一种大豆叶片特异性启动子 SRS4 及其应用 技术领域 本发明属生物技术领域， 确切地说是大豆叶片光控基因 SRS4 启动子及其在转基 因植物中的应用。
背景技术 大豆为蝶形花科大豆属一年生草本植物， 种子含有丰富的蛋白质， 原产我国， 至今 已有 5000 年的种植史。大豆不仅是重要的食用油脂和蛋白食品原料， 而且是饲养业重要的 蛋白饲料来源， 是我国重要的粮油作物之一。
我国是大豆生产大国， 但由于我国大豆种植面积减少及食用油消费量的不断增长 和养殖业发展对豆粕需求的增加， 导致我国大豆需求量迅速增加， 如今我国也成为世界最 大的大豆净进口国。
目前， 利用传统育种， 改良栽培等方法提高大豆产量已陷入瓶颈 ； 因此， 利用基因 工程来获得优质高产和稳产大豆是我国的当务之急。
植物基因工程研究的主要内容是基因的表达和调控， 但外源基因表达量不足是不 能获得理想转基因植物的重要原因。启动子在决定基因表达方面起着关键作用， 因此选择 合适的植物启动子是增强外源基因表达的首要问题。
组成型启动子在转基因植物应用中暴露出一些问题， 如： 外源基因在整株植物中 表达， 产生大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累， 打破了植物原有的代谢平衡 ； 有些 产物对植物并非必需甚至有毒， 因而阻碍了植物的正常生长， 甚至导致死亡。因此， 人们必 需寻找特异性启动子代替组成型启动子， 以更好地调控外源基因表达。
1， 5- 二磷酸核酮糖羧化 / 加氧酶 (Rubisco) 存在于所有高等植物中， 是光合植 物叶片中含量最丰富的蛋白质， 约占可溶性总蛋白的 50 ％ ； 也是光合作用中的关键酶。 Rubisco 由 8 个大亚基 (rbcL) 和 8 个小亚基 (rbcS) 组成， 其中由核基因编码的小亚基基因 的表达受光调控， 并具有组织特异性。
发明内容
本发明的目的是提供一种大豆叶片特异性启动子 SRS4。
一种大豆叶片特异性启动子 SRS4， 它的碱基序列如 SEQ ID No.1 所示 ；
它是以大豆 “吉农 13” 基因组 DNA 为模板， 以
SS ： 5`-GTGGATGACTCAAGTGCTGG-3`SA ： 5`-TCATTGAGGAAGCCATTTGC-3` 为 引 物， 通 过 PCR 方法扩增获得。
一种含有碱基序列为 SEQ ID No.1 基因的植物表达载体。
本发明另一个目的是， 一种大豆叶片特异性启动子 SRS4， 在转基因植物中的应用， 特别是转基因大豆中的应用。
本发明一种大豆叶片特异性启动子 SRS4， 是用本发明人独特发计的引物， 以大豆 “吉农 13” 基因组 DNA 为模板， 采用 TAIL-PCR 克隆了大豆 rbcS 基因 SRS4 启动子 5` 侧翼，根据 TAIL-PCR 所得序列和已知序列设计特异引物， 克隆大豆 rbcS 基因 SRS4 启动子， 并构 建其植物表达载体， 用农杆菌介导的烟草遗传转化， 表达 GUS 基因的方式进行筛选， 筛出一 种叶片特异性光控启动子 SRS4。
1， 5- 二磷酸核酮糖羧化 / 加氧酶 (Rubisco) 存在于所有高等植物中， 具有双重 功能， 既能催化 RuBP 与 CO2 形成 3- 磷酸甘油酸的反应， 又能催化 RuBP 与 O2 氧化裂解形成 3- 磷酸甘油酸、 磷酸和磷酸乙醇酸的加氧反应 ； 因此， RuBP 羧化酶是处于光合碳还原和光 合碳氧化两个相反方向但又相互连锁的循环交叉点上， 它的含量和活性变化对植物净光合 效率起着决定性作用 ； 为建立植物转基因表达的时、 空、 量三维调控系统奠定理论基础 ； 对 研究基因表达调控、 构建基因工程载体、 表达目的蛋白、 提高产量有着重要的意义。 附图说明 图 1 为 TAIL-PCR 产物的电泳分析， M： DL2000 ； 1， 2， 3 泳道 ： AD2 和特异引物组合所 得的第 1， 2， 3 轮 PCR 产物 ；
图 2 为大豆 rbcS 启动子 SRS4 的电泳分析， M： DL2000 ； 1： 大豆 rbcS 启动子的 PCR 产物。
图 3 为重组质粒的 PCR 及酶切鉴定， M： DL2000， 1： 重组质粒的 PCR 鉴定， 2： 重组质 粒的双酶切鉴定。具体实施方式
实施例 1 提取大豆 “吉农 13” 基因组 DNA
将大豆 “吉农 13” 种子播在装好砂的营养钵中， 放在 RXZ 型智能人工气候培养箱中 培养。种子出芽前采用暗培养， 出芽后采用 Hoagland 营养液培养， 白天 25℃， 黑夜 16℃， 光 照 16h/d， 光强 3000lx， 相对湿度 75％ ； 取生长 2 周的大豆幼苗嫩叶， 按照 AxyPrep 基因组 DNA 小量提取试剂盒进行， 提取大豆 “吉农 13” 基因组 DNA ；
用紫外分光光度计测定 DNA 在 260nm 和 280nm 处吸光度， 计算 DNA 浓度与纯度， 所 得 DNA 浓度为 OD260/OD280 ＝ 1.865， 纯度为 850ng/μl ；
实施例 2 大豆 rbcS 基因 SRS4 启动子 5` 侧翼序列的克隆
采用 TAIL-PCR 克隆大豆 rbcS 启动子 5` 侧翼序列， 操作程序参照刘耀光等的方 法。
引物来源 ： 依据 NCBI 登录的大豆 RuBP 羧化酶小亚基基因 (SRS4) 编码区上游 DNA 序列 (GeneBank accession ： M16889) 设计退火温度较高 (60 ℃ -65 ℃ ) 的 3 个特异引物 SP1， SP2， SP3 ； 经过独特设计的退火温度较低 (40℃ -45℃ ) 的兼并引物 AD2 保存于本实验 室 ( 表 1)。
表1： 引物及碱基组成
以大豆 “吉农 13” 基因组 DNA 为模板， 用特异性的巢式引物 SP1、 SP2 和 SP3 分别 与兼并引物 AD2 进行 3 轮 PCR 扩增 ； 将第一轮 PCR 产物稀释 50 倍作第二轮模板， 将第二轮 PCR 产物稀释 100 倍作第三轮模板。
1％琼脂糖凝胶电泳检测 3 轮 PCR 产物 ( 图 1)， 用 DNA 凝胶回收试剂盒回收第三轮 PCR 产物中的单一条带 ； 将回收产物与 pMD18-T 载体连接， 转化 E.coliJM109 感受态细胞， 进行 Amp(100mg/ml)、 IPTG、 X-gal 筛选 ； 挑白色单菌落扩大培养后提取重组质粒， 重组质粒 经 PCR 鉴定后， 将阳性克隆菌液送上海生工测序 ；
测序结果显示 ： 所得序列长度为 867bp， 两侧含有上下游引物， 同时 3` 端序列与已 知序列的 5` 端部分序列完全相同， 表明已成功克隆到大豆 rbcS 启动子 5` 侧翼序列。
实施例 3 大豆 rbcS 基因 SRS4 启动子 SRS4(1538bp) 的获得
根据 TAIL-PCR 所得序列和已知序列设计特异引物 ：
SS ： 5`-GTGGATGACTCAAGTGCTGG-3`
SA ： 5`-TCATTGAGGAAGCCATTTGC-3`
以大豆 “吉农、 13” 基因组 DNA 为模板， 以 SS， SA 为引物扩增目的基因， 经 1％琼脂 糖凝胶电泳检测， 结果显示 ： 在约 2000bp 处有单一的特异条带 ( 图 2)， 大小与预计理论值 相符。
用 DNA 凝胶回、 收试剂盒回收 PCR 产物 ； 将纯化产物与 pMD18-T 载体连接， 转化 E.coliJM109 感受态细胞， 进行 Amp、 蓝白斑筛选， 选取重组质粒 PCR 及酶切鉴定 ( 图 3) 均 为阳性的克隆菌液送上海生工测序 ； 测序结果分析显示 ： 片段长度为 1538bp， 克隆序列的 部分序列分别与 TAIL-PCR 所得序列、 已知序列部分几乎完全重叠， 表明已成功克隆到大豆 rbcS 启动子序列 ； 其碱基序列如序列表 SEQ ID No.1 所示 ；
大豆 rbcS 基因 SRS4 启动子序列分析
用 DNAman 比对所得大豆 rbcS 基因 SRS4 启动子序列 (1538bp) 和设计引物的大豆 rbcS 启动子序列 (699bp)， 两者相应区域同源性达 97％， 相似性达 45％； 同时也将其与 NCBI 数据库中菜豆 rbcS2 启动子序列、 豌豆的 rbcS 启动子序列相比较， 同源性分别为 73.43％、 33.25％ ； 用 PLACE 分析克隆的大豆 rbcS 启动子序列， 发现共有 10 个 GATA 盒 (GATA)， 5个 I 盒 (GATAAG)， 1 个 GT-1 位点 (GGTTAA)， 5 个 GT-1 保守序列 (GRWAAW)， 3 个 REalpha 元件 (AACCAA)， 这些都是在光诱导表达启动子中的保守元件， 能够调节基因受光诱导后的转录 活性。
实施例 4
一、 大豆 rbcS 基因 SRS4 启动子植物表达载体构建
根据获得的启动子序列设计引物， 在 SSPAS 5` 端引入 PstI 酶切位点， SSPAA 5` 端 引入 NcoI 酶切位点， 以含大豆 SRS4 启动子的重组质粒为模板进行 PCR 扩增。 PCR 反应条件 ： 94℃ 5min ； 94℃ 30s， 60。 ℃ 30s， 72。 ℃ 2min ； 72℃ 10min， 4℃ 15min PCR 扩增， 获得带酶切位 点的启动子序列。 用 PstI/NcoI 双酶切扩增的 PCR 产物和植物表达载体 Pcambia1301， 分别 纯化回收、 连接， 构建大豆 rbcS 基因 SRS4 启动子的植物表达载体， 命名为 Pcambia-GrbcSP。
二、 大豆 rbcS 基因 SRS4 启动子的植物表达载体的功能验证
1、 农杆菌介导的烟草遗传转化及转基因植株的阳性筛选
利用三亲杂交法将构建好的植物表达载体 Pcambia-GrbcSP 导入根癌农杆菌菌株LBA4404， 然后侵染烟草种子萌发后 20d 苗龄的叶片外植体 ( 大小 ： 0.5cm×0.5cm)， 共培养 后用 50mg/L 卡那霉素筛选， 同时以 Pcambia1301 载体作为对照。烟草组织培养、 农杆菌介 导转化、 抗性愈伤组织的筛选及植株再生等实验按参考文献操作， 略有改动。 将获得抗性植 株用 PCR 法进行阳性检测， 引物均为 gus 基因内部引物， 产物大小为 450bp 左右。
2、 GUS 组织化学分析
将阳性转基因植株的叶片、 叶鞘、 茎秆、 根， 切成适当大小， 浸入适量的 GUS 染液 中， 37℃过夜， 用 75％酒精脱色， 观察。染色结果发现 ： rbcS 启动子只驱动 gus 基因在转基 因植株的叶、 叶鞘中表达， 在茎秆、 根中不表达 ； 而 35S 启动子驱动 gus 基因在整个转基因植 株中都表达。
3、 转基因植株光诱导表达 GUS 活性检测
将 PCR 检测的阳性转基因植株在黑暗处培养 6 或 7 天， 取其叶片定量分析 GUS 活 性； 随后将其在正常光照下培养 (16h light， 8h dark) 并在 24h、 48h 和 96h 后分别取其叶 片对 GUS 进行活性分析。
结果显示， 将在黑暗处培养 6 或 7 天的植株移入正常光照下继续培养时， 其 GUS 活 性明显高于黑暗处培养时的 GUS 活性 ； 而且随着光照时间的延长， GUS 活性也越来越高。 三、 大豆 rbcS 基因 SRS4 启动子缺失体植物表达载体构建
根据获得的启动子序列设计引物， 在 SSPAS 5` 端引入 PstI 酶切位点， SSPAA 5` 端 引入 NcoI 酶切位点。以含大豆 SRS4 启动子的重组质粒为模板进行 PCR 扩增目标片段。
SSPAS1 ： 5`-AACTGCAGTCACTGGAACTAACATCTTG-3`
SSPAS2 ： 5`-AACTGCAGAGGCAGTGGCTTCTTATGAG-3`
SSPAS3 ： 5`-AACTGCAGCATCACCTACCATCCCCTTC-3`
SSPAS4 ： 5`-AACTGCAGAACTCCACCACCATCACACA-3`
SSPAA ： 5`-CTAGCCATGGTCATTGAGGAAGCCATTTGC-3`
PCR 反应条件 ： 94℃ 5min ； 94℃ 30s， 60℃ 30s， 72℃ 2min ； 72℃ 10min， 4℃ 15min. PCR 扩 增 获 得 带 酶 切 位 点 的 启 动 子 缺 失 体 序 列， 长度分别为 ： 1089bp、 938bp、 712bp 和 334bp。 用 PstI/NcoI 双酶切扩增的 PCR 产物和植物表达载体 Pcambia1301， 分别纯化回收、 连接， 构建大豆 rbcS 基因 SRS4 启动子缺失体的植物表达载体， 命名为 Pcambia-GrbcSP1、 Pcambia-GrbcSP2、 Pcambia-GrbcSP3 和 Pcambia-GrbcSP4。
同上方法进行启动子缺失体植物表达载体的功能验证。
结果表明 ：
1. 在 获 得 的 转 基 因 植 物 中， Pcambia-GrbcSP1、 Pcambia-GrbcSP2、 Pcambia-GrbcSP3 和 Pcambia-GrbcSP4 与 Pcambia-GrbcSP GUS 组织化学分析结果相同。
2. 定量检测显示 ： 在获得的转基因植物中， Pcambia-GrbcSP 驱动的 GUS 活性最高。
3. 光诱导表达 GUS 活性检测中， Pcambia-GrbcSP 驱动的 GUS 基因大豆 rbcS 基因 光照敏感度最高。
背景技术 大豆为蝶形花科大豆属一年生草本植物， 种子含有丰富的蛋白质， 原产我国， 至今 已有 5000 年的种植史。大豆不仅是重要的食用油脂和蛋白食品原料， 而且是饲养业重要的 蛋白饲料来源， 是我国重要的粮油作物之一。
我国是大豆生产大国， 但由于我国大豆种植面积减少及食用油消费量的不断增长 和养殖业发展对豆粕需求的增加， 导致我国大豆需求量迅速增加， 如今我国也成为世界最 大的大豆净进口国。
目前， 利用传统育种， 改良栽培等方法提高大豆产量已陷入瓶颈 ； 因此， 利用基因 工程来获得优质高产和稳产大豆是我国的当务之急。
植物基因工程研究的主要内容是基因的表达和调控， 但外源基因表达量不足是不 能获得理想转基因植物的重要原因。启动子在决定基因表达方面起着关键作用， 因此选择 合适的植物启动子是增强外源基因表达的首要问题。
组成型启动子在转基因植物应用中暴露出一些问题， 如： 外源基因在整株植物中 表达， 产生大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累， 打破了植物原有的代谢平衡 ； 有些 产物对植物并非必需甚至有毒， 因而阻碍了植物的正常生长， 甚至导致死亡。因此， 人们必 需寻找特异性启动子代替组成型启动子， 以更好地调控外源基因表达。
1， 5- 二磷酸核酮糖羧化 / 加氧酶 (Rubisco) 存在于所有高等植物中， 是光合植 物叶片中含量最丰富的蛋白质， 约占可溶性总蛋白的 50 ％ ； 也是光合作用中的关键酶。 Rubisco 由 8 个大亚基 (rbcL) 和 8 个小亚基 (rbcS) 组成， 其中由核基因编码的小亚基基因 的表达受光调控， 并具有组织特异性。
发明内容
本发明的目的是提供一种大豆叶片特异性启动子 SRS4。
一种大豆叶片特异性启动子 SRS4， 它的碱基序列如 SEQ ID No.1 所示 ；
它是以大豆 “吉农 13” 基因组 DNA 为模板， 以
SS ： 5`-GTGGATGACTCAAGTGCTGG-3`SA ： 5`-TCATTGAGGAAGCCATTTGC-3` 为 引 物， 通 过 PCR 方法扩增获得。
一种含有碱基序列为 SEQ ID No.1 基因的植物表达载体。
本发明另一个目的是， 一种大豆叶片特异性启动子 SRS4， 在转基因植物中的应用， 特别是转基因大豆中的应用。
本发明一种大豆叶片特异性启动子 SRS4， 是用本发明人独特发计的引物， 以大豆 “吉农 13” 基因组 DNA 为模板， 采用 TAIL-PCR 克隆了大豆 rbcS 基因 SRS4 启动子 5` 侧翼，根据 TAIL-PCR 所得序列和已知序列设计特异引物， 克隆大豆 rbcS 基因 SRS4 启动子， 并构 建其植物表达载体， 用农杆菌介导的烟草遗传转化， 表达 GUS 基因的方式进行筛选， 筛出一 种叶片特异性光控启动子 SRS4。
1， 5- 二磷酸核酮糖羧化 / 加氧酶 (Rubisco) 存在于所有高等植物中， 具有双重 功能， 既能催化 RuBP 与 CO2 形成 3- 磷酸甘油酸的反应， 又能催化 RuBP 与 O2 氧化裂解形成 3- 磷酸甘油酸、 磷酸和磷酸乙醇酸的加氧反应 ； 因此， RuBP 羧化酶是处于光合碳还原和光 合碳氧化两个相反方向但又相互连锁的循环交叉点上， 它的含量和活性变化对植物净光合 效率起着决定性作用 ； 为建立植物转基因表达的时、 空、 量三维调控系统奠定理论基础 ； 对 研究基因表达调控、 构建基因工程载体、 表达目的蛋白、 提高产量有着重要的意义。 附图说明 图 1 为 TAIL-PCR 产物的电泳分析， M： DL2000 ； 1， 2， 3 泳道 ： AD2 和特异引物组合所 得的第 1， 2， 3 轮 PCR 产物 ；
图 2 为大豆 rbcS 启动子 SRS4 的电泳分析， M： DL2000 ； 1： 大豆 rbcS 启动子的 PCR 产物。
图 3 为重组质粒的 PCR 及酶切鉴定， M： DL2000， 1： 重组质粒的 PCR 鉴定， 2： 重组质 粒的双酶切鉴定。具体实施方式
实施例 1 提取大豆 “吉农 13” 基因组 DNA
将大豆 “吉农 13” 种子播在装好砂的营养钵中， 放在 RXZ 型智能人工气候培养箱中 培养。种子出芽前采用暗培养， 出芽后采用 Hoagland 营养液培养， 白天 25℃， 黑夜 16℃， 光 照 16h/d， 光强 3000lx， 相对湿度 75％ ； 取生长 2 周的大豆幼苗嫩叶， 按照 AxyPrep 基因组 DNA 小量提取试剂盒进行， 提取大豆 “吉农 13” 基因组 DNA ；
用紫外分光光度计测定 DNA 在 260nm 和 280nm 处吸光度， 计算 DNA 浓度与纯度， 所 得 DNA 浓度为 OD260/OD280 ＝ 1.865， 纯度为 850ng/μl ；
实施例 2 大豆 rbcS 基因 SRS4 启动子 5` 侧翼序列的克隆
采用 TAIL-PCR 克隆大豆 rbcS 启动子 5` 侧翼序列， 操作程序参照刘耀光等的方 法。
引物来源 ： 依据 NCBI 登录的大豆 RuBP 羧化酶小亚基基因 (SRS4) 编码区上游 DNA 序列 (GeneBank accession ： M16889) 设计退火温度较高 (60 ℃ -65 ℃ ) 的 3 个特异引物 SP1， SP2， SP3 ； 经过独特设计的退火温度较低 (40℃ -45℃ ) 的兼并引物 AD2 保存于本实验 室 ( 表 1)。
表1： 引物及碱基组成
以大豆 “吉农 13” 基因组 DNA 为模板， 用特异性的巢式引物 SP1、 SP2 和 SP3 分别 与兼并引物 AD2 进行 3 轮 PCR 扩增 ； 将第一轮 PCR 产物稀释 50 倍作第二轮模板， 将第二轮 PCR 产物稀释 100 倍作第三轮模板。
1％琼脂糖凝胶电泳检测 3 轮 PCR 产物 ( 图 1)， 用 DNA 凝胶回收试剂盒回收第三轮 PCR 产物中的单一条带 ； 将回收产物与 pMD18-T 载体连接， 转化 E.coliJM109 感受态细胞， 进行 Amp(100mg/ml)、 IPTG、 X-gal 筛选 ； 挑白色单菌落扩大培养后提取重组质粒， 重组质粒 经 PCR 鉴定后， 将阳性克隆菌液送上海生工测序 ；
测序结果显示 ： 所得序列长度为 867bp， 两侧含有上下游引物， 同时 3` 端序列与已 知序列的 5` 端部分序列完全相同， 表明已成功克隆到大豆 rbcS 启动子 5` 侧翼序列。
实施例 3 大豆 rbcS 基因 SRS4 启动子 SRS4(1538bp) 的获得
根据 TAIL-PCR 所得序列和已知序列设计特异引物 ：
SS ： 5`-GTGGATGACTCAAGTGCTGG-3`
SA ： 5`-TCATTGAGGAAGCCATTTGC-3`
以大豆 “吉农、 13” 基因组 DNA 为模板， 以 SS， SA 为引物扩增目的基因， 经 1％琼脂 糖凝胶电泳检测， 结果显示 ： 在约 2000bp 处有单一的特异条带 ( 图 2)， 大小与预计理论值 相符。
用 DNA 凝胶回、 收试剂盒回收 PCR 产物 ； 将纯化产物与 pMD18-T 载体连接， 转化 E.coliJM109 感受态细胞， 进行 Amp、 蓝白斑筛选， 选取重组质粒 PCR 及酶切鉴定 ( 图 3) 均 为阳性的克隆菌液送上海生工测序 ； 测序结果分析显示 ： 片段长度为 1538bp， 克隆序列的 部分序列分别与 TAIL-PCR 所得序列、 已知序列部分几乎完全重叠， 表明已成功克隆到大豆 rbcS 启动子序列 ； 其碱基序列如序列表 SEQ ID No.1 所示 ；
大豆 rbcS 基因 SRS4 启动子序列分析
用 DNAman 比对所得大豆 rbcS 基因 SRS4 启动子序列 (1538bp) 和设计引物的大豆 rbcS 启动子序列 (699bp)， 两者相应区域同源性达 97％， 相似性达 45％； 同时也将其与 NCBI 数据库中菜豆 rbcS2 启动子序列、 豌豆的 rbcS 启动子序列相比较， 同源性分别为 73.43％、 33.25％ ； 用 PLACE 分析克隆的大豆 rbcS 启动子序列， 发现共有 10 个 GATA 盒 (GATA)， 5个 I 盒 (GATAAG)， 1 个 GT-1 位点 (GGTTAA)， 5 个 GT-1 保守序列 (GRWAAW)， 3 个 REalpha 元件 (AACCAA)， 这些都是在光诱导表达启动子中的保守元件， 能够调节基因受光诱导后的转录 活性。
实施例 4
一、 大豆 rbcS 基因 SRS4 启动子植物表达载体构建
根据获得的启动子序列设计引物， 在 SSPAS 5` 端引入 PstI 酶切位点， SSPAA 5` 端 引入 NcoI 酶切位点， 以含大豆 SRS4 启动子的重组质粒为模板进行 PCR 扩增。 PCR 反应条件 ： 94℃ 5min ； 94℃ 30s， 60。 ℃ 30s， 72。 ℃ 2min ； 72℃ 10min， 4℃ 15min PCR 扩增， 获得带酶切位 点的启动子序列。 用 PstI/NcoI 双酶切扩增的 PCR 产物和植物表达载体 Pcambia1301， 分别 纯化回收、 连接， 构建大豆 rbcS 基因 SRS4 启动子的植物表达载体， 命名为 Pcambia-GrbcSP。
二、 大豆 rbcS 基因 SRS4 启动子的植物表达载体的功能验证
1、 农杆菌介导的烟草遗传转化及转基因植株的阳性筛选
利用三亲杂交法将构建好的植物表达载体 Pcambia-GrbcSP 导入根癌农杆菌菌株LBA4404， 然后侵染烟草种子萌发后 20d 苗龄的叶片外植体 ( 大小 ： 0.5cm×0.5cm)， 共培养 后用 50mg/L 卡那霉素筛选， 同时以 Pcambia1301 载体作为对照。烟草组织培养、 农杆菌介 导转化、 抗性愈伤组织的筛选及植株再生等实验按参考文献操作， 略有改动。 将获得抗性植 株用 PCR 法进行阳性检测， 引物均为 gus 基因内部引物， 产物大小为 450bp 左右。
2、 GUS 组织化学分析
将阳性转基因植株的叶片、 叶鞘、 茎秆、 根， 切成适当大小， 浸入适量的 GUS 染液 中， 37℃过夜， 用 75％酒精脱色， 观察。染色结果发现 ： rbcS 启动子只驱动 gus 基因在转基 因植株的叶、 叶鞘中表达， 在茎秆、 根中不表达 ； 而 35S 启动子驱动 gus 基因在整个转基因植 株中都表达。
3、 转基因植株光诱导表达 GUS 活性检测
将 PCR 检测的阳性转基因植株在黑暗处培养 6 或 7 天， 取其叶片定量分析 GUS 活 性； 随后将其在正常光照下培养 (16h light， 8h dark) 并在 24h、 48h 和 96h 后分别取其叶 片对 GUS 进行活性分析。
结果显示， 将在黑暗处培养 6 或 7 天的植株移入正常光照下继续培养时， 其 GUS 活 性明显高于黑暗处培养时的 GUS 活性 ； 而且随着光照时间的延长， GUS 活性也越来越高。 三、 大豆 rbcS 基因 SRS4 启动子缺失体植物表达载体构建
根据获得的启动子序列设计引物， 在 SSPAS 5` 端引入 PstI 酶切位点， SSPAA 5` 端 引入 NcoI 酶切位点。以含大豆 SRS4 启动子的重组质粒为模板进行 PCR 扩增目标片段。
SSPAS1 ： 5`-AACTGCAGTCACTGGAACTAACATCTTG-3`
SSPAS2 ： 5`-AACTGCAGAGGCAGTGGCTTCTTATGAG-3`
SSPAS3 ： 5`-AACTGCAGCATCACCTACCATCCCCTTC-3`
SSPAS4 ： 5`-AACTGCAGAACTCCACCACCATCACACA-3`
SSPAA ： 5`-CTAGCCATGGTCATTGAGGAAGCCATTTGC-3`
PCR 反应条件 ： 94℃ 5min ； 94℃ 30s， 60℃ 30s， 72℃ 2min ； 72℃ 10min， 4℃ 15min. PCR 扩 增 获 得 带 酶 切 位 点 的 启 动 子 缺 失 体 序 列， 长度分别为 ： 1089bp、 938bp、 712bp 和 334bp。 用 PstI/NcoI 双酶切扩增的 PCR 产物和植物表达载体 Pcambia1301， 分别纯化回收、 连接， 构建大豆 rbcS 基因 SRS4 启动子缺失体的植物表达载体， 命名为 Pcambia-GrbcSP1、 Pcambia-GrbcSP2、 Pcambia-GrbcSP3 和 Pcambia-GrbcSP4。
同上方法进行启动子缺失体植物表达载体的功能验证。
结果表明 ：
1. 在 获 得 的 转 基 因 植 物 中， Pcambia-GrbcSP1、 Pcambia-GrbcSP2、 Pcambia-GrbcSP3 和 Pcambia-GrbcSP4 与 Pcambia-GrbcSP GUS 组织化学分析结果相同。
2. 定量检测显示 ： 在获得的转基因植物中， Pcambia-GrbcSP 驱动的 GUS 活性最高。
3. 光诱导表达 GUS 活性检测中， Pcambia-GrbcSP 驱动的 GUS 基因大豆 rbcS 基因 光照敏感度最高。
6101979563 A CN 101979568
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