聚乙二醇化雷公藤红素及其制备方法和用途.pdf

本发明属医药技术领域，涉及聚乙二醇化雷公藤红素及其制备方法和用途；所述的聚乙二醇化雷公藤红素具有下列通式的结构。本发明提供了聚乙二醇化雷公藤红素的制备方法，还提供了聚乙二醇化雷公藤红素及甲氧基氨基聚乙二醇10kDa单修饰雷公藤红素mPEG10k-NHCO-Celastrol在制备肿瘤治疗药物方面的用途；其中，所述肿瘤包括：前列腺癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、肺癌等各种恶性肿瘤。本发明采用聚乙二醇对雷公藤红素进行化学结构修饰，可解决其溶解性问题，聚乙二醇修饰雷公藤红素后可制成注射剂体内注射能延长雷公藤红素的消除半衰期，降低其毒副作用，减少患者的给药频率。

1.聚乙二醇化雷公藤红素，其特征在于：其结构通式如下式：      其中， R为CH₃O-(CH₂CH₂O)n-CH₂CH₂-NH- 或者CH₃O-(CH₂CH₂O)n-CH₂CH₂-CO-； R’为-NH-CH₂CH₂-(CH₂CH₂O)n-CH₂CH₂-NH-或者–CO-CH₂CH₂- (CH₂CH₂O)n -CH₂CH₂ - CO-，所述的聚乙二醇分子量为2 kDa～80 kDa之间。 2.按权利要求1所述的聚乙二醇化雷公藤红素，其特征在于，所述的聚乙二醇分子量为10 kDa～30 kDa。 3.按权利要求1所述的聚乙二醇化雷公藤红素，其特征在于，所述的聚乙二醇的有代表性的分子质量为2 kDa、3.5 kDa、5 kDa、10 kDa、20 kDa或30 kDa。 4.按权利要求1所述的聚乙二醇化雷公藤红素，其特征在于，所述的聚乙二醇是末端氨基聚乙二醇、末端羧基聚乙二醇或末端羟基聚乙二醇。 5.按权利要求1所述的聚乙二醇化雷公藤红素，其特征在于，所述的聚乙二醇是直链单修饰聚乙二醇或直链双修饰聚乙二醇或支链聚乙二醇。 6.权利要求1所述的聚乙二醇化雷公藤红素的制备方法，其特征在于，其包括步骤： 将雷公藤红素和聚乙二醇在无水有机溶剂中搅拌反应，反应结束后，过滤，乙醚沉淀有机相滤液，过滤，无水乙醚多次洗涤沉淀，干燥沉淀物，即得产物。 7.按权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的聚乙二醇对雷公藤红素的羟基或羧基位点进行修饰。 8.按权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的制得的最终沉淀物再次采用反相硅胶柱或离子交换凝胶柱精制。 9.按权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的雷公藤红素与聚乙二醇的摩尔配比为5：1～1.5：1。 10.按权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述方法中，当选用单修饰聚乙二醇时，雷公藤红素与聚乙二醇的摩尔配比为1.5：1～2：1；当选用双修饰聚乙二醇时，雷公藤红素与聚乙二醇的摩尔配比为4：1～3：1。 11.按权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述方法中，采用DMAP、EDC·HCl、DCC、HOBut、NMP、ClCOOBuⁱ、NHS、TEA或SOCl₂为三光气催化剂、保护剂、活化剂、pH调节剂及脱水剂。 12.权利要求1所述的聚乙二醇化雷公藤红素在制备抗肿瘤药物药物中的用途。 13.按权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤为前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌或宫颈癌。

聚乙二醇化雷公藤红素及其制备方法和用途

技术领域

本发明属医药技术领域，涉及聚乙二醇化雷公藤红素及其制备方法和用途。

背景技术

    雷公藤（Triptergium wilfordii）为卫矛科一年生藤本植物，是一种我国常见的有毒蜜源植物，又名断肠草、草滕根等。雷公藤作为中国传统医学中常用的中草药，已有700多年历史，临床实践显示其对自身免疫性疾病、肾病综合症、癌症等疾病疗效显著。研究发现，雷公藤中主要有三种活性成分：雷公藤甲素、雷公藤乙素、雷公藤红素。雷公藤红素（Celastrol，Tripterine，简称：红素）又名南蛇藤素，是雷公藤中主要活性成分中的一个具有多种活性的单体，属三萜类色素，来源于雷公藤的根皮，其分子式为C₂₉H₃₈O₄，相对分子质量450.61，其化学结构式如下式：

据文献报道，雷公藤红素具有抗炎、免疫抑制、诱导细胞凋亡（如人肥大细胞白血病细胞系HMC-1、CEM-6T）、抗肿瘤、抗氧化、抗真菌、杀虫等药理活性。尤其是在2006年中科院武汉植物园袁晓与美国韦恩大学研究人员合作，研究发现雷公藤红素能显著抑制糜蛋白酶活性及前列腺癌细胞蛋白酶活性，从而证明雷公藤红素是一种蛋白酶抑制剂之后，雷公藤红素的研究与开发更加深入。如：（夏玲红，崔岚，雷公藤红素的药理作用研究进展[J]，医药导报，2009,28,6: 730-732； Yang HJ，Chen D，Cui QZ，et a1．Celastrol, a Triterpene Extracted from the Chinese “Thunder of God Vine，” Is a potent Proteasome inhibitor and Suppresses Human Prostate Cancer Growth in Nude Micel [J], Cancer Res, 2006, 66(9)：4758-4765．）

但由于雷公藤红素具有水溶性差、毒性大等缺陷，故迄今为止尚未有雷公藤红素药物上市。目前已有有关雷公藤红素脂质体、脂质微球、成盐、小分子化学修饰、氢化结构改造等的研究报道。如：黄煜伦，雷公藤红素纳米脂质体的制备及抗胶质瘤的实验研究[D], 江苏：苏州大学神经外科，2009；刘悉承，李志高，张志兰等，雷公藤红素纳米脂质注射液及其制备方法[P].CN 101548950A, 2009-10-7.； 吴正红，王柏刚，黄煜伦等，雷公藤红素脂质体及其制备[P].CN 101239040A，2009-8-13.； 刘珂，关玉昆，邵萌等，一种雷公藤红素盐及其制备方法与用途[P]. CN 101279995 A，20080-10-8.；刘珂，关玉昆，赵烽等，一种雷公藤红素衍生物及其制备方法与用途[P]. CN 101311187 A，2008-11-26； Devlin J.P., Derivatives of pentacyclic nortriterpene quinine methides as compounds useful in the treatment of inflammatory, neurodegenerative, and neoplastic diseases[P]. US 20040220267A1.等。

聚乙二醇化技术（PEGylation）即聚乙二醇与目标化合物发生化学反应，改良目标化合物的理化性能。现有技术公开了聚乙二醇是FDA批准的无毒、无副作用、安全可靠的药用辅料。聚乙二醇与药物结合可以改变药物的药代动力学，进而改变药物的药效学，特别是聚乙二醇修饰能使药物达到或接近目标浓度的时间延长，保护药物的药效得以发挥。聚乙二醇对小分子药物进行结构修饰，可以提高其溶解性，控制其释放，延长其在血液的时间。

发明内容

本发明的目的是提供聚乙二醇化雷公藤红素及其制备方法和用途。

从理论上将，聚乙二醇对雷公藤红素进行化学修饰，可以弥补雷公藤红素药用的不足之处。本发明的聚乙二醇化雷公藤红素较雷公藤红素具有长效、低毒、溶解性好等优点。其结构通式如下式所示： 

    其中，

R为CH₃O-(CH₂CH₂O)n-CH₂CH₂-NH- 或者CH₃O-(CH₂CH₂O)n-CH₂CH₂-CO-；

R’为-NH-CH₂CH₂-(CH₂CH₂O)n-CH₂CH₂-NH-或者–CO-CH₂CH₂- (CH₂CH₂O)n -CH₂CH₂ - CO-， 有代表性的分子质量为2 kDa、3.5 kDa、5 kDa、10 kDa、20 kDa、30 kDa的聚乙二醇。

本发明提供了聚乙二醇化雷公藤红素的制备方法，其包括步骤：

在反应瓶里先加入雷公藤红素、催化剂、脱水剂和惰性溶剂，再加入聚乙二醇的惰性溶剂溶液，搅拌反应。反应完毕后，过滤反应液，滤液采用乙醚沉淀，反复溶解、反复沉淀，最后干燥乙醚沉淀物，即得聚乙二醇化雷公藤红素。

本发明中，硅胶板点样、HPLC-UV监测反应进程。其中，反应温度范围：4 ℃～35 ℃，优选20 ℃～28 ℃；反应时间范围：2 h～72 h，优选12 h～36 h。

本发明所述制备方法中，聚乙二醇包括单修饰聚乙二醇，如甲氧基氨基聚乙二醇或甲氧基羟基聚乙二醇或甲氧基羧基聚乙二醇；双修饰聚乙二醇，如双氨基聚乙二醇或双羟基聚乙二醇或双羧基聚乙二醇。

所述制备方法中，聚乙二醇的分子质量介于2 kDa至80 kDa之间，其中有代表性的是2 kDa，3.5 kDa，5 kDa，10 kDa，20 kDa，30 kDa。

所述制备方法中，单修饰聚乙二醇与雷公藤红素摩尔配比为1：1～1：5，优选1：2～1：3；双修饰聚乙二醇与雷公藤红素摩尔配比为1：2～1：10，优选1：4～1：6。

本发明的制备方法中，所述的惰性溶剂选自二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯、苯、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、丙酮、环己酮等，优选二氯甲烷。

所述制备方法中，可加入催化剂，如4-二甲氨基吡啶（DMAP），N-甲基吡咯烷酮（NMP），亦可加入脱水剂，如二环己基碳二亚胺（DCC）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）。

本发明的一个实施例中，提供了甲氧基氨基聚乙二醇10 kDa单修饰雷公藤红素（mPEG_10k-NHCO- Celastrol）的制备方法，并经结构鉴别，理化性质，体外细胞活性、药代动力学以及药效学试验，所制得的mPEG_10k-NHCO- Celastrol其结构式如下式：

本发明提供了一种聚乙二醇化雷公藤红素的注射制剂，该注射剂含有有效剂量的聚乙二醇化雷公藤红素与可药用辅料及注射用水。

本发明经体内外抗肿瘤试验结果显示，

雷公藤红素对人前列腺癌PC-3细胞、人宫颈癌Hela细胞、人胃癌SGC7901细胞、人肺癌A549细胞或人肝癌SMMC-7721细胞的IC₅₀为0.5～10.0 μM，本发明的聚乙二醇化雷公藤红素的细胞活性只有等摩尔的雷公藤红素活性的3%～15%；所述的聚乙二醇化雷公藤红素抑瘤率较高，能延缓雷公藤红素在裸鼠体内的代谢，从而延长其消除半衰期。

本发明提供了聚乙二醇化雷公藤红素在制备肿瘤治疗药物方面的用途。所述肿瘤包括：前列腺癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、肺癌等各种恶性肿瘤。

本发明还提供了所述的甲氧基氨基聚乙二醇10 kDa单修饰雷公藤红素（mPEG_10k-NHCO-Celastrol）在制备肿瘤治疗药物方面的用途。所述肿瘤包括：前列腺癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、肺癌等各种恶性肿瘤。

本发明中，采用聚乙二醇对雷公藤红素进行化学结构修饰，可以解决其溶解性问题，聚乙二醇修饰雷公藤红素后可制成注射剂体内注射能延长雷公藤红素的消除半衰期，降低其毒副作用，减少患者的给药频率。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的聚乙二醇化雷公藤红素及其制备方法和用途进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1为mPEG_10k-NHCO-Celastrol与Celastrol的HPLC-UV(425 nm)对比图。

图2为mPEG_10k-NHCO-Celastrol红外吸收图谱。

图3为mPEG_10k-NHCO-Celastrol核磁共振氢谱。

图4为mPEG_10k-NHCO-Celastrol核磁共振碳谱。

图5为mPEG_10k-NHCO-Celastrol质谱图谱。

具体实施方式

本发明实验中所采用的试剂与仪器：

液相用试剂皆为色谱纯，其他试剂皆为分析纯，实验用水为去离子超纯水。细胞系购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；细胞培养器材购自Corning公司；裸鼠购自上海实验动物中心。

EDC·HCl购于Sigma公司； DMAP、NMP、DCC、TEA、TFA、t-BuOH、DMF、氯甲酸异丁酯购于国药集团化学试剂有限公司；聚乙二醇购于北京键凯科技有限公司；雷公藤红素购于南京泽朗医药科技有限公司，纯度为99.2%。

紫外分光光度计UV-2700（Hitachi公司）；HPLC-UV L-2000（Hitachi公司）；质谱仪（AB SCIEX TOF/TOF? 5800系统）；核磁共振仪(Mercury Plus 400 MHz, Varian公司)；AVATR^TM 360型傅立叶变换红外光谱仪（Thermo Scientific公司）；MAXQ恒温摇床（Thermo Scientific公司）；XW-80A漩涡混合器（上海医大仪器厂）；Multiskan MK3酶标仪（Thermo 电器公司）；色谱柱YMC C18 (5 μm, 150 mm×4.6 mm L.D.)；HPLC Guard Cartridge System（Phenomenex公司）。

实施例1：mPEG_10k-NHCO-Celastrol的制备

雷公藤红素4.5 g（10 mmol）加入含有DCC 2.06 g（10 mmol）、DMAP 0.5 g（4 mmol）、TEA 550 μg（5.45 mmol）和甲氧基氨基聚乙二醇10 kDa（mPEG_10k-CH₂CH₂-NH₂·HCl）50 g（4.76 mmol）的无水二氯甲烷溶液中，室温下反应，硅胶板点样监测反应进程。反应完毕后，过滤反应液，旋转蒸干滤液，加入去离子水，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥、浓缩、冷乙醚沉淀，沉淀用二氯甲烷反复溶解、无水乙醚多次洗涤，即得mPEG_10k-NHCO-Celastrol 产物52.13 g，为红黄色固体，HPLC-UV测定其修饰率。

mPEG_10k-NHCO-Celastrol的分子量为10981.5(MALDI-TOF-TOF)。

实施例2：mPEG_10k-NHCO-Celastrol的制备

0 ℃充N₂的条件下，氯甲酸异丁酯0.642 g（4.7 mmol）加入含有雷公藤红素4.5 g（10 mmol）、NMP 1.5 g（15.15 mmol）的无水二氯甲烷溶液中，在此条件下反应20 min，之后再加入预先加入TEA 550 μg（5.45 mmol）的mPEG_10k-CH₂CH₂-NH₂·HCl50 g（4.76 mmol）二氯甲烷溶液，保持0 ℃下反应2 h，移至室温下继续反应，硅胶板点样监测反应进程。反应完毕后，过滤反应液，旋转蒸干滤液，加入去离子水，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥、浓缩、冷乙醚沉淀，沉淀用二氯甲烷反复溶解、无水乙醚多次洗涤，即得mPEG_10k-NHCO-Celastrol 产物51.65 g，为红黄色固体，HPLC-UV测定其修饰率。

实施例3：mPEG_10k-NHCO-Celastrol的制备

雷公藤红素4.5 g（10 mmol）加入含有NHS 0.863 g（7.5 mmol）、DCC 2.06 g（10 mmol）的无水二氯甲烷溶液中，25℃下反应，过滤，滤液蒸干，得雷公藤红素琥珀酰亚胺酯。另外mPEG_10k-CH₂CH₂-NH₂·HCl 50 g （4.76 mmol）溶于无水二氯甲烷溶液中，TEA 调pH至9.0，加入上述雷公藤红素琥珀酰亚胺酯，25 ℃下反应，硅胶板点样监测反应进程。反应完毕后，过滤反应液，旋转蒸干滤液，加入去离子水，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥、浓缩、冷乙醚沉淀，沉淀用二氯甲烷反复溶解、无水乙醚多次洗涤，即得mPEG_10k-NHCO-Celastrol 产物52.05 g，为红黄色固体，HPLC-UV测定其修饰率。

实施例4：Celastrol-CONH-PEG_10k-NHCO-Celastrol的制备

雷公藤红素9.0 g（20 mmol）加入含有DCC 2.06 g（10 mmol）、DMAP 0.5 g（4 mmol）、TEA 550 μg（5.45 mmol）和末端双端氨基聚乙二醇10 kDa（HCl·H₂N-CH₂CH₂-PEG_10k- CH₂CH₂-NH₂·HCl）50 g（4.76 mmol）的无水二氯甲烷溶液中，25 ℃下反应，硅胶板点样监测反应进程。反应完毕后，过滤反应液，蒸干滤液，加入去离子水，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥、浓缩、冷乙醚沉淀，沉淀用二氯甲烷反复溶解、无水乙醚多次洗涤，即得双氨基修饰聚乙二醇化雷公藤红素（Celastrol-CONH-PEG_10k- NHCO-Celastrol）产物53.15 g，为红黄色固体，HPLC-UV测定其修饰率。

实施例5：mPEG_2×10k-NHCO-Celastrol的制备

雷公藤红素4.5g（10 mmol）加入含有DCC 2.06 g （10 mmol）、DMAP 0.5 g（4 mmol）、TEA 550 μg（5.45 mmol）和支链氨基聚乙二醇20 kDa（mPEG_2×10k-CH₂CH₂-NH₂·HCl）100g（4.76 mmol）的无水二氯甲烷溶液中，室温下反应，硅胶板点样监测反应进程。反应完毕后，过滤反应液，旋转蒸干滤液，加入去离子水，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥、浓缩、冷乙醚沉淀，沉淀用二氯甲烷反复溶解、无水乙醚多次洗涤，即得mPEG_10k-NHCO-Celastrol 产物102.10 g，为红黄色固体，HPLC-UV测定其修饰率。

实施例6：mPEG_10k-OOC-Celastrol的制备

雷公藤红素4.5 g（10 mmol）加入含有DCC 2.06 g（10 mmol）、DMAP 0.5 g（4 mmol）和甲氧基羟基聚乙二醇10 kDa（mPEG_10k-CH₂CH₂-OH）50 g（4.77 mmol）的无水二氯甲烷溶液中，室温下反应，硅胶板点样监测反应进程。反应完毕后，过滤反应液，除去不溶物，旋转蒸干滤液，加入去离子水，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥、浓缩、冷乙醚沉淀，沉淀用二氯甲烷反复溶解、无水乙醚多次洗涤，即得mPEG_10k-OOC-Celastrol产物51.52 g，为红黄色固体，HPLC-UV测定其修饰率。

实施例7：mPEG_10k-OOC-Celastrol的制备

雷公藤红素4.5g（10 mmol）加入含有EDC·HCl 1.91 g（10 mmol）和mPEG_10k-CH₂CH₂ -OH 50 g（4.77 mmol）的无水二氯甲烷溶液中，室温下反应，硅胶板点样监测反应进程。反应完毕后，过滤反应液，除去不溶物，旋转蒸干滤液，加入去离子水，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥、浓缩、冷乙醚沉淀，沉淀用二氯甲烷反复溶解、无水乙醚多次洗涤，即得mPEG_10k-OOC-Celastrol产物51.73 g，为红黄色固体，HPLC-UV测定其修饰率。

实施例8：mPEG_10k-OOC-Celastrol的制备

雷公藤红素4.5 g（10 mmol）加入含有2,4,6-三氯苯甲酰氯2.44 g（10 mmol）、DMAP 0.5g（4 mmol）和mPEG_10k-CH₂CH₂-OH 50 g（4.77 mmol）的无水二氯甲烷溶液中，室温下反应，硅胶板点样监测反应进程。反应完毕后，过滤反应液，旋转蒸干滤液，加入去离子水，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥、旋转蒸发器浓缩、冷乙醚沉淀，沉淀用二氯甲烷反复溶解、无水乙醚多次洗涤，即得mPEG_10k-OOC-Celastrol产物52.23 g，为红黄色固体，HPLC-UV测定其修饰率。

实施例9：Celastrol-COO-PEG_10k-OOC-Celastrol的制备

雷公藤红素9.0g（10 mmol）加入含有DCC 2.06 g（10 mmol）、DMAP 0.5g（4 mmol）和双端羟基聚乙二醇10 kDa（HO-CH₂CH₂-PEG_10k-CH₂CH₂-OH）50 g（5.0 mmol）的无水二氯甲烷溶液中，室温下反应，硅胶板点样监测反应进程。反应完毕后，过滤反应液，旋转蒸干滤液，加入去离子水，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥、浓缩、冷乙醚沉淀，沉淀用二氯甲烷反复溶解、无水乙醚多次洗涤，即得Celastrol-COO-PEG_10k-OOC-Celastrol产物53.60 g，为红黄色固体，HPLC-UV测定其修饰率。

实施例10： mPEG_10k-NHCOO-Celastrol的制备

10 ℃充N₂的条件下，雷公藤红素 4.5 g（10 mmol）加入含有氯化亚砜1.19 g(10 mmol) 的无水DMF溶液中，反应1 h，再于0 ℃充N₂的条件下加入含有t-BuOH 0.89g（12 mmol）、TEA 2.0 mg（20 mmol），反应3 h，得产物tBu-Celastrol。然后在上述反应溶液中加入三光气4.5 g (15 mmol) ，室温下在通风橱中密封反应过夜，搅拌过滤，浓缩，用无水二氯甲烷溶解，加入 TEA 20 mL、NHS 1.726 g(1.5 mmol)，室温搅拌24 h，之后调节pH至9.0，加入甲氧基氨基聚乙二醇mPEG_10k-CH₂CH₂-NH₂·HCl 50 g （4.76 mmol），室温下反应，硅胶板点样监测反应进程。反应完毕后，加入TFA（终浓度为10%），室温静置12 h，过滤反应液，旋转蒸干滤液，加入去离子水，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥、旋转蒸发器浓缩、冷乙醚沉淀，沉淀用二氯甲烷反复溶解、无水乙醚多次洗涤，即得mPEG_10k-NHCOO-Celastrol产物53.10 g，为红黄色固体，HPLC-UV测定其修饰率。

实施例11： Celastrol-OOCNH-PEG_10k-NHCOO-Celastrol的制备

10 ℃充N₂的条件下，雷公藤红素 4.5 g（10 mmol）加入含有氯化亚砜1.19 g (10 mmol) 的无水DMF溶液中，反应1 h，再于0 ℃充N₂的条件下加入含有t-BuOH 0.89g（12 mmol）、TEA 2.0 mg（20 mmol），反应3 h，得产物tBu-Celastrol。然后在上述反应溶液中加入三光气9.0 g (30 mmol) ，室温下在通风橱中密封反应过夜，搅拌过滤，减压浓缩，用无水二氯甲烷溶解，加入 TEA 40 mL、NHS 3.452 g(3.0 mmol)，室温搅拌24 h，之后调节pH至9.0，加入双端氨基聚乙二醇10 kDa（HCl·H₂N-CH₂CH₂-PEG_10k-CH₂CH₂- NH₂·HCl）50 g （4.76 mmol），室温下反应，硅胶板点样监测反应进程。反应完毕后，加入TFA（终浓度为10%），室温静置12 h，过滤反应液，旋转蒸干滤液，加入去离子水，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥、浓缩、冷乙醚沉淀，沉淀用二氯甲烷反复溶解、无水乙醚多次洗涤，即得Celastrol-OOCNH-PEG_10k-NHCOO-Celastrol产物53.41 g，为红黄色固体，HPLC-UV测定其修饰率。

实施例12： mPEG_10k-COO-Celastrol的制备

    10 ℃充N₂的条件下，雷公藤红素 4.5 g（10 mmol）加入含有氯化亚砜1.19 g(10 mmol) 的无水DMF溶液中，反应1 h，再于0 ℃充N₂的条件下加入含有t-BuOH 0.89g（12 mmol）、TEA 2.0 mg（20 mmol），反应3 h，得产物tBu-Celastrol。之后加入甲氧基羧基聚乙二醇mPEG_10k-CH₂CH₂-COOH 50 g（4.76 mmol）、DCC 2.06 g（10 mmol）、DMAP 0.5 g（4 mmol），室温下反应，硅胶板点样监测反应进程。反应完毕后，加入TFA（终浓度为10%），室温静置，过滤反应液，旋转蒸干滤液，加入去离子水，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥、浓缩、冷乙醚沉淀，沉淀用二氯甲烷反复溶解、无水乙醚多次洗涤，即得mPEG_10k-COO-Celastrol产物52.01 g，为红黄色固体，HPLC-UV测定其修饰率。

实施例13： mPEG_10k-OCOO-Celastrol的制备

10 ℃充N₂的条件下，雷公藤红素 4.5 g（10 mmol）加入含有氯化亚砜1.19 g(10 mmol) 的无水DMF溶液中，反应1 h，再于0 ℃充N₂的条件下加入含有t-BuOH 0.89g（12 mmol）、TEA 2.0 mg（20 mmol），反应3 h，得产物tBu-Celastrol。另外称甲氧基羟基聚乙二醇mPEG_10k-CH₂CH₂-OH 50 g（4.76 mmol）加入到含有三光气4.5 g (15 mmol)的无水二氯甲烷反应液中，室温下在通风橱中密封反应过夜，搅拌过滤，减压浓缩，用无水二氯甲烷溶解，加入上述Boc-Celastrol二氯甲烷溶液，室温下在通风橱中密封反应过夜，硅胶板点样监测反应进程。反应完毕后，加入TFA（终浓度为10%），室温静置，过滤反应液，旋转蒸干滤液，加入去离子水，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥、浓缩、冷乙醚沉淀，沉淀用二氯甲烷反复溶解、无水乙醚多次洗涤，即得mPEG_10k-OCOO-Celastrol产物52.12 g，为红黄色固体，HPLC-UV测定其修饰率。

实施例14： Celastrol-OOCO-PEG_10k-OCOO-Celastrol的制备

10 ℃充N₂的条件下，雷公藤红素 4.5 g（10 mmol）加入含有氯化亚砜1.19 g(10 mmol) 的无水DMF溶液中，反应1 h，再于0 ℃充N₂的条件下加入含有t-BuOH 0.89g（12 mmol）、TEA 2.0 mg（20 mmol），反应3 h，得产物tBu-Celastrol。另外称取双羟基聚乙二醇HO-CH₂CH₂-PEG_10k-CH₂CH₂-OH 50 g（4.74 mmol）加入到含有三光气9.0 g (30 mmol)的无水二氯甲烷反应液中，室温下在通风橱中密封反应过夜，搅拌过滤，减压浓缩，用无水二氯甲烷溶解，加入上述Boc-Celastrol二氯甲烷溶液，室温下在通风橱中密封反应过夜，硅胶板点样监测反应进程。反应完毕后，加入TFA（终浓度为10%），室温静置，过滤反应液，旋转蒸干滤液，加入去离子水，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥、浓缩、冷乙醚沉淀，沉淀用二氯甲烷反复溶解、无水乙醚多次洗涤，即得Celastrol-OOCO-PEG_10k-OCOO-Celastrol产物52.56 g，为红黄色固体，HPLC-UV测定其修饰率。

实施例15：mPEG_10k-NHCO-Celastrol注射液的制备

    称取上述方法所制备的mPEG_10k-NHCO-Celastrol 0.2 g，溶于10 ml 注射用生理盐水，0.45 μm 水相过滤，滤液装入洁净的西林瓶中，121 ℃灭菌20 min，即得mPEG_10k-NHCO-Celastrol注射液，含药量10mg/ml。

试验例1：mPEG_10k-NHCO-Celastrol体外细胞毒性试验

将体外的人前列腺癌PC-3细胞、人宫颈癌Hela细胞、人胃癌SGC7901细胞、人肺癌A549细胞、人肝癌SMMC-7721细胞按照2.0×10⁵个细胞/毫升的密度接种到96孔细胞培养板中，分6组（阴性对照组、Celastrol对照组、雷公藤红素组、mPEG_10k-NHCO-Celastrol高中低三个剂量组），24小时后加入不同浓度不同的受试物，与细胞共培养24h后，采用细胞凋亡试剂盒染色，酶标仪测定吸光度，计算受试物的半数抑制浓度（IC₅₀）。实验重复三次。

体外抗肿瘤试验结果：细胞试验发现，雷公藤红素对以上细胞的IC₅₀为0.5～10.0 μM，其中A549细胞对雷公藤红素较为敏感(IC₅₀= 0.68 μM)； mPEG_10k-NHCO-Celastrol的细胞活性只有等摩尔的雷公藤红素活性的3%～15%，原因可能是较大分子量的聚乙二醇对雷公藤红素的屏蔽影响以及聚乙二醇的氨基与雷公藤红素的羧基反应形成酰胺从而引起活性的降低。

试验例2：mPEG_10k-NHCO-Celastrol体内抗肿瘤试验

尽管A549细胞相比其他系细胞对雷公藤红素及聚乙二醇化雷公藤红素的敏感性较高，但是有文献报道裸鼠对A549细胞的免疫较强，故而选用PC-3细胞而非A549细胞进行雷公藤红素与聚乙二醇化雷公藤红素的体内抗肿瘤试验。将PC-3细胞按照8.0×10⁶个/ml的浓度处理，取60只裸鼠，分6组（阴性对照组、Celastrol对照组、雷公藤红素组、mPEG_10k-NHCO-Celastrol高中低三个剂量组），每只小鼠腋窝皮下接种0.2 mL。次日按体重随机分组，生理盐水组，雷公藤红素高中低剂量组和mPEG_10k-NHCO-Celastrol高中低剂量组，连续给药31天，计算抑瘤率。

实验结果：连续注射等摩尔量的Celastrol和mPEG_10k-NHCO-Celastrol，结果发现，mPEG_10k-NHCO-Celastrol组抑瘤率相对较高，这说明mPEG_10k-NHCO-Celastrol能延缓雷公藤红素在裸鼠体内的代谢，从而延长其消除半衰期。