技术领域
本发明关于一种制药学或营养学上的制剂形式，一种此种制剂形式的制 造方法及利用此种制剂形式的治疗方法。提供有人用及兽用的制剂形式。
背景技术
孢粉质是各种植物、苔类、菌类及藻类的孢子外膜。通过用溶剂、碱及 酸的连续处理来移除可能附着于孢子外膜上或孢子外膜所含的脂质、碳水化 合物、蛋白质及核酸，可将孢粉质从孢子上分离出来。亦用到了酶的方法。 孢粉质在化学上及物理上呈稳定状态，且其被描述为类似于类胡萝卜素并具 有疏水性。其他由葡聚糖、甘露聚糖及甲壳素形成的孢子外膜可具有相似的 化学及物理稳定性。然而一些孢子的内膜部分由纤维素构成；该内膜很大程 度上会被此等化学处理分解(F.Zetzsche与K.Huggler Annalen，1928， 461，89)。
DE-A-19902724揭示了一种制剂形式，其中微囊体由填充了活性物质的孢 粉质孢蒴制成。此等制剂形式具有一缺点，就是该种或该等活性物质的释放 视乎孢蒴的完整性而定。与该揭示不同，本发明利用酒精的存在及其弹性本 质来辅助孢粉质囊的填充，特别是用来提高处理速度，并利用特定的孢子外 膜尺寸来确定输送目标。
US-A-5013552揭示了把由花粉粒子中得来已满载的纤维素外壳用于输送 系统。此种外壳与内膜类似，即其会被用来获得孢粉质的提取过程所破坏。
发明内容
根据本发明的第一个方面，一种制药学或营养学上的制剂形式包含有效 剂量的活性物质，该活性物质与一承载物化学结合，该承载物由植物、苔 类、菌类、藻类或其片段的孢子外膜中选出，可选择性地进一步带有赋形 剂。
根据本发明的第二个方面，一种制药学或营养学上的制剂形式包含有效 剂量的活性物质，该活性物质在物理上被结合于一承载物中，该承载物由植 物、苔类、菌类、藻类或其片段的孢子外膜中选出，可选择进一步带有赋形 剂。
当该活性物质在物理上被结合时，其可被吸附于承载物上。
作为另一选择且经常更为可取的是保留该活性物质于与中空孢子外膜例 如孢子花粉素的孢子花粉素壁连为一整体的腔体中，或保留于中心腔体内。 这三方面均使该制剂形式可以通过将其吸收进入血流，随后将外膜分解以释 放活性物质的方法进行施药。
根据本发明的第三方面，一种制药学或营养学的制剂形式的制作方法包 含以下步骤：
以一渗透辅助液体接触一孢子外膜
以一活性物质接触该孢子外膜并让该物质能够渗入孢粉质壁腔体内及/或
以一活性物质接触孢子外膜并让该物质渗入孢子外膜内部，且随后移除 该渗透辅助液体并让该孢子外膜干燥以将该物质保留在外膜内。
一种优选的渗透辅助液体可为由一族群中选出的一溶剂或增溶介质，该 族群包括C1至C4酒精，更优选为乙醇及水性C1至C4酒精，优选为水性乙醇。
孢粉质的孢子外膜可被浸于一种溶有活性物质的溶液中。另可选择在与 活性物质接触前将外膜浸于溶剂或其他渗透辅助液体中。
孢粉质的孢子外膜可被：(i)在大气压力下或在真空中压成片剂，然后 将其与活性物质(或仅为带有或不带有渗透辅助液体的液态活性物质)溶液 接触；(ii)置于有活性物质存在的真空中，其中该活性物质带有或不带有渗 透辅助液体。这些过程可在室温或高至摄氏250度的温度下进行操作。该活 性物质可以包含一种药物、一种药物混合物、一种营养物质、一种营养物质 混合物或一种药物与营养物质的混合物。营养物质的例子包括矿物质及香精 油。可以提供降低胆固醇制剂形式。维生素、矿物质、食物调味料及其他营 养补充性活性物质可以利用根据本发明的制剂形式进行施用。
可将根据本发明此方面的制剂形式结合于食品中，例如像谷物条那样的 降低胆固醇食品。亦提供有兽用营养产品。
可以大量承载活性物质，例如达到孢子外膜重量的几倍。此种可以容纳 相当大量的其他物质的能力促进了添加营养补充物质或其他成分或添加剂例 如香料、防腐剂、抗氧化剂或矿物质在其他产品例如食物及饮料。孢粉质外 膜可以在产品被服用之前为活性物质提供防潮、防酸、抗碱氧化或抗光解的 保护。有些物质，例如硫酸铜，不易于释放进入水性溶液中，而另一些(那 些仅在物理上包括的)则释放缓慢。扫描电子显微镜(SEM)X光下显示整个孢 粉质外壳的硫酸铜被均匀地吸收。当活性成分被输送经过肠道时可被缓慢释 放。如不希望有上述情况则可在孢粉质外膜上增加另一外膜以延迟释放。孢 子外膜可以被衍化以降低其半渗透性，例如用一低粘度树脂，如阿拉伯树 胶。如果不希望被吸收进入血流中，可使用较大粒子的孢粉质(大于100微 米)。
在优选的制剂形式中，孢子外膜包含孢粉质、葡聚糖、甘露聚糖或甲壳 素。这些孢子外膜具有在化学上及物理上呈稳定状态，使用及施用方便且准 备简单，价格低廉的优点。其通常不含有可滤出杂质并可被设计成提供高活 性物质承载能力的功能，且其具有无蛋白质的优点，可防止过敏或其他由蛋 白质或变性蛋白质引起的生理影响。后者可能会存在于一不够严格的提取过 程中，例如US-A-5013552中所描述的那样。
在本发明的优选实施例中，该承载物基本上由孢子外膜组成，该孢子外 膜包含孢粉质、甲壳素、葡聚糖或甘露聚糖，且基本上不含蛋白质。
优选为蛋白质含量不超过0.5％，最好是不超过0.1％。
优选的外膜的蛋白质含量低至足以在6％w/v的水性氢氧化钾中回流2小时 后再没有观察到进一步的蛋白质流失。
根据本发明的制剂形式，其具有在酸或碱性介质中呈稳定状态，但在某 种环境下尤其是在血液中会快速地生物分解的优点。此分解产物可为无毒且 无炎症反应。在胃肠道中的停留时间短。分解可在血流中迅速发生，且在胃 肠道中的程度可能较小，其使得药物或活性物质的施用有效且迅速，例如在 几分钟如20分钟的时间内。
该制剂形式可包含一生物轭合，即通过化学结合以合成方法获得的一大 分子复合物，例如将药物分子共价键接至一包含孢粉质或其他孢子外膜的承 载物或培养基上。尽管共价键接用于同样的应用较为可取，但也可以使用离 子键接、氢键键接、范德华力或在孢子外膜内封囊的方法，尤其在可不需要 药物或其他活性物质与承载物强力键接时可应用例如吸入处方剂中。活性物 质或药物可与孢粉质直接反应或在物理上与其附着以产生一生物轭合。然 而，在本发明的实施例中孢粉质或其他孢子外膜被功能化，从而药物可以通 过具有适当稳定性的共价键接或其他化学键接而附着。例如，在通过口部输 送的情况下可选择在酸性溶液中呈稳定状态的键接，从而活性物质及承载物 可以通过胃部进入肠道。或可选择利用孢子外膜所提供的保护使囊封的药物 呈稳定状态。通过一额外的外膜例如使用阿拉伯树胶或淀粉可以达到对物理 附着或化学附着的活性物质的额外保护。亦可以使用传统的薄膜，例如羟丙 基纤维素或其他改良的纤维素。
根据这些资料的制剂形式在施药方面有特定应用，即其在液体中或尤其 在酸性介质例如β-内酰胺(β-lactams)、头孢菌素(cephalosporins)或双脱 氧腺甘酸(dideoxyadenosine)中呈不稳定状态。可减少释放进入血液前的分 解。亦可促进将不可溶的或几乎不可溶的药物例如环孢霉素 (cyclosporins)、紫杉醇(taxanes)或其他大环内酯物(macrolides)施加入血 流中，例如环孢素(ciclosporin)、甲苯咪唑(mebendazole)、制霉菌素 (nystatin)、异丙酚(propofol)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、miconazole anthracyclinones或丙氟哌酸(ciprofloxacin)。
若承载物由孢粉质或其他孢子外膜组成的或包含孢粉质或其他孢子外膜 的，由于其在口服之后能够快速吸混进入血液及有快速代谢(20分钟至2小 时)的能力，相较于市面有售的用于传输药物或其他活性物质的聚合物而言 具有显着优势。另外其易于被衍化以附着多种具有不同的溶解性及稳定性的 药物。此种承载物可以根据其生物性起源在保持化学上及形态上一致，能够 保护酸性不稳定分子且无毒。再者，当口服孢粉质或其他孢子外膜或将其吸 入肺中时也没有过敏反应，部分原因是与此等反应相关的蛋白质及碳水化合 物已由植物孢子原料中移除。孢粉质或孢子外膜在血液中迅速分解使活性成 分迅速释放。此种外膜在施药及吸收过程中可保持其大小及形态。特定物种 而来的孢子外膜的大小及形态的统一使制剂形式可以根据药物的承载量及输 送的模式而被优化。较大的粒子可包含较高比例的活性物质，例如药物或功 能性食物成分。我们已发现25微米的粒子可以在中心腔体内容纳多于同等重 量的活性物质。以前已经提出过，此种大粒子不能通过肠壁吸混进入血流 (ML Wierner，Fd Chem.Toxic.，1988，26(10)867-880)。
有很多涉及生物轭合这个课题的论文、评论及书籍生物轭合(两著名引 用包括：Bioconjugate Techniques，Greg T Hermanson，1996，Academic Press Inc及Bioconjugation in Pharmaceutical Chemistry，I1 Farmaco，1999，54，497-526)。很多偶联剂已被揭示。碳化二亚胺如DCC (二环己基碳二亚胺dicyclohexylcarbodiimide)或EDC{1-(3-二甲氨基丙 基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐1-ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride}非常有效。与伯胺或与 羧酸酯基团(carboxylate groups)结合的一些药物及探针可以直接与非衍化 孢粉质结合。
根据本发明的制剂形式可以单独施用，特别是用于吸入施药，但通常选 择至少一种与施药途径相关的适当药学赋形剂、稀释剂或承载物。
该制剂形式可被制造为适于口部、含服或舌下以片剂、胶囊，包括软凝 胶胶囊、胚珠、酏剂溶液或悬液的形式给药。该制剂形式可被制造为适用于 立即、延迟、经改良或在控制下释放输送。在压缩处方剂中的孢子外膜的作 用有时较为有利，因为其具有弹性，可在制成片剂或在需要缩小片剂尺寸时 保持完整。
该制剂形式还可被制造为适用于快速消散或快速溶解给药。
可以使用压缩片剂或其他压缩制剂形式。可以应用水性及非水性外层。 处方剂或可选择使用一分解质或发泡剂结合以便于在液体中消散。
根据本发明的片剂可包括赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、 碳酸钙、二碱式磷酸钙、氨基乙酸及淀粉，优选为谷类、马铃薯或木薯淀 粉，分解质，例如羧甲淀粉钠(sodium starch glycollate)、交联羧甲纤维 素钠(croscarmelose sodium)及制粒黏结剂，例如聚乙烯吡咯烷酮 (polyvinylpyrollidone)、羟丙基甲基纤维素 (hydroxypropylmethylcellulose)、羟丙基纤维素(hydroxypropyl cellulose)、甲基纤维素、蔗糖及凝胶。亦可使用润滑剂，例如硬脂酸镁及 助流剂，例如滑石或硅胶。
根据本发明的制剂形式可以用作凝胶胶囊的填充物。优选的赋形剂包括 乳糖、混晶糖、淀粉、纤维素及聚乙二醇。或可选择使用冷冻干燥制剂形 式，例如在GB1548022中所揭示的及各种与RP Scherer公司的ZydisTM剂相 关的专利。
根据本发明的制剂形式可以包括水性悬液或干性粒子或作为悬液用于补 充的其他成分。
改良的释放或脉动释放制剂形式可以包括释放频率改良剂包括羟丙基甲 基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、醋酸纤维素、聚环 氧乙烷、黄原酸胶(xanthan gum)、卡波姆(Carbomer)、油、蜡及甲基丙烯酸 盐(methacrylate)共聚物。
也可使用经皮肤给药方式，尤其使用小的孢粉质片段。
在特别优选的实施例中本发明的制剂形式被制造为适用于肺部给药。孢 粉质或其他孢子外膜可从一苔类、真菌或植物物种中选出以提供选定尺寸的 粒子来使制剂形式可以渗透到所需给药位置，例如下肺部。特别优选一大小 约为1-100微米的粒子，最好是约为1-30微米，更优选为约1-10微米，尤 其是1-5微米。
根据本发明此方面的制剂形式具有粒子大小统一的优点。此外，用酸、 碱或有机溶液对孢子进行提取之后粒子的大小和形状大致不变。被提取的孢 子外膜可保持与其所来自的孢子在大小及形状上保持相似。相对之下，微粉 化药物，例如传统上用于哮喘治疗的那种，其具有许多种粒子大小，包括一 部分的幼细粒子，也有较大的凝块。每一种来自一特定物种的孢子，其尺寸 上的区分都很小且具有一致的形状，并可被选出以提供一适合于在一选定部 位或以一选定模式进行给药的制剂形式。根据本发明的有用孢子可根据以下 出版物所揭示那样从裸子植物、被子植物、种子蕨类、菌类及藻类中获取， 其结合于本说明书作为参考：
G.Shaw，Sporopollenin in Phytochemical Phylogeny，J.B. Harborne(Ed)，Academic press，London and New York，第3章， (1997)，31-5。
P.D.Moore，J.A.Webb与M.E.Collinson，Pollen analysis，第二 版，Blackwell Scientific Publications，(1999)。
J.Brooks，Some Chemical and Geochemical Studies on Sporopollenin in：Sporopollenin，J.Brooks，M.Muir，P.Van Gijzel 与G.Shaw，(Eds)Academic press，London and New York，(1971)， 305-348。
典型物种的孢子大小如下：
孢子大小示例
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 1.2微米
勿忘我属植物(勿忘草)(Myosotis(Forgetmenot)) 2.4-5微米
黑曲霉(Aspergillus niger) 4微米
青霉菌(Penicillium) 3-5微米
小鸡油菌(Cantharellus minor) 4-6微米
灵芝(Ganomerma) 5-6.5微米
田头菇(Agrocybe) 10-14微米
异株荨麻(Urtica dioica) 10-12微米
黑蒽花霉(Periconia) 16-18微米
附球菌(Epicoccum) 20微米
伸筋草(Lycopodium clavatum) 25微米
冷杉(Abies) 125微米
矮南瓜(Cucurbitapapo) 200微米
南瓜(Cuburbita) 250微米
引致例如农夫肺等疾病的孢子之所以能够引致疾病是因为其积存于肺部 的一特定位置。通过从孢子移除含有蛋白质及其他相关物质以制成孢子外 膜，剩下的无害形体可以将有益介质传输至肺部中这些相同的位置。
根据本发明的一制剂形式可以通过肺部吸入或鼻腔吸入的方式给药，并 可以通过使用一干粉末吸入剂或一定量吸入气雾剂喷雾或由一加压容器、 泵、喷雾或雾化器利用适当的推进剂，例如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA 134a) 或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(HFA 227)方便地传输。
根据传统做法，定量吸入气雾剂成分可以结合一表面活性剂或共溶剂。
根据本发明的制剂形式可以以栓剂或阴道栓剂的形式给药。制剂形式， 尤其是结合孢粉质或孢子的片段的，可以外敷以凝胶、水分凝胶液、溶液、 乳剂、软膏或粉剂的形式施用。该处方剂亦可在皮肤上或经皮肤给药，例如 通过使用皮肤贴。
本发明的制剂形式可提供给人用或兽用。
附图说明
图1至图14所示为根据本发明各个实施例的孢粉质衍化/功能化方法的 反应方程式；
图15为嵌入丙烯酸树脂的孢粉质切片后的横截面的电子显微图像。
具体实施方式
本发明通过举例的方法进一步描述，但其不意味任何限制。
孢粉质或其他孢子外膜可以通过使用一有机溶液与强酸与强碱的组合物 对孢子进行严格处理而分离出来。
例1：从伸筋草(Lycopodium clavatum)中分离孢粉质
使伸筋草(250克，Fluka有售)悬浮于丙酮(700毫升)中并在回流下 搅拌4小时。滤出固态残余物，用干净的丙酮冲洗，装回反应瓶中并再次使 其悬浮于氢氧化钾溶液(850毫升，于水的浓度为6％w/v)中。然后将该混合 物在回流下搅拌6小时。滤出残余物，用热水充分冲洗，装回反应瓶中，然 后重复氢氧化处理。过滤后将固态物质用热水、热乙醇及水再次冲洗。将残 余物在乙醇(750毫升)回流下搅拌2小时，过滤，然后先后用干净的乙醇及 二氯甲烷冲洗。再使所得固体悬浮于干净的二氯甲烷(750毫升)中，在回流 下搅拌2小时，滤出再风干24小时。
然后使滤出的粒子悬浮于正磷酸(85％，800毫升)中，在温和的回流下 搅拌5天并过滤。用足量热水冲洗残余物再吸干。再重复正磷酸处理及干 燥。然后用热水、乙醇及二氯甲烷冲洗粒子。最后将该固体在乙醇(800毫 升)回流下搅拌2小时，过滤并用二氯甲烷冲洗，然后风干并真空干燥以生 产孢粉质(50克)。
例2：甲状腺素的物理附着及生物性评估
孢粉质(0.5克)压缩于10公吨下2分钟。将所得片剂加入一溶液中，该 溶液为包含300微克甲状腺素的0.3毫升DMSO(二甲基亚砜)及1.5毫升乙醇。 该片剂不到一分钟就吸收了溶液，然后将该样本置于有五氧化二磷的真空下 在摄氏5度下干燥至恒重。将物理附着甲状腺素的孢粉质给自愿者口服。不到 15分钟病人血液中甲状腺素水平上升了1奈米摩/公升(nano mole/litre)。在 此上升的同时，可观察到明显数量的孢粉质粒子或部分分解的粒子，如例18 中所观察到的。因此，假设自愿者体内有5公升血液，如口服15分钟后发现4 微克甲状腺素则相当于药物传输量的0.66％。其与传输的孢粉质粒子的量 (0.6％)保持一致。此甲状腺素水平的迅速上升应于1至2个小时之后才发 生，因为其首先会被位于消化道较下位置的空肠(jeujenum)所吸收。
例3：人重组细胞生长激素的物理吸收
孢粉质(0.5克)于10公吨下压缩2分钟形成片剂(16毫米乘3毫 米)。将该片剂加入一将人体重组生长激素固体处方剂[5.5毫克，其包括该 激素(1毫克)及一甘露醇、氨基乙酸、磷酸氢二钠、氢氧化钠及/或磷酸的 混合物]溶于一混合物的溶液中，该混合物包括一稀释液(0.5毫升；包括甘 油、间甲酚水(m-cresol water)及氢氧化钠及/或盐酸)及乙醇(2.0毫 升)。该孢粉质片剂迅速地(15秒)增至其原有体积的几乎4倍，同时吸收 所有的溶液。将所得粉末在摄氐5度及真空下干燥48小时，在此段时间内达 到恒重。
例4：可溶解胰岛素处方剂的物理吸收
将一可溶解胰岛素(包括0.18克胰岛素、rDNA(核糖体DNA)、氯化 锌、甘油、间甲酚、氢氧化钠、盐酸及水的一2立方厘米的处方剂)及乙醇 (1毫升)的溶液加入孢粉质(1克)中，该1克的孢粉质已事先于10公吨 下被压缩2分钟形成片剂。在孢粉质片剂增长至其原有体积的几乎4倍的同 时，该溶液在20秒内被吸收。将该所得粉末在摄氏5度及真空下干燥48小 时，在这段时间内达到恒重。
例5：向日葵油的物理吸收
通过在一16毫米模具中以10公吨压力压缩2分钟制备孢粉质(0.5克) 片剂。将该等片剂在室温下加入一向日葵油(1毫升)和一辅助吸收液体的混 合物中(表1)。将所得粉末在一干燥器中在有P2O5(五氧化二磷)及摄氐50 度下烘干至恒重。
当不用溶剂时该片剂将实质上保持无变化超过3小时。
表1
辅助吸收液体 完全吸收所用时间 乙醇 20秒 二乙醚 1分5秒 石油醚 3小时 二氯甲烷 35秒 己烷 3小时 乙酸乙酯 50秒 乙腈 20秒 甲苯 2分15秒
在摄氏40度下重复乙醇与向日葵油的物理附着，其缩短了完全吸收该样 本所用的时间；12秒钟后即完成吸收。用于完全吸收的时间非常依赖所使用 的辅助吸收液体及温度。
例6：氨基乙酸的物理吸收
将一孢粉质片剂(0.5克)加入用乙醇(0.5毫升)稀释的1M氨基乙酸 溶液(0.5毫升)中。溶液被迅速吸收，再将所得粉末在有五氧化二磷的真空 下干燥至恒重。孢粉质的承载量被发现为1.9毫摩/克。重复此实验，但不必 压缩孢粉质。孢粉质的承载量被发现为0.38毫摩/克。这显示出当孢粉质被 压缩时，其对氨基乙酸的吸收明显增加。
孢粉质被发现将其在水中激烈搅拌30分钟后可保留15％的水溶性氨基乙 酸。同样的样本在外层覆上淀粉后被发现在激烈搅拌30分钟后可保留35％的 氨基乙酸。
例7：硫酸铜的物理吸收
将一孢粉质片剂(0.5克)加入用乙醇(0.5毫升)稀释的1M硫酸铜溶 液(0.5毫升)中。该溶液被迅速吸收，然后将所得粉末在有五氧化二磷的真 空下干燥至恒重。孢粉质的承载量被发现为2.5毫摩/克。在扫描电子显微镜 (SEM)X光下显示整个孢粉质外壳的硫酸铜被均匀地吸收。
孢粉质在水中搅拌30分钟后被发现保留了75％的硫酸铜。
例8：LR White 的物理吸收
将一孢粉质片剂(0.1克)加入50％LR White的乙醇溶液(2毫 升：其中含80％多羟基取代双酚A二甲基丙烯酸酯树脂(polyhydroxy substituted bisphenol A dimethacrylate resin)，19.6％C12甲基丙烯酸 酯(C12 methacrylate ester)，0.9％二甲基对甲苯胺(dimethyl para toluidine))中。将该混合物温和地搅动2小时。将所得粒子通过离心法分 离并进一步用LR White(2毫升)再处理12小时。然后将该混合物 置于一胶囊中在摄氏60度下加热8小时。所得聚合物填满孢粉质粒子及其壁 内腔体，如扫描电子显微镜下所示(图15)。
例9：孢粉质的衍化(图1)
由伸筋草中分离出来的孢粉质可在一大约5毫摩/克的水平通过直接溴化 而卤化(F.Zetsche与K.Huggler，Liebigs Ann.Chem.，1928，461， 89)。其可通过与二氯甲基醚及四氯化锡产生作用而被氯甲基化，以得到承 载量约为1毫摩/克的氯(G.Mackenzie与G.Shaw，Int.J.Peptide Protein Res.，1980，15，298-300)。使用传统的Merrifield方法用氯甲 基团来合成一单一的三缩氨酸。或可选择用1，3-二氨基丙烷使孢粉质氨化， 以使其得到承载量为1.6毫摩/克的碱(R Adamson，S.Gregson与G. Shaw，Int.J.Peptide Protein Res.，1983，22，560-564)。该1，3-二氨 基丙烷孢粉质可以与氯乙酸酐或者与氯乙酰氯产生反应，随后用4-羟基苯甲 醇链接剂钠盐进行处理。随后可用苯甲基终止隔离剂以传统的方法来合成一 四缩氨酸。孢粉质的二氨基乙烷衍化物可产生离子交换树脂类物料，而此物 料与溴乙酸乙酯/碱水解作用(承载量为1.4毫摩/克)反应可得到酸。通过 孢粉质与氯磺酸(承载量为1.6毫摩/克)的反应可得到一酸性产物(G. Shaw，M.Sykes，R.W.Humble，G.Mackenzie，D.Marsdan，E. Phelivan，Reactive Polymers，1988，9，211-217)。
孢粉质相较于许多市面有售的聚合物而言具有在物理上及化学上坚固但 同时相对地易于衍化的优点。市面有售的聚合物中最常用作生物轭合的结合 基团为BNH2、-OH、SH及CO2H。孢粉质具有易于将此种结合基团引导至其表面 的优点，以直接或通过一隔离剂或链接剂基团与一药物产生一共价键接，其 在结合团与药物之间形成一短链。我们已改进文献中所揭示的孢粉质上的链 接剂及结合基团，并已在前面的部分中总结过。在将此等衍化的孢粉质作为 药物输送物质的应用中，下面所描述的新的链接剂/结合基团相对于文献中所 记载的那些来说具有附着方便，承载量提高，附着稳定且将毒性副产物减到 最小的优点。必须注意的是同一来源的孢粉质粒子在其形态及化学上近乎一 致。此一致性是在治药领域中所使用的人造聚合物未必有的。根据本发明的 第四方面，提供有一伯胺功能化的孢粉质。
用于药物输送的几种市面有售的聚合物，例如多聚(L-赖氨酸)及多聚 (L-天门冬氨酸)，其具有一用于药物附着的伯胺基团，由于其有效的亲核 性使其可成为用于多种药物媒介应用的一特别多用途的链接剂/结合功能基 团。一般，用碳化二亚胺试剂将胺基团与含羧基药物结合。伯胺亦可与二琥 珀酰亚胺基碳酸酯(disuccinimidyl carbonate)及三乙胺(triethylamine)反 应以产生异脲(Bioconjugate Techniques，Greg T Hermanson，1996， Academic Press Inc及Bioconjugation in pharmaceutical chemistry，Il Farmaco，1999，54，497-526及其中参考)，其可附着输送胺的药物，例如 胰岛素。
本发明一优选的方面提供了一新颖的方法来用一伯胺功能基团以最低的 化学作用来衍化孢粉质，并避免无毒隔离剂基团的使用，例如以前所使用的 二胺。此方法包括用氨水(0.880)在室温下处理孢粉质以产生孢粉质的胺化 形，随后用LiAlH4(氢化铝锂)还原以产生聚合物的伯胺基(-NH2)形。可得到大 约1毫摩/克的承载量。
例10：伯胺功能化的孢粉质的制备(图2)
将孢粉质(2克)在0.880氨水中于室温下搅拌4天。通过过滤收集孢粉 质，然后用水(10x100立方厘米)、EtOH(乙醇)(2x30立方厘米)及DCM (二氯甲烷)(2x30立方厘米)冲洗。然后将孢粉质在真空中干燥至恒重。 在二氧六环(dioxane)(100立方厘米)中的N2(氮气)下搅拌LiAlH4(氢化 铝锂)(3.6克)。加入胺化的孢粉质(2克)并于N2(氮气)中回流4天。 冷却该混合物。小心地加入乙酸乙酯(100立方厘米)并冷却。用玻璃棒将不 可溶的大块搅碎。缓慢地加入水(100立方厘米)然后加入2M硫酸(200立 方厘米)。然后用水(2x250立方厘米)、EtOH(2x250立方厘米)、DCM (2x250立方厘米)冲洗伯胺化孢粉质，然后在真空中干燥至恒重(1.8 克)。
根据本发明的第五个方面，提供有一聚氨基功能化的孢子外膜。亦提供 有一包含化学上结合有效剂量活性物质的聚氨基功能化孢粉质的制剂形式。
一些聚氨基化合物，例如自然存在于体内的精胺及亚精胺。它们无毒， 并因此可以作为隔离剂基团应用。在一优选实施例中，可以在一惰性溶剂中 通过加热或回流使一聚氨基化合物与孢粉质反应以形成共价键。
相对于二胺及伯胺来说，使用聚胺具有一优点，即其具有用于药物附着 的额外的亲核氨基团，以提供此等衍化具有提高的药物装载能力的衍化孢粉 质及类似的孢子外膜。亦可用相似的方法使用芳族聚胺，例如1，3，5-邻苯二 胺及相关的杂环，例如三聚氰胺。分别使用光气或硫光气连同带有氢氧基的 药物，例如核苷(例如司他夫定(D4T)、阿昔洛韦(acyclovir)及齐他夫定 (AZT))，可容易地将芳族胺类分别活化成异氰酸酯或异硫氰酸酯氢氧基 团。例11揭示了使此等结合或隔离剂基团附着的方法。
例11：聚胺功能化的孢粉质的制备(图3)
亚精胺(0.7毫摩)、1，3，5-邻苯二胺(0.7毫摩)及三聚氰胺，分别与 孢粉质(0.1克)在各种溶剂例如甲苯(10毫升)、二甲基亚砜(DMSO dimethyl sulphoxide)及二甲基甲酰胺(DMF dimethyl formamide)中回流 24小时以使其在经过滤，然后用甲苯(2x10立方厘米)、2M HCl(盐酸) (2x10立方厘米)、水(3x10立方厘米)、EtOH(2x10立方厘米)及DCM (2x10立方厘米)冲洗，并在真空中干燥至恒重后的承载量分别为1.6、0.95 及0.54毫摩/克。
根据本发明的第六个方面，提供有一羧酸功能化的孢子外膜。亦提供有 包含化学上结合有效剂量活性物质的羧酸功能化孢子外膜的制剂形式。
一常用于形成药物-聚合物结合物的方法，包括通过N-羟基丁二酰亚胺酯 利用N-羟基丁二酰亚胺及一碳化二亚胺活化一羧酸盐功能。此等活化酯可以 有效地与带有伯胺的药物例如缩氨酸，及含氢氧基的药物例如核苷氢氧基团 结合。数种市面有售的碳化二亚胺可溶于水性或有机溶剂。附着于孢粉质的 羧酸链接剂已被揭示(G.Shaw，M.Sykes，R.W.Humble，G.Mackenzie，D. Marsdan，E.Phelivan，Reactive Polymers，1988，9，211-217)。此作用 包括了1，3-二氨基丙烷衍化孢粉质与溴乙酸乙酯产生反应后皂化。例如通过 使前面提到的聚氨基衍化孢粉质与例如琥珀酸酐或溴乙酸乙酯反应，随后再 进行皂化，可以提高承载量。另一可以引导羧酸功能的方法为一氨基酸或例 如Gly(甘氨酸)-Phe(苯丙氨酸)-Ala(丙氨酸)-Leu(亮氨酸)或Gly (甘氨酸)-Phe(苯丙氨酸)-Leu(亮氨酸)-Gly(甘氨酸)的短缩氨酸链 的附着。一附着在孢子外膜上作为链接剂的氨基酸较引人注目，因为其通过 在一适当溶剂中将一无保护的氨基酸或或氨基酸的乙酯或其他烷基酯与孢子 外膜进行加热或回流即可轻易得到。此等链接剂的进一步优点为其无毒性。 例12揭示了一非衍化氨基酸附着至孢粉质的方法。
例12：制备氨基酸功能化孢粉质作为附着羧酸功能的一种方法(图 4)
一种氨基乙酸(0.1克)与孢粉质(0.1克)的混合物在DMSO中回流24 小时。通过过滤收集孢粉质，并用甲苯(2x10立方厘米)、EtOH(2x10立方 厘米)、2M HCl(2x10立方厘米)、水(3x10立方厘米)、EtOH(2x10立方 厘米)及DCM(2x10立方厘米)冲洗以使其承载量为3.6毫摩/克。
例13显示出一用于将氨基酸酯附着至孢粉质并随后提供羧基功能的方 法。
例13：制备氨基酸酯功能化孢粉质作为附着一羧酸功能的一种方法 (图5)
将甘氨酸乙酯盐酸盐(0.1克)在甲苯(20立方厘米)及三乙胺(2毫 升)中搅拌。加入孢粉质(0.1克)并将该混合物回流24小时并搅拌。通过 过滤收集冷却的衍化孢子，用甲苯(2x10立方厘米)、EtOH(2x10立方厘 米)、2M HCl(2x10立方厘米)、水(3x10立方厘米)、EtOH(2x10立方厘 米)及DCM(2x10立方厘米)冲洗。然后将孢粉质在真空中干燥，其所显示 的承载量为1.7毫摩/克。通过在2M NaOH(20毫升)回流2小时，可使相应 羧酸的钠盐进行乙酯功能的水解作用。与2M HCl(40毫升)在室温下中和， 随后用水冲洗并在真空下干燥，即得所需要的酸(承载量为2.8毫摩/克)。
以上过程亦可用于承载量范围为1.0至2.5毫摩/克的例如β-丙胺酸、L- 赖胺酸、α-L-丙胺酸、天门冬氨酸、谷氨酸及氨基丙二酸的乙酯氢氯化物。 附着氨基丙二酸、天门冬氨酸或谷氨酸的优点为其具有两个羧酸盐功能基 团，具有额外的承载药物的能力。
根据本发明的第七个方面提供有一多羟基功能化的孢子外膜。亦提供有 一种包括化学上结合有效剂量活性物质的多羟基功能化孢子外膜的制剂形 式。
大部分由碳水化合物中获得的多羟基链接剂，由于具有多个根据糖的属 性附着至孢子外膜的氢氧基团，其具有易于附着，无毒，承载量高的优点。 孢子外膜上具有大量氢氧基团，具有可以附着多种药物的优点。多羟基衍化 孢子外膜的稳定性及化学上与形态学上的一致性，相对于多醣类药物媒介例 如淀粉、纤维素及非孢子衍化甲壳素来说具有优点。后述的聚合物未被发现 具有与孢粉质或与其相等的孢子外膜同样的化学上及/或形态上的一致性，或 同样的酸碱抵抗力及吸水性。
此等结合物材料上的氢氧基团可被转化为很多适于合成药物-聚合物结合 物的活性物种。例如氢氧基团可以用琥珀酰亚氨基碳酸盐及二氮杂茂基碳酸 盐及对硝基苯基甲酸盐(p-nitrophenylformates)活化成甲磺酸盐及甲苯磺酸 盐。所有这些都易于与含有伯胺的药物，例如缩氨酸产生反应。氢氧基团亦 可被氧化成醛或酮。
包含伯胺的药物可以通过还原氨化附着。聚合物上的氢氧基团亦可用 CNBr(溴化氰)活化以形成氰酸酯，其可以与包含胺的药物产生反应。因此 一种从碳水化合物衍生的一药物-聚合物结合物可以与一孢子外膜结合以产生 一带有大量反应性的氢氧基团的结合物且其在化学上及形态上具有一致性。 例14显示出一种可将一多羟基链接剂附着于孢粉质的方法。
例14：多羟基功能化孢粉质的制备(图6)
在DMSO(10立方厘米)中将山梨醇胺(Sorbitolamine)(0.13克，0.69 毫摩)搅拌。加入孢粉质(0.1克，0.23毫摩)，将该混合物回流24小时。 通过过滤收集冷却的孢子，并用DMSO(2x10立方厘米)、水(100立方厘 米)、EtOH(2x10立方厘米)及DCM(2x10立方厘米)冲洗。将孢粉质在真 空下干燥至恒重，使其承载量为1.7毫摩/克。
例15：三(羟甲基)甲胺(tris(hydroxymethyl)methylamine)-孢粉质 的制备(图7)
一与例14相似的程序使用三(羟甲基)甲胺 (tris(hydroxymethyl)methylamine)可达到0.83毫摩/克的承载量。
例16：荧光素及甲状腺素共价键附着孢粉质的制备
荧光素(0.5克)与甲状腺素(0.5克)分别与孢粉质(0.1克)在DMSO (20毫升)中回流。通过过滤收集冷却的孢粉质并用水(100立方厘米)、 EtOH(2x10立方厘米)及DCM(2x10立方厘米)冲洗。将孢粉质在真空中干 燥至恒重以使其承载量分别为1.0及0.37毫摩/克。
如果药物或其他活性物质足够稳定以抵挡回流步骤，则这种附着方式非 常有效。此直接附着方法相对在化学上不如孢粉质稳定的许多市面有售的聚 合物来说具有显着优点。
较不稳定的药物，例如胰岛素可以通过例如一琥珀酰氨基隔离剂及使用 DCC及HOBt(1-羟基苯并三唑)作为偶联剂附着于氨基孢粉质。在此种结合 中的孢粉质相较于市面有售的聚合物而言具有化学一致性的优点，从而使结 合至每组孢粉质的药物的预期承载量非常一致。一药物，例如胰岛素的附着 方法包括以下步骤：
例17：结合胰岛素的孢粉质的制备
将溶解于干二甲基甲酰胺(DMF，15毫升)中的琥珀酰酐(0.57克，5.7 毫摩)加入于干DMF(30毫升)的氨基孢粉质(1克)悬液中。将该反应混合 物在氮气中在室温下搅拌一整夜。通过过滤分离其产物，用丙酮冲洗并在有 P2O5存在的真空下干燥48小时。再将干DMF中的DCC(3.80克，18.4毫摩) 及HOBt(2.27克，1.84毫摩)连续加入干DMF(20毫升)中的琥珀酰氨基孢 粉质悬液中。将该混合物在氮气中在室温下搅拌3小时然后将冷冻干燥的胰 岛素(0.2克)加入干DMF(20毫升)中作为一溶液。将该混合物在室温下搅 拌48小时。通过在摄氏0度加入水(10毫升)停止该反应。将该混合物在室 温下温和地搅拌2小时，过滤并用丙酮及醚冲洗以产生承载量为0.03毫摩/ 克的胰岛素-琥珀酰氨基孢粉质(insulin-succinylamido sporopollenin)。
以上示例展示出怎样将蛋白质和酶附着至孢粉质及相似孢子外膜。寡核 苷酸，例如反义寡核苷酸可以通过相似的化学反应来附着以使此药物可以口 服。以前此等化合物经常作为PEG(聚乙二醇)-3’-寡核苷酸或PEG-5’-寡核 苷酸结合物被注射输送。可以通过利用前面提到的羟化结合孢粉质，进行那 些与用来合成PEG-3’-寡核苷酸或PEG-5’-寡核苷酸结合物的合成偶联反应相 似的步骤。
应用几乎不具有水溶性的药物，例如紫杉醇及环孢霉素的孢粉质-药物类 型结合物具有特殊的益处。此等药物可以在很多情况下附着于孢粉质，例 如，在高效溶剂，例如DMSO中或在缓冲水性溶剂中使用偶联剂。当口服孢粉 质-药物型结合物到达血流时药物可以高度消散方式释放，因此可以更好地被 血清溶剂化。因此孢粉质及相似孢子外膜亦可作为使用聚乙二醇(PEGs)以 外的一种选择，其常被用来衍化在水性系统中几乎不溶的药物。相对于使用 时需要注射的PEG-药物结合物，此种结合物具有一优点即其可口服。
例18：生物评估
给两临床试验者服用孢粉质(1克；25微米；来源于伸筋草)，每隔30 分钟抽取血液样本。
血液样本(20)用离心机以3000转/分的速度分离八分钟。然后移离血 清，并将残余物质用水冲洗几次(共10毫升)，并转移至较大的试管。然后 将样本充分混合再用离心机分离一次。移除上层清液，将小粒及残余液体 (0.5毫升)再次悬置于0.5毫升甘油中。取每分约0.1毫升的等分并用光学 显微镜检查。检查盖片下面整个部分。用以下方法计算孢粉质粒子数量。通 过计算完整的粒子及攒在一团的片段的数量来计算粒子的总数。这些片段被 当作来源于同一孢粉质粒子，但其可能包含几个粒子的成分。
显微镜测试结果如下：
来自第一人体试验者的样本(进食后)
1)施用孢粉质前：
未发现粒子。
2a)施用30分钟后：
80个粒子，其中有12个为完整的，其余为10-20个片段形成的蔟。
2b)施用30分钟后：
发现45个粒子，其中7个是完整的，其余的为片段。
3a)施用60分钟后：
发现2个完整粒子及27组小的片段。
3b)施用60分钟后：
发现20组小的片段，无完整粒子。
4)施用90分钟后：
观察到1个完整粒子及12组非常小的片段。
5)施用120分钟后：
观察到少量小的片段。
来自第二人体试验者的样本(进食前)：
1)施用孢粉质前：
未发现粒子。
2a)施用后30分钟：
发现3个完整粒子及48个非常小的片段。
2b)施用30分钟后：
发现4个完整粒子及35个片段。
3a)施用60分钟后：
观察到1个完整粒子及17个极小的片段。
3b)施用60分钟后：
可见2个粒子及15个片段。
4)施用90分钟后：
未发现粒子或片段。
由1克孢粉质进入血流中的最小比例估计为0.60％。
估计有疗效的所需药物-孢粉质结合物的剂量为：
假设平均承载量为1毫摩/克，则由1克孢粉质进入血流中的药物总量将 为0.006毫摩。
对于1克物理地或共价地附着有胰岛素(M.W.6000)的0.03毫摩/克的 孢粉质而言，可以使11毫克(0.018毫米)30国际单位(IU)的胰岛素进入血 流中。正常人每天产生24u胰岛素，而普通糖尿病患者每天需要60u，假设皮 下注射剂与口服效果相同，则最大量的2克孢粉质可以相当于1天的胰岛素 供应。
对于1克附有甲状腺素(M.Wt.776.9)承载量为0.37毫摩/克的孢粉质 而言，其可提供1.7毫克的甲状腺素，[约为17剂(平均剂量为100微 克)]。物理附着于承载量为600微克/克的孢粉质的甲状腺素可预期地输送 3.6微克进入血流。此值通过对自愿者血液中发现的甲状腺素进行分析获得证 明，其中口服15分钟后的甲状腺素量为4微克/5公升血液(即传输了 0.66％，与传输孢粉质粒子的量一致)。
孢粉质或其他相似的孢子外膜可被多重衍化。通过此方式孢粉质可被用 于在一剂量中传输多于一种的药物。另外，一药物与一活性介质亦可被一起 结合于同一孢粉质粒子中。此外，此种多重功能性可被用于引导功能基团， 例如一脂肪酸链，以形成一种脂质结合物，或一聚乙二醇(PEG)以形成一 PEG-脂质结合物，一旦附着的粒子到达血流中，可以通过内体空间阻隔及能 使药物较慢地释放来保护附着的药物。例如，孢粉质的残余双键及羧酸基团 可被分别衍化。因此该双键首先与溴产生反应形成溴基孢粉质，使其与迭氮 化钠反应形成一新颖的迭氮基孢粉质，用氢化铝锂将其还原以形成一伯胺基 孢粉质。使伯胺在缓冲溶液中及以EDC作为偶联剂与一药物，例如抗滤过性 病原体药物AZT单磷酸盐反应以产生AZT单磷酸孢粉质。随后将剩余在孢粉 质上的羧酸基团与十六烷基氨用DDC浓缩。十六烷基半族则当附着药物在胃 部的短暂时间内为其提供额外的保护。此类型的附着方法的一示例如下(图 8)。
根据本发明的第八个方面，提供有一卤基功能化孢子外膜。亦提供有一 包括化学上结合有效剂量活性物质的卤基功能化孢子外膜的制剂形式。
例19：通过溴化、迭氮化及还原对伯胺的引导
将孢粉质(1克)在有30％溴的乙酸(10立方厘米)中搅拌24小时。通 过过滤重新获得孢粉质，并用甲醇(10x5立方厘米)及醚(5立方厘米)冲 洗，并在真空下干燥以产生溴基孢粉质(A，图8)。加入一溶于DMSO(30立 方厘米)中的迭氮化钠(1.25克，19.2毫摩)溶液并将该混合物以摄氏60 度加热48小时。通过过滤、冲洗、干燥(1.8毫摩/克的N3)并与一含有氢化 铝锂(0.2克)的THF(15立方厘米)混合物回流1小时，以收集形成的迭氮 基孢粉质(B，图8)。将该混合物冷却至室温，冲洗并干燥以获取胺基孢粉 质(C，图8)(1.4毫摩/克的NH2)。
例20：AZT单磷酸盐的附着
将AZT单磷酸盐(2.1毫摩)加入一在0.1M MES(脂肪酸甲酯磺酸 盐)，pH值为4.7-6.0的缓冲溶液(15立方厘米)中的胺基孢粉质(0.3 克；1.4毫摩/克的NH2)搅拌悬液。加入EDC(2.1毫摩)，并将混合物在室 温下搅拌18小时。滤出粒子，用水冲洗并在真空下干燥以得出AZT单磷酸盐 酰胺化孢粉质(D，图8)(1毫摩/克)。
例21：十六烷基胺的附着
将一AZT单磷酸盐孢粉质(0.3克；1毫摩/克)及DCC(2.1毫摩)的混 合物在DMSO(10立方厘米)中搅拌18小时。通过过滤并在真空下干燥移除 所得的十六烷基氨基(1毫摩/克)/AZT单磷酸盐酰氨化(1毫摩/克)孢粉 质(E，图8)。
承载量约为1毫摩/克的孢粉质具有残留氢氧基团，如Fmoc(芴甲氧羰 酰基)分析中所得(图9中路线A)。这些功能基团可用于直接或通过隔离剂 基团附着药物。
例22：氢氧基团的烷化
将一含有孢粉质(1克；1毫摩/克)及氯乙酸(6毫摩)的6M NaOH(50 立方厘米)悬液搅拌18小时，冲洗及干燥后获取承载量为0.8毫摩/克的孢 粉质-乙酸(图9中路线B)。
例23：氢氧基团的酰化
i)使用酐及酸性氯化物：
残留的氢氧基团易于通过试剂例如乙酰氯或乙酸酐被乙酰化2，3，4，及通过 苯酰氯被苯酰化，以在标准状态下以获得酰化的孢粉质(图9中路线C)。将 苯酰氯(5毫摩)加入一搅和的并含有孢粉质(0.1克；1毫摩/克OH)的DCM (10立方厘米)、DMAP(4-二甲氨基吡啶)及于冰浴中冷却的嘧啶(3毫 摩)的悬液中。将苯酰化的孢粉质(0.6毫摩/克苯酰化)过滤，冲洗，干 燥。
ii)使用一N-保护(N-protected)氨基酸及偶联剂：
用N-保护(N-protected)氨基酸例如Fmoc氨基乙酸(图8中路线D)及 偶联剂例如DMAP催化的DCC以直接酰化氢氧基团尚未被公开。因此此方法的 一个示例如下：将含有DCC(0.5毫摩)及Fmoc氨基乙酸(1毫摩)的DCM (20立方厘米)及DMF(1立方厘米)溶液搅拌20分钟。然后将DCM蒸发除 去，将剩余物溶于DMF(10立方厘米)所形成的溶液加入一于DMF(10立方 厘米)中含有孢粉质(0.1毫摩/克)的悬液中。加入一于DMF(2立方厘米) 含有DMAP(0.1毫摩)的溶液，然后将所得混合物搅拌24小时。滤出Fmoc 氨基乙酸孢粉质，用DMF、DCM及MeOH(甲醇)冲洗并干燥(0.41毫摩/克 Fmoc氨基乙酸)。
可以使用一相似的附着方法来附着缩氨酸及蛋白质药物。
(iii)氢氧基团的氨基甲酸化：
剩余的氢氧基团可以与异氰酸盐发生反应(图9中路线E)。此方法可用 于形成异相双功能链接剂，以使用p-马来酰亚胺异氰酸盐(p- maleimidophenyl isocyanate)来结合氢氧基团。用异氰酸苯酯衍化孢粉质的 步骤如下：将孢粉质(1克；1毫摩/克)与异氰酸苯酯的悬液搅拌并以摄氏 80度加热18小时，以获取孢粉质氨基甲酸盐(0.9毫摩/克)，将其滤出， 用DMSO及甲醇冲洗并干燥。
(iv)氢氧基团的卤化：
孢粉质剩余的氢氧基团用SOCl2、POCl3或PCl5可以轻易地被卤化(图9 中路线F)。孢粉质的此卤化形式可用于通过一链接剂并随后用一药物进一步 衍化聚合物。氢氧基团的卤化阐述如下：将无水碳酸钾(6.37毫摩)及孢粉 质(1克；1毫摩/克OH)于摄氏0度加入一于DCM中含有PCl5的溶液中。将 该混合物搅拌15分钟，然后滤出孢粉质，用DCM及乙醇冲洗并干燥(1毫摩/ 克Cl)。
参考：
1.S.Kettley，PhD University of Hull，2001。
2.G.Shaw，The Chemistry of Sporopollenin，于：Sporopollenin，J. Brooks，M.Muir，P.Van Gijzel及G.Shaw，(Eds)Academic press， London and New York，1971，305-348。
3.F.Zetche，P.Kalt，J.Liechti，E.Ziegler，J.Prakt.Chem，， 1937，148，267。
4.P.Fawcett，D.Gree，R.Holleyhead及G.Shaw，Grana，1970， 10，246。
5.M.E.Annunziato，U.S.Patel，M.Ranade及P.S.Palumbo Bioconjugate Chem.，1993，4，212。
一些生物轭合使用硫醇结合基团(Biocojugate Techniques，Greg T Hermanson，1996，Academic Press Inc及Bioconjugation in pharmaceutical chemistry，Il Farmaco 1999，54，497-526)。孢粉质易 于被衍化，以通过例如，先对孢粉质双键进行溴化，随后用硫脲(图10)或 者用NaSH处理方法引导硫醇基团。
根据本发明的第九个方面，提供有一硫醇功能化的孢子外膜。亦提供有 一包含化学上结合有效剂量活性物质的硫醇功能化孢子外膜的制剂形式。
例24：硫醇基团至孢粉质的附着(图10)
将一于DMSO(10立方厘米)中含有溴基孢粉质(1克，4.5毫摩/克；如 前面所描述的方法通过孢粉质与乙酸中的溴反应获得)与硫脲(60毫摩)的 悬液回流24小时。通过过滤收集所得物，并用DMSO、水、2M HCl、水、EtOH 及DCM冲洗。将该等粒子在25％KOH中在回流并搅拌6小时。冷却后将此粒 子过滤并用水、2M HCl、水及甲醇冲洗并干燥以获得硫醇化的孢粉质(5.2毫 摩/克)。
例25：p-硝基苯酰氧碳酰(p-nitrobenzoyloxycarbonyl)基团至孢粉 质的附着(图11)
用p-硝基苯酰氧碳酰基氯化物(p-nitrobenzoyloxycarbonyl chloride) 对硫醇基团的酰化(图11)：
硫醇化孢粉质(5.2毫摩/克)在N2下用含有p-硝基苯酰氧碳酰基氯化物 (p-nitrobenzoyloxycarbonyl chloride)(30毫摩)及三乙胺(30毫摩)的 DCM(25立方厘米)在回流下搅拌。将粒子滤出，用DCM及甲醇冲洗并干燥以 获取p-硝基苯酰氧碳酰基(p-nitrobenzoylthiooxycarbonylated)孢粉质 (2.45毫摩/克)。
有许多用于使碳-碳附着于孢粉质的方法。此相当复杂但在物理上及化学 上呈稳定状态的聚合物质的结构尚未完全获知；因此很难知道将来在其表面 会发现有什幺反应产生。然而，碳-碳键结构的一简单示例包括二乙基丙二酸 酯与溴基孢粉质在乙氧甲钠溶液中的反应，以在与KOH溶液水解及与一无机 酸中和后在孢粉质上产生一二酸功能(结构C，图12)并由此增加CO2H基团 的承载量。此方法的一示例如下：
根据本发明的第十个方面提供有一通过碳-碳键功能化的孢子外膜。亦提 供有一包含一孢子外膜、一碳-碳键，与有效剂量活性物质结合的其他功能基 团的制剂形式。
例26：功能基团碳-碳键至孢粉质的附着
将二乙基丙二酸酯(25毫摩)在摄氏50度下缓慢加入一甲氧基钠(30立 方厘米；25毫摩钠)溶液中。将所得溶液缓慢加入一于乙醇(50立方厘米) 中含有溴基孢粉质(1克；5毫摩/克溴)的搅和悬液中。加入后(15分钟) 将该混合物回流18小时。滤出二乙基丙二酰基孢粉质(A，图12)并用乙醇 冲洗。将氢氧化钾(15毫摩)溶于水(2立方厘米)中再加至乙醇(10立方 厘米)中。将该溶液加至一于乙醇(40立方厘米)中含有二乙基孢粉质二乙 基丙二酸酯(A，图12)的搅和悬液中并回流18小时。滤出粒子并用水及乙 醇冲洗再干燥以获取钾盐(B，图12)。将置于冰水中的B的悬液用稀释硫酸 酸化，以于用水及乙醇冲洗并干燥后获取孢粉质丙二酸(C，图12)(1毫摩 /克)。
金属被附着于附着至孢粉质的隔离剂基团以产生一过滤物质且无关于药 物传输{G.Shaw，M.Sykes，R.W.Humble，G.Mackenzie，D.Marsdan，E. Phelivan，Reactive Polymers，9，(1988)，211-217}。然而至今尚未揭 示具有金属络合物的药物。接下来的例子揭示一种方法，其中孢粉质作为铂 的配位基(D，图12)。其与为人所知的抗肿瘤药物例如顺铂(cisplatin)、 卡铂(CBDCA)及JM-40类似(图13)。图12中简单显示出合成新型衍化物 (D，图12)的方法，其细节如下：
例27：顺铂(cisplatin)至孢粉质的附着
将一包含cis-[PtCl2(NH3)2](顺-二氨二氯铂)(1.33毫摩)的DMF(20 立方厘米)溶液加入至一于DMF(20立方厘米)中含有孢粉质丙二酸(C，图 12)的搅和悬液中。然后加入0.1M水性KOH(27立方厘米)并将所得混合物 在摄氏60度下搅拌48小时。滤出铂孢子(Sporoplatin)(D，图12并在图13 中以此名称显示)并用水、乙醇及醚(0.9毫摩/克)冲洗。
一些金(I)硫醇盐(gold(I)thiolate)络合物显示对类风湿性关节炎具 有有效活性。Allochrysine及较近期的口服的瑞得(Ridaura)(R.Bau，J. Am.Chem.Soc.，1998，120，9380)。瑞得(Ridaura)为一硫糖/磷化氢与 金的络合物，且如多数的糖分会在消化系统内被分解。相关的孢粉质/磷化氢 与金的络合物在肠部应更稳定且更易于将金(I)硫醇盐(gold(I)thiolate)输 送进入血流中以治疗类风湿性关节炎。也可以使用铂、钌、钆及锝络合物。
例28：孢粉质的金(I)硫醇盐(gold(I)thiolate)络合物(图14)
将包含碳酸钾(1毫摩)的乙醇-水(1∶4；50立方厘米)加入至一硫醇 化孢粉质悬液(1克；1毫摩/克)中，在室温下搅拌5小时并冷却至摄氏0 度。于摄氏0度慢慢加入一包含(三乙膦)氯化金(I)(1.1毫摩)的乙醇- 水。可将该溶液提升至室温，并再进一步搅拌12小时。将该(三乙膦)(孢 粉质-S)金(I)衍化物(0.8毫摩/克)用水、乙醇及醚冲洗并干燥。