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1、(10)授权公告号 CN 101361764 B (45)授权公告日 2011.10.05 CN 101361764 B *CN101361764B* (21)申请号 200810119495.4 (22)申请日 2008.09.01 A61K 36/074(2006.01) A61K 31/715(2006.01) A61P 1/16(2006.01) A61P 37/02(2006.01) A61K 31/375(2006.01) (73)专利权人 北京世纪博康医药科技有限公司 地址 100070 北京市丰台区丰台科技园区海 鹰路 9 号， 金汤大厦 3 段 203 (72)发明人 郝守祝。
2、 CN 1745641 A,2006.03.15, CN 1634121 A,2005.07.06, CN 1745641 A,2006.03.15, (54) 发明名称 一种含有褐藻多糖硫酸酯和灵芝多糖的组合 物和其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种组合物， 该组合物含有褐 藻多糖硫酸酯和灵芝多糖类物质。本发明组合物 在防治化学性肝损伤、 调节免疫力药品和保健品 中的应用。 发明人的研究表明， 本发明组合物应用 于药品或者保健品长期服用对调节人体免疫系统 平衡、 增强对疾病抵御能力、 治疗化学性肝损伤均 有良好的效果。本发明同时公开了组合物的制备 工艺。 (51)Int.Cl. (56)。
3、对比文件 审查员 王海鹏 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 11 页 附图 4 页 CN 101361764 B1/1 页 2 1. 一种药物组合物， 含有褐藻多糖硫酸酯和灵芝多糖， 其中的灵芝多糖选自灵芝药材、 灵芝提取物、 灵芝孢子粉提取物、 灵芝破壁孢子粉提取物、 灵芝菌丝体提取物的一种或多 种。 2. 根据权利要求 1 的组合物， 其中褐藻多糖硫酸酯和灵芝多糖的重量比为 1 100-100 1。 3. 根据权利要求 1 或 2 的组合物， 其为药品或保健品的形式。 4. 根据权利要求 3 的组合物， 组合物中还含有药学可接受的辅料或保健。
4、品可接受的添 加剂。 5. 根据权利要求 1 的组合物， 其特征是组合物中还含有维生素 C。 6.根据权利要求1、 2或4的组合物， 其为片剂、 丸剂、 胶囊剂、 颗粒剂、 粉剂、 口服液或糖 浆。 7. 权利要求 1 6 的组合物在制备保肝药物或保健品中的用途。 8. 权利要求 1 6 的组合物在制备治疗或预防化学性肝损伤的药物或保健品中的用 途。 9. 权利要求 1 6 的组合物在制备调节人体免疫力的药物或保健品中的用途。 权 利 要 求 书 CN 101361764 B1/11 页 3 一种含有褐藻多糖硫酸酯和灵芝多糖的组合物和其应用 技术领域 0001 本发明公开了一种组合物， 特别公。
5、开了一种以褐藻多糖硫酸酯和灵芝多糖类物质 为活性成分的口服组合物， 进一步的， 本发明公开了该组合物在防治化学肝损伤、 调节免疫 力方面的应用。 背景技术 0002 化学性肝损伤主要来自于工作环境、 食物、 药品和大量饮酒带来的有害物质， 这些 物质类型涵盖无机毒物(重金属、 氯化物等)、 农药、 药品和酒精等。 作为人体重要解毒器官 的肝脏， 具有肝动脉和肝静脉两个渠道血液供应， 化学物质可通过胃肠道门静脉或者体循 环进入肝脏进行转化， 因此肝脏容易受到这些物质中化学毒物的损害。 自工业革命以来， 大 自然和工业生产中存在一些对肝脏有毒性的物质， 研究人员称之为 “亲肝毒物” ， 这些物质 。
6、在人体中易导致患病， 潜伏期短， 病变过程与吸入剂量或者感染剂量呈现正相关， 可引起肝 脏细胞不同程度的坏死、 脂肪变形、 肝硬化和肝癌。工业生产中的原料、 中间产物和最终产 品均可能具有肝毒性， 因此需要十分警惕化学性肝损伤的发生。同时这也要求研究人员能 够研究一些有效的防治肝损伤的药品和保健品。 0003 肝脏是人体的重要器官， 目前人类肝脏疾病患者越来越多， 但是迄今为止尚缺乏 疗效明显兼具副作用小的药物。一般认为， 肝细胞损伤是多种作用的结果。化学物质 ( 比 如氯化碳、 酒精等 ) 所致肝损伤的病理机制多认为与肝内脂肪酸代谢障碍和自由基及其引 发的过氧化有关。 0004 研究认为， 。
7、化学毒物可能通过如下病理机制侵染肝脏 ： 0005 1. 脂肪变性、 四氯化碳、 黄磷等干扰脂质蛋白的合成转运路径， 最后形成脂肪肝。 0006 2. 脂质过氧化反应， 这是一种毒性肝损伤的特定表现形式， 例如四氯化碳等在体 内代谢时产生一种氧化能力很强的中间产物， 这种中间产物作用于生物细胞膜上的脂质形 成过氧化， 从而破坏膜的磷脂层空间结构， 导致细胞的结构和功能发生病理性改变。 0007 3. 胆汁郁积反应， 主要源于肝脏细胞膜和微绒毛受损， 引起胆汁酸排泄障碍。 0008 化学物质导致的肝损伤可由其在肝细胞内的物质代谢引起。 比如细胞内的酒精能 够通过升高 NADH/NAD 的值抑制线。
8、粒体三羧酸循环， 导致肝内脂肪酸代谢障碍， 氧化减弱以 及 NADH 增多， 促进了脂肪酸的合成， 使得中性脂肪在肝细胞内堆积发生脂肪变性， 严重的 脂肪变性甚至导致肝细胞坏死和肝内纤维组织增生。肝损伤疾病， 尤其是脂肪肝和肝功能 异常多伴随血脂水平增高， 这揭示脂肪酸代谢紊乱与脂肪肝和肝损伤有一定关系。 0009 近年来的研究证实脂质过氧化是一个重要的化学性肝损伤路径， 体内过氧化反应 增强可引起机体抗氧化能力下降， 从而自由基的生成增加。随之而来的自由基不仅氧化细 胞膜脂质， 更重要的是会氧化细胞膜蛋白， 从而导致肝细胞功能和结构失常。SOD 和 CAT 等 自由基清除剂可分别清除脂质过氧。
9、化作用中产生的具备高度反应活性的超氧阴离子和羟 自由基， 防治脂质过氧化导致的细胞损伤。 0010 免疫系统是人体内最重要的生物系统之一， 其功能对人体有很大影响。一旦出现 说 明 书 CN 101361764 B2/11 页 4 免疫系统功能失调， 将会导致人体对疾病体康能力弱化。 近年来免疫失调、 免疫功能低下人 群比例越来越大， 长期以往将导致免疫系统疾病患者急剧增多。免疫系统是人体抵御病原 菌侵犯最重要的保卫系统， 这个系统由免疫器官 ( 骨髓、 胸腺、 脾脏、 淋巴结、 扁桃体、 小肠 集合淋巴结、 阑尾等 )、 免疫细胞 ( 淋巴细胞、 单核吞噬细胞、 中性粒细胞、 嗜碱粒细胞、 。
10、嗜酸 粒细胞、 肥大细胞、 血小板等 )， 以及免疫分子 ( 补体、 免疫球蛋白、 细胞因子等 ) 组成。它 是机体防卫病原体入侵最有效的武器， 但其功能的亢进会对自身器官或组织产生伤害。在 很多自身疾病中， 免疫系统功能失常往往是一个重要致病原因。免疫系统各组分功能的正 常是维持机体免疫功能相对稳定的保证， 任何组分的缺陷或功能的亢进都会给机体带来损 害。 0011 免疫系统各组分广布全身， 错综复杂， 特别是免疫细胞和免疫分子在机体内不断 地产生、 循环和更新。免疫系统具有高度的辨别力， 能精确识别自己和非己物质， 以维持机 体的相对稳定性 ； 同时还能接受、 传递、 扩大、 储存和记忆有。
11、关免疫的信息， 针对免疫信息发 生正和负的应答并不断调整其应答性， 因此免疫系统功能的失调也会对人体极为不利 ： 人 体的识别能力异常容易导致过敏现象的发生 ( 使用某种食物、 注射药物出现过敏反应， 甚 至导致休克 )， 反之则会引起反复感染 ； 人体的自我稳定能力异常， 会使免疫系统对自身的 细胞作出反应， 引发自身免疫疾病。 由此可见， 人体免疫系统对人类的健康起着举足轻重的 作用， 如果它的功能不稳定， 人体很有可能会被病毒、 细菌这些病原体侵害。 0012 海藻是海洋水产资源的重要组成部分， 海藻门褐子纲海带目海带科海带属的海带 (Lam/nar/ajaponica aresch) 。
12、是产量最高的海藻， 我国的海带产量位居世界首位。海带又 称海洋蔬菜， 含有丰富的功能性物质， 如碘、 甘露醇、 维生素 (A、 B、 C、 F)、 牛磺酸以及人体所 需要的微量元素硒、 钴、 铬， 是一种既有食用价值， 又有药用、 保健、 工业、 农业价值的大型藻 类产品。 0013 褐藻多糖硫酸酯是一类硫酸化的多糖， 存在于褐藻中， 根据国际命名原则统一称 为 fucoidan( 褐藻糖胶或褐藻聚糖， 岩藻聚糖， 褐藻多糖硫酸酯 )。现在人们对褐藻多糖硫 酸酯的组成有了较为清晰地了解， 它是一类化学组成和结构非常复杂的多糖， 以岩藻糖和 硫酸基为主， 随着藻类的不同还含有半乳糖， 木糖， 糖。
13、醛酸等其他成分。海带 Fucoidan 由岩 藻糖。半乳糖， 木糖， 糖醛酸， 阿拉伯糖等单糖组成。以岩藻糖和半乳糖为主， 二者比例大约 为 3 ： 1。 0014 现有的研究已经证实海带多糖在防治肝损伤、 调节免疫力方面具有良好的效果。 0015 在防治多种原因导致的化学肝损伤方面， 研究证实褐藻多糖硫酸酯能增加某些抗 氧化酶的活性， 减少自由基的产生， 从而减轻自由基对肝脏、 肾脏组织的攻击。 因此， 通过清 除自由基及抗氧化作用， 褐藻多糖硫酸酯可发挥肝保护作用。另外， 褐藻多糖硫酸酯在体 外能直接清除超氧阴离子自由基和羟基自由基 (0H)， 是一种很好的抗氧化剂 ； 在体内也 有较强的。
14、清除活性氧自由基的能力， 能显著降低血清和组织中高脂质过氧化物 (LPO) 的含 量， 显著增强血清和组织中 SOD 活性。 0016 在调节免疫力方面， 海带硫酸多糖对小鼠腹腔巨噬细胞激活及细胞毒作用的影响 ( 聊城大学学报， 2004.17(2)56-57) 研究认为海带硫酸多糖能激活小鼠腹腔巨噬细胞， 增 强其免疫机能， 对抵抗和杀死肿瘤细胞具有积极作用。 0017 海带硫酸多糖对小鼠腹腔巨噬细胞的免疫调节作用 ( 中国免疫学， 2000.2(16) 说 明 书 CN 101361764 B3/11 页 5 研究了一种包含 L- 岩藻糖、 D- 半乳糖等平均分子量为 15000D 的海带。
15、多糖对小鼠吞噬细胞 的激活作用。以肿瘤抑制率衡量， 抑制肿瘤细胞病变有效率达到了 86.5。说明海带多糖 可以有效激活巨噬细胞， 分泌细胞毒效应分子， 提高巨噬细胞过氧化物酶活性以及吞噬功 能。 0018 已有多篇文献公开了褐藻多糖硫酸酯的制备方法。日本专利昭 46-2248 采用十六 烷氯化吡啶或十六烷三甲基溴化铵与褐藻多糖硫酸酯反应成季胺盐复合物， 再利用该复合 物对盐的溶解度差异， 用乙醇、 甲醇和离子交换树脂处理， 纯化除去褐藻胶、 中性多糖和其 它杂质， 而得到比较纯化的褐藻多糖硫酸酸酯。 CN1129109A则公开了由干海带浸泡、 数次过 滤、 二次乙醇提取、 一次乙醇洗涤、 配合。
16、调节 PH 范围等的碱凝析法。CN1344565A 则公开了 另一种制备方法， 包括原料预处理、 控温搅拌浸提、 离心、 浓缩、 乙醇沉淀、 无水乙醇脱水等 步骤。CN1517356A 则将岩藻聚糖硫酸酯配制成水溶液， 加入过氧化氢、 次氯酸或亚硝酸及 其盐， 将所得混合溶液加热， 用截留分子量 3000-5000 的膜超滤， 得到岩藻聚糖硫酸酯低聚 糖。CN1616494A 以天然海藻硫酸多糖为原料， 将海藻硫酸糖溶液中加入抗坏血酸和过氧化 氢， 控制反应温度， 恒温降解时间为 0.5-3hr， 再透析或超滤， 减压浓缩， 制得 4-100KDa 的低 分子量海藻硫酸多糖产物。另外， CN1。
17、670028A、 CN1392160A、 CN1197674A 也分别公开了采用 絮凝等方法制备海藻多糖。在本发明中， 以上发明公开的技术方案均可被引入获得本发明 所用的褐藻多糖硫酸酯。 0019 灵芝 (Ganoderma Lucidum) 为担子菌纲， 多孔菌科灵芝属。在植物学意义上， 灵芝 包括已知近两百种多孔菌科灵芝属植物中的任何一种， 狭义上的灵芝是指为中华人民共和 国药典 (2005 版本， 二部 ) 所收载的赤芝或者紫芝的干燥子实体。根据药典的描述， 灵芝可 以补气安神、 平咳固喘， 同时灵芝也是美国 草药药典 收录的仅有的十种中草药之一。现 代研究表明灵芝的有效成份主要有灵芝多。
18、糖、 灵芝酸、 腺苷、 麦角甾醇、 皂甙、 嘌呤、 嘧啶、 生 物碱、 内酯等， 灵芝多糖是灵芝药理活性的主要成分， 05 版中国药典一部已将灵芝多糖作为 灵芝质量控制标准。 0020 实验表明， 灵芝多糖在衰老、 中毒和氧自由基起着主要作用。 灵芝多糖可抑制氧化 剂tBOOH引起的M膜样变性和坏死， 提高细胞的存活率， 另外对四氧嘧啶引发的小鼠氧自 由基损伤也有保护作用。李明春等人 ( 灵芝多糖对小鼠腹腔巨噬细胞活性氧自由基的影 响 . 中国药理学与毒理学杂志， 2000， 14(1) ： 6568) 采用激光扫描共聚焦显微镜技术， 动 态监测灵芝多糖均一体GL所对小鼠腹腔巨噬细胞(M)活性。
19、氧自由基含量的影响， 实验表 明， 灵芝多糖能降低小鼠腹腔 M 活性氧自由基的产生， 并能拮抗 PMA 引起的小鼠腹腔 M 活性氧自由基的产量。 0021 已有的研究也证实了灵芝多糖在调节免疫力方面的应用。 灵芝孢子多糖对荷瘤小 鼠的免疫调节作用 ( 中国药科大学学报， 2007.38(2) ： 162-166)， 灵芝多糖对小鼠体液免疫 功能的影响 ( 暨南大学学报， 2003.24(2) ： 51-53)， 灵芝多糖 151 服液对小鼠免疫功能影响 的研究 ( 泰山医学院学报， 2004.25(6) ： 586-588) 等文献采用多种实验方案验证了灵芝多 糖对调节免疫的作用。中国专利申请。
20、 CN02151784.3， CN03116403.X， CN200510049438.X 等 均公开了灵芝多糖在调节人体免疫力中的应用。 0022 灵芝多糖的生产， 除以野生或者人工栽培的灵芝子实体为原料外， 也可从灵芝菌 深层发酵的菌丝体或发酵液中提取。 灵芝多糖分子量覆盖很大， 从几百到数十万， 除了小部 说 明 书 CN 101361764 B4/11 页 6 分低分子外大多不溶于高浓度酒精而溶于热水， 因此比较适用水提取 - 醇沉淀工艺。 发明内容 0023 本发明的目的在于提供一种组合物、 制剂， 同时本发明也公开了该组合物、 制剂的 制备方法、 应用。 0024 申请人研究发现通。
21、过将褐藻多糖硫酸酯、 灵芝多糖类物质组合， 对防治化学性肝 损伤、 调节免疫力具有协同的、 突出的效果， 其长期使用安全性和保健效果均优于现有产 品。同时本发明组合物防治化学性肝损伤、 调节免疫力成效上具有协同的治疗作用。其疗 效高于单独成分， 总体上降低了多糖成分的使用量。 安全研究发现， 本发明制剂没有明显的 毒性反应， 适合长期服用。 0025 本发明在本领域第一次引入褐藻多糖硫酸酯和灵芝多糖类物质进行组合用于作 为防治化学性肝损伤。 本发明申请人通过大量实验研究首次确定了将褐藻多糖硫酸酯和灵 芝多糖类物质组合物用于防治化学性肝损伤的可行性。 0026 本发明在本领域第一次引入褐藻多糖硫。
22、酸酯和灵芝多糖组合物用于调节人体免 疫力。 本发明申请人通过大量实验研究首次确定了将褐藻多糖硫酸酯和灵芝多糖组合物用 于调节人体免疫力的可行性。 0027 本发明技术方案提供了一种褐藻多糖硫酸酯和灵芝多糖的组合物， 包含活性成分 褐藻多糖硫酸酯和具有明显协同作用活性的灵芝多糖类物质， 其中灵芝多糖类物质选自灵 芝药材、 灵芝提取物、 灵芝孢子粉提取物、 灵芝破壁孢子粉提取物、 灵芝菌丝体提取物等的 一种或多种， 优选为灵芝菌丝体提取物。 将本发明组合物用于药物制剂时， 还可选择性的包 括药学上可接受的载体。 相应的， 本发明提供了将该组合物用于防治化学性肝损伤、 调节免 疫力的用途。 0028。
23、 在本发明提供的技术方案中， 提供了本发明组合物的口服制剂， 其中含有本发明 组合物和药学上可接受的载体。褐藻多糖硫酸酯和灵芝多糖类物质重量份数比可以是 1 ： 100-100 ： 1， 优选为 1 ： 30-30 ： 1， 最优选为 1 ： 10-10 ： 1。 0029 本发明所用的褐藻多糖硫酸酯取材于海藻类生物， 包括任何可以提供褐藻多糖硫 酸酯的植物， 包括马尾藻、 裙带菜、 羊栖菜、 鼠尾藻、 海黍子、 昆布、 泡叶藻或墨角藻等， 优选 的植物为海带， 无论是人工养殖的还是天然生长的。从这些植物中获得的褐藻多糖硫酸酯 方法可以引用背景技术中所述的技术方法， 所获得的分子量在十万数量级。
24、水平上。 从海带、 马尾藻、 海黍子中获得的褐藻多糖硫酸酯平均分子量分别为 350KD、 550KD、 980KD。本发明 应用时， 可以使用这些分子量比较高的褐藻多糖硫酸酯， 优先选用分子量在 5000D-200KD 低分子量的褐藻多糖硫酸酯， 所用低分子量褐藻多糖硫酸酯可以从海藻中提取也可以从高 分子量褐藻多糖硫酸酯解聚而来。 需要指出的是， 随着技术的持续进步， 可供本发明应用的 褐藻多糖硫酸酯分子量变化是落在本发明范围内的。 所用的褐藻多糖硫酸酯的纯度不小于 50， 优选为不小于 70， 更优选为不小于 90， 最佳是不小于 95。 0030 根据所用藻类种类不同， 所获得的褐藻多糖硫。
25、酸酯主要的基团岩藻糖、 硫酸基含 量存在一定的差异， 但这种差异不影响本发明应用于防治化学性肝损伤， 所带来的只是保 健效果的强化或者弱化， 这是属于本发明范围之内的。本发明所指的褐藻多糖硫酸酯涵盖 化学上所普遍接受的褐藻多糖硫酸酯定义的一类化学物质。 说 明 书 CN 101361764 B5/11 页 7 0031 本发明所用灵芝多糖类物质不受提取工艺的限制。可以引用多种方法来获得。例 如广州食品工业科技 (2003.19(4) ： 12-15) 所提到的现有的获取灵芝多糖的技术方法 ； 灵 芝多糖生物学功能及其提取方法研究(黑龙江医药2007.3(20) ： 207-209)所提到的技术。
26、方 法。 0032 在本发明中， 一个优选的提取工艺可以是 ： 将灵芝菌丝体用水提取 ( 优先用水煮 法或者水回流法， 水温80-100， 时间1-4小时)， 然后用醇沉淀(优选乙醇， 浓度60-95， 温度 4-30， 时间 3-12 小时 )， 由此可获得富含灵芝多糖的初提物。重复上述过程 1-3 次。 即可得本发明灵芝多糖。 0033 根据本发明的精神， 本领域技术人员可以得知应用其他若干常用药材用与替代本 发明所用的灵芝来达到类似或者相同的实施效果。 通过目前已上市的若干防治化学肝损伤 保健品的功效成分和文献， 例如灵芝枸杞复合抗氧化作用 ( 食品与机械， 2004.6) 公开了灵 芝。
27、多糖、 枸杞多糖对羟基自由基、 超氧阴离子自由基等均有良好的防治作用。 本领域技术人 员可以知道枸杞多糖同样可以起到类如本发明灵芝多糖的效果。 这是涵盖在本发明范围内 的。 0034 本发明发明人同时研究了将褐藻多糖硫酸酯灵芝多糖组合物加入维生素 C 所带 来的效果改善， 申请人的实验显示维生素 C 可以在本发明组合的基础上进一步对本发明效 果有所提高， 因此本发明还包括着这样一个技术方案 ： 在本发明组合物的基础上， 加入适量 维生素 C 来改善木发明的实施效果。 0035 本发明组合物可以直接制成制剂， 也可以选择性地加入药学载体然后制成口服制 剂。 本发明组合物对防治人体化学性肝损伤、 。
28、调节免疫力具有积极作用， 因此可以适用于亚 健康人群做保健品。本发明所述的保健品泛指可以提高和保护人体健康状态的产品， 包括 食物和饮料。所指的食物包括但不限于小麦制品、 淀粉制品、 肉类制品、 植物提取物、 奶乳、 保健糖等 ； 所指的饮料包括所有人体可饮用的液体制品包括普通的饮用饮料和用于提高特 定机能的功能饮料， 比如运动饮料。 0036 本发明在应用于保健品时， 还可以在最终制备为产品时加入其他营养成分使用， 这些营养物质包括淀粉、 葡萄糖、 乳糖、 甘露糖、 蔗糖、 糖浆、 蜂蜜、 多种氨基酸、 钙铁锌、 维生 素等。 0037 本发明组合物具体应用时， 可以与辅料结合使用。辅料可包。
29、括赋形剂、 抗氧剂、 PH 调节剂、 防腐剂、 等渗剂等任何药学和营养学上可接受的、 安全性有保证的辅料。 0038 本发明组合物可以制备为多种类型， 包括胶囊、 片剂、 粉剂、 颗粒剂、 口服液或糖浆 等， 优选为胶囊和口服液。改变产品的外表存在形式属于本领域技术人员可以联想到的技 术方案， 因此改变最终产品的形状属于本发明的覆盖范围。 0039 申请人对本发明产品功能进行了研究， 发现与褐藻多糖硫酸酯或灵芝多糖单独应 用相比， 本发明组合物应用可显著降低肝脏、 脑组织和血液中的过氧化物含量、 提高体内抗 氧化剂活性、 清除自由基和脂质过氧化作用， 具有协同的疗效。长期服用本发明产品具有 护。
30、肝作用， 并对预防和 / 或治疗化学性肝损伤有积极作用。免疫调节作用的研究发现本发 明应用可显著提高调节人体免疫力的效果， 并且能同时调节体液、 淋巴、 细胞等多个免疫系 统， 具有协同的疗效。 说 明 书 CN 101361764 B6/11 页 8 具体实施方式 0040 如下实施例旨在说明本发明具体实施方案， 并不限定本发明保护范围。在实施例 中所用的灵芝多糖为依据本发明说明书第六页所获得的。 0041 制备实施例 1 0042 褐藻多糖硫酸酯 1mg 0043 灵芝多糖 10mg 0044 淀粉 18mg 0045 甘露醇 18mg 0046 葡萄糖 15mg 0047 微晶纤维素 1。
31、0mg 0048 硅胶 2mg 0049 将上述成分搅拌混匀成组合物， 测定重量后制成胶囊。 0050 制备实施例 2 0051 褐藻多糖硫酸酯 20mg 0052 灵芝多糖 5mg 0053 淀粉 20mg 0054 甘露醇 22mg 0055 葡萄糖 15mg 0056 微晶纤维素 10mg 0057 硅胶 2mg 0058 将上述成分搅拌混匀成组合物， 测定重量后制成胶囊。 0059 制备实施例 3 0060 褐藻多糖硫酸酯 50mg 0061 灵芝多糖 5mg 0062 淀粉 24mg 0063 甘露醇 24mg 0064 葡萄糖 15mg 0065 微晶纤维素 10mg 0066 硅。
32、胶 3mg 0067 将上述成分搅拌混匀成组合物， 测定重量后制成胶囊。 0068 制备实施例 4 0069 褐藻多糖硫酸酯 40mg 0070 灵芝多糖 9mg 0071 血红素铁 7mg 0072 维生素 C 8ug 0073 叶酸 400ug 0074 将上述成分混匀研磨成粉末溶解于去离子水至 1000ml， 进行密封、 灭菌和分装， 制 备为符合特定规格的口服液。 0075 在大规模生产中本发明制备口服液可以在用量上进行放大， 充分溶解后进行罐装 说 明 书 CN 101361764 B7/11 页 9 然后密封、 灭菌和分装为符合规格的口服液， 比如 500ml， 1L 等。 007。
33、6 对比实施例 1 0077 褐藻多糖硫酸酯 20mg 0078 淀粉 20mg 0079 甘露醇 24mg 0080 葡萄糖 16mg 0081 微晶纤维素 10mg 0082 硅胶 2mg 0083 将上述成分搅拌混匀成组合物， 测定重量后制成胶囊。 0084 对比实施例 2 0085 灵芝多糖 5mg 0086 淀粉 20mg 0087 甘露醇 20mg 0088 葡萄糖 16mg 0089 微晶纤维素 10mg 0090 硅胶 2mg 0091 将上述成分搅拌混匀成组合物， 测定重量后制成胶囊。 0092 实验例 1 0093 实验材料 ： 小白鼠， 健康状况良好。本发明组合物， 褐藻。
34、多糖硫酸酯 : 灵芝多糖 4:1， 溶于水制为混悬液。 0094 实验项目 ： 急性毒性试验 30 天喂养试验 0095 实验方法 ： 0096 1. 急毒性试验 ： 选择小白鼠 40 只， 雌雄各 20 只， 体重为 18-22g。雌雄小鼠各随机 分成四个剂量组 16.00， 7.27， 3.31， 1.50g/KG(bw)， 小鼠灌胃后连续观察 15d， 记录毒性表 现和死亡情况。 0097 2.30d 喂养试验 ： 采用的样品同急毒性试验， 选用体重为 55-70g 的 Wistar 大 鼠， 将大鼠分为对照组和三个剂量组， 高剂量 B 组采用 4.50g/kg(bw)， 中剂量 C 组。
35、 0.90g/ kg(bw)， 低剂量D组0.16g/kg(bw)， 每组十只大鼠， 对照A组喂食正常基础饲料， 饲料摄入量 按照大鼠体重 10计算。连续观察三十天。观察指标包括 ： 0098 (1) 临床观察 ： 动物的一般表现、 行为、 中毒症状、 死亡症状， 每周称取一次体重和 摄入量， 计算食物总利用率。 0099 (2) 血常规及生化指标 ： 在试验第三十一天微静脉取血， 测定血红蛋白 HGB、 红细 胞 RBC、 白细胞 WBC。 0100 1. 急毒性试验结果如下 ： 0101 表 1 本发明组合物急毒性试验结果 0102 说 明 书 CN 101361764 B8/11 页 1。
36、0 0103 假定生产的保健品以成人 60kg 体重日摄入量 0.05g/kg.bw， 对照我们采用的最高 对照组， 相当于成人摄入量的 320 倍。试验观察十四天未见中毒症状， 死亡数为零。受试物 对两种性别的小鼠急毒性LD50均大于15.00g/kg.bw.根据现行的毒性分级， 属于无毒级别。 0104 2.30 天喂养试验结果 0105 1. 对大鼠体重的影响， 结果参见附图 1 0106 结论 ： 各组动物生长正常。与对照组比较， 各剂量组与之不存在统计学差异 (P0.05) 0107 2. 对大鼠食物吸收率的影响， 结果参见附图 2 0108 结论 ： 动物喂食 30 天， 动物未出。
37、现拒食现象。各剂量组动物与对照组动物食物吸 收率不存在统计学差异 (P0.05) 0109 3. 血清学检查结果结果参见附图 3( 本图中血清蛋白单位为 g/dl、 红细胞计数为 *1012/l) 白细胞计数为 *109/l) 0110 结论 ： 剂量组与对照组没有显著的统计学差异 (P0.05)。 0111 综合上述实验结果， 可以认为本品无副作用。 0112 实验例 2 0113 材料与方法 ： Wistar 大鼠， 188-212g ； 本发明组合物， 规格为每份 25mg， 褐藻多糖 硫酸酯 ： 灵芝多糖 4:1， 溶于水制为混悬液 ； 四氯化碳 ； 谷丙转氨酶 ALT ； 谷草转氨酶。
38、 AST ； 甘 油三酯TG。 剂量分组 ： 设置三个剂量组 ： 500mg/kd.bw.d(高剂量组)， 250mg/kd.bw.d(中剂 量组 )， 120mg/kd.bw.d( 低剂量组 )， 受试物稀释至所需要的浓度， 另外设置褐藻多糖硫酸 酯对照组 ( 简写为 A 对照组 )、 灵芝多糖对照组 (B 对照组 ) 和四氯化碳模型组、 阴性对照 组。 褐藻多糖硫酸酯对照组给与褐藻多糖硫酸酯250mg/kd.bw.d， 灵芝多糖对照组给与灵芝 多糖 250mg/kg.bw.d， 四氯化碳模型组， 阴性对照组给与蒸馏水。 0114 实验方法 ： 以 2四氯化碳造急性化学肝脏损伤模型 ： 各剂。
39、量组依据设定剂量给 予本发明组合物(灌胃量5.00ml/kg.bw)， A， B对照组分别给予褐藻多糖硫酸酯、 灵芝多糖。 空白对照组、 模型组给予蒸馏水， 连续三十天。第 30 天将各组动物隔夜禁食 16 小时， 然后 将模型组、 组合物剂量组、 A， B 对照组一次性灌胃给予四氯化碳 (2浓度、 5ml/kg.Bw). 剂 量组、 A、 B 对照组继续给与受试物至 24 小时后结束试验， 处死动物。 ， 取血分离血清， 测定 ALT、 AST 以及肝组织中 TG 含量， 并取肝脏作病理切片。病理组织学观察肝细胞以变性、 坏 死等为技术指标， 。ALT、 AST、 TG 检查结果参见附图 4。
40、， 5， 6。 0115 由图可见， 本发明组合物高剂量组的 ALT 低于四氯化碳模型组， 差异显著 ； 高剂量 组的AST低于四氯化碳模型组， 差异显著。 同时还可以看出， 在同等剂量250mg/kd.bw.d下， 本发明效果明显优于单独的褐藻多糖硫酸酯、 灵芝多糖， 差异显著。相对分别取得了 ALT 指 说 明 书 CN 101361764 B9/11 页 11 标 ： 26.0、 26.7， AST 指标 ： 8.3、 7的改善， 可以认为效果取得了明显进步。在 TG 指 标上也有约 5的改善。 0116 肝细胞病理学组织观察结果参见附图 7 0117 由图可见， 本发明高剂量组肝细胞病。
41、变程度明显小于四氯化碳模型组， 差异显著。 在病理改变程度上， 明显优于褐藻多糖硫酸酯、 灵芝多糖的单独应用。 同等剂量下本发明组 合物相对于褐藻多糖硫酸酯、 灵芝多糖单独应用效果取得了 11.9、 12.0的改善， 改善效 果明显。 上述试验结果显示， 本发明所公开的组合物可以有效防治化学肝损伤、 有效提高人 体免疫能力。 对比对照组， 本发明组合物用于防治化学性肝损伤效果明显， 同等用量下效果 明显好于两个单独组分。 0118 实验例 3 0119 选用雌性小鼠， 随机分为四组， 体重18-22g。 本发明组合物， 其中褐藻多糖硫酸酯 ： 灵芝多糖 3 ： 1， 溶解于去离子水制成混悬液。。
42、注射用环磷酰胺 (cyclophosphamide， Cy)， 用于免疫力低下模型构建。绵羊红细胞 (sheep erythrocyte， SRBC)。 0120 按照人体正常使用量成人 60kg 体重日摄入量 0.05g/kg.Bw， 涉及分成高中低三个 剂量组(剂量分别相当于正常人使用量的5， 2， 1倍)， 每组十只。 另外设置褐藻多糖硫酸酯 对照组、 灵芝多糖对照组、 模型组、 对照组， 分别给予正常人体用量 2 倍的褐藻多糖硫酸酯、 灵芝多糖、 蒸馏水、 蒸馏水， 分别记为 A 对照组、 B 对照组、 模型组。采用灌胃给药， 每日一 次。20 天后测定各项免疫指标。其中在第十五天时除。
43、对照组外每只小鼠腹腔注射 Cy50mg/ kg( 对照组给予等容量生理盐水 ) 连续 2d， 制备免疫功能低下的动物模型 . 第二十天每鼠 尾静脉注入离心后 50的印度墨汁 (0.1ml/10g)， 2min 和 10min 后分别从眼球取血 40l， 并 将其加到4ml0.1NaHCO3溶液中， 600nm波长测定吸光度值， 按文献方法测定吞噬指数。 记 录小鼠体重， 活杀取胸腺并称湿重， 以小鼠胸腺重 / 体重 (mg/g) 作为胸腺指数。半数溶血 值、 淋巴细胞转化率的测定方法采用常规的文献方法， 比如文献 ： 淮山药多糖免疫调节作用 研究(时珍国医国药， 2007.18(5)所采用的方。
44、案DTH测试方法如下 ： 制备DTH模型， 第十五 天每鼠腹部涂 1 DNFB 丙酮麻油溶液 50ml 致敏， 次日同剂量强化 1 次， 同时除对照组外制 备免疫低下模型， 该模型构建方法参考上述用于测试胸腺指数、 吞噬指数的模型构建方法。 致敏后三天， 将 1 DNFB 溶液均匀涂抹于小鼠右耳进行攻击。攻击 24h， 引颈处死小鼠， 剪 下左右耳壳， 用直径 9mm 打孔器打下圆耳片称重， 左右耳片之差为肿胀度。 0121 抗疲劳能力测试无关于免疫力， 因此没有模型组， 也无需采用免疫力低下模型构 建， 只需对照组即可。 0122 结果 1 表 2 对小鼠迟发型变态反应 DTH 的影响 01。
45、23 说 明 书 CN 101361764 B10/11 页 12 0124 结果 2 ： 表 3 对正常小鼠免疫器官胸腺指数的影响 0125 0126 结果 3 ： 表 4 对小鼠巨噬细胞功能的影响 0127 0128 结果 4 ： 表 5 对小鼠淋巴细胞转化率的影响 0129 说 明 书 CN 101361764 B11/11 页 13 0130 结果 5 ： 表 6 对小鼠体液免疫能力的影响 0131 0132 结果 6 ： 表 7 对小鼠抗疲劳能力的影响 0133 0134 对比对照实验组的的数据， 本发明提高免疫力的效果优于单独使用单一成分。 本发明 调节免疫功能涵盖了调节体液系统和。
46、吞噬细胞及淋巴系统， 能够全方位的增强人体免疫力。表 现在 ： 1. 在正常剂量下全方位的增强免疫功能， 包括体液免疫、 吞噬细胞、 淋巴免疫。 。2. 把组 合物单位浓度提高一定剂量(比如5倍量)， 可以抑制人体免疫机能的增强， 或者降低人体免疫 机能。说明本发明用途可以双向调节免疫机能， 高剂量下对免疫力亢奋有一定抑制作用。 说 明 书 CN 101361764 B1/4 页 14 图 1 本发明组合物对大鼠体重的影响 图 2 本发明组合物对大鼠体重的影响 说 明 书 附 图 CN 101361764 B2/4 页 15 图 3 血清学检查结果 图 4 本发明组合物对血 ALT 水平的影响 说 明 书 附 图 CN 101361764 B3/4 页 16 图 5 本发明组合物对血 AST 水平的影响 图 6 本发明组合物对 TG 的影响 说 明 书 附 图 CN 101361764 B4/4 页 17 图 7 病理组织学观察结果 说 明 书 附 图 。