技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种linc00673基因的靶向抑制剂及其用途。
背景技术
人类恶性脑胶质瘤是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤，死亡率和复发率非常高而且患者的预后很差。手术切除联合术后放化疗是肿瘤治疗的常见策略，化疗已经成为治疗脑胶质瘤的重要手段。血肿瘤屏障(blood tumor barrier,BTB)主要是由高度特异的内皮细胞组成，它限制了大多数抗肿瘤药物进入脑肿瘤组织，成为影响大分子化疗药物疗效的关键。因此，探索安全有效的方法增加血肿瘤屏障的通透性，提高肿瘤组织中的药物浓度，是提高脑胶质瘤化疗疗效亟待解决的问题。
长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA转录本。研究表明，LncRNA能够调控胶质瘤的发生与发展。。研究表明，linc00673促进肺癌细胞的迁移和侵袭，发挥癌基因的作用。研究报道，linc00673在胃癌中高表达。目前尚未发现linc00673在胶质瘤微血管内皮中的表达并参与血肿瘤屏障通透性的调控。前期， 我们应用real-time PCR法检测了linc00673的表达水平。结果显示，在脑胶质瘤微血管内皮细胞中linc00673的表达水平显著高于正常对照组，这一结果提示linc00673可能参与对脑胶质瘤微血管内皮细胞的功能调控。
RNA 干扰技术的原理是利用Dicer酶切割RNA分子，形成RNA沉默复合体，靶向结合目标RNA分子进而降解RNA分子的过程。本发明希望利用RNA干扰技术研制linc00673基因的抑制剂，在胶质瘤基因治疗领域发挥作用。
目前，linc00673在胶质瘤发生发展中的作用以及相关机制还未见报道，关于linc00673在胶质瘤基因治疗方面的应用目前还一片空白。因此，研制一种linc00673相关的药物成为目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明人经实验证明linc00673基因在胶质瘤在组织中高表达，抑制linc00673的表达能够开放血肿瘤屏障，增加血肿瘤屏障的通透性，提高肿瘤组织中的药物浓度，从而提高脑胶质瘤化疗疗效。
本发明的目的在于利用RNA干扰技术，设计并提供一种linc00673基因靶向抑制剂及其用途，该抑制剂可与linc00673基因特异性结合，使linc00673基因沉默，从而抑制linc00673基因对血肿瘤屏障通透性的影响，达到治疗胶质瘤的目的。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明提供了一种linc00673基因的靶向抑制剂，该靶向抑制剂的基因序列为：
5’-GGGTGCTTTGAACCAGGAAAG-3’（SEQ ID No.1）
linc00673基因的shRNA模板序列包括正义链和反义链序列：
正义链:
5’-
CACCGGGTGCTTTGAACCAGGAAAGTTCAAGAGACTTTCCTGGTTCAAAGCACCCTTTTTTG -3’（SEQ ID No.2）。
反义链：
5’-
GATCCAAAAAAGGGTGCTTTGAACCAGGAAAGTCTCTTGAACTTTCCTGGTTCAAAGCACCC-3’（SEQ ID No.3）。
进一步地，转录上述的shRNA的转录产物序列：5’-
GGGTGCTTTGAACCAGGAAAGTTCAAGAGACTTTCCTGGTTCAAAGCACCCTT-3’ （SEQ ID No.4）。
优选的，该抑制剂为任何药物治疗学上可接受的的剂型。
优选的，该抑制剂的剂型为注射制剂。
优选的，该抑制剂为任何药物治疗学上可接受的的剂量。
一种linc00673基因抑制剂作为制备用于治疗人脑胶质瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
1、本发明靶向抑制剂特异性强，抑制linc00673基因的表达。
2、linc00673基因抑制剂靶向治疗，协同传统化疗药物，增加化疗药物血肿瘤屏障通透性，能显著降低传统治疗药物的在脑内药物浓度低的问题。
3、实验已证明在体外细胞学水平上应用，治疗效果确切，无不良反应发生。
附图说明
图1为长链非编码RNA Linc00673在正常内皮细胞(对照组)和胶质瘤内皮细胞(实验组)中的表达情况柱形图。
图2为应用linc00673基因抑制剂后，跨内皮电阻值测定(A)和辣根过氧化酶通透量实验检测(B)对BTB通透性的影响柱形图。
图3为应用linc00673基因抑制剂后，Western blot检测对紧密连接蛋白的表达的影响的电泳图和柱形图。
图4为应用linc00673基因抑制剂后，免疫荧光检测紧密连接蛋白的表达与分布的改变的照片。
具体实施方式
本发明主要技术方案是。
1. shRNA的设计和干扰载体的制备。
2.干扰效率的验证。
3. 跨内皮电阻值测定。
4. 辣根过氧化酶通透量实验。
5. Western blot。
6. 细胞免疫荧光实验。
一、体外血肿瘤屏障的建立
将hCMEC/D3细胞培养于transwell小室的上室中(collagen IV包被，0.4 um pore size，12 mm diameter，Costar, USA)，放入6孔板内；同时将人脑胶质瘤U251细胞以20，000个细胞/毫升的密度种植于另一个6孔板的孔内。
待小室内内皮细胞长满单层，将长满内皮细胞的transwell小室转移至种有人脑胶质瘤U251细胞的6孔板的孔内，小室给予培养液1毫升，6孔板的孔内给予培养液2.5毫升，每隔一天更换新的培养液，共培养4天。
二、实时定量PCR检测linc00673的表达。
（1） Trizol法提取细胞中的总RNA。
用冷PBS洗涤收集的细胞，加入1 ml Trizol试剂吹打数次，镜下观察细胞成油滴状（充分裂解），后移入1.5 ml EP管中，静置5 分钟，使其充分裂解；向样品中加入0.2 ml氯仿，手动剧烈震荡室温下静置3分钟；于4℃ 12000g离心15分钟，取上层水相到新的EP管中，再加入0.5 ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温下静置10分钟；4℃ 12000g离心15分钟后弃上清，加入1 ml 75%乙醇；4℃ 7500g离心5分钟，干燥15分钟后加入40 μl DEPC水，样品可冻存于-80℃冰箱。
（2）一步染料法qRT-PCR检测linc00673的表达：
测定CT值，以GAPDH为内参照，以2-△△Ct表示linc00673的相对表达量。
检测linc00673基因在正常脑微血管内皮细胞和胶质瘤微血管内皮细胞中的表达水平（如图1所示）。与正常内皮组相比，Linc00673在实验组中的表达显著增加。数据表示平均值±标准差(n=3, *P<0.05)。
三、linc00673基因抑制剂的制备和应用
设计linc00673基因的干扰序列，选定靶向人linc00673基因并特异性抑制linc00673基因表达的靶基因序列如下：
5’-GGGTGCTTTGAACCAGGAAAG-3’
在NCBI 的同原序列比对分析nucleotide blast 中输入GGGTGCTTTGAACCAGGAAAG序列进行比对分析，结果表明该序列和人的其它mRNA 基因没有高度同源性，可作特异性干扰MCM3AP-AS1基因的特异性序列。
针对以上靶序列设计靶向人MCM3AP-AS1基因而抑制linc00673基因表达的shRNA序列如下，包括正义链和反义链，此shRNA 序列为：
正义链:
5’-CACCGGGTGCTTTGAACCAGGAAAGTTCAAGAGACTTTCCTGGTTCAAAGCACCCTTTTTTG -3’（SEQ ID No.2）。
反义链：
5’-GATCCAAAAAAGGGTGCTTTGAACCAGGAAAGTCTCTTGAACTTTCCTGGTTCAAAGCACCC-3’（SEQ ID No.3）。
转录上述的shRNA 的转录产物，序列为：
5’-GGGTGCTTTGAACCAGGAAAGTTCAAGAGACTTTCCTGGTTCAAAGCACCCTT-3’ （SEQ ID No.4）。
将以上序列信息设计并合成相应质粒，作为linc00673基因抑制剂。linc00673基因抑制剂转染：sh-NC、sh-linc00673的质粒U6/GFP/Neo,使linc00673表达沉默，不含有linc00673序列或shRNA的空质粒为实验阴性对照；应用24孔培养板培养胶质瘤的血管内皮细胞，当细胞生长达到80%左右时进行转染；配置转染需要的质粒、Opti-MEM®Ⅰ和LTX and Plus reagent (Life Technologies)转染试剂。A管：一个孔按照1μg质粒DNA溶解于50 μl Opti-MEM®Ⅰ+1μl p3000，放置5 min，B管：孔按照1μl LTX and Plus溶解于50 μl Opti-MEM®Ⅰ中；将A、B两管混匀后静置5 min；吸出培养液，每孔加入转染混合液100 µL，再加入EBM-2培养液400 µL；48 h后用含有浓度为0.4 mg/mL抗生素G418的培养基进行筛选，不断增加G418的浓度，大约4周后得到能够稳定沉默MCM3AP-AS1的细胞系。在后续实验中分为3组，分别是：正常组;转染linc00673沉默空质粒的空白对照组；转染linc00673沉默质粒的抑制剂组。
四、分别测定正常组，空白对照组和抑制剂组跨内皮电阻值
建立体外BTB模型后，跨内皮电阻值的测定：采用millicell-ERS系统测定，首先将共培养的细胞培养板在37°C放置于恒温条件下，电极片分别放入小室的内外侧，读数稳定后，分别记录结果，每个小室测定三个不同的点，取平均数，减去空白背景的读数后，TEER值计算为读数与Transwell小室的表面积相乘计算，计算单位用Ω·cm2表示。
实验结果如图2（A）所示，检测应用linc00673基因抑制剂后，相对于正常组和空白对照组，体外血肿瘤屏障模型的跨内皮电阻值显著下降；提示应用linc00673基因抑制剂后，体外BTB通透性显著增加。
五、正常组，空白对照组和抑制剂组辣根过氧化酶通透量实验
建立体外BTB模型后，体外BTB模型的Transwell小室加入含有0.5umol/l辣根过氧化物酶的无血清EBM-2培养基。24h后收集BTB模型下室中的培养液，酶标仪测定HRP含量，用HRP标准品绘制HRP标准品曲线，计算渗透到下室的HRP量。HRP量=每小时每平方厘米表面积的HRP的皮摩尔数表示。
实验结果如图2（B）所示，检测应用linc00673基因抑制剂后，相对于正常组和空白对照组，体外血肿瘤屏障模型辣根过氧化酶通透量显著增加；提示应用linc00673基因抑制剂后，体外BTB通透性显著增加。
六、Western blot
(1) 收集细胞，加入RIPA蛋白裂解液，震荡摇匀，冰上静置30min, 4°C条件下12000g 离心30min；
(2) 获得并收集上清并采用BCA法测定样品的蛋白浓度；
(3)取40mg蛋白与5x上样缓冲液混合(1:4)，煮沸5min变性；
(4)将变性蛋白加入8-10%不等的SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；
(5)转膜：电压100V，电流120mA, 90min-200min；
(6)5%脱脂牛奶封闭2h；
(7) 一抗稀释液以一定比例稀释相关抗体封膜，4°C过夜；
(8) TTBS洗5min，3次，加相应二抗，室温摇床上孵育2h；
(9)ECL发光，照相，quantity one软件定量分析。
实验结果如图3所示，检测应用linc00673基因抑制剂后，相对于正常组和空白对照组，体外血肿瘤屏障模型中肿瘤血管内皮细胞紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5的表达水平显著下调。
(八) 免疫荧光
内皮细胞以2000/cm2密度接种于1.5%明胶包被的盖玻片上。达到90% 融合后，PBS洗三遍每次5min，以4%多聚甲醛固定30分钟。PBS洗三遍每次5min，5%BSA封闭15min，然后以相应的抗体孵育过夜。PBS洗三遍每次5min，然后以Cy3标记的山羊抗兔荧光二抗，避光孵育30min，细胞核以DAPI按照1：500进行稀释染色10min。PBS洗三遍每次5min，50%甘油封片并在Olympus BX60 Upright Fluorescence系统进行观察。
实验结果如图4所示：相对于正常组和空白对照组，检测应用linc00673基因抑制剂后，体外血肿瘤屏障模型中肿瘤血管内皮细胞紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5的表达由连续性分布变为间断性分布。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医科大学附属盛京医院
<120> 一种linc00673基因的靶向抑制剂及其用途
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gggtgctttg aaccaggaaa g 21
<210> 2
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caccgggtgc tttgaaccag gaaagttcaa gagactttcc tggttcaaag cacccttttt 60
tg 62
<210> 3
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gatccaaaaa agggtgcttt gaaccaggaa agtctcttga actttcctgg ttcaaagcac 60
cc 62
<210> 4
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gggtgctttg aaccaggaaa gttcaagaga ctttcctggt tcaaagcacc ctt 53