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1、(10)授权公告号 CN 102258471 B (45)授权公告日 2012.12.26 CN 102258471 B *CN102258471B* (21)申请号 201110103029.9 (22)申请日 2011.04.22 A61K 9/127(2006.01) A61K 31/704(2006.01) A61K 47/20(2006.01) A61K 47/22(2006.01) A61K 47/48(2006.01) (73)专利权人 南开大学 地址 300071 天津市南开区卫津路 94 号 (72)发明人 刘育 王魁 郭东升 (74)专利代理机构 天津佳盟知识产权代理有限 。
2、公司 12002 代理人 侯力 CN 101367949 A,2009.02.18, 说明书全文 . CN 101347421 A,2009.01.21, 说明书全文 . JP 2009161626 A,2009.07.23, 说明书全 文 . JP 4185008 B2,2008.11.19, 说明书全文 . CN 101196475 A,2008.06.11, 说明书全文 . 王魁等 . 多刺激响应超分子囊泡 . 大环化学 和超分子化学的新发展当前学科交叉的一个重 要桥梁中国化学会全国第十五届大环化学暨第 七届超分子化学学术讨论会论文摘要集 .2010, 第 82-83 页 . 王魁等 .。
3、 多刺激响应超分子囊泡 . 大环化学 和超分子化学的新发展当前学科交叉的一个重 要桥梁中国化学会全国第十五届大环化学暨第 七届超分子化学学术讨论会论文摘要集 .2010, 第 82-83 页 . 李芊等 . 磺化杯芳烃与麻醉剂分子的包结行 为 .大环化学和超分子化学的新发展当前学 科交叉的一个重要桥梁中国化学会全国第十五 届大环化学暨第七届超分子化学学术讨论会论文 摘要集 .2010, 第 308-309 页 . (54) 发明名称 一种基于磺化杯 4 芳烃的纳米超分子囊泡 制备及应用 (57) 摘要 一种基于磺化杯 4 芳烃的纳米超分子囊 泡制备， 其构筑单元以磺化杯 4 芳烃为主体 (C4。
4、AS)， 以不对称紫精为客体(MVC12)， 通过主-客 体包结配位相互作用构筑超分子组装体， 制备方 法是 ： 将 C4AS 和 MVC12溶解于水中并均匀混合即 可。本发明的优点是 ： 制备方法简便， 主、 客体原 料用量少， 对药物的负载率高 ； 该超分子囊泡对 外界温度、 氧化 - 还原以及环糊精的加入等刺激 在短时间内就具有良好的响应性 ； 该超分子囊泡 可以负载亲水的抗癌药阿霉素且负载后的阿霉素 对癌细胞的杀伤作用较之单纯的阿霉素并没有改 变， 而其对正常细胞的毒害作用较之单纯的阿霉 素有明显的下降， 其在抗癌药物负载、 运输和靶向 释放领域具有广阔的应用前景。 (51)Int.C。
5、l. (56)对比文件 审查员 陈玉平 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 9 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 9 页 1/1 页 2 1. 一种基于磺化杯 4 芳烃的纳米超分子囊泡的应用， 其特征在于 ： 将亲水的抗癌药 阿霉素负载到制备的超分子囊泡的空腔内， 方法如下 ： 将阿霉素、 磺化杯 4 芳烃简称 C4AS 和不对称紫精简称 MVC12溶解于水中后混合均匀得到溶液， 在 10000 转 / 分钟条件下离心 2 分钟， 然后进行透析直到透析袋外的溶液中观测不到阿霉素的荧光， 即可制得阿霉素负载 的超分子囊泡，。
6、 所述阿霉素、 C4AS 和 MVC12的浓度分别为 0.01 mM， 0.04 mM 和 0.08 mM。 权 利 要 求 书 CN 102258471 B 2 1/5 页 3 一种基于磺化杯 4 芳烃的纳米超分子囊泡制备及应用 【技术领域】 0001 本发明属于纳米超分子材料技术领域， 特别是一种基于磺化杯 4 芳烃的纳米超 分子囊泡制备及应用。 【背景技术】 0002 囊泡是生命体的重要建筑块， 在化学、 生物和材料科学领域有着重要而广泛的 应用， 例如 ： 药物 / 基因传递体系， 光丰收体系和微反应器等 (S.Zhou， C.Burger， B.Chu， M.Sawamura， N.。
7、Nagahama， M.Toganoh， U.E.Hackler， H.Isobe， E.Nakamura.Science 2001， 291， 1944-1947 ； (2)D.E.Discher， A.Eisenberg.Science2002， 297， 967-973 ； (3)X.Zhang， S.Rehm， M.M.Safont-Sempere， F.Wrthner.Nat.Chem.2009， 1， 623-629.)。 囊 泡 组 装 体 聚集 / 解聚的可控调控往往是实现这些功能的前提条件 (X.Guo， F.C.Szoka.Acc.Chem. Res.2003， 36， 3。
8、35-341.)。 因此， 构筑对于外界刺激具有良好响应性的囊泡是当前一个十分 热门的研究课题。近年来人们通过努力已经构筑了对于外界光、 电、 热和 pH 等刺激具有单 一响应性的囊泡 (M.Lee， S.-J.Lee， L.-H.Jiang.J.Am.Chem.Soc.2004， 126， 12724-12725 ； (2)C.Wang， Q.Chen， H.Xu， Z.Wang， X.Zhang.Adv.Mater.2010， 22， 2553-2555 ； (3)A.Napoli， M.Valentini， N.Tirelli， M.Mller， J.A.Hubbell.Nat.Mate。
9、r.2004， 3， 183-189 ； (4)E.Kim， D.Kim， H.Jung， J.Lee， S.Paul， N.Selvapalam， Y.Yang， N.Lim， C.G.Park， K.Kim.Angew. Chem.， Int.Ed.2010， 49， 4405-4408.)， 但对于多种外界刺激均具有可控响应性的多刺激 响应囊泡的构筑尚无报道， 而多刺激响应囊泡具有单一响应性囊泡不具备的多功能性等优 点。 0003 超分子手段是除共价键手段外的另一种构筑两亲性组装体的方法。由于以超分 子手段构筑的两亲性组装体是通过多重弱的可逆的相互作用的协同作用而形成的， 因此 超分子两。
10、亲性材料是一类具有良好响应性和可调控性的软物质材料。到目前为止， 以氢 键、 电荷转移和 相互作用等为代表的非共价键相互作用已经被大量使用来构筑 超分子两亲性材料并展现出良好的性能 (Y.Wang， H.Xu， X.Zhang.Adv.Mater.2009， 21， 2849-2864.)， 但通过大环主体与客体的主 - 客体包结配位来构筑超分子两亲性材料的报 道还并不多见 (Q.Yan， J.Yuan， Z.Cai， Y.Xin， Y.Kang， Y.Yin.J.Am.Chem.Soc.2010， 132， 9268-9270 ； (2)Y.J.Jeon， P.K.Bharadwaj， S.。
11、W Choi， J.W Lee， K.Kim.Angew.Chem.Int. Ed.2002， 41， 4474-4476.)。以环糊精、 磺化杯芳烃和葫芦脲等为代表的大环主体与客体分 子的包结配位相互作用通常是在生物兼容的水介质中进行的， 而这一介质对于其它非共价 键相互作用并非十分有利。 由于这些大环主体同样已被证明是生物兼容的分子(F.Perret， A.N.Lazar， A.W Coleman.Chem.Commun.2006， 2425-2438 ； (2)K.Wang， D.-S.Guo， H.-Q. Zhang， D.Li， X.-L.Zheng， Y.Liu.J.Med.Che。
12、m.2009， 52， 6402-6412 ； (3)V.D.Uzunova， C.Cullinane， K.Brix， W M.Nau， A.I.Day.Org.Biomol.Chem.2010， 8， 2037-2042 ； (4) K.Uekama， F.Hirayama， T.Irie.Chem.Rev.1998， 98， 2045-2076.)， 因此通过其与合适客体 所构筑的两亲性材料在生物技术和药物领域有着广泛的应用前景。 说 明 书 CN 102258471 B 3 2/5 页 4 0004 杯芳烃以其固有的锥式构象和僵化的骨架结构成为构筑两亲性材料的理想分 子。杯芳烃的锥式构。
13、象是形成两亲性材料高曲率聚集的先决条件 ； 杯芳烃僵化的骨架结 构能提高两亲性聚集体的稳定性。但到目前为止除了两个最近的利用杯芳烃空腔与客体 包结配位作用构筑两亲性聚集体的报道外 (K.Wang， D.-S.Guo， Y.Liu.Chem.Eur， J.2010， 16， 8006-8011 ； (2)V.Francisco， N.Basilio， L.Garca-Ro， J.R.Leis， E.F.Maques， C.Vzquez-Vzquez.Chem.Commun.2010， 46， 6551-6553.)， 其它通过杯芳烃构筑囊泡的报 道均是通过在其上下缘一面修饰亲水基团一面修饰疏水基。
14、团的共价键合成的方法而得到 的。 0005 目前， 利用抗癌药物对癌症患者进行治疗过程中抗癌药物在杀伤癌细胞的同时对 人体正常细胞也有很大的毒害作用， 因此制备生物兼容的纳米载体材料对抗癌药进行负 载、 运输和靶向释放以此来减少抗癌药对于正常细胞的毒害作用或者提高抗癌药对癌细胞 的杀伤效果在日常生活中具有巨大的实际应用价值。 【发明内容】 0006 本发明的目的是针对上述技术分析， 提供一种基于磺化杯 4 芳烃的纳米超分子 囊泡制备及应用， 该超分子囊泡系基于磺化杯 4 芳烃和不对称紫精二元超分子组装的多 刺激响应囊泡， 磺化杯 4 芳烃的存在可以诱导不对称紫精的临界聚集浓度下降大约 1000。
15、 倍， 因而形成该超分子囊泡所使用的两个组分的浓度很低， 因此其对负载的药物具有高的 负载率 ； 该超分子囊泡可以对外界温度、 氧化 - 还原以及环糊精的加入等刺激具有良好的 响应性， 此外该超分子囊泡可以负载亲水的抗癌药阿霉素， 负载后的阿霉素对癌细胞的杀 伤作用较之单纯的阿霉素并没有改变， 而其对正常细胞的毒害作用较之单纯的阿霉素有明 显的下降。 0007 本发明的技术方案 ： 0008 一种基于磺化杯 4 芳烃的纳米超分子囊泡制备， 其构筑单元以磺化杯 4 芳烃 为主体， 简称 C4AS， 以不对称紫精为客体， 简称 MVC12， 通过主 - 客体包结配位相互作用构筑 超分子组装体， 构。
16、筑单元 C4AS 和 MVC12的结构如下 ： 0009 0010 其特征在于 ： 所述超分子囊泡制备方法是 ： 将 C4AS 和 MVC12溶解于水中并均匀混 合即可制得超分子囊泡溶液， 所述 C4AS 和 MVC12的浓度分别为 0.04mM 和 0.08mM。 0011 所述超分子囊泡溶液中的超分子囊泡在 5-70两个温度点范围内随外界温度的 说 明 书 CN 102258471 B 4 3/5 页 5 升高而解聚， 随着外界温度的降低而再次生成。 0012 所述超分子囊泡溶液中的超分子囊泡通过加入环糊精而解聚， 所述环糊精包括 -环糊精、 -环糊精和-环糊精， 其在超分子囊泡溶液中的浓。
17、度分别为0.16mM、 0.24mM 和 0.24mM。 0013 所述超分子囊泡溶液中的超分子囊泡随着不对称紫精单元 MVC12的单电子还原而 变小， 具体实施方法是 ： 在超分子囊泡溶液中加入过量的水合肼使不对称紫精单元还原到 自由基阳离子状态即单电子还原， 超分子囊泡的平均粒径缩小到原来的三分之一。 0014 所述超分子囊泡溶液中的超分子囊泡随着不对称紫精单元 MVC12的双电子还原而 解聚， 具体实施方法是 ： 将 1.6V 的还原电势作用于超分子囊泡溶液中， 30 分钟后不对称紫 精单元 MVC12将还原到电中性状态， 即双电子还原， 并使超分子囊泡完全解聚。 0015 一种所述基于。
18、磺化杯 4 芳烃的纳米超分子囊泡的应用， 将亲水的抗癌药阿霉素 负载到超分子囊泡的空腔内。 0016 本发明的优点是 ： 基于磺化杯 4 芳烃和不对称紫精二元超分子组装构筑的纳米 超分子囊泡， 制备方法简便， 主、 客体原料用量少， 对药物的负载率高 ； 该超分子囊泡具有多 刺激响应特性， 对外界温度、 氧化 - 还原以及环糊精的加入等刺激在短时间内就具有良好 的响应性 ； 该超分子囊泡可以负载亲水的抗癌药阿霉素且负载后的阿霉素对癌细胞的杀伤 作用较之单纯的阿霉素并没有改变， 而其对正常细胞的毒害作用较之单纯的阿霉素有明显 的下降， 其在抗癌药物负载、 运输和靶向释放领域具有广阔的应用前景。 。
19、【附图说明】 0017 图 1 为磺化杯 4 芳烃存在下不对称紫精的临界聚集浓度图。 0018 图2为磺化杯4芳烃和不对称紫精超分子组装的多刺激响应囊泡的动态光散射 图。 0019 图3为磺化杯4芳烃和不对称紫精超分子组装的多刺激响应囊泡的透射电子显 微镜图像。 0020 图4为磺化杯4芳烃和不对称紫精超分子组装的多刺激响应囊泡的扫描电子显 微镜图像。 0021 图5为磺化杯4芳烃和不对称紫精超分子组装的多刺激响应囊泡的光散射强度 随温度和时间的变化关系图。 0022 图6为在5和70两个温度点磺化杯4芳烃和不对称紫精超分子组装的多刺激 响应囊泡的往复变温紫外光谱及其所导致体系 450nm 波。
20、长处吸光度的变化曲线图。 0023 图7为往构筑的磺化杯4芳烃和不对称紫精组装的超分子囊泡体系中逐渐加入 - 环糊精导致体系 450nm 波长处吸光度的变化曲线图。 0024 图 8 为往构筑的磺化杯 4 芳烃和不对称紫精组装的超分子囊泡体系中加入 - 环糊精后的透射电子显微镜图像。 0025 图9为往构筑的磺化杯4芳烃和不对称紫精组装的超分子囊泡体系中逐渐加入 - 环糊精导致体系 450nm 波长处吸光度的变化曲线图。 0026 图 10 为往构筑的磺化杯 4 芳烃和不对称紫精组装的超分子囊泡体系中逐渐加 入 - 环糊精导致体系 450nm 波长处吸光度的变化曲线图。 说 明 书 CN 10。
21、2258471 B 5 4/5 页 6 0027 图 11 为磺化杯 4 芳烃和不对称紫精超分子组装的多刺激响应囊泡及其不对称 紫精单元被过量水合肼单电子还原后以及再氧化的动态光散射对比图。 0028 图 12 为磺化杯 4 芳烃和不对称紫精超分子组装的多刺激响应囊泡在其不对称 紫精单元被过量水合肼单电子还原后的透射电子显微镜图像。 0029 图 13 为磺化杯 4 芳烃和不对称紫精组装的超分子囊泡体系的循环伏安实验曲 线。 0030 图 14 为磺化杯 4 芳烃和不对称紫精组装的超分子囊泡在 1.6V 的还原电势 ( 参 比于 Ag/AgCl 电极 ) 条件下作用 30 分钟后， 不对称紫精。
22、单元被电化学还原到电中性状态时 的透射电子显微镜图像。 0031 图 15 为阿霉素负载的磺化杯 4 芳烃和不对称紫精超分子组装的多刺激响应囊 泡的紫外吸收光谱变化图。 0032 图 16 为未负载阿霉素的磺化杯 4 芳烃和不对称紫精超分子组装的多刺激响应 囊泡、 阿霉素以及阿霉素负载的磺化杯 4 芳烃和不对称紫精超分子组装的多刺激响应囊 泡分别和 NIH3T3 细胞 ( 正常细胞 ) 进行孵化后连续记录四天的各组细胞的数量对比图。 0033 图 17 为阿霉素以及被磺化杯 4 芳烃和不对称紫精超分子组装的多刺激响应囊 泡负载后的阿霉素分别和 HepG-2 细胞 ( 癌细胞 ) 进行孵化后连续。
23、记录四天的各组细胞的 数量对比图。 0034 图 18 为阿霉素以及阿霉素负载的磺化杯 4 芳烃和不对称紫精超分子组装的多 刺激响应囊泡分别和 NIH3T3 细胞 ( 正常细胞 ) 进行孵化 96 小时后活细胞的形态与阿霉素 以及被磺化杯 4 芳烃和不对称紫精超分子组装的多刺激响应囊泡负载后的阿霉素分别 和 HepG-2 细胞 ( 癌细胞 ) 进行孵化 96 小时后活细胞的形态的对比图。 【具体实施方式】 0035 实施例 1 ： 0036 一种基于磺化杯 4 芳烃的纳米超分子囊泡制备， 将 C4AS 和 MVC12溶解于水中并 均匀混合即可制得超分子囊泡溶液， 所述 C4AS 和 MVC12。
24、的浓度分别为 0.04mM 和 0.08mM。 0037 在没有 C4AS 存在下 MVC12的临界聚集浓度为 210-2M(M.Krieg， M.-P.Pileni， A.M.Braun， M.Gratzel.J.Colloid Interface Sci.1981， 83， 209-213.) ； 如图 1 所示， 磺化 杯 4 芳烃的存在可以诱导不对称紫精的临界聚集浓度下降大约 1000 倍。 0038 该超分子囊泡的粒径和形貌分别通过动态光散射、 透射电子显微镜和扫描电子显 微镜所表征， 如图 2、 图 3、 图 4 所示。 0039 实施例 2 ： 0040 该超分子囊泡的多刺激响应。
25、性的实验验证 ： 0041 1) 将超分子囊泡溶液从 15升温至 70， 如图 5 所示， 其光散射强度随着温度的 升高在短时间内发生明显的下降， 最后降到水的光散射强度， 表明所构筑的超分子囊泡随 着外界温度的升高可以完全的解聚。此外， 在 5 和 70两个温度点的往复变温紫外实验及 其所导致体系450nm波长处吸光度的变化， 如图6所示， 证实该超分子囊泡的生成和解聚随 着外界温度的变化可以往复多次。 0042 2) 在超分子囊泡溶液中逐渐加入环糊精， 导致其在 450nm 波长处吸光度的变化， 说 明 书 CN 102258471 B 6 5/5 页 7 如图 7 所示， 表明加入两倍不。
26、对称紫精量的 - 环糊精 (0.16mM) 即可使囊泡完全解聚 ； 加 入 - 环糊精后的透射电子显微镜图像， 如图 8 所示， 同样证实了囊泡的完全解聚。此外， 紫外光谱实验中 450nm 波长处吸光度的变化， 如图 9、 图 10 所示， 证实加入三倍不对称紫精 量的 - 环糊精 (0.24mM) 或 - 环糊精 (0.24mM) 同样可使囊泡完全解聚。 0043 3) 在超分子囊泡溶液中加入过量的水合肼， 使不对称紫精单元还原到自由基阳离 子状态 ( 单电子还原 )， 动态光散射的结果如图 11 所示， 表明体系中组装体的平均粒径缩 小到原来的三分之一 ； 透射电子显微镜的图像， 如图 。
27、12 所示， 证实这些组装体的形貌仍然 是囊泡结构。将不对称紫精单元再次氧化到双正电荷状态后的动态光散射结果， 如图 11 所 示， 表明囊泡的粒径又可恢复到原来的大小。 0044 4) 对超分子囊泡溶液进行循环伏安实验， 实验结果如图 13 所示， 根据此结果将 1.6V的还原电势(参比于Ag/AgCl电极)作用于磺化杯4芳烃和不对称紫精组装的超分 子囊泡体系中， 30分钟后不对称紫精单元将还原到电中性状态(双电子还原) ； 透射电子显 微镜的图像， 如图 14 所示， 证实此状态下囊泡已经完全解聚。 0045 实施例 3 ： 0046 一种所述基于磺化杯 4 芳烃的纳米超分子囊泡的应用， 。
28、将亲水的抗癌药阿霉素 负载到制备的超分子囊泡的空腔内， 方法如下 ： 0047 1) 将阿霉素、 C4AS 和 MVC12溶解于水中后混合均匀得到溶液， 在 10000 转 / 分钟 条件下离心 2 分钟， 然后进行透析直到透析袋外的溶液中观测不到阿霉素的荧光， 即可制 得阿霉素负载的超分子囊泡， 所述阿霉素、 C4AS 和 MVC12的浓度分别为 0.01mM， 0.04mM 和 0.08mM。检测表明 ： 超分子囊泡对阿霉素的包封率和负载率分别为 86.0和 6.1。 0048 如图 15 所示， 超分子囊泡对阿霉素的成功负载由紫外吸收光谱变化所证实。 0049 2) 将未负载阿霉素的超分。
29、子囊泡、 阿霉素和阿霉素负载的超分子囊泡分别与 NIH3T3 细胞 ( 正常细胞 ) 进行孵化， 连续记录四天各组细胞的数量， 如图 16 所示， 结果表 明， 未负载阿霉素的超分子囊泡的细胞毒性远远低于抗癌药阿霉素的细胞毒性 ； 而被超分 子囊泡负载的阿霉素对正常细胞的毒害作用较之单纯的阿霉素也有明显的下降。 0050 3)将阿霉素和阿霉素负载的超分子囊泡分别与HepG-2细胞(癌细胞)进行孵化， 连续记录四天各组细胞的数量， 如图 17 所示， 结果表明， 被超分子囊泡负载的阿霉素对癌 细胞的杀伤作用较之单纯的阿霉素并没有改变。 这是由于抗癌药阿霉素与癌细胞的相互作 用较之与正常细胞更强，。
30、 导致其从超分子囊泡中释放到癌细胞的效率较之释放到正常细胞 更高所造成的。 0051 图 18 为阿霉素以及阿霉素负载的磺化杯 4 芳烃和不对称紫精超分子组装的多 刺激响应囊泡分别和 NIH3T3 细胞 ( 正常细胞 ) 进行孵化 96 小时后活细胞的形态与阿霉素 以及被磺化杯 4 芳烃和不对称紫精超分子组装的多刺激响应囊泡负载后的阿霉素分别 和 HepG-2 细胞 ( 癌细胞 ) 进行孵化 96 小时后活细胞的形态的对比图。 说 明 书 CN 102258471 B 7 1/9 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102258471 B 8 2/9 页 9 图 3 图 4 说 。
31、明 书 附 图 CN 102258471 B 9 3/9 页 10 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102258471 B 10 4/9 页 11 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 102258471 B 11 5/9 页 12 图 9 图 10 说 明 书 附 图 CN 102258471 B 12 6/9 页 13 图 11 图 12 说 明 书 附 图 CN 102258471 B 13 7/9 页 14 图 13 图 14 说 明 书 附 图 CN 102258471 B 14 8/9 页 15 图 15 图 16 说 明 书 附 图 CN 102258471 B 15 9/9 页 16 图 17 图 18 说 明 书 附 图 CN 102258471 B 16 。