Xaa5 为 Lys、 D-Lys、 Arg、 D-Arg 或 HoR ；
Xaa6 为 Leu、 Ile、 Nle、 Val、 Trp、 Phe、 D-Phe 或 Thi ；
Xaa7 为 Leu、 Ile、 Nle、 Val、 Trp、 Phe、 D-Phe 或 Thi ；
Xaa8 为 Lys、 D-Lys、 Arg、 D-Arg 或 HoR ；
Xaa9 为 Lys、 D-Lys、 Arg、 D-Arg 或 HoR ；
Xaa11 为 Leu、 Ile、 Nle、 Val、 Trp、 Phe、 D-Phe 或 Thi ；
Xaa16 为 Lys、 D-Lys、 Arg、 D-Arg 或 HoR ；
Xaa17 为 Leu、 Ile、 Nle、 Val、 Trp、 Phe、 D-Phe 或 Thi ； Xaa18 为 Cys 或缺失， 当 Xaa1 与 Xaa18 同为 Cys 时， 该多肽可以形成环肽。
作为本发明的一种优选方案 Xaa1 与 Xaa18 同为 Cys 或同时缺失 ； Xaa2 优选 Arg、 D-Arg 或缺失 ； Xaa3 优选 Phe、 D-Phe 或缺失 ； Xaa4 优选 Lys、 D-Lys、 Arg、 Aib 或 HoR ； Xaa5 优选 Lys、 Arg 或 D-Arg ； Xaa6 优选 Leu、 Ile 或 Nle ； Xaa7 优选 Trp、 Phe、 D-Phe 或 Thi ； Xaa8 优选 Lys、 D-Lys 或 Arg ； Xaa9 优选 Lys、 D-Lys 或 Arg ； Xaa11 优选 Leu、 D-Phe 或 Phe ； Xaa16 优选 Lys、 D-Lys 或 Arg ； Xaa17 优选 Trp、 Phe、 D-Phe 或 Thi。
本发明所涉及的氨基酸残基既包括天然氨基酸， 也包括非天然氨基酸。本发明所 涉及的天然氨基酸所对应的三字母代码表如表 1 所示， 本发明所涉及的非天然氨基酸所对 应的三字母代码表及结构如表 2 所示。
本发明所涉及的所有氨基酸残基若不特别限定其构型， 代表 L 型氨基酸。
本发明所涉及的多肽， 既可以是线性肽， 也可以是环肽。 当 Xaa1 与 Xaa18 同为 Cys 时， 可以通过加入氧化剂使得 Xaa1 与 Xaa18 之间形成二硫键， 此时该肽由线性肽变成环肽。
本发明所涉及的多肽为线性肽时， 其 C 末端既可以是羧酸的形式， 也可以是酰胺 的形式， 优选以酰胺的形式存在。
表1： 天然氨基酸三字母代码表
表2： 非天然氨基酸三字母代码表及结构
本发明优选的一个实施方式中公开了一种线性的多肽 (AMP-1)， 其氨基酸序列为 ： Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO ： 3)
本发明另一个优选的实施方式中公开了一组线性的多肽 (AMP-2， AMP-3， AMP-4， AMP-5， AMP-6， AMP-7， AMP-8， AMP-9， AMP-10， AMP-11， AMP-12)， 其氨基酸序列分别为 ： LysArg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-D-Lys-D-Phe-NH2(SEQ ID NO ： 4)D-LysD-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-D-Lys-D-Phe-NH2(SEQ ID NO ： 5)D-L
ys-D-Arg-Leu-Phe-D-Lys-D-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-D-Lys-D-Phe-NH2(SEQ IDNO ： 6)
Phe-Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO ： 7)
Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Tyr-Leu-Arg-Arg-Phe-NH2(SEQ ID NO ： 8)
Arg-Arg-Ile-Phe-Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Tyr-Leu-Arg-Arg-Phe-NH2(SEQ ID NO ： 9)
Arg-Leu-Arg-Arg-Ile-Phe-Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Tyr-Leu-Arg-Arg-Phe-NH2(S EQID NO ： 10)
Lys-Arg-Leu-Thi-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Thi-NH2(SEQ ID NO ： 11)
Lys-Arg-Nle-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Thi-NH2(SEQ ID NO ： 12)
Aib-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Thi-NH2(SEQ ID NO ： 13)
HoR-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Thi-NH2(SEQ ID NO ： 14)
本发明的又一个优选的实施方式公开了一种环状的多肽 (AMP-13)， 其氨基酸序列 为：
本发明还有个目的就是提供上述线性及环状多肽的制备方法， 可以采用本领域技 术人员熟悉的固相化学合成技术制备线性肽以及通过双氧水氧化法在线性肽的基础上制 备环肽。
固相化学合成技术的制备步骤如下 ：
(1) 在树脂上固相合成多肽 ；
(2) 将步骤 (1) 的产物在三氟乙酸或氢氟酸中进行裂解， 优选三氟乙酸， 并加入侧 链保护基清除剂， 然后用 5-20 倍体积的冰乙醚沉淀多肽， 离心， 弃上清， 再用冰乙醚反复洗 涤沉淀 4-5 次， 真空干燥， 得到粗肽 ；
若本发明所涉及的多肽 C 末端为羧酸形式则步骤 (1) 采用 Wang 树脂进行合成 ； 若 本发明所涉及的多肽 C 末端为酰胺形式则步骤 (1) 采用 Rink Amide MBHA 树脂进行合成。
步骤 (1) 是在液相环境中进行， 具体包括 ： 浸泡树脂 - 脱除氨基保护基 - 洗涤 - 偶 联氨基酸 - 监测 - 洗涤 - 脱除氨基保护基 ( 顺序偶联剩余氨基酸 )- 干燥树脂。
其中氨基保护基是指为保护参与缩合反应的氨基而引入的化学基团。所述的氨 基保护基选自 ： 叔丁氧羰基 (Boc)、 苄氧羰基 (Z) 和 9- 芴基 - 甲基羰基 (Fmoc)， 优选 9- 芴 基 - 甲基羰基 (Fmoc)。
作为固相多肽合成技术的一个优势， 对部分氨基酸的侧链可以通过引入化学基团
进行保护， 例如 Arg 及 HoR 可以采用五甲基苯并呋喃 -5- 磺酰基 (Pbf) ； Cys 可以采用三苯 甲基 (Trt) ； Lys 及 Trp 可以采用叔丁氧羰基 (Boc) ； Tyr 可以采用叔丁基 (tBu)。所述的保 护基团不限于此， 可以根据本领域常规方案进行合理选择。
步骤 (1) 的液相环境所用溶剂选自 ： 二甲基甲酰胺 (DMF) 或二氯甲烷 (DCM)， 优选 DMF。
步骤 (1) 中脱除氨基保护基需要加入氨基保护基的脱除剂， 氨基保护基的脱除剂 选用哌啶 (PIP) 溶液， 浓度 10-40％ (PIP/DMF)， 脱除时间为 20-50min。 优选浓度为 20-25％ (PIP/DMF)， 脱除时间 25-35min。
步骤 (1) 中氨基酸的偶联需要加入偶联试剂， 偶联试剂由 ： 碳二亚胺型试剂或者 苯并三氮唑鎓盐型试剂与 1- 羟基苯并三唑 (HOBt) 组成。
碳二亚胺型试剂包括二环己基碳二亚胺 (DCC)、 二异丙基碳二亚胺 (DIC) 及 N- 二 氨基丙基 -N- 乙基碳二亚胺 (EDC)。
苯并三氮唑鎓盐型试剂包括 2-(1H- 苯并三偶氮 L-1- 基 )-1， 1， 3， 3- 四甲基脲四 氟硼酸酯 (TBTU)、 O- 苯并三唑 -N， N， N’ ， N’ - 四甲基脲六氟磷酸盐 (HBTU)、 六氟磷酸苯并三 唑 -1- 氧基三 ( 二甲氨基 ) 磷 (BOP)、 六氟磷酸苯并三唑 -1- 基 - 氧基三吡咯烷基磷 (PyBOP) 等。 偶联试剂优选二异丙基碳二亚胺 (DIC) 与 1- 羟基苯并三唑 (HOBt)、 2-(1H- 苯并 三偶氮 L-1- 基 )-1， 1， 3， 3- 四甲基脲四氟硼酸酯 (TBTU) 与 1- 羟基苯并三唑 (HOBt)， 最优 选 DIC( 二异丙基碳二亚胺 ) 与 1- 羟基苯并三唑 (HOBt)。
步骤 (1) 中的 “监测” 采用茚三酮检测法监测多肽的缩合反应。
步骤 (1) 中的顺序连接氨基酸是指根据多肽氨基酸序列从 C 端向 N 端逐个连接氨 基酸。
步骤 (2) 所述的侧链保护基清除剂是选自如茴香硫醚、 三异丙基硅烷、 苯酚、 水、 1， 2- 乙二硫醇、 间甲酚等两个或者两个以上的组合并与三氟乙酸或氢氟酸按 5-20 ％ (V/ V) 进行配制得到。优选三氟乙酸 (TFA) ∶茴香硫醚∶ 1， 2- 乙二硫醇∶ 75％苯酚∶水＝ 85 ∶ 5 ∶ 5 ∶ 4 ∶ 1。
特别有益的是为满足医药用途的质量要求， 本发明所提供的多肽制备方法还包括 采用常规手段进行纯化。所采用的纯化方法可以为反相色谱法或离子交换色谱法， 优选反 相色谱法。
本发明所涉及的多肽的体外抗菌活性可以通过测定其最低抑菌浓度 (MIC) 来鉴 定。美国临床实验室标准化委员会 (NCCLS) 推荐采用常量肉汤稀释法来测定各抗菌肽的最 低抑菌浓度 (MIC)， 培养基采用 Mueller-Hinton(MH) 肉汤培养基。以两性霉素 B、 多粘菌素 E 及万古霉素作为阳性对照。体外活性测定表明， 本发明提供的多肽对革兰氏阳性菌、 革兰 氏阴性菌及真菌均具有显著的杀菌效果， 对临床上分离的耐药性革兰氏阳性菌、 耐药性革 兰氏阴性菌及耐药性真菌同样具有显著的杀菌效果， 具有广谱、 高效的特点。 因此本发明所 涉及的多肽可以在临床上作为活性成分替代传统抗生素进行治疗。
以下实施例仅代表本发明阐述的一个方面， 不是本发明主题的局限。
具体实施方式实施例 1 ： AMP-1 的制备及纯化
序 列： Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO ： 3)
(1) 材料及试剂
Rink Amide MBHA 树脂， 取代值 0.41mmol/g。
所 需 带 保 护 的 氨 基 酸 为 Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、 Fmoc-L-Leu-OH、 Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、 Fmoc-L-Phe-OH 及 Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH。
试剂 ： HOBt、 DIC、 DMF、 哌啶。
(2) 仪器
PSI300 型多肽合成仪、 Waters600 半制备型高效液相色谱仪、 磁力搅拌器。
(3) 操作步骤 ( 以 0.25mmol 为例 )
a. 固相化学合成多肽
称取 Rink Amide MBHA 树脂 0.61g， 置于多肽合成仪的反应器中， 加入 10mLDMF， 浸 泡 2h， 然后加入 20％ PIP/DMF 溶液 15mL， 混合 30min 来脱除氨基保护剂， 用 DMF 洗涤树脂 7 次， 然后向反应器中加入 387.4mg Fmoc-L-Phe-OH、 等摩尔的偶联试剂 DIC(0.33mol/L) 与 HOBt(0.33mol/L) 进行反应， 反应温度为室温， 以茚三酮反应监测反应进程， 确保氨基酸偶 联到树脂上， 用 DMF 洗涤树脂 7 次。当第一个氨基酸偶联到树脂上后， 即可按照上述方法继 续进行下一个氨基酸的偶联反应， 如此循环， 直至全部氨基酸偶联完成。 b. 裂解及沉淀
肽合成结束后， 真空干燥树脂， 称重。按照 1g 树脂 10mL 裂解试剂的比例加入裂解 试剂， 试剂配比为 TFA ∶茴香硫醚∶ 1， 2- 乙二硫醇∶ 75％苯酚∶水＝ 85 ∶ 5 ∶ 5 ∶ 4 ∶ 1， 室温搅拌反应 3 小时， 抽滤。接着向裂解抽滤液中加入 10 倍体积的冰乙醚沉淀多肽， 离心， 弃上清， 再用冰乙醚反复洗涤沉淀 4 ～ 5 次， 真空干燥， 称重粗肽。
c. 反相色谱纯化
用制备型 HPLC， 采用反相色谱法， 纯化上述粗肽。
HPLC 条件如下 ：
色谱柱 ： XBridgeTM Prep C18 5μm OBDTM 19×150mm
流速 ： 10mL/min
检测波长 ： 210nm
流动相 ： A： 含 0.1％ TFA 水溶液
B： 含 0.1％ TFA 的乙腈
梯度洗脱程序如表 3 ：
表 3 梯度洗脱表
收集目标肽纯度大于 99％的部分， 然后 50℃减压浓缩至干。经 ESI-MS 测定， 该肽 的分子量为 1880.28， 理论值为 1880.43。
实施例 2 ： 表 4 中 HRP5 类似物的制备及纯化
(1) 材料及试剂
Rink Amide MBHA 树脂， 取代值 0.41mmol/g。
所 需 带 保 护 的 氨 基 酸 Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、 Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、 Fmoc-L-Leu-OH 、 Fmoc-L-HoR(Pbf)-OH 、 Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 、 Fmoc-D-Lys(Boc)-OH 、 Fmoc-L-Phe-OH、 Fmoc-D-Phe-OH、 Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、 Fmoc-L-Ile-OH、 Fmoc-L-Nle-OH、 Fmoc-L-Thi-OH 及 Fmoc-L-Aib-OH。
试剂 ： HOBt、 DIC、 DMF、 哌啶。
(2) 仪器
PSI300 型多肽合成仪、 Waters600 半制备型高效液相色谱仪、 磁力搅拌器。
(3) 操作步骤 ( 以 0.25mmol 为例 )
以类似实施例 1 中操作步骤 a-c 的方法制备及纯化表 4 中的多肽， 收集纯度大于 99％的部分， 然后 50℃减压浓缩至干。ESI-MS 测定值如表 4 所示。
表 4HRP5 类似物
实施例 3 ： 环肽 AMP-13 的制备及纯化
(1) 材料及试剂
Rink Amide MBHA 树脂， 取代值 0.41mmol/g。
所 需 带 保 护 的 氨 基 酸 为 Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、 Fmoc-L-Leu-OH、 Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、 Fmoc-L-Phe-OH、 Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH 及 Fmoc-L-Cys(Trt)-OH。
试剂 ： HOBt、 DIC、 DMF、 哌啶、 30％ H2O2。
(2) 仪器
PSI300 型多肽合成仪、 Waters600 半制备型高效液相色谱仪、 磁力搅拌器。
(3) 操作步骤
a. 以类似实施例 1 中操作步骤 a-c 的方法制备及纯化具有如下序列 (Cys-Lys-Ar g-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-Cys-NH2) 的多肽， 收集纯度大于 然后 50℃减压浓缩至干。经 ESI-MS 测定， 该肽的分子量为 2086.24， 理论值为 99％的部分， 2086.72。
b. 分子内二硫键的形成
称取本实施例操作步骤 a 中多肽 100.0mg， 溶于 200ml 水， 配制成浓度为 0.5mg/ml 的溶液， 加入 3.33ml 浓度为 30％的过氧化氢， 室温下搅拌反应， 用 HPLC 监测反应的进行， 直 至完全转化为氧化型。
c. 反向色谱纯化
以类似实施例 1 中操作步骤 c 的方法纯化， 收集环肽 AMP-13 纯度大于 99％的部 分， 然后 50℃减压浓缩至干。 经 ESI-MS 测定， 该肽的分子量为 2084.25， 理论值为 2084.72。
实施例 4 ： 体外抗菌活性测定
根据美国临床实验室标准化委员会 (NCCLS) 推荐的常量肉汤稀释法测定各抗菌 肽的最低抑菌浓度 (MIC)， 培养基采用 Mueller-Hinton(MH) 肉汤培养基。
具体步骤为 ：
(1) 抗菌药物贮存液制备 ：
精确配制浓度为 1280μg/mL 的上述 HRP5 类似物 AMP 1 ～ 13 和阳性对照品两性 霉素 B、 多粘菌素 E 及万古霉素。配制好的各贮存液置于 -20℃环境中保存备用。
(2) 培养基的配制 ：
称取 MH 肉汤培养基 21g， 溶于蒸馏水中并定容至 1L， 121℃高温灭菌 30min。
(3) 接种物的制备 ：
用接种环挑取形态相似待检菌落 3 ～ 5 个， 接种于 4 ～ 5mL 的 MH 肉汤中， 35℃孵 育 2 ～ 6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或 MH 肉汤校正浓度至 0.5 麦氏比浊标准， 约含 1 ～ 2×108CFU/mL。用 MH 肉汤将上述菌悬液进行 1 ∶ 100 稀释后备用。
(4) 稀释抗菌药物的制备及菌液接种 ：
取无菌试管 (13×100mm)13 支， 排成一排， 第 1 管中加入 1.6mL MH 肉汤， 第 2-13
管中各加入 1mL MH 肉汤， 然后向第 1 管加入抗菌药物原液 (1280μg/mL)0.4mL， 混匀， 接 着吸取 1mL 至第 2 管， 混匀后再从第 2 管中吸取 1mL 至第 3 管， 如此连续倍比稀释至第 11 管， 并从第 11 管中吸取 1mL 弃去， ， 然后向第 1-11 管及第 13 管中加入上述制备好的接种物 各 1mL， 使每管最终菌液浓度约为 5×105CFU/mL。第 1-11 管药物浓度分别为 128μg/mL、 64μg/mL、 32μg/mL、 16μg/mL、 8μg/mL、 4μg/mL、 2μg/mL、 1μg/mL、 0.5μg/mL、 0.25μg/ mL、 0.125μg/mL， 第 12 管为不含抗菌药物及接种物的空白对照， 第 13 管为不含抗菌药物的 阴性对照。
(5) 孵育 ： 将接种好的稀释管塞好塞子， 置 35℃普通空气孵箱中孵育 16 ～ 20h。
(6) 结果 ： 以肉眼观察， 无细菌生长的最低药物浓度即为该样品的最低抑菌浓度 (MIC)。各抗菌肽的 MIC 测定结果如表 5 所示。
表 5HRP5 类似物的 MIC 测定结果
背景技术 自从青霉素发现以来， 抗生素一直是人类治疗病原微生物感染的有力武器， 但 随着传统抗生素的滥用， 越来越多的病原菌开始对传统抗生素产生耐药性， 所以急需寻 找 - 类全新的抗菌药物来替代抗生素进行使用。
阳离子抗菌肽 (cationic antimicrobial peptides) 是植物和动物产生的一般由 12-50 个氨基酸残基组成的阳离子型 ( 富含精氨酸及赖氨酸 ) 多肽， 能够保护宿主不受外界 病原微生物感染。阳离子抗菌肽的抗菌谱比传统抗生素宽， 来自昆虫、 猪、 蛙以及人的阳离 子抗菌肽不仅对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌有抗菌作用， 而且还具有抗真菌及抗病毒活 性。 传统抗生素通过消除微生物生长或生存必不可少的条件， 如使酶变性， 来达到杀菌的目 的， 但细菌只要一种基因突变后就可以抵抗此类抗生素的攻击。而阳离子抗菌肽则通过中 和电荷的方法与细菌细胞膜相互作用， 以此穿透杀死细菌， 极大地减少了细菌产生耐药性 的可能。 但天然的阳离子抗菌肽并非完美无缺， 部分抗菌肽对真核生物有一定的毒性， 对病 原物高杀灭活性的同时往往伴随着对真核生物的溶血作用。 因此如何提高其活性并最大程 度降低其毒性是目前抗菌肽药物开发的难点和希望所在。目前的研究主要将 α- 螺旋的两 性抗菌肽作为研究对象， 围绕阳离子氨基酸以及疏水性氨基酸数量及位置， 对抗菌肽进行 结构改造， 如残基替换、 截取天然抗菌肽的部分序列以及增加肽链的正电荷含量等， 取得了 较大进展。
富 组 蛋 白 (histidine rich protein， HRPs 或 histatins) 是 - 类 存 在 于 灵 长类动物腮腺和颌下腺分泌物中富含组氨酸的阳离子多肽。现已分离出至少 12 种人 HRPs(HRP1-12)， 其中 HRP1、 HRP3 及 HRP5 是主要富组蛋白， 占总 HRPs 的 85％ -90％， 分别由 38， 32， 24 个氨基酸组成。HRP1 和 HRP3 由不同的基因编码， HRP5 是 HRP3 经蛋白酶水解的 产物， 包含在 HRP3 的 N 末端 24 个残基中。编码 HRP1， 3 的基因已被测序且定位于人类第 4 号染色体 q13 上。现有研究表明 ： HRPs 具有多种活跃的生物学功能， 其抗微生物作用尤为 重要， 如抑制、 杀灭变形链球菌和白色念珠菌等。
HRP5 含有 24 个氨基酸残基， 分子量为 3037D。其氨基酸序列为 Asp-Ser-His-Ala -Lys-Arg-His-His-Gly-Tyr-Lys-Arg-Lys-Phe-His-Glu-Lys-His-His-Ser-His-Arg-GlyTyr(SEQ ID NO ： 1)。Raj 等学者认为 HRP5 抗白色念珠菌的特性与其氨基酸序列有关， 他们 分别将 HRP5 及其残基片段 N16(1-16 位氨基酸 )、 C16(9-24 位氨基酸 )、 C14(11-24 位氨基 酸 )、 C12(13-24 位氨基酸 )、 C10(15-24 位氨基酸 ) 和 M10(7-16 位氨基酸 ) 分别与不同浓 度的白色念球菌作用， 检测其抗白色念球菌的能力。试验结果表明 C16 和 C14 有较强的抑 制白色念珠菌生长的能力， 而且 HRP5 与 C16 的抗白色念球菌的活性基本一致， 而同样含有 16 个氨基酸的 N16 抗白色念珠菌的活性远远低于 C16。这一结果提示 HRP5 的抗白色念珠
阳离子抗菌肽 (cationic antimicrobial peptides) 是植物和动物产生的一般由 12-50 个氨基酸残基组成的阳离子型 ( 富含精氨酸及赖氨酸 ) 多肽， 能够保护宿主不受外界 病原微生物感染。阳离子抗菌肽的抗菌谱比传统抗生素宽， 来自昆虫、 猪、 蛙以及人的阳离 子抗菌肽不仅对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌有抗菌作用， 而且还具有抗真菌及抗病毒活 性。 传统抗生素通过消除微生物生长或生存必不可少的条件， 如使酶变性， 来达到杀菌的目 的， 但细菌只要一种基因突变后就可以抵抗此类抗生素的攻击。而阳离子抗菌肽则通过中 和电荷的方法与细菌细胞膜相互作用， 以此穿透杀死细菌， 极大地减少了细菌产生耐药性 的可能。 但天然的阳离子抗菌肽并非完美无缺， 部分抗菌肽对真核生物有一定的毒性， 对病 原物高杀灭活性的同时往往伴随着对真核生物的溶血作用。 因此如何提高其活性并最大程 度降低其毒性是目前抗菌肽药物开发的难点和希望所在。目前的研究主要将 α- 螺旋的两 性抗菌肽作为研究对象， 围绕阳离子氨基酸以及疏水性氨基酸数量及位置， 对抗菌肽进行 结构改造， 如残基替换、 截取天然抗菌肽的部分序列以及增加肽链的正电荷含量等， 取得了 较大进展。
富 组 蛋 白 (histidine rich protein， HRPs 或 histatins) 是 - 类 存 在 于 灵 长类动物腮腺和颌下腺分泌物中富含组氨酸的阳离子多肽。现已分离出至少 12 种人 HRPs(HRP1-12)， 其中 HRP1、 HRP3 及 HRP5 是主要富组蛋白， 占总 HRPs 的 85％ -90％， 分别由 38， 32， 24 个氨基酸组成。HRP1 和 HRP3 由不同的基因编码， HRP5 是 HRP3 经蛋白酶水解的 产物， 包含在 HRP3 的 N 末端 24 个残基中。编码 HRP1， 3 的基因已被测序且定位于人类第 4 号染色体 q13 上。现有研究表明 ： HRPs 具有多种活跃的生物学功能， 其抗微生物作用尤为 重要， 如抑制、 杀灭变形链球菌和白色念珠菌等。
HRP5 含有 24 个氨基酸残基， 分子量为 3037D。其氨基酸序列为 Asp-Ser-His-Ala -Lys-Arg-His-His-Gly-Tyr-Lys-Arg-Lys-Phe-His-Glu-Lys-His-His-Ser-His-Arg-GlyTyr(SEQ ID NO ： 1)。Raj 等学者认为 HRP5 抗白色念珠菌的特性与其氨基酸序列有关， 他们 分别将 HRP5 及其残基片段 N16(1-16 位氨基酸 )、 C16(9-24 位氨基酸 )、 C14(11-24 位氨基 酸 )、 C12(13-24 位氨基酸 )、 C10(15-24 位氨基酸 ) 和 M10(7-16 位氨基酸 ) 分别与不同浓 度的白色念球菌作用， 检测其抗白色念球菌的能力。试验结果表明 C16 和 C14 有较强的抑 制白色念珠菌生长的能力， 而且 HRP5 与 C16 的抗白色念球菌的活性基本一致， 而同样含有 16 个氨基酸的 N16 抗白色念珠菌的活性远远低于 C16。这一结果提示 HRP5 的抗白色念珠
菌的功能区位于羧基端。为了进一步研究 HRP5 的结构和功能的关系， 许多学者通过残基替 换得到了一系列的变异体， 其中较重要的是 dhvar1、 dhvar2、 dhvar4、 dhvar5。它们是 HRP5 活性区 (11-24 位氨基酸 ) 变异体。 发明内容
多肽或其药用盐， 所述多肽具有如下氨基酸序列 ：
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Leu-Xaa11-Lys-Tyr-Leu-Ar g-Xaa16-Xaa17-Xaa18(SEQ ID NO ： 2)
其中 Xaa1 为 Cys 或缺失 ；
Xaa2 为 Lys、 D-Lys、 Arg、 D-Arg、 HoR 或缺失 ；
Xaa3 为 Leu、 Ile、 Nle、 Val、 Trp、 Phe、 D-Phe、 Thi 或缺失 ；
Xaa4 为 Lys、 D-Lys、 Arg、 D-Arg、 Aib 或 HoR ；
Xaa5 为 Lys、 D-Lys、 Arg、 D-Arg 或 HoR ；
Xaa6 为 Leu、 Ile、 Nle、 Val、 Trp、 Phe、 D-Phe 或 Thi ；
Xaa7 为 Leu、 Ile、 Nle、 Val、 Trp、 Phe、 D-Phe 或 Thi ；
Xaa8 为 Lys、 D-Lys、 Arg、 D-Arg 或 HoR ；
Xaa9 为 Lys、 D-Lys、 Arg、 D-Arg 或 HoR ；
Xaa11 为 Leu、 Ile、 Nle、 Val、 Trp、 Phe、 D-Phe 或 Thi ；
Xaa16 为 Lys、 D-Lys、 Arg、 D-Arg 或 HoR ；
Xaa17 为 Leu、 Ile、 Nle、 Val、 Trp、 Phe、 D-Phe 或 Thi ； Xaa18 为 Cys 或缺失， 当 Xaa1 与 Xaa18 同为 Cys 时， 该多肽可以形成环肽。
作为本发明的一种优选方案 Xaa1 与 Xaa18 同为 Cys 或同时缺失 ； Xaa2 优选 Arg、 D-Arg 或缺失 ； Xaa3 优选 Phe、 D-Phe 或缺失 ； Xaa4 优选 Lys、 D-Lys、 Arg、 Aib 或 HoR ； Xaa5 优选 Lys、 Arg 或 D-Arg ； Xaa6 优选 Leu、 Ile 或 Nle ； Xaa7 优选 Trp、 Phe、 D-Phe 或 Thi ； Xaa8 优选 Lys、 D-Lys 或 Arg ； Xaa9 优选 Lys、 D-Lys 或 Arg ； Xaa11 优选 Leu、 D-Phe 或 Phe ； Xaa16 优选 Lys、 D-Lys 或 Arg ； Xaa17 优选 Trp、 Phe、 D-Phe 或 Thi。
本发明所涉及的氨基酸残基既包括天然氨基酸， 也包括非天然氨基酸。本发明所 涉及的天然氨基酸所对应的三字母代码表如表 1 所示， 本发明所涉及的非天然氨基酸所对 应的三字母代码表及结构如表 2 所示。
本发明所涉及的所有氨基酸残基若不特别限定其构型， 代表 L 型氨基酸。
本发明所涉及的多肽， 既可以是线性肽， 也可以是环肽。 当 Xaa1 与 Xaa18 同为 Cys 时， 可以通过加入氧化剂使得 Xaa1 与 Xaa18 之间形成二硫键， 此时该肽由线性肽变成环肽。
本发明所涉及的多肽为线性肽时， 其 C 末端既可以是羧酸的形式， 也可以是酰胺 的形式， 优选以酰胺的形式存在。
表1： 天然氨基酸三字母代码表
表2： 非天然氨基酸三字母代码表及结构
本发明优选的一个实施方式中公开了一种线性的多肽 (AMP-1)， 其氨基酸序列为 ： Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO ： 3)
本发明另一个优选的实施方式中公开了一组线性的多肽 (AMP-2， AMP-3， AMP-4， AMP-5， AMP-6， AMP-7， AMP-8， AMP-9， AMP-10， AMP-11， AMP-12)， 其氨基酸序列分别为 ： LysArg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-D-Lys-D-Phe-NH2(SEQ ID NO ： 4)D-LysD-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-D-Lys-D-Phe-NH2(SEQ ID NO ： 5)D-L
ys-D-Arg-Leu-Phe-D-Lys-D-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-D-Lys-D-Phe-NH2(SEQ IDNO ： 6)
Phe-Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO ： 7)
Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Tyr-Leu-Arg-Arg-Phe-NH2(SEQ ID NO ： 8)
Arg-Arg-Ile-Phe-Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Tyr-Leu-Arg-Arg-Phe-NH2(SEQ ID NO ： 9)
Arg-Leu-Arg-Arg-Ile-Phe-Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Tyr-Leu-Arg-Arg-Phe-NH2(S EQID NO ： 10)
Lys-Arg-Leu-Thi-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Thi-NH2(SEQ ID NO ： 11)
Lys-Arg-Nle-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Thi-NH2(SEQ ID NO ： 12)
Aib-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Thi-NH2(SEQ ID NO ： 13)
HoR-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Thi-NH2(SEQ ID NO ： 14)
本发明的又一个优选的实施方式公开了一种环状的多肽 (AMP-13)， 其氨基酸序列 为：
本发明还有个目的就是提供上述线性及环状多肽的制备方法， 可以采用本领域技 术人员熟悉的固相化学合成技术制备线性肽以及通过双氧水氧化法在线性肽的基础上制 备环肽。
固相化学合成技术的制备步骤如下 ：
(1) 在树脂上固相合成多肽 ；
(2) 将步骤 (1) 的产物在三氟乙酸或氢氟酸中进行裂解， 优选三氟乙酸， 并加入侧 链保护基清除剂， 然后用 5-20 倍体积的冰乙醚沉淀多肽， 离心， 弃上清， 再用冰乙醚反复洗 涤沉淀 4-5 次， 真空干燥， 得到粗肽 ；
若本发明所涉及的多肽 C 末端为羧酸形式则步骤 (1) 采用 Wang 树脂进行合成 ； 若 本发明所涉及的多肽 C 末端为酰胺形式则步骤 (1) 采用 Rink Amide MBHA 树脂进行合成。
步骤 (1) 是在液相环境中进行， 具体包括 ： 浸泡树脂 - 脱除氨基保护基 - 洗涤 - 偶 联氨基酸 - 监测 - 洗涤 - 脱除氨基保护基 ( 顺序偶联剩余氨基酸 )- 干燥树脂。
其中氨基保护基是指为保护参与缩合反应的氨基而引入的化学基团。所述的氨 基保护基选自 ： 叔丁氧羰基 (Boc)、 苄氧羰基 (Z) 和 9- 芴基 - 甲基羰基 (Fmoc)， 优选 9- 芴 基 - 甲基羰基 (Fmoc)。
作为固相多肽合成技术的一个优势， 对部分氨基酸的侧链可以通过引入化学基团
进行保护， 例如 Arg 及 HoR 可以采用五甲基苯并呋喃 -5- 磺酰基 (Pbf) ； Cys 可以采用三苯 甲基 (Trt) ； Lys 及 Trp 可以采用叔丁氧羰基 (Boc) ； Tyr 可以采用叔丁基 (tBu)。所述的保 护基团不限于此， 可以根据本领域常规方案进行合理选择。
步骤 (1) 的液相环境所用溶剂选自 ： 二甲基甲酰胺 (DMF) 或二氯甲烷 (DCM)， 优选 DMF。
步骤 (1) 中脱除氨基保护基需要加入氨基保护基的脱除剂， 氨基保护基的脱除剂 选用哌啶 (PIP) 溶液， 浓度 10-40％ (PIP/DMF)， 脱除时间为 20-50min。 优选浓度为 20-25％ (PIP/DMF)， 脱除时间 25-35min。
步骤 (1) 中氨基酸的偶联需要加入偶联试剂， 偶联试剂由 ： 碳二亚胺型试剂或者 苯并三氮唑鎓盐型试剂与 1- 羟基苯并三唑 (HOBt) 组成。
碳二亚胺型试剂包括二环己基碳二亚胺 (DCC)、 二异丙基碳二亚胺 (DIC) 及 N- 二 氨基丙基 -N- 乙基碳二亚胺 (EDC)。
苯并三氮唑鎓盐型试剂包括 2-(1H- 苯并三偶氮 L-1- 基 )-1， 1， 3， 3- 四甲基脲四 氟硼酸酯 (TBTU)、 O- 苯并三唑 -N， N， N’ ， N’ - 四甲基脲六氟磷酸盐 (HBTU)、 六氟磷酸苯并三 唑 -1- 氧基三 ( 二甲氨基 ) 磷 (BOP)、 六氟磷酸苯并三唑 -1- 基 - 氧基三吡咯烷基磷 (PyBOP) 等。 偶联试剂优选二异丙基碳二亚胺 (DIC) 与 1- 羟基苯并三唑 (HOBt)、 2-(1H- 苯并 三偶氮 L-1- 基 )-1， 1， 3， 3- 四甲基脲四氟硼酸酯 (TBTU) 与 1- 羟基苯并三唑 (HOBt)， 最优 选 DIC( 二异丙基碳二亚胺 ) 与 1- 羟基苯并三唑 (HOBt)。
步骤 (1) 中的 “监测” 采用茚三酮检测法监测多肽的缩合反应。
步骤 (1) 中的顺序连接氨基酸是指根据多肽氨基酸序列从 C 端向 N 端逐个连接氨 基酸。
步骤 (2) 所述的侧链保护基清除剂是选自如茴香硫醚、 三异丙基硅烷、 苯酚、 水、 1， 2- 乙二硫醇、 间甲酚等两个或者两个以上的组合并与三氟乙酸或氢氟酸按 5-20 ％ (V/ V) 进行配制得到。优选三氟乙酸 (TFA) ∶茴香硫醚∶ 1， 2- 乙二硫醇∶ 75％苯酚∶水＝ 85 ∶ 5 ∶ 5 ∶ 4 ∶ 1。
特别有益的是为满足医药用途的质量要求， 本发明所提供的多肽制备方法还包括 采用常规手段进行纯化。所采用的纯化方法可以为反相色谱法或离子交换色谱法， 优选反 相色谱法。
本发明所涉及的多肽的体外抗菌活性可以通过测定其最低抑菌浓度 (MIC) 来鉴 定。美国临床实验室标准化委员会 (NCCLS) 推荐采用常量肉汤稀释法来测定各抗菌肽的最 低抑菌浓度 (MIC)， 培养基采用 Mueller-Hinton(MH) 肉汤培养基。以两性霉素 B、 多粘菌素 E 及万古霉素作为阳性对照。体外活性测定表明， 本发明提供的多肽对革兰氏阳性菌、 革兰 氏阴性菌及真菌均具有显著的杀菌效果， 对临床上分离的耐药性革兰氏阳性菌、 耐药性革 兰氏阴性菌及耐药性真菌同样具有显著的杀菌效果， 具有广谱、 高效的特点。 因此本发明所 涉及的多肽可以在临床上作为活性成分替代传统抗生素进行治疗。
以下实施例仅代表本发明阐述的一个方面， 不是本发明主题的局限。
具体实施方式实施例 1 ： AMP-1 的制备及纯化
序 列： Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO ： 3)
(1) 材料及试剂
Rink Amide MBHA 树脂， 取代值 0.41mmol/g。
所 需 带 保 护 的 氨 基 酸 为 Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、 Fmoc-L-Leu-OH、 Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、 Fmoc-L-Phe-OH 及 Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH。
试剂 ： HOBt、 DIC、 DMF、 哌啶。
(2) 仪器
PSI300 型多肽合成仪、 Waters600 半制备型高效液相色谱仪、 磁力搅拌器。
(3) 操作步骤 ( 以 0.25mmol 为例 )
a. 固相化学合成多肽
称取 Rink Amide MBHA 树脂 0.61g， 置于多肽合成仪的反应器中， 加入 10mLDMF， 浸 泡 2h， 然后加入 20％ PIP/DMF 溶液 15mL， 混合 30min 来脱除氨基保护剂， 用 DMF 洗涤树脂 7 次， 然后向反应器中加入 387.4mg Fmoc-L-Phe-OH、 等摩尔的偶联试剂 DIC(0.33mol/L) 与 HOBt(0.33mol/L) 进行反应， 反应温度为室温， 以茚三酮反应监测反应进程， 确保氨基酸偶 联到树脂上， 用 DMF 洗涤树脂 7 次。当第一个氨基酸偶联到树脂上后， 即可按照上述方法继 续进行下一个氨基酸的偶联反应， 如此循环， 直至全部氨基酸偶联完成。 b. 裂解及沉淀
肽合成结束后， 真空干燥树脂， 称重。按照 1g 树脂 10mL 裂解试剂的比例加入裂解 试剂， 试剂配比为 TFA ∶茴香硫醚∶ 1， 2- 乙二硫醇∶ 75％苯酚∶水＝ 85 ∶ 5 ∶ 5 ∶ 4 ∶ 1， 室温搅拌反应 3 小时， 抽滤。接着向裂解抽滤液中加入 10 倍体积的冰乙醚沉淀多肽， 离心， 弃上清， 再用冰乙醚反复洗涤沉淀 4 ～ 5 次， 真空干燥， 称重粗肽。
c. 反相色谱纯化
用制备型 HPLC， 采用反相色谱法， 纯化上述粗肽。
HPLC 条件如下 ：
色谱柱 ： XBridgeTM Prep C18 5μm OBDTM 19×150mm
流速 ： 10mL/min
检测波长 ： 210nm
流动相 ： A： 含 0.1％ TFA 水溶液
B： 含 0.1％ TFA 的乙腈
梯度洗脱程序如表 3 ：
表 3 梯度洗脱表
收集目标肽纯度大于 99％的部分， 然后 50℃减压浓缩至干。经 ESI-MS 测定， 该肽 的分子量为 1880.28， 理论值为 1880.43。
实施例 2 ： 表 4 中 HRP5 类似物的制备及纯化
(1) 材料及试剂
Rink Amide MBHA 树脂， 取代值 0.41mmol/g。
所 需 带 保 护 的 氨 基 酸 Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、 Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、 Fmoc-L-Leu-OH 、 Fmoc-L-HoR(Pbf)-OH 、 Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 、 Fmoc-D-Lys(Boc)-OH 、 Fmoc-L-Phe-OH、 Fmoc-D-Phe-OH、 Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、 Fmoc-L-Ile-OH、 Fmoc-L-Nle-OH、 Fmoc-L-Thi-OH 及 Fmoc-L-Aib-OH。
试剂 ： HOBt、 DIC、 DMF、 哌啶。
(2) 仪器
PSI300 型多肽合成仪、 Waters600 半制备型高效液相色谱仪、 磁力搅拌器。
(3) 操作步骤 ( 以 0.25mmol 为例 )
以类似实施例 1 中操作步骤 a-c 的方法制备及纯化表 4 中的多肽， 收集纯度大于 99％的部分， 然后 50℃减压浓缩至干。ESI-MS 测定值如表 4 所示。
表 4HRP5 类似物
实施例 3 ： 环肽 AMP-13 的制备及纯化
(1) 材料及试剂
Rink Amide MBHA 树脂， 取代值 0.41mmol/g。
所 需 带 保 护 的 氨 基 酸 为 Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、 Fmoc-L-Leu-OH、 Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、 Fmoc-L-Phe-OH、 Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH 及 Fmoc-L-Cys(Trt)-OH。
试剂 ： HOBt、 DIC、 DMF、 哌啶、 30％ H2O2。
(2) 仪器
PSI300 型多肽合成仪、 Waters600 半制备型高效液相色谱仪、 磁力搅拌器。
(3) 操作步骤
a. 以类似实施例 1 中操作步骤 a-c 的方法制备及纯化具有如下序列 (Cys-Lys-Ar g-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-Cys-NH2) 的多肽， 收集纯度大于 然后 50℃减压浓缩至干。经 ESI-MS 测定， 该肽的分子量为 2086.24， 理论值为 99％的部分， 2086.72。
b. 分子内二硫键的形成
称取本实施例操作步骤 a 中多肽 100.0mg， 溶于 200ml 水， 配制成浓度为 0.5mg/ml 的溶液， 加入 3.33ml 浓度为 30％的过氧化氢， 室温下搅拌反应， 用 HPLC 监测反应的进行， 直 至完全转化为氧化型。
c. 反向色谱纯化
以类似实施例 1 中操作步骤 c 的方法纯化， 收集环肽 AMP-13 纯度大于 99％的部 分， 然后 50℃减压浓缩至干。 经 ESI-MS 测定， 该肽的分子量为 2084.25， 理论值为 2084.72。
实施例 4 ： 体外抗菌活性测定
根据美国临床实验室标准化委员会 (NCCLS) 推荐的常量肉汤稀释法测定各抗菌 肽的最低抑菌浓度 (MIC)， 培养基采用 Mueller-Hinton(MH) 肉汤培养基。
具体步骤为 ：
(1) 抗菌药物贮存液制备 ：
精确配制浓度为 1280μg/mL 的上述 HRP5 类似物 AMP 1 ～ 13 和阳性对照品两性 霉素 B、 多粘菌素 E 及万古霉素。配制好的各贮存液置于 -20℃环境中保存备用。
(2) 培养基的配制 ：
称取 MH 肉汤培养基 21g， 溶于蒸馏水中并定容至 1L， 121℃高温灭菌 30min。
(3) 接种物的制备 ：
用接种环挑取形态相似待检菌落 3 ～ 5 个， 接种于 4 ～ 5mL 的 MH 肉汤中， 35℃孵 育 2 ～ 6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或 MH 肉汤校正浓度至 0.5 麦氏比浊标准， 约含 1 ～ 2×108CFU/mL。用 MH 肉汤将上述菌悬液进行 1 ∶ 100 稀释后备用。
(4) 稀释抗菌药物的制备及菌液接种 ：
取无菌试管 (13×100mm)13 支， 排成一排， 第 1 管中加入 1.6mL MH 肉汤， 第 2-13
管中各加入 1mL MH 肉汤， 然后向第 1 管加入抗菌药物原液 (1280μg/mL)0.4mL， 混匀， 接 着吸取 1mL 至第 2 管， 混匀后再从第 2 管中吸取 1mL 至第 3 管， 如此连续倍比稀释至第 11 管， 并从第 11 管中吸取 1mL 弃去， ， 然后向第 1-11 管及第 13 管中加入上述制备好的接种物 各 1mL， 使每管最终菌液浓度约为 5×105CFU/mL。第 1-11 管药物浓度分别为 128μg/mL、 64μg/mL、 32μg/mL、 16μg/mL、 8μg/mL、 4μg/mL、 2μg/mL、 1μg/mL、 0.5μg/mL、 0.25μg/ mL、 0.125μg/mL， 第 12 管为不含抗菌药物及接种物的空白对照， 第 13 管为不含抗菌药物的 阴性对照。
(5) 孵育 ： 将接种好的稀释管塞好塞子， 置 35℃普通空气孵箱中孵育 16 ～ 20h。
(6) 结果 ： 以肉眼观察， 无细菌生长的最低药物浓度即为该样品的最低抑菌浓度 (MIC)。各抗菌肽的 MIC 测定结果如表 5 所示。
表 5HRP5 类似物的 MIC 测定结果
11CN 102766197 A
序列表1/15 页
12CN 102766197 A序列表2/15 页
13CN 102766197 A序列表3/15 页
14CN 102766197 A序列表4/15 页
15CN 102766197 A序列表5/15 页
16CN 102766197 A序列表6/15 页
17CN 102766197 A序列表7/15 页
18CN 102766197 A序列表8/15 页
19CN 102766197 A序列表9/15 页
20CN 102766197 A序列表10/15 页
21CN 102766197 A序列表11/15 页
22CN 102766197 A序列表12/15 页
23CN 102766197 A序列表13/15 页
24CN 102766197 A序列表14/15 页
25CN 102766197 A序列表15/15 页26