具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核苷酸及其应用 本申请是申请日为 2008 年 1 月 23 日、 申请号为 200810004736.0、 发明名称为 “具 有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核苷酸及其应用” 的申请的分案申请。技术领域
本发明涉及生物领域， 具体地说， 涉及一种具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核 苷酸及其应用。 背景技术 上世纪八十年代日本学者发现卡介苗 (BCG) 中的 DNA 组分在人和动物体内具有抗 肿瘤活性， 后来研究反义核酸治疗的科学家又发现人工合成的硫代寡聚脱氧核苷酸存在非 特异的免疫刺激活性。Krieg AM 等在 《Nature》 1995， 第 374 卷、 第 546-549 页中揭示了这 些现象的本质， 发现核酸中的免疫刺激活性成分是一些含有非甲基化 5′ -CpG-3′二核苷 酸的六核苷酸序列， 特征为 5’ -PuPuCpGPyPy-3’ (Pu 代表嘌呤 A 或 G ； Py 代表嘧啶 C 或 T)， 如 5’ -GACGTT-3’ 等。其中， 核心核苷酸 C 和 G 为其活性所必需， 两端各两个核苷酸也与其 活性紧密相关。 上述六核苷酸特征序列称作 CpG 基元 (CpG motif)， 含有 CpG 基元的寡聚脱 氧核苷酸统称为 CpG 寡聚脱氧核苷酸 (CpG-ODN)。含有上述特征的 CpG-ODN 对小鼠具有良 好的免疫刺激活性， 动物实验结果显示了 CpG-ODN 在疫苗佐剂、 肿瘤预防和治疗、 感染预防 和治疗以及过敏预防和治疗等领域具有良好的应用前景。 但是进一步研究发现其免疫刺激 活性具有种属特异性， 因此阐明活化人免疫细胞的 CpG 基元和 CpG-ODN 是将 CpG-ODN 应用 于人体临床的必要前提。Krieg AM 等在 《The Journal of Immunology 2000， 第 164 卷、 第 1617-1624 页中报道了第一个能够活化人免疫细胞的 CpG 基元 5’ -GTCGTT-3’ 。由此衍生的 CpG-ODN( 如 CpG-ODN 2006) 在体外对人免疫细胞具有良好的免疫刺激活性， 而且目前多个 人体临床研究也证实了 CpG-ODN 2006 在疫苗佐剂、 肿瘤治疗以及感染治疗等领域的免疫 效果。根据 Krieg AM 等研究结果， 上述 CpG-ODN 是人特异的， 对小鼠没有活性， 因此只能用 猴子等灵长类动物作为动物模型来评价这些序列在体内的免疫刺激活性， 这增加了实验的 难度， 例如成本增加、 动物来源难于获得等。因此， 发现一种非种属特异性的广谱 CpG-ODN 是十分有必要的。
对于有关 CpG-ODN 的研究在文献 《中华微生物学和免疫学杂志》 2001， 21(5)， 第 471-475 页、 《动物医学进展》 2004， 25(4)， 第 25-28 页、 《Gene Therapy》 1996， 第 6 卷， 第 893-903 页中有所描述。另外， 专利文献 CN 1271733A、 CN 1526718A、 US 2005/0267057A1 或 WO 99/56755 中也公开了一些 CpG-ODN 及其相关的应用， 但是在上述文献中， 均未公开有 关具有两个或两个以上拷贝的 5’ -NTCGTT-3’ 基元 (N 不代表 A 或 G) 的核苷酸， 也未公开任 何有关包含该基元的硫代寡聚脱氧核苷酸对人和小鼠具有交叉免疫刺激活性的技术启示。
发明内容
本发明的目的在于提供一种非种属特异性的、 具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核苷酸。更具体地说， 本发明提供了一种对人和小鼠具有交叉免疫刺激活性的硫代寡聚脱 氧核苷酸。
本发明的目的还在于提供该具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核苷酸在制备疫 苗佐剂以及在制备预防或治疗肿瘤、 感染和过敏的药物中的应用。
本发明人在现有技术的基础上进行研究， 发现 ： (1) 活化人免疫细胞的 CpG 基元 为 5’ -NTCGTPy-3’ ( 其中 N 代表 A、 G、 C 或 T， Py 代表嘧啶 C 或 T) ； (2) 活化小鼠免疫细胞 的 CpG 基元为 5’ -NA/TCGTT-3’ ( 其中 N 代表 A、 G、 C 或 T)。在此研究基础上， 发现出含有 5’ -NTCGTT-3’ 基元 ( 包括 5’ -ATCGTT-3’ 、 5’ -GTCGTT-3’ 、 5’ -CTCGTT-3’ 和 5’ -TTCGTT-3’ ) 的 CpG-ODN 对人和小鼠具有交叉免疫刺激活性。发明人进一步研究表明， 核苷酸序列中具 有两个或两个以上拷贝的 5’ -NTCGTT-3’ 基元 (N 不代表 A 或 G) 是本发明所述的硫代寡聚 脱氧核苷酸对人和小鼠具有交叉免疫刺激活性的关键。
鉴于此， 本发明提供了一种具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核苷酸， 其序列中 具有两个或两个以上拷贝的 5’ -NTCGTT-3’ 基元， 所述 N 不代表 A 或 G， 优选为 T 或 C。所述 硫代寡聚脱氧核苷酸的长度为 15 ～ 35 个核苷酸， 优选为 20 ～ 30 个核苷酸。所述 CpG 是 非甲基化的。
当 N 为 T 时， 所述硫代寡聚脱氧核苷酸的序列优选为 ： 5’ -TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ 、 5’ -TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ 、 5’ -TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ 、 5’ -TCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’ 、 5’ -TCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’ 、 5’ -TCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’ 、 5’ -TTCGTTTTTCGTTTTTCGTT-3’ 、 5’ -TTCGTTATTCGTTATTCGTT-3’ 、 5’ -TTCGTTGTTCGTTGTTCGTT-3’ 、 5’ -TTCGTTCTTCGTTCTTCGTT-3’ 、 5’ -TCTTCGTTTTTCGTTTTTCGTT-3’ 、 5’ -TCTTCGTTATTCGTTATTCGTT-3’ 、 5’ -TCTTCGTTGTTCGTTGTTCGTT-3’ 、 5’ -TCTTCGTTCTTCGTTCTTCGTT-3’ 、 5’ -TTCGTTTTCGTTTTCGTTTTCGTT-3’ 、 5’ -TCTTCGTTTTCGTTTTCGTT-3’ 、 5’ -TTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’ 、 5’ -TTCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’ 、 5’ -TTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ 、 5’ -TCTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ 、 5’ -TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ 或 5’ -TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ 。 当所述 N 为 C 时， 所述硫代寡聚脱氧核苷酸的序列优选为 ：5’ -TCGTCTCGTTTCGTCTCGTT-3’ 或
5’ -TCGTCTCGTTTCGTCTCGTTTCGTCTCGTT-3’ 。
本发明所述的硫代寡聚脱氧核苷酸的制备方法是本领域技术人员所熟知的， 例如 可以采用固相亚磷酰胺三酯法化学合成， 此法具有高效和快速偶联等优点， 已广泛应用于 DNA 化学合成领域中。目前对于寡聚脱氧核苷酸人工合成多委托专业的基因合成公司来处 理， 例如国内可委托上海生工生物技术公司合成。
固相亚磷酰胺三酯法由 3’ 端开始， 具体反应步骤如下 ：
1. 脱保护基 ： 用三氯乙酸脱去连接在 CPG(Controlled Pore Glass) 上的核苷酸 的保护基团 DMT( 二甲氧基三苯甲基 )， 获得游离的 5’ 羟基， 以供下一步缩合反应使用 ；
2. 活化 ： 将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱， 形成 亚磷酰胺四唑活性中间体 ( 其 3’ 端已被活化， 但 5’ 端仍受 DMT 保护 )， 此中间体与 CPG 上 已脱保护基的核苷酸发生缩合反应 ；
3. 连接 ： 亚磷酰胺四唑活性中间体遇到 CPG 上已脱保护基的核苷酸时， 将与其 5’ 羟基发生亲合反应， 缩合并脱去四唑， 此时寡核苷酸链向前延长一个碱基 ；
4. 氧化 ： 缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在 CPG 上的寡核苷酸连接， 而亚磷酯键不稳定， 易被酸或碱水解， 此时使用硫代试剂将亚磷酰胺氧化为硫磷双键的磷 酸三酯， 从而得到稳定的寡核苷酸 ；
5. 封闭 ： 缩合反应后为了防止连在 CPG 上的未参与反应的 5’ 羟基在随后的循环 反应中被延伸， 常通过乙酰化来封闭此端羟基。
经过以上五个步骤后， 一个脱氧核苷酸就被连到 CPG 的核苷酸上。重复以上的脱 保护基、 活化、 连接、 氧化、 封闭过程即可得到一个 DNA 片段粗品。最后对其进行切割、 脱保 护基、 纯化 ( 常用的有 PAGE 法、 HPLC 法、 C18 法和 OPC 法等方法 )、 定量等合成后处理即可 得到符合本发明要求的硫代寡聚脱氧核苷酸。
本发明还提供了硫代寡聚脱氧核苷酸在制备疫苗佐剂中的应用。
本发明还提供了硫代寡聚脱氧核苷酸在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明还提供了硫代寡聚脱氧核苷酸在制备预防或治疗感染的药物中的应用。
本发明还提供了硫代寡聚脱氧核苷酸在制备预防或治疗过敏的药物中的应用。
所述硫代寡聚脱氧核苷酸在体外对人和小鼠免疫细胞均有良好的免疫刺激活性， 可以从对小鼠中的免疫刺激活性结果来评价其在人体中的免疫刺激活性。作为疫苗佐剂， 其能够显著增强小鼠对基因工程乙肝疫苗的免疫应答， 而且能够使免疫应答偏向 TH1 方向。 由于本发明所述的硫代寡聚脱氧核苷酸能够诱生出很强的 TH1 类免疫应答， 表明其也可用 于过敏和感染的预防和治疗。同时， 本发明所述的硫代寡聚脱氧核苷酸在小鼠体内也具有 良好的抑制肿瘤生长的活性。 附图说明
图 1 为示出具有 5’ -NTCGTPy-3’ ( 其中 N 代表 A、 G、 C 或 T， Py 代表嘧啶 C 或 T) 基 元的寡聚脱氧核苷酸的人免疫刺激活性的图。
图 2 为示出具有 5’ -NA/TCGTT-3’ ( 其中 N 代表 A、 G、 C 或 T) 基元的寡聚脱氧核苷 酸的小鼠免疫刺激活性的图。图 3a 为示出本发明寡聚脱氧核苷酸 (T1 ～ T6、 C1 和 C2) 以及对照序列 1826 的人 免疫刺激活性的图。
图 3b 为示出本发明寡聚脱氧核苷酸 (T7 ～ T14) 的人免疫刺激活性的图。
图 3c 为示出本发明寡聚脱氧核苷酸 (T15 ～ T22) 的人免疫刺激活性的图。
图 4a 为示出本发明寡聚脱氧核苷酸 (T1 ～ T6、 C1 和 C2) 以及对照序列 1826 和 T7C 的小鼠免疫刺激活性的图。
图 4b 为示出本发明寡聚脱氧核苷酸 (T7 ～ T14) 的小鼠免疫刺激活性的图。
图 4c 为示出本发明寡聚脱氧核苷酸 (T15 ～ T22) 的小鼠免疫刺激活性的图。
图 5 为示出本发明寡聚脱氧核苷酸作为疫苗佐剂增强小鼠对基因工程乙肝表面 抗原的免疫应答的图。
图 6 为示出本发明寡聚脱氧核苷酸与其它疫苗佐剂联用增强小鼠对基因工程乙 肝表面抗原的免疫应答的图。
图 7 为示出本发明寡聚脱氧核苷酸在小鼠体内诱生 TH1 类免疫应答的图。
图 8 为示出本发明寡聚脱氧核苷酸在小鼠体内抑制肿瘤生长的图。 具体实施方式 以下结合附图通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明， 但这并非是对本 发明的限制， 本领域技术人员根据本发明的基本思想， 可以做出各种修改或改进， 但是只要 不脱离本发明的基本思想， 均在本发明的范围之内。
实施例 1. 具有 5’ -NTCGTPy-3’ ( 其中 N 代表 A、 G、 C 或 T， Py 代表嘧啶 C 或 T) 基 元的寡聚脱氧核苷酸的人免疫刺激活性
为了阐明活化人免疫细胞的 CpG 基元， 本发明人对 CpG 基元中除核心核苷酸 CpG 以外的其余四个核苷酸进行了突变研究。 为此， 发明人设计了一组 CpG-ODN， 如表 1 所示， 每 条序列长度为 12 个核苷酸， 均含有两个相同拷贝的 CpG 基元。用这些 CpG-ODN 刺激体外培 养的人外周血单个核细胞 (PBMC)， 通过测定培养上清中的 IgM 含量， 即可评价它们对人免 疫细胞的活性。
本实施例中所使用的 CpG-ODN 由本发明人设计， 委托上海生工生物技术公司进行 人工合成， 并进行全链硫代修饰， 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 纯化， 溶于生理盐水， -20℃ 冰箱中保存备用。
表1
序号 1 2 3编号 1444 2444 3444序列 5’ -ATCGTT ATCGTT-3’ 5’ -GTCGTT GTCGTT-3’ 5’ -CTCGTT CTCGTT-3’6101979566 A CN 101979571说4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 4444 2144 2244 2344 2444 2414 2424 2434 2444 2441 2442 2443 2444明书5/12 页5’ -TTCGTT TTCGTT-3’ 5’ -GACGTT GACGTT-3’ 5’ -GGCGTT GGCGTT-3’ 5’ -GCCGTT GCCGTT-3’ 5’ -GTCGTT GTCGTT-3’ 5’ -GTCGAT GTCGAT-3’ 5’ -GTCGGT GTCGGT-3’ 5’ -GTCGCT GTCGCT-3’ 5’ -GTCGTT GTCGTT-3’ 5’ -GTCGTA GTCGTA-3’ 5’ -GTCGTG GTCGTG-3’ 5’ -GTCGTC GTCGTC-3’ 5’ -GTCGTT GTCGTT-3’无菌条件下取健康人静脉血， 肝素抗凝后用人淋巴细胞分离液 ( 购自北方同正生 物技术公司 ) 分离 PBMC ； 计数后用 RPMI 1640 培养基 ( 购自美国 Gibco 公司 ) 将细胞浓度 6 调整至 1×10 /ml， 接种至 96 孔细胞板中， 每孔 200μl ； 加入 CpG-ODN 至终浓度为 2μM， 5％ CO2 条件下 37℃培养 8 天。用羊抗人 IgM( 购自美国 SIGMA 公司 ) 包被 96 孔酶标板， 每孔 200ng， 4℃过夜 ； 洗板 3 次后加入上述 PBMC 培养上清， 每孔 100μl， 37℃作用 1 小时 ； 洗板 3 次后加入 1 ∶ 10000 稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人 IgM( 购自美国 SIGMA 公司 )， 每孔 100μl， 37℃作用 1 小时 ； 洗板 3 次后用邻苯二胺 (OPD) 显色， 2M 硫酸终止反应， 用分 光光度计测定 490nm 处吸光度值 OD490。所测得 OD490 值越大， 表明该 CpG-ODN 对人免疫细 胞的活性越强。
结果详见图 1， 其中 “对照” 为不加 CpG-ODN 的细胞对照。序号为 1 ～ 4 的四个序 列， 仅在 CpG 基元的第一位核苷酸不同， 结果显示它们对人免疫细胞的活性相当， 表明活化 人免疫细胞的 CpG 基元的第一位核苷酸为 N( 其中 N 代表 A、 G、 C 或 T) ； 序号为 5 ～ 8 的四 个序列， 仅在 CpG 基元的第二位核苷酸不同， 结果显示该位置必须为 T， 否则对人免疫细胞 的活性很弱 ； 序号为 9 ～ 12 的四个序列， 仅在 CpG 基元的第五位核苷酸不同， 结果显示该位 置也必须为 T， 否则对人免疫细胞的活性很弱 ； 序号为 13 ～ 16 的四个序列， 仅在 CpG 基元的
第六位核苷酸不同， 结果显示该位置为 C 或 T 时具有较好的免疫刺激活性。综上所述， 活化 人免疫细胞的 CpG 基元为 5’ -NTCGTPy-3’ ( 其中 N 代表 A、 G、 C 或 T， Py 代表嘧啶 C 或 T)。
实施例 2. 具有 5’ -NA/TCGTT-3’ ( 其中 N 代表 A、 G、 C 或 T) 基元的寡聚脱氧核苷 酸对小鼠的免疫刺激活性
为了阐明活化小鼠免疫细胞的 CpG 基元， 本发明人对 CpG 基元中除核心核苷酸 CpG 以外的其余四个核苷酸进行了突变研究。本实施例中使用的 CpG-ODN 序列见表 1。用这些 CpG-ODN 刺激小鼠脾脏单个核细胞 (SMMC)， 通过测定培养上清中的 IgM 含量， 即可评价它们 对小鼠免疫细胞的活性。所使用的为 Balb/c 小鼠， 雌性， 6 ～ 8 周， 购自中国医学科学院实 验动物中心。
无菌条件下取 Balb/c 小鼠脾脏， 用 RPMI 1640 培养基制备 SMMC 悬液 ； 计数后用 6 RPMI 1640 培养基将细胞浓度调整至 1×10 /ml， 接种至 96 孔细胞板中， 每孔 200μl ； 加入 CpG-ODN 至终浓度为 2μM， 5％ CO2 条件下 37℃培养 3 天。用羊抗小鼠 IgM( 购自美国 SIGMA 公司 ) 包被 96 孔酶标板， 每孔 200ng， 4℃过夜 ； 洗板 3 次后加入上述 SMMC 培养上清， 每孔 100μl， 37℃作用 1 小时 ； 洗板 3 次后加 1 ∶ 10000 稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小 鼠 IgM( 购自美国 SIGMA 公司 )， 每孔 100μ1， 37℃作用 1 小时 ； 洗板 3 次后用 OPD 显色， 2M 硫酸终止反应， 用分光光度计测定 490nm 处吸光度值 OD490。所测得 OD490 值越大， 表明该 CpG-ODN 对小鼠免疫细胞的活性越强。 结果详见图 2， 其中 “对照” 为不加 CpG-ODN 的细胞对照。序号为 1 ～ 4 的四个序 列， 仅在 CpG 基元的第一位核苷酸不同， 结果显示它们对小鼠免疫细胞的活性相当， 表明活 化小鼠免疫细胞的 CpG 基元的第一位核苷酸为 N( 其中 N 代表 A、 G、 C 或 T) ； 序号为 5 ～ 8 的四个序列， 仅在 CpG 基元的第二位核苷酸不同， 结果显示该位置必须为 A 或 T， 否则对小 鼠免疫细胞的活性很弱 ； 序号为 9 ～ 12 的四个序列， 仅在 CpG 基元的第五位核苷酸不同， 结 果显示该位置必须为 T， 否则对小鼠免疫细胞的活性很弱 ； 序号为 13 ～ 16 的四个序列， 仅 在 CpG 基元的第六位核苷酸不同， 结果显示该位置也必须为 T， 否则对小鼠免疫细胞的活性 很弱。综上所述， 活化小鼠免疫细胞的 CpG 基元为 5’ -NA/TCGTT-3’ ( 其中 N 代表 A、 G、 C或 T)。
由 实 施 例 1 和 2 的 研 究 结 果 可 知，活 化 人 免 疫 细 胞 的 CpG 基 元 为 5’ -NTCGTPy-3’ ( 其中 N 代表 A、 G、 C 或 T， Py 代表嘧啶 C 或 T) ； 活化小鼠免疫细胞的 CpG 基元为 5’ -NA/TCGTT-3’ ( 其中 N 代表 A、 G、 C 或 T)。综合上述研究结果， 可以看出对人和 小鼠具有交叉免疫刺激活性的 CpG 基元为 5’ -NTCGTT-3’ ( 其中 N 代表 A、 G、 C 或 T)。
实施例 3. 本发明寡聚脱氧核苷酸对人免疫细胞的免疫刺激活性
根据实施例 1 和 2 中发现的对人和小鼠具有交叉免疫刺激活性的 CpG 基元， 发明 人设计合成了一组 CpG-ODN， 如表 2 所示， 长度为 15 ～ 35 个核苷酸， 分别含有两个或多于 两个拷贝的 5’ -TTCGTT-3’ 基元 ( 编号为 T1 ～ T22) 和 5’ -CTCGTT-3’ 基元 ( 编号为 C1 和 C2)。
表 2 中的 CpG-ODN 除了对照序列 T7C 和 1826 分别引自文献 《中华微生物学和免 疫学杂志》 2001， 21(5)， 第 471-475 页、 《The Journal of Immunology》 1998， 第 160 卷， 第 870-876 页， 其余均由本发明人设计。 本实施例中所用对照序列以及发明人自行设计的序列 均委托上海生工生物技术公司进行合成， 全链硫代修饰， PAGE 纯化， 溶于生理盐水， -20℃冰
箱中保存备用。
表2
编号 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15 T16 T17 T18序列 5’ -TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ 5’ -TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ 5’ -TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ 5’ -TCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’ 5’ -TCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’ 5’ -TCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’ 5’ -TTCGTTTTTCGTTTTTCGTT-3’ 5’ -TTCGTTATTCGTTATTCGTT-3’ 5’ -TTCGTTGTTCGTTGTTCGTT-3’ 5’ -TTCGTTCTTCGTTCTTCGTT-3’ 5’ -TCTTCGTTTTTCGTTTTTCGTT-3’ 5’ -TCTTCGTTATTCGTTATTCGTT-3’ 5’ -TCTTCGTTGTTCGTTGTTCGTT-3’ 5’ -TCTTCGTTCTTCGTTCTTCGTT-3’ 5’ -TTCGTTTTCGTTTTCGTTTTCGTT-3’ 5’ -TCTTCGTTTTCGTTTTCGTT-3’ 5’ -TTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’ 5’ -TTCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’9101979566 A CN 101979571说T19 T20 T21 T22 C1 C2 T7C 1826明书8/12 页5’ -TTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ 5’ -TCTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ 5’ -TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ 5’ -TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ 5’ -TCGTCTCGTTTCGTCTCGTT-3’ 5’ -TCGTCTCGTTTCGTCTCGTTTCGTCTCGTT-3’ 5’ -TCGTCGTCGTCGTCGTCGTCG-3’ 5’ -TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’根据实施例 1 所述的方法测定本发明寡聚脱氧核苷酸对人免疫细胞的免疫刺激 活性， 不同之处在于在 96 孔细胞板中加入本发明寡聚脱氧核苷酸至终浓度为 4nM、 8nM、 16nM 和 32nM。结果见表 3、 图 3a、 3b 和 3c。
表3
由表 3、 图 3a、 3b 和 3c 可见， 本发明寡聚脱氧核苷酸对人免疫细胞具有高度的 免疫刺激活性， 在 4 ～ 32nM 浓度范围内就有很强的活性。对照序列 1826 含有两拷贝 5’ -GACGTT-3’ 基元， 为小鼠特异性 CpG-ODN， 因此对人免疫细胞的活性较弱。
实施例 4. 本发明寡聚脱氧核苷酸对小鼠免疫细胞的免疫刺激活性
根据实施例 2 所述的方法， 测定本发明寡聚脱氧核苷酸对小鼠免疫细胞的免疫刺 激活性， 不同之处在于在 96 孔细胞板中加入本发明寡聚脱氧核苷酸至终浓度为 12.5nM、 25nM、 50nM、 100nM 和 200nM。结果见表 4、 图 4a、 4b 和 4c。
表4
由表 4、 图 4a、 4b 和 4c 可见， 本发明寡聚脱氧核苷酸对小鼠免疫细胞具有高度的 免疫刺激活性， 在 12.5 ～ 200nM 浓度范围内就有很强的活性。对照序列 1826 含有两拷贝 5’ -GACGTT-3’ 基元， 为小鼠特异性 CpG-ODN， 因此对小鼠免疫细胞具有最强的活性。对照序 列 T7C 含有多拷贝 5’ -GTCGTC-3’ 基元， 为人特异性 CpG-ODN， 因此对小鼠免疫细胞的活性 很弱。由实施例 3 和 4 中的实验结果可以看出， 可以根据对人和小鼠具有交叉免疫刺激 活性的 CpG 基元 5’ -NTCGTT-3’ ( 其中 N 不代表 A 或 G) 来设计对人和小鼠具有高度交叉免 疫刺激活性的寡聚脱氧核苷酸， 同时也提示可以用小鼠作为动物模型来评价这类寡聚脱氧 核苷酸的潜在人体临床应用价值。
实施例 5. 本发明寡聚脱氧核苷酸作为疫苗佐剂增强小鼠对基因工程乙肝表面抗 原的免疫应答
本实施例中使用 CpG-ODN T1 ～ T6 和 C1 ～ C2。 基因工程乙肝表面抗原 (HBsAg) 由 中国预防医学科学院病毒学研究所病毒遗传与免疫室提供， CHO 细胞表达， 纯度大于 95％。 Balb/c 小鼠， 雌性， 6 ～ 8 周， 购自中国医学科学院实验动物中心。
将 HBsAg 吸附于 1mg/ml 的 Al(OH)3， 最终蛋白浓度为 10μg/ml。经左后肢腓肠肌 免疫 Balb/c 小鼠， 总体积为 100μl， 每组 6 只小鼠。实验组每只小鼠注射 1μg 经 Al(OH)3 吸附的 HBsAg 和 10μg 本发明所述的寡聚脱氧核苷酸， 对照组每只小鼠注射 1μg 经 Al(OH)3 吸附的 HBsAg。免疫后 4 周采血并分离出血清， 按照常规方法对该血清进行 2 倍系列稀释， 用于检测抗原特异性 IgG 总抗体。
用 HBsAg 包被 96 孔酶标板， 每孔 200ng， 4℃过夜 ； 洗板 3 次后用 1％牛血清白蛋白 37℃封闭 1 小时 ； 洗板 3 次后加入上述 2 倍系列稀释的待检血清， 37℃作用 1 小时 ； 洗板 3 次后加入 1 ∶ 10000 稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠 IgG( 购自美国 SIGMA 公司 )， 每孔 100μl， 37℃作用 1 小时 ； 洗板 3 次后用 OPD 显色， 2M 硫酸终止反应， 用分光光度计测 定 490nm 处吸光度值 OD490 并确定终点滴度 ( 临界值设为 0.10)。
图5中 “对照” 表示 Al(OH)3 作为佐剂免疫后诱生的 HBsAg 特异性 IgG 抗体滴度。 免疫时加入本发明的 CpG-ODN 即可显著增强对 HBsAg 的免疫应答， 特异性抗体滴度 ( 对数 值 ) 可增强 10 倍以上， 表明它们具有极好的疫苗佐剂活性。由于这些 CpG-ODN 对人和小鼠 具有交叉免疫刺激活性， 提示它们也可作为人用疫苗佐剂。
实施例 6. 本发明寡聚脱氧核苷酸与其它疫苗佐剂联用增强小鼠对基因工程乙肝 表面抗原的免疫应答
本实施例中使用 CpG-ODN T1。 基因工程 HBsAg 由中国预防医学科学院病毒学研究 所病毒遗传与免疫室提供， CHO 细胞表达， 纯度大于 95％。Balb/c 小鼠， 雌性， 6 ～ 8 周， 购 自中国医学科学院实验动物中心。
将 HBsAg 直接用生理盐水稀释或吸附于 1mg/ml 的 Al(OH)3 上， 最终蛋白浓度为 10μg/ml。经左后肢腓肠肌免疫 Balb/c 小鼠， 总体积为 100μl， 每组 6 只小鼠。HBsAg 组 每只小鼠注射 1μg 不含任何佐剂的 HBsAg， HBsAg+Al 组每只小鼠注射 1μg 经 Al(OH)3 吸附 的 HBsAg， HBsAg+CpG 组每只小鼠注射 1μg 的 HBsAg 和 10μg 的 CpG-ODN T1， HBsAg+Al+CpG 组每只小鼠注射 1μg 经 Al(OH)3 吸附的 HBsAg 和 10μg 的 CpG-ODN T1。免疫后 4 周采血， 并根据实施例 5 所述的方法检测抗原特异性 IgG 总抗体。
由图 6 可见， 不使用佐剂的 HBsAg 组免疫效果最差， 特异性抗体滴度仅为 2.7 个对 数值， 用 Al(OH)3 或 CpG-ODN T1 作为佐剂可显著增强 HBsAg 的免疫效果， 特异性抗体滴度 ( 对数值 ) 均可增加 5 倍左右。Al(OH)3 和 CpG-ODN T1 具有协同作用， 联合使用具有最强 的佐剂活性， 可使特异性抗体滴度增加 10 倍以上。上述结果表明， 本发明寡聚脱氧核苷酸 作为疫苗佐剂既可单独使用， 也可与其它疫苗佐剂如 Al(OH)3 联合使用。实施例 7. 本发明寡聚脱氧核苷酸在小鼠中增强 TH1 类免疫应答
根据实施例 5 所述的方法， 测定本发明寡聚脱氧核苷酸对小鼠 TH1 类免疫应 答的影响， 不同之处在于检测时所使用的酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠 IgG2a( 购自美国 SBA 公司 )。结果显示在图 7 中。
抗原特异性免疫应答分为 TH1 和 TH2 两种类型， 其中 TH1 类应答与高水平的抗原特 异性 IgG2a 抗体滴度相对应。Al(OH)3 是一种极强的 TH2 类疫苗佐剂， 能够抑制 TH1 类免疫 应答， 表现为免疫后诱生极低水平的特异性 IgG2a 抗体。 在本实施例中， Al(OH)3 作为 HBsAg 佐剂诱生的特异性 IgG2a 抗体滴度仅为 2.3 个对数值， 如图 7 中 “对照” 所示。免疫时加入 本发明的 CpG-ODN 即使免疫应答偏向 TH1 方向， 表现为特异性 IgG2a 抗体滴度增加 2 ～ 3 个 对数值， 即 100 ～ 1000 倍。上述结果表明， 本发明寡聚脱氧核苷酸是一类极强的 TH1 类免 疫刺激剂。当代免疫学研究表明， 过敏是一种 TH2 类免疫应答相关的疾病， 如果能够将免疫 应答类型逆转为 TH1 类， 即可预防和治疗过敏。此外， 肿瘤和感染的预防和治疗均需要诱生 较强的 TH1 类免疫应答。基于本发明的 CpG-ODN 能够诱生很强的 TH1 类免疫应答， 因此本发 明的 CpG-ODN 除了能够作为疫苗佐剂， 也可应用于过敏、 肿瘤和感染的预防和治疗等其它 领域。
实施例 8. 本发明寡聚脱氧核苷酸在小鼠体内能够抑制肿瘤生长
将 C-26 实体瘤 ( 由中国医学科学院医药生物技术研究所提供 ) 用铜网磨碎， 用 6 pH 为 7.2 的磷酸盐缓冲液将细胞浓度调整至 1×10 /ml， 经左后肢腹侧皮下接种 Balb/c 小 鼠， 每只小鼠 100μl， 每组 8 只小鼠。从接种后第二天开始， 每两天向肿瘤接种部位注射 CpG-ODN T1， 每只小鼠 10μg， 体积为 100μl， 对照组小鼠仅注射 100μl 生理盐水， 总共注 射 6 次。末次注射 5 天后处死小鼠， 摘除肿瘤并称重。计算每组动物的平均瘤重， 并按以下 公式计算抑瘤率 ： ( 对照组平均瘤重 - 治疗组平均瘤重 )/ 对照组平均瘤重 ×100％。结果 显示在图 8 中。
本申请是申请日为 2008 年 1 月 23 日、 申请号为 200810004736.0、 发明名称为 “具 有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核苷酸及其应用” 的申请的分案申请。技术领域
本发明涉及生物领域， 具体地说， 涉及一种具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核 苷酸及其应用。 背景技术 上世纪八十年代日本学者发现卡介苗 (BCG) 中的 DNA 组分在人和动物体内具有抗 肿瘤活性， 后来研究反义核酸治疗的科学家又发现人工合成的硫代寡聚脱氧核苷酸存在非 特异的免疫刺激活性。Krieg AM 等在 《Nature》 1995， 第 374 卷、 第 546-549 页中揭示了这 些现象的本质， 发现核酸中的免疫刺激活性成分是一些含有非甲基化 5′ -CpG-3′二核苷 酸的六核苷酸序列， 特征为 5’ -PuPuCpGPyPy-3’ (Pu 代表嘌呤 A 或 G ； Py 代表嘧啶 C 或 T)， 如 5’ -GACGTT-3’ 等。其中， 核心核苷酸 C 和 G 为其活性所必需， 两端各两个核苷酸也与其 活性紧密相关。 上述六核苷酸特征序列称作 CpG 基元 (CpG motif)， 含有 CpG 基元的寡聚脱 氧核苷酸统称为 CpG 寡聚脱氧核苷酸 (CpG-ODN)。含有上述特征的 CpG-ODN 对小鼠具有良 好的免疫刺激活性， 动物实验结果显示了 CpG-ODN 在疫苗佐剂、 肿瘤预防和治疗、 感染预防 和治疗以及过敏预防和治疗等领域具有良好的应用前景。 但是进一步研究发现其免疫刺激 活性具有种属特异性， 因此阐明活化人免疫细胞的 CpG 基元和 CpG-ODN 是将 CpG-ODN 应用 于人体临床的必要前提。Krieg AM 等在 《The Journal of Immunology 2000， 第 164 卷、 第 1617-1624 页中报道了第一个能够活化人免疫细胞的 CpG 基元 5’ -GTCGTT-3’ 。由此衍生的 CpG-ODN( 如 CpG-ODN 2006) 在体外对人免疫细胞具有良好的免疫刺激活性， 而且目前多个 人体临床研究也证实了 CpG-ODN 2006 在疫苗佐剂、 肿瘤治疗以及感染治疗等领域的免疫 效果。根据 Krieg AM 等研究结果， 上述 CpG-ODN 是人特异的， 对小鼠没有活性， 因此只能用 猴子等灵长类动物作为动物模型来评价这些序列在体内的免疫刺激活性， 这增加了实验的 难度， 例如成本增加、 动物来源难于获得等。因此， 发现一种非种属特异性的广谱 CpG-ODN 是十分有必要的。
对于有关 CpG-ODN 的研究在文献 《中华微生物学和免疫学杂志》 2001， 21(5)， 第 471-475 页、 《动物医学进展》 2004， 25(4)， 第 25-28 页、 《Gene Therapy》 1996， 第 6 卷， 第 893-903 页中有所描述。另外， 专利文献 CN 1271733A、 CN 1526718A、 US 2005/0267057A1 或 WO 99/56755 中也公开了一些 CpG-ODN 及其相关的应用， 但是在上述文献中， 均未公开有 关具有两个或两个以上拷贝的 5’ -NTCGTT-3’ 基元 (N 不代表 A 或 G) 的核苷酸， 也未公开任 何有关包含该基元的硫代寡聚脱氧核苷酸对人和小鼠具有交叉免疫刺激活性的技术启示。
对于有关 CpG-ODN 的研究在文献 《中华微生物学和免疫学杂志》 2001， 21(5)， 第 471-475 页、 《动物医学进展》 2004， 25(4)， 第 25-28 页、 《Gene Therapy》 1996， 第 6 卷， 第 893-903 页中有所描述。另外， 专利文献 CN 1271733A、 CN 1526718A、 US 2005/0267057A1 或 WO 99/56755 中也公开了一些 CpG-ODN 及其相关的应用， 但是在上述文献中， 均未公开有 关具有两个或两个以上拷贝的 5’ -NTCGTT-3’ 基元 (N 不代表 A 或 G) 的核苷酸， 也未公开任 何有关包含该基元的硫代寡聚脱氧核苷酸对人和小鼠具有交叉免疫刺激活性的技术启示。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种非种属特异性的、 具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核苷酸。更具体地说， 本发明提供了一种对人和小鼠具有交叉免疫刺激活性的硫代寡聚脱 氧核苷酸。
本发明的目的还在于提供该具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核苷酸在制备疫 苗佐剂以及在制备预防或治疗肿瘤、 感染和过敏的药物中的应用。
本发明人在现有技术的基础上进行研究， 发现 ： (1) 活化人免疫细胞的 CpG 基元 为 5’ -NTCGTPy-3’ ( 其中 N 代表 A、 G、 C 或 T， Py 代表嘧啶 C 或 T) ； (2) 活化小鼠免疫细胞 的 CpG 基元为 5’ -NA/TCGTT-3’ ( 其中 N 代表 A、 G、 C 或 T)。在此研究基础上， 发现出含有 5’ -NTCGTT-3’ 基元 ( 包括 5’ -ATCGTT-3’ 、 5’ -GTCGTT-3’ 、 5’ -CTCGTT-3’ 和 5’ -TTCGTT-3’ ) 的 CpG-ODN 对人和小鼠具有交叉免疫刺激活性。发明人进一步研究表明， 核苷酸序列中具 有两个或两个以上拷贝的 5’ -NTCGTT-3’ 基元 (N 不代表 A 或 G) 是本发明所述的硫代寡聚 脱氧核苷酸对人和小鼠具有交叉免疫刺激活性的关键。
鉴于此， 本发明提供了一种具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核苷酸， 其序列中 具有两个或两个以上拷贝的 5’ -NTCGTT-3’ 基元， 所述 N 不代表 A 或 G， 优选为 T 或 C。所述 硫代寡聚脱氧核苷酸的长度为 15 ～ 35 个核苷酸， 优选为 20 ～ 30 个核苷酸。所述 CpG 是 非甲基化的。
当 N 为 T 时， 所述硫代寡聚脱氧核苷酸的序列优选为 ： 5’ -TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ 、 5’ -TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ 、 5’ -TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ 、 5’ -TCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’ 、 5’ -TCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’ 、 5’ -TCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’ 、 5’ -TTCGTTTTTCGTTTTTCGTT-3’ 、 5’ -TTCGTTATTCGTTATTCGTT-3’ 、 5’ -TTCGTTGTTCGTTGTTCGTT-3’ 、 5’ -TTCGTTCTTCGTTCTTCGTT-3’ 、 5’ -TCTTCGTTTTTCGTTTTTCGTT-3’ 、 5’ -TCTTCGTTATTCGTTATTCGTT-3’ 、 5’ -TCTTCGTTGTTCGTTGTTCGTT-3’ 、 5’ -TCTTCGTTCTTCGTTCTTCGTT-3’ 、 5’ -TTCGTTTTCGTTTTCGTTTTCGTT-3’ 、 5’ -TCTTCGTTTTCGTTTTCGTT-3’ 、 5’ -TTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’ 、 5’ -TTCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’ 、 5’ -TTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ 、 5’ -TCTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ 、 5’ -TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ 或 5’ -TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ 。 当所述 N 为 C 时， 所述硫代寡聚脱氧核苷酸的序列优选为 ：5’ -TCGTCTCGTTTCGTCTCGTT-3’ 或
5’ -TCGTCTCGTTTCGTCTCGTTTCGTCTCGTT-3’ 。
本发明所述的硫代寡聚脱氧核苷酸的制备方法是本领域技术人员所熟知的， 例如 可以采用固相亚磷酰胺三酯法化学合成， 此法具有高效和快速偶联等优点， 已广泛应用于 DNA 化学合成领域中。目前对于寡聚脱氧核苷酸人工合成多委托专业的基因合成公司来处 理， 例如国内可委托上海生工生物技术公司合成。
固相亚磷酰胺三酯法由 3’ 端开始， 具体反应步骤如下 ：
1. 脱保护基 ： 用三氯乙酸脱去连接在 CPG(Controlled Pore Glass) 上的核苷酸 的保护基团 DMT( 二甲氧基三苯甲基 )， 获得游离的 5’ 羟基， 以供下一步缩合反应使用 ；
2. 活化 ： 将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱， 形成 亚磷酰胺四唑活性中间体 ( 其 3’ 端已被活化， 但 5’ 端仍受 DMT 保护 )， 此中间体与 CPG 上 已脱保护基的核苷酸发生缩合反应 ；
3. 连接 ： 亚磷酰胺四唑活性中间体遇到 CPG 上已脱保护基的核苷酸时， 将与其 5’ 羟基发生亲合反应， 缩合并脱去四唑， 此时寡核苷酸链向前延长一个碱基 ；
4. 氧化 ： 缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在 CPG 上的寡核苷酸连接， 而亚磷酯键不稳定， 易被酸或碱水解， 此时使用硫代试剂将亚磷酰胺氧化为硫磷双键的磷 酸三酯， 从而得到稳定的寡核苷酸 ；
5. 封闭 ： 缩合反应后为了防止连在 CPG 上的未参与反应的 5’ 羟基在随后的循环 反应中被延伸， 常通过乙酰化来封闭此端羟基。
经过以上五个步骤后， 一个脱氧核苷酸就被连到 CPG 的核苷酸上。重复以上的脱 保护基、 活化、 连接、 氧化、 封闭过程即可得到一个 DNA 片段粗品。最后对其进行切割、 脱保 护基、 纯化 ( 常用的有 PAGE 法、 HPLC 法、 C18 法和 OPC 法等方法 )、 定量等合成后处理即可 得到符合本发明要求的硫代寡聚脱氧核苷酸。
本发明还提供了硫代寡聚脱氧核苷酸在制备疫苗佐剂中的应用。
本发明还提供了硫代寡聚脱氧核苷酸在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明还提供了硫代寡聚脱氧核苷酸在制备预防或治疗感染的药物中的应用。
本发明还提供了硫代寡聚脱氧核苷酸在制备预防或治疗过敏的药物中的应用。
所述硫代寡聚脱氧核苷酸在体外对人和小鼠免疫细胞均有良好的免疫刺激活性， 可以从对小鼠中的免疫刺激活性结果来评价其在人体中的免疫刺激活性。作为疫苗佐剂， 其能够显著增强小鼠对基因工程乙肝疫苗的免疫应答， 而且能够使免疫应答偏向 TH1 方向。 由于本发明所述的硫代寡聚脱氧核苷酸能够诱生出很强的 TH1 类免疫应答， 表明其也可用 于过敏和感染的预防和治疗。同时， 本发明所述的硫代寡聚脱氧核苷酸在小鼠体内也具有 良好的抑制肿瘤生长的活性。 附图说明
图 1 为示出具有 5’ -NTCGTPy-3’ ( 其中 N 代表 A、 G、 C 或 T， Py 代表嘧啶 C 或 T) 基 元的寡聚脱氧核苷酸的人免疫刺激活性的图。
图 2 为示出具有 5’ -NA/TCGTT-3’ ( 其中 N 代表 A、 G、 C 或 T) 基元的寡聚脱氧核苷 酸的小鼠免疫刺激活性的图。图 3a 为示出本发明寡聚脱氧核苷酸 (T1 ～ T6、 C1 和 C2) 以及对照序列 1826 的人 免疫刺激活性的图。
图 3b 为示出本发明寡聚脱氧核苷酸 (T7 ～ T14) 的人免疫刺激活性的图。
图 3c 为示出本发明寡聚脱氧核苷酸 (T15 ～ T22) 的人免疫刺激活性的图。
图 4a 为示出本发明寡聚脱氧核苷酸 (T1 ～ T6、 C1 和 C2) 以及对照序列 1826 和 T7C 的小鼠免疫刺激活性的图。
图 4b 为示出本发明寡聚脱氧核苷酸 (T7 ～ T14) 的小鼠免疫刺激活性的图。
图 4c 为示出本发明寡聚脱氧核苷酸 (T15 ～ T22) 的小鼠免疫刺激活性的图。
图 5 为示出本发明寡聚脱氧核苷酸作为疫苗佐剂增强小鼠对基因工程乙肝表面 抗原的免疫应答的图。
图 6 为示出本发明寡聚脱氧核苷酸与其它疫苗佐剂联用增强小鼠对基因工程乙 肝表面抗原的免疫应答的图。
图 7 为示出本发明寡聚脱氧核苷酸在小鼠体内诱生 TH1 类免疫应答的图。
图 8 为示出本发明寡聚脱氧核苷酸在小鼠体内抑制肿瘤生长的图。 具体实施方式 以下结合附图通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明， 但这并非是对本 发明的限制， 本领域技术人员根据本发明的基本思想， 可以做出各种修改或改进， 但是只要 不脱离本发明的基本思想， 均在本发明的范围之内。
实施例 1. 具有 5’ -NTCGTPy-3’ ( 其中 N 代表 A、 G、 C 或 T， Py 代表嘧啶 C 或 T) 基 元的寡聚脱氧核苷酸的人免疫刺激活性
为了阐明活化人免疫细胞的 CpG 基元， 本发明人对 CpG 基元中除核心核苷酸 CpG 以外的其余四个核苷酸进行了突变研究。 为此， 发明人设计了一组 CpG-ODN， 如表 1 所示， 每 条序列长度为 12 个核苷酸， 均含有两个相同拷贝的 CpG 基元。用这些 CpG-ODN 刺激体外培 养的人外周血单个核细胞 (PBMC)， 通过测定培养上清中的 IgM 含量， 即可评价它们对人免 疫细胞的活性。
本实施例中所使用的 CpG-ODN 由本发明人设计， 委托上海生工生物技术公司进行 人工合成， 并进行全链硫代修饰， 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 纯化， 溶于生理盐水， -20℃ 冰箱中保存备用。
表1
序号 1 2 3编号 1444 2444 3444序列 5’ -ATCGTT ATCGTT-3’ 5’ -GTCGTT GTCGTT-3’ 5’ -CTCGTT CTCGTT-3’6101979566 A CN 101979571说4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 4444 2144 2244 2344 2444 2414 2424 2434 2444 2441 2442 2443 2444明书5/12 页5’ -TTCGTT TTCGTT-3’ 5’ -GACGTT GACGTT-3’ 5’ -GGCGTT GGCGTT-3’ 5’ -GCCGTT GCCGTT-3’ 5’ -GTCGTT GTCGTT-3’ 5’ -GTCGAT GTCGAT-3’ 5’ -GTCGGT GTCGGT-3’ 5’ -GTCGCT GTCGCT-3’ 5’ -GTCGTT GTCGTT-3’ 5’ -GTCGTA GTCGTA-3’ 5’ -GTCGTG GTCGTG-3’ 5’ -GTCGTC GTCGTC-3’ 5’ -GTCGTT GTCGTT-3’无菌条件下取健康人静脉血， 肝素抗凝后用人淋巴细胞分离液 ( 购自北方同正生 物技术公司 ) 分离 PBMC ； 计数后用 RPMI 1640 培养基 ( 购自美国 Gibco 公司 ) 将细胞浓度 6 调整至 1×10 /ml， 接种至 96 孔细胞板中， 每孔 200μl ； 加入 CpG-ODN 至终浓度为 2μM， 5％ CO2 条件下 37℃培养 8 天。用羊抗人 IgM( 购自美国 SIGMA 公司 ) 包被 96 孔酶标板， 每孔 200ng， 4℃过夜 ； 洗板 3 次后加入上述 PBMC 培养上清， 每孔 100μl， 37℃作用 1 小时 ； 洗板 3 次后加入 1 ∶ 10000 稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人 IgM( 购自美国 SIGMA 公司 )， 每孔 100μl， 37℃作用 1 小时 ； 洗板 3 次后用邻苯二胺 (OPD) 显色， 2M 硫酸终止反应， 用分 光光度计测定 490nm 处吸光度值 OD490。所测得 OD490 值越大， 表明该 CpG-ODN 对人免疫细 胞的活性越强。
结果详见图 1， 其中 “对照” 为不加 CpG-ODN 的细胞对照。序号为 1 ～ 4 的四个序 列， 仅在 CpG 基元的第一位核苷酸不同， 结果显示它们对人免疫细胞的活性相当， 表明活化 人免疫细胞的 CpG 基元的第一位核苷酸为 N( 其中 N 代表 A、 G、 C 或 T) ； 序号为 5 ～ 8 的四 个序列， 仅在 CpG 基元的第二位核苷酸不同， 结果显示该位置必须为 T， 否则对人免疫细胞 的活性很弱 ； 序号为 9 ～ 12 的四个序列， 仅在 CpG 基元的第五位核苷酸不同， 结果显示该位 置也必须为 T， 否则对人免疫细胞的活性很弱 ； 序号为 13 ～ 16 的四个序列， 仅在 CpG 基元的
第六位核苷酸不同， 结果显示该位置为 C 或 T 时具有较好的免疫刺激活性。综上所述， 活化 人免疫细胞的 CpG 基元为 5’ -NTCGTPy-3’ ( 其中 N 代表 A、 G、 C 或 T， Py 代表嘧啶 C 或 T)。
实施例 2. 具有 5’ -NA/TCGTT-3’ ( 其中 N 代表 A、 G、 C 或 T) 基元的寡聚脱氧核苷 酸对小鼠的免疫刺激活性
为了阐明活化小鼠免疫细胞的 CpG 基元， 本发明人对 CpG 基元中除核心核苷酸 CpG 以外的其余四个核苷酸进行了突变研究。本实施例中使用的 CpG-ODN 序列见表 1。用这些 CpG-ODN 刺激小鼠脾脏单个核细胞 (SMMC)， 通过测定培养上清中的 IgM 含量， 即可评价它们 对小鼠免疫细胞的活性。所使用的为 Balb/c 小鼠， 雌性， 6 ～ 8 周， 购自中国医学科学院实 验动物中心。
无菌条件下取 Balb/c 小鼠脾脏， 用 RPMI 1640 培养基制备 SMMC 悬液 ； 计数后用 6 RPMI 1640 培养基将细胞浓度调整至 1×10 /ml， 接种至 96 孔细胞板中， 每孔 200μl ； 加入 CpG-ODN 至终浓度为 2μM， 5％ CO2 条件下 37℃培养 3 天。用羊抗小鼠 IgM( 购自美国 SIGMA 公司 ) 包被 96 孔酶标板， 每孔 200ng， 4℃过夜 ； 洗板 3 次后加入上述 SMMC 培养上清， 每孔 100μl， 37℃作用 1 小时 ； 洗板 3 次后加 1 ∶ 10000 稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小 鼠 IgM( 购自美国 SIGMA 公司 )， 每孔 100μ1， 37℃作用 1 小时 ； 洗板 3 次后用 OPD 显色， 2M 硫酸终止反应， 用分光光度计测定 490nm 处吸光度值 OD490。所测得 OD490 值越大， 表明该 CpG-ODN 对小鼠免疫细胞的活性越强。 结果详见图 2， 其中 “对照” 为不加 CpG-ODN 的细胞对照。序号为 1 ～ 4 的四个序 列， 仅在 CpG 基元的第一位核苷酸不同， 结果显示它们对小鼠免疫细胞的活性相当， 表明活 化小鼠免疫细胞的 CpG 基元的第一位核苷酸为 N( 其中 N 代表 A、 G、 C 或 T) ； 序号为 5 ～ 8 的四个序列， 仅在 CpG 基元的第二位核苷酸不同， 结果显示该位置必须为 A 或 T， 否则对小 鼠免疫细胞的活性很弱 ； 序号为 9 ～ 12 的四个序列， 仅在 CpG 基元的第五位核苷酸不同， 结 果显示该位置必须为 T， 否则对小鼠免疫细胞的活性很弱 ； 序号为 13 ～ 16 的四个序列， 仅 在 CpG 基元的第六位核苷酸不同， 结果显示该位置也必须为 T， 否则对小鼠免疫细胞的活性 很弱。综上所述， 活化小鼠免疫细胞的 CpG 基元为 5’ -NA/TCGTT-3’ ( 其中 N 代表 A、 G、 C或 T)。
由 实 施 例 1 和 2 的 研 究 结 果 可 知，活 化 人 免 疫 细 胞 的 CpG 基 元 为 5’ -NTCGTPy-3’ ( 其中 N 代表 A、 G、 C 或 T， Py 代表嘧啶 C 或 T) ； 活化小鼠免疫细胞的 CpG 基元为 5’ -NA/TCGTT-3’ ( 其中 N 代表 A、 G、 C 或 T)。综合上述研究结果， 可以看出对人和 小鼠具有交叉免疫刺激活性的 CpG 基元为 5’ -NTCGTT-3’ ( 其中 N 代表 A、 G、 C 或 T)。
实施例 3. 本发明寡聚脱氧核苷酸对人免疫细胞的免疫刺激活性
根据实施例 1 和 2 中发现的对人和小鼠具有交叉免疫刺激活性的 CpG 基元， 发明 人设计合成了一组 CpG-ODN， 如表 2 所示， 长度为 15 ～ 35 个核苷酸， 分别含有两个或多于 两个拷贝的 5’ -TTCGTT-3’ 基元 ( 编号为 T1 ～ T22) 和 5’ -CTCGTT-3’ 基元 ( 编号为 C1 和 C2)。
表 2 中的 CpG-ODN 除了对照序列 T7C 和 1826 分别引自文献 《中华微生物学和免 疫学杂志》 2001， 21(5)， 第 471-475 页、 《The Journal of Immunology》 1998， 第 160 卷， 第 870-876 页， 其余均由本发明人设计。 本实施例中所用对照序列以及发明人自行设计的序列 均委托上海生工生物技术公司进行合成， 全链硫代修饰， PAGE 纯化， 溶于生理盐水， -20℃冰
箱中保存备用。
表2
编号 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15 T16 T17 T18序列 5’ -TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ 5’ -TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ 5’ -TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ 5’ -TCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’ 5’ -TCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’ 5’ -TCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’ 5’ -TTCGTTTTTCGTTTTTCGTT-3’ 5’ -TTCGTTATTCGTTATTCGTT-3’ 5’ -TTCGTTGTTCGTTGTTCGTT-3’ 5’ -TTCGTTCTTCGTTCTTCGTT-3’ 5’ -TCTTCGTTTTTCGTTTTTCGTT-3’ 5’ -TCTTCGTTATTCGTTATTCGTT-3’ 5’ -TCTTCGTTGTTCGTTGTTCGTT-3’ 5’ -TCTTCGTTCTTCGTTCTTCGTT-3’ 5’ -TTCGTTTTCGTTTTCGTTTTCGTT-3’ 5’ -TCTTCGTTTTCGTTTTCGTT-3’ 5’ -TTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’ 5’ -TTCGTTTCGTTTCGTTTCGTTTCGTT-3’9101979566 A CN 101979571说T19 T20 T21 T22 C1 C2 T7C 1826明书8/12 页5’ -TTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ 5’ -TCTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ 5’ -TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ 5’ -TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3’ 5’ -TCGTCTCGTTTCGTCTCGTT-3’ 5’ -TCGTCTCGTTTCGTCTCGTTTCGTCTCGTT-3’ 5’ -TCGTCGTCGTCGTCGTCGTCG-3’ 5’ -TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’根据实施例 1 所述的方法测定本发明寡聚脱氧核苷酸对人免疫细胞的免疫刺激 活性， 不同之处在于在 96 孔细胞板中加入本发明寡聚脱氧核苷酸至终浓度为 4nM、 8nM、 16nM 和 32nM。结果见表 3、 图 3a、 3b 和 3c。
表3
由表 3、 图 3a、 3b 和 3c 可见， 本发明寡聚脱氧核苷酸对人免疫细胞具有高度的 免疫刺激活性， 在 4 ～ 32nM 浓度范围内就有很强的活性。对照序列 1826 含有两拷贝 5’ -GACGTT-3’ 基元， 为小鼠特异性 CpG-ODN， 因此对人免疫细胞的活性较弱。
实施例 4. 本发明寡聚脱氧核苷酸对小鼠免疫细胞的免疫刺激活性
根据实施例 2 所述的方法， 测定本发明寡聚脱氧核苷酸对小鼠免疫细胞的免疫刺 激活性， 不同之处在于在 96 孔细胞板中加入本发明寡聚脱氧核苷酸至终浓度为 12.5nM、 25nM、 50nM、 100nM 和 200nM。结果见表 4、 图 4a、 4b 和 4c。
表4
由表 4、 图 4a、 4b 和 4c 可见， 本发明寡聚脱氧核苷酸对小鼠免疫细胞具有高度的 免疫刺激活性， 在 12.5 ～ 200nM 浓度范围内就有很强的活性。对照序列 1826 含有两拷贝 5’ -GACGTT-3’ 基元， 为小鼠特异性 CpG-ODN， 因此对小鼠免疫细胞具有最强的活性。对照序 列 T7C 含有多拷贝 5’ -GTCGTC-3’ 基元， 为人特异性 CpG-ODN， 因此对小鼠免疫细胞的活性 很弱。由实施例 3 和 4 中的实验结果可以看出， 可以根据对人和小鼠具有交叉免疫刺激 活性的 CpG 基元 5’ -NTCGTT-3’ ( 其中 N 不代表 A 或 G) 来设计对人和小鼠具有高度交叉免 疫刺激活性的寡聚脱氧核苷酸， 同时也提示可以用小鼠作为动物模型来评价这类寡聚脱氧 核苷酸的潜在人体临床应用价值。
实施例 5. 本发明寡聚脱氧核苷酸作为疫苗佐剂增强小鼠对基因工程乙肝表面抗 原的免疫应答
本实施例中使用 CpG-ODN T1 ～ T6 和 C1 ～ C2。 基因工程乙肝表面抗原 (HBsAg) 由 中国预防医学科学院病毒学研究所病毒遗传与免疫室提供， CHO 细胞表达， 纯度大于 95％。 Balb/c 小鼠， 雌性， 6 ～ 8 周， 购自中国医学科学院实验动物中心。
将 HBsAg 吸附于 1mg/ml 的 Al(OH)3， 最终蛋白浓度为 10μg/ml。经左后肢腓肠肌 免疫 Balb/c 小鼠， 总体积为 100μl， 每组 6 只小鼠。实验组每只小鼠注射 1μg 经 Al(OH)3 吸附的 HBsAg 和 10μg 本发明所述的寡聚脱氧核苷酸， 对照组每只小鼠注射 1μg 经 Al(OH)3 吸附的 HBsAg。免疫后 4 周采血并分离出血清， 按照常规方法对该血清进行 2 倍系列稀释， 用于检测抗原特异性 IgG 总抗体。
用 HBsAg 包被 96 孔酶标板， 每孔 200ng， 4℃过夜 ； 洗板 3 次后用 1％牛血清白蛋白 37℃封闭 1 小时 ； 洗板 3 次后加入上述 2 倍系列稀释的待检血清， 37℃作用 1 小时 ； 洗板 3 次后加入 1 ∶ 10000 稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠 IgG( 购自美国 SIGMA 公司 )， 每孔 100μl， 37℃作用 1 小时 ； 洗板 3 次后用 OPD 显色， 2M 硫酸终止反应， 用分光光度计测 定 490nm 处吸光度值 OD490 并确定终点滴度 ( 临界值设为 0.10)。
图5中 “对照” 表示 Al(OH)3 作为佐剂免疫后诱生的 HBsAg 特异性 IgG 抗体滴度。 免疫时加入本发明的 CpG-ODN 即可显著增强对 HBsAg 的免疫应答， 特异性抗体滴度 ( 对数 值 ) 可增强 10 倍以上， 表明它们具有极好的疫苗佐剂活性。由于这些 CpG-ODN 对人和小鼠 具有交叉免疫刺激活性， 提示它们也可作为人用疫苗佐剂。
实施例 6. 本发明寡聚脱氧核苷酸与其它疫苗佐剂联用增强小鼠对基因工程乙肝 表面抗原的免疫应答
本实施例中使用 CpG-ODN T1。 基因工程 HBsAg 由中国预防医学科学院病毒学研究 所病毒遗传与免疫室提供， CHO 细胞表达， 纯度大于 95％。Balb/c 小鼠， 雌性， 6 ～ 8 周， 购 自中国医学科学院实验动物中心。
将 HBsAg 直接用生理盐水稀释或吸附于 1mg/ml 的 Al(OH)3 上， 最终蛋白浓度为 10μg/ml。经左后肢腓肠肌免疫 Balb/c 小鼠， 总体积为 100μl， 每组 6 只小鼠。HBsAg 组 每只小鼠注射 1μg 不含任何佐剂的 HBsAg， HBsAg+Al 组每只小鼠注射 1μg 经 Al(OH)3 吸附 的 HBsAg， HBsAg+CpG 组每只小鼠注射 1μg 的 HBsAg 和 10μg 的 CpG-ODN T1， HBsAg+Al+CpG 组每只小鼠注射 1μg 经 Al(OH)3 吸附的 HBsAg 和 10μg 的 CpG-ODN T1。免疫后 4 周采血， 并根据实施例 5 所述的方法检测抗原特异性 IgG 总抗体。
由图 6 可见， 不使用佐剂的 HBsAg 组免疫效果最差， 特异性抗体滴度仅为 2.7 个对 数值， 用 Al(OH)3 或 CpG-ODN T1 作为佐剂可显著增强 HBsAg 的免疫效果， 特异性抗体滴度 ( 对数值 ) 均可增加 5 倍左右。Al(OH)3 和 CpG-ODN T1 具有协同作用， 联合使用具有最强 的佐剂活性， 可使特异性抗体滴度增加 10 倍以上。上述结果表明， 本发明寡聚脱氧核苷酸 作为疫苗佐剂既可单独使用， 也可与其它疫苗佐剂如 Al(OH)3 联合使用。实施例 7. 本发明寡聚脱氧核苷酸在小鼠中增强 TH1 类免疫应答
根据实施例 5 所述的方法， 测定本发明寡聚脱氧核苷酸对小鼠 TH1 类免疫应 答的影响， 不同之处在于检测时所使用的酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠 IgG2a( 购自美国 SBA 公司 )。结果显示在图 7 中。
抗原特异性免疫应答分为 TH1 和 TH2 两种类型， 其中 TH1 类应答与高水平的抗原特 异性 IgG2a 抗体滴度相对应。Al(OH)3 是一种极强的 TH2 类疫苗佐剂， 能够抑制 TH1 类免疫 应答， 表现为免疫后诱生极低水平的特异性 IgG2a 抗体。 在本实施例中， Al(OH)3 作为 HBsAg 佐剂诱生的特异性 IgG2a 抗体滴度仅为 2.3 个对数值， 如图 7 中 “对照” 所示。免疫时加入 本发明的 CpG-ODN 即使免疫应答偏向 TH1 方向， 表现为特异性 IgG2a 抗体滴度增加 2 ～ 3 个 对数值， 即 100 ～ 1000 倍。上述结果表明， 本发明寡聚脱氧核苷酸是一类极强的 TH1 类免 疫刺激剂。当代免疫学研究表明， 过敏是一种 TH2 类免疫应答相关的疾病， 如果能够将免疫 应答类型逆转为 TH1 类， 即可预防和治疗过敏。此外， 肿瘤和感染的预防和治疗均需要诱生 较强的 TH1 类免疫应答。基于本发明的 CpG-ODN 能够诱生很强的 TH1 类免疫应答， 因此本发 明的 CpG-ODN 除了能够作为疫苗佐剂， 也可应用于过敏、 肿瘤和感染的预防和治疗等其它 领域。
实施例 8. 本发明寡聚脱氧核苷酸在小鼠体内能够抑制肿瘤生长
将 C-26 实体瘤 ( 由中国医学科学院医药生物技术研究所提供 ) 用铜网磨碎， 用 6 pH 为 7.2 的磷酸盐缓冲液将细胞浓度调整至 1×10 /ml， 经左后肢腹侧皮下接种 Balb/c 小 鼠， 每只小鼠 100μl， 每组 8 只小鼠。从接种后第二天开始， 每两天向肿瘤接种部位注射 CpG-ODN T1， 每只小鼠 10μg， 体积为 100μl， 对照组小鼠仅注射 100μl 生理盐水， 总共注 射 6 次。末次注射 5 天后处死小鼠， 摘除肿瘤并称重。计算每组动物的平均瘤重， 并按以下 公式计算抑瘤率 ： ( 对照组平均瘤重 - 治疗组平均瘤重 )/ 对照组平均瘤重 ×100％。结果 显示在图 8 中。
由图 8 可见， 对照组小鼠的平均瘤重为 1.43 克， 经过注射 6 次 CpG-ODN T1 治疗后， 治疗组小鼠的平均瘤重为 0.59 克， 抑瘤率达到 58.7％。上述结果表明， 本发明寡聚脱氧核 苷酸具有良好的抗肿瘤效果， 可在临床上用于肿瘤的免疫治疗。14101979566 A CN 101979571
序列表1/6 页
15101979566 A CN 101979571序列表2/6 页
16101979566 A CN 101979571序列表3/6 页
17101979566 A CN 101979571序列表4/6 页
18101979566 A CN 101979571序列表5/6 页
19101979566 A CN 101979571序列表6/6 页