三七三醇皂苷提取物及其制备方法 技术领域 本发明涉及一种中药提取物及其制备， 特别涉及中药三七的提取物三七三醇皂苷 提取物及其制备。
背景技术 三七 (Panax notoginseng， PN) 是风干后的中国传统中药三七 (Burk)F.H.Chen 的 根。三七皂甙 ( 也称为 ： 三七总皂苷， 英文名 ： Panax Notoginsenosides， PNS) 是三七的主 要有效成份， 由 30 余种不同的皂甙组成， 临床上广泛用于治疗微循环障碍相关性疾病， 如 心血管疾病和肝功能障碍。
三七皂甙已经列入国家药典， 有相应制剂产品上市， 如： 注射用血塞通。三七皂苷 的主要成份为 ： 人参皂苷 Rb1， 人参皂苷 Rg1， 三七皂苷 R1， 其制备方法有多篇报道。
三七三醇皂苷为三七皂甙的一种， 对脑血管疾病有治疗作用。
三 七 三 醇 皂 苷 也 有 多 篇 文 献 报 道， 如： 中 国 专 利 200410073881， 公开了一种 三七三醇皂甙的制备方法， 包括取三七粉碎， 加浓度为 60％的乙醇浸泡、 渗漉， 收集渗漉液， 渗漉液减压浓缩， 浓缩液用蒸馏水稀释， 缓慢加到大孔吸附树脂分离柱中， 用 40％乙醇洗 脱， 收集 40％乙醇洗脱液， 然后再精制得三七三醇皂甙。
200510075040 公开了一种三七三醇皂苷的生产制备方法及其应用， 包括取三七粉 碎， 加浓度为 50-90％的乙醇浸泡、 渗漉， 收集渗漉液， 渗漉液减压浓缩， 浓缩液用蒸馏水稀 释， 缓慢加到大孔吸附树脂分离柱中， 用 40％乙醇洗脱， 收集 40％乙醇洗脱液， 然后再精制 得三七三醇皂苷等步骤。
以上方法均使用大孔吸附树脂分离， 分离效果不佳， 本发明人在对三七三醇皂苷 进行研究过程中， 采用 C18 反相硅胶柱分离， 试验出一组新的三七三醇皂甙提取物及其制备 方法， 这些三七三醇皂甙提取物具有疗效高， 纯度高， 吸收好， 质量稳定， 同时制备方法分离 效果佳， 含量高， 工艺简单， 操作方便， 成本低廉， 适合工业化生产。
发明内容
本发明提供一种三七三醇皂苷提取物的制备方法， 所述制备方法步骤如下 ： a. 取三七 ； b. 乙醇渗漉 ； c. 渗漉液浓缩 ； d. 分离出上清液 ； e. 上清液干燥后上硅胶柱， f. 用乙酸乙酯和乙醇混合液洗脱 ； 收集洗脱液。 g 洗脱液浓缩得提取物。 优选的本发明的制备方法步骤如下 ： a. 取三七， 粉碎成粗颗粒 ；b.3 ～ 10 倍 70％乙醇浸泡 8 小时， 渗漉， 收集 20 ～ 40 倍量 70％乙醇渗漉液， 渗漉 流速为 1BV/hc. 渗漉液于 70℃以下减压浓缩至药材的 1.5 倍， ；
d. 离心， 上清液减压浓缩至干 ；
e. 干粉和硅胶比例 1 ∶ 1 ～ 3 拌样 ； 上 200 ～ 300 目硅胶柱， 样品与分离硅胶比 例 1 ∶ 50 ～ 150 ；
f. 用乙酸乙酯和无水乙醇 3 ～ 5 ∶ 1( 体积比 ) 为洗脱剂洗脱， 薄层层析法判断洗 脱终点 ；
g. 收集洗脱液， 洗脱液 70℃以下真空减压浓缩至干或以常规方法冻干、 喷干， 即 得。
本发明更详细的制备方法如下 ：
三七， 粉碎成颗粒， 3 ～ 10 倍 70％乙醇浸泡 8 小时， 装渗漉桶渗漉， 收集 20 ～ 40 倍量 70％乙醇渗漉液， 渗漉流速为 1BV/h， 渗漉液于 70℃以下减压浓缩至药材的 1.5 倍， 离 心， 上清液减压浓缩至干， 干粉和硅胶比例 1 ∶ 1 ～ 3 拌样 ； 上 200 ～ 300 目硅胶柱， 样品与 分离硅胶比例 1 ∶ 50 ～ 150 ； 用乙酸乙酯和无水乙醇 3 ～ 5 ∶ 1 为洗脱剂洗脱， 薄层层析 法判断洗脱终点， 薄层层析条件为 ： 氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝ 15 ∶ 40 ∶ 22 ∶ 10， 下 层展开后， 用喷 10％硫酸乙醇加热 105℃显色 )， 洗脱液 70℃以下真空减压浓缩至干或以常 规方法冻干、 喷干， 即得。 本发明最优选的的三七三醇皂苷提取物的制备方法见本发明实施例。
本发明还包括用本发明的制备方法获得的提取物制备的药物组合物， 所述药物组 合物是用上述三七三醇皂苷作为药物活性成分制备成的药物制剂。
本发明的药物组合物， 根据需要可以含有药物可接受的载体， 其中三七三醇皂苷 作为药物活性成分， 其在制剂中所占重量百分比可以是 0.1-99.9％， 其余为药物可接受的 载体。本发明的药物制剂组合物， 以单位剂量形式存在， 所述单位剂量形式是指制剂的单 位， 如片剂的每片， 胶囊的每粒胶囊， 口服液的每瓶， 颗粒剂每袋， 注射剂的每支等。
本发明的药物组合物可以是任何可药用的剂型， 这些剂型包括 ： 片剂、 糖衣片剂、 薄膜衣片剂、 肠溶衣片剂、 胶囊剂、 硬胶囊剂、 软胶囊剂、 口服液、 口含剂、 颗粒剂、 冲剂、 丸 剂、 散剂、 膏剂、 丹剂、 混悬剂、 粉剂、 溶液剂、 注射剂、 栓剂、 软膏剂、 硬膏剂、 霜剂、 喷雾剂、 滴 剂、 贴剂。
本发明的药物组合物， 其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂， 诸如粘合剂、 填充 剂、 稀释剂、 压片剂、 润滑剂、 崩解剂、 着色剂、 调味剂和湿润剂， 必要时可对片剂进行包衣。 适用的填充剂包括纤维素、 甘露糖醇、 乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、 聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物， 例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括， 例如硬脂酸镁。 适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。
可通过混合， 填充， 压片等常用的方法制备固体口服组合物。 进行反复混合可使活 性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。
口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、 溶液、 乳剂、 糖浆剂或酏剂， 或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含 有常规的添加剂， 诸如悬浮剂， 例如山梨醇、 糖浆、 甲基纤维素、 明胶、 羟乙基纤维素、 羧甲基 纤维素、 硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪， 乳化剂， 例如卵磷脂、 脱水山梨醇一油酸酯或阿拉
伯胶 ； 非水性载体 ( 它们可以包括食用油 )， 例如杏仁油、 分馏椰子油、 诸如甘油的酯的油性 酯、 丙二醇或乙醇 ； 防腐剂， 例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸， 并且如果需 要， 可含有常规的香味剂或着色剂。
对于注射剂， 制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体 和浓度， 可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载 体中， 在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒， 然后密封。辅料例如一种局部麻醉 剂、 防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。 为了提高其稳定性， 可在装入小瓶以后将这 种组合物冰冻， 并在真空下将水除去。
本发明的药物组合物， 在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载 体， 所述药物可接受的载体选自 ： 甘露醇、 山梨醇、 焦亚硫酸钠、 亚硫酸氢钠、 硫代硫酸钠、 盐 酸半胱氨酸、 巯基乙酸、 蛋氨酸、 维生素 C、 EDTA 二钠、 EDTA 钙钠， 一价碱金属的碳酸盐、 醋 酸盐、 磷酸盐或其水溶液、 盐酸、 醋酸、 硫酸、 磷酸、 氨基酸、 氯化钠、 氯化钾、 乳酸钠、 木糖醇、 麦芽糖、 葡萄糖、 果糖、 右旋糖苷、 甘氨酸、 淀粉、 蔗糖、 乳糖、 甘露糖醇、 硅衍生物、 纤维素及 其衍生物、 藻酸盐、 明胶、 聚乙烯吡咯烷酮、 甘油、 土温 80、 琼脂、 碳酸钙、 碳酸氢钙、 表面活性 剂、 聚乙二醇、 环糊精、 β- 环糊精、 磷脂类材料、 高岭土、 滑石粉、 硬脂酸钙、 硬脂酸镁等。
本发明的药物组合物在使用时根据病人的情况确定用法用量， 可每日服三次， 每 次 1-20 剂， 如： 1-20 袋或粒或片， 每剂 1mg-1000mg。
以下通过实验数据说明本发明的有益效果。
本发明的三七三醇皂苷提取物在 LPS 诱导的微循环障碍形成之后的作用
对粘附于小静脉壁白细胞的数目的影响 ：
在 LPS 组， 注射 LPS20 分钟 (E) 和 LPS60 分钟 (F) 导致了大量白细胞对血管壁的 粘附。在 LPS+ 三七三醇皂苷提取物组， 注射 LPS 之后 20 分钟导致了粘附于小静脉壁的白 细胞数目显著增加 (H)， 然后开始三七三醇皂苷后处理， 导致了粘附白细胞数目的明显降低 (I)。
对 照 组 60 分 钟 的 观 察 期 只 发 现 了 少 量 粘 附 的 白 细 胞。 相 反， LPS 组 粘 附 于 小 静 脉 壁 的 白 细 胞 数 目 进 行 性 增 加 并 和 时 间 呈 现 线 性 关 系， LPS 注 射 后 20 分 钟 为 5.6±0.3cells/200μm， 而在 60 分钟时高达 13.1±1.1cells/200μm。三七皂甙提取物后 处理 30 分钟显著改善了 LPS 诱导的白细胞对血管壁的粘附。
对肥大细胞脱颗粒作用的影响 ：
注射 LPS60 分钟之后脱颗粒的肥大细胞增加到 52.3±5.21％。 三七三醇皂苷提取 物后处理显著地抑制了 LPS 诱导的肥大细胞脱颗粒， 其值达到了 22.56±5.62％。
对中性粒细胞粘附分子 CD11b 和 CD18 的表达的影响 ：
LPS 刺 激 之 后 CD11b 和 CD18 的 荧 光 强 度 被 明 显 提 高， 其值分别达到和 56.33±4.00 和 66.85±3.18。三七三醇皂苷提取物后处理抑制了 CD11b 的荧光强度。
对血浆细胞因子浓度的影响 ：
LPS 刺激之后所有测定的细胞因子都迅速升高了， 分别达到了 261.52±64.41， 652.83±156.32 和 2.53±0.21ng/L。三七三醇皂苷提取物后处理显著的抑制 IL-6 和 INF-γ 的产生， 在一定程度上改善了 TNF-α 的释放。
试验的结果显示在 LPS 注射之后 20 分钟运用三七三醇皂苷提取物后处理对于以上提到的每一个 LPS 诱导产生改变的效果是， 能够显著的减少粘附于小静脉壁白细胞的 数目、 脱颗粒的肥大细胞的数目以及中性粒细胞 CD11b 的表达以及 LPS 诱导的血浆 IL-6， INF-γ 浓度， 这些结果显示运用三七三醇皂苷提取物后处理能够改善三七三醇皂苷提取物 诱导的白细胞的粘附， 能够改善在本试验条件之下 LPS 诱导的微循环障碍。这些结果表明 三七三醇皂苷提取物对 LPS 诱导的败血症具有治疗作用。
另一项研究表明， 用本发明的三七三醇皂苷提取物处理可以很好地降低肠系膜上 动脉缺血 - 再灌注诱导的肝脏微循环障碍， 包括降低微静脉直径， 红细胞流速和灌注的窦 状隙数量， 以及增加白细胞滚动和粘附。本发明的三七三醇皂苷提取物对微循环障碍的改 善作用是基于对缺血 - 再灌注诱导的肝脏损伤的保护作用。
有关试验表明， 本发明的三七三醇皂甙提取物比现有技术疗效高， 副作用少， 纯度 高， 吸收好， 质量稳定， 用途新颖， 同时制备方法工艺简单， 操作方便， 成本低廉， 适合工业化 生产。 具体实施方式
下面以具体来说明本发明， 实施例是为了便于理解本发明， 而不以任何方式限制 本发明的权利要求和核心内容。 实施例 1 三七三醇组皂苷的制备
三七， 粉碎成颗粒， 过 20 目筛， 8 倍 70％乙醇浸泡 8 小时， 装渗漉桶渗漉， 收集 30 倍量 70％乙醇渗漉液， 渗漉流速为 1BV/h， 渗漉液于 70℃以下减压浓缩至药材的 1.5 倍， 离 心， 上清液减压浓缩至干， 干粉和硅胶比例 1 ∶ 2 拌样 ； 上 250 目硅胶柱， 样品与分离硅胶比 例 1 ∶ 100 ； 用乙酸乙酯和无水乙醇 4 ∶ 1 为洗脱剂洗脱， 薄层层析法判断洗脱终点， 薄层层 析条件为 ： 氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝ 15 ∶ 40 ∶ 22 ∶ 10， 下层展开后， 用喷 10％硫酸 乙醇加热 105℃显色， 洗脱液 70℃以下真空减压浓缩至干或以常规方法冻干、 喷干， 即得。
实施例 2 实施例 1 所述的三七三醇组皂苷的检测
性状 ： 淡黄色或棕褐色粉末， 味苦。
照高效液相色谱法测定提取物含量
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 ； 乙腈 -0.05％磷 酸溶液 (99 ∶ 400) 为流动相 ； 检测波长为 203nm。理论板数按人参皂苷 Re 峰计算应不低 于 2500。对照品溶液的制备分别精密称取人参皂苷 Rg1， 人参皂苷 Re 和三七皂苷 R1 适量。 加甲醇分别制成每 1ml 含人参皂苷 Rg1 1.3mg、 人参皂苷 Re 0.2mg 的溶液、 三七皂苷 R1 0.6mg， 即得。
供试品溶液的制备 取提取物粉末 0.05g 至 25ml 容量瓶中， 精密称定， 加 20ml 甲 醇溶解， 超声处理， 放冷后加甲醇定容至刻度， 摇匀， 滤过， 即得。
测定法 分别精密吸取上述对照品溶液各 10μl 与供试品溶液 10μl， 注入液相 色谱仪， 测定， 即得。
Rg1 含量占总提取物 70％
三七皂苷 R1 含量占总提取物 20％
人参皂苷 Re 含量范围占总提取物 9％，
提取物中水分不超过 10.0％ ； 水分照水分测定法 (《中国药典》 2005 版附录 IX H
第一法 ) 测定， 不得过 10.0％。
三七总皂苷含量在 85％以上 ；
三七总皂苷中 Rb1 不多于 8％。
实施例 3
三七， 粉碎成颗粒， 3 倍 70％乙醇浸泡 8 小时， 装渗漉桶渗漉， 收集 20 倍量 70％乙 醇渗漉液， 渗漉流速为 1BV/h， 渗漉液于 70℃以下减压浓缩至药材的 1.5 倍， 离心， 上清液减 压浓缩至干， 干粉和硅胶比例 1 ∶ 1 拌样 ； 上 200 目硅胶柱， 样品与分离硅胶比例 1 ∶ 50 ； 用乙酸乙酯和无水乙醇 3 ∶ 1 为洗脱剂洗脱， 薄层层析法判断洗脱终点， 薄层层析条件为 ： 氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝ 15 ∶ 40 ∶ 22 ∶ 10， 下层展开后， 用喷 10％硫酸乙醇加热 105℃显色 )， 洗脱液 70℃以下真空减压浓缩至干或以常规方法冻干、 喷干， 即得。
实施例 4
三七， 粉碎成颗粒， 10 倍 70％乙醇浸泡 8 小时， 装渗漉桶渗漉， 收集 40 倍量 70％ 乙醇渗漉液， 渗漉流速为 1BV/h， 渗漉液于 70℃以下减压浓缩至药材的 1.5 倍， 离心， 上清液 减压浓缩至干， 干粉和硅胶比例 1 ∶ 3 拌样 ； 上 200 ～ 300 目硅胶柱， 样品与分离硅胶比例 1 ∶ 150 ； 用乙酸乙酯和无水乙醇 5 ∶ 1 为洗脱剂洗脱， 薄层层析法判断洗脱终点， 薄层层析 条件为 ： 氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝ 15 ∶ 40 ∶ 22 ∶ 10， 下层展开后， 用喷 10％硫酸乙 醇加热 105℃显色 )， 洗脱液 70℃以下真空减压浓缩至干或以常规方法冻干、 喷干， 即得。 实施例 5
三七， 粉碎成颗粒， 5 倍 70％乙醇浸泡 8 小时， 装渗漉桶渗漉， 收集 25 倍量 70％乙 醇渗漉液， 渗漉流速为 1BV/h， 渗漉液于 70℃以下减压浓缩至药材的 1.5 倍， 离心， 上清液减 压浓缩至干， 干粉和硅胶比例 1 ∶ 1.5 拌样 ； 上 250 目硅胶柱， 样品与分离硅胶比例 1 ∶ 80 ； 用乙酸乙酯和无水乙醇 4 ∶ 1 为洗脱剂洗脱， 薄层层析法判断洗脱终点， 薄层层析条件为 ： 氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝ 15 ∶ 40 ∶ 22 ∶ 10， 下层展开后， 用喷 10％硫酸乙醇加热 105℃显色 )， 洗脱液 70℃以下真空减压浓缩至干或以常规方法冻干、 喷干， 即得。
实施例 6
实施例 3 的提取物， 经过检测， Rg1 含量占总提取物 40％， 三七皂苷 R1 含量占总提 取物 10％， 人参皂苷 Re 含量占总提取物 5％。提取物中水分不超过 10.0％ ； 三七总皂苷含 量在 80％以上 ； 三七总皂苷中 Rb1 不多于 10％。
实施例 7
实施例 4 的提取物， 经过检测， Rg1 含量占总提取物 70％， 三七皂苷 R1 含量占总提 取物 20％， 人参皂苷 Re 含量占总提取物 5％。提取物中水分不超过 10.0％ ； 三七总皂苷含 量在 85％以上 ； 三七总皂苷中 Rb1 不多于 8％。
实施例 8
实施例 5 的提取物， 经过检测， Rg1 含量占总提取物 50％， 三七皂苷 R1 含量占总提 取物 15％， 人参皂苷 Re 含量占总提取物 10％。提取物中水分不超过 10.0％ ； 三七总皂苷 含量在 85％以上 ； 三七总皂苷中 Rb1 不多于 8％。
实施例 9
三七， 粉碎成颗粒， 6 倍 70 ％乙醇浸泡 8 小时， 装渗漉桶渗漉， 收集 35 倍量 70 ％ 乙醇渗漉液， 渗漉流速为 1BV/h， 渗漉液于 70℃以下减压浓缩至药材的 1.5 倍， 离心， 上清
液减压浓缩至干， 干粉和硅胶比例 1 ∶ 2.5 拌样 ； 上 270 目硅胶柱， 样品与分离硅胶比例 1 ∶ 120 ； 用乙酸乙酯和无水乙醇 4.5 ∶ 1 为洗脱剂洗脱， 薄层层析法判断洗脱终点， 薄层层 析条件为 ： 氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝ 15 ∶ 40 ∶ 22 ∶ 10， 下层展开后， 用喷 10％硫酸 乙醇加热 105℃显色 )， 洗脱液 70℃以下真空减压浓缩至干或以常规方法冻干、 喷干， 即得。
实施例 10
取实施例 1 的三七三醇组皂苷， 根据需要可以含有药物可接受的载体， 根据制剂 学常规技术制备成片剂 .
实施例 11
取实施例 1 的三七三醇组皂苷， 根据需要可以含有药物可接受的载体， 根据制剂 学常规技术制备成胶囊剂 .
实施例 12
取实施例 1 的三七三醇组皂苷， 根据需要可以含有药物可接受的载体， 根据制剂 学常规技术制备成注射剂 .
实施例 13
两组病人， 各 50 人， 服用现有技术的三七三醇组皂苷片和本发明最优选的实施例 1 的三七三醇组皂苷片， 有效率相同， 后者头晕， 恶心等副作用减少 50％以上。8