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一种海岛棉 DREB 转录因子基因及其应用
    技术领域 本发明涉及植物基因工程领域， 尤其涉及一种海岛棉 DREB 转录因子基因以及其 构建的植物表达载体及其在耐旱转基因植物研制方面的应用。
     背景技术 转录因子 (transcription factor， TF) 又称为反式作用因子， 是指可以与真核生 物基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异性结合的蛋白， 通过他们之间以及与其它相 关蛋白之间的相互作用激活或抑制某些基因的转录。 根据结合方式的不同可以把转录因子 分为两类 ： 一类是普遍性转录因子， 另一类是特异性转录因子， 普遍性转录因子能够和启动 子的核心序列 TATA 框结合， 可以激活所有基因的转录， 而特异性转录因子与 DNA 序列上的 其它调节元件结合， 只能激活特定的基因。 自从 1987 年 Paz-Ares 首次报道了玉米转录因子 基因后， 迄今从高等植物中分离出的调控干旱、 低温、 高盐、 激素、 生长发育及病原反应等相 关基因表达的转录因子已达数百种。 研究发现在拟南芥中编码转录因子的基因至少有 1533 个， 约占其基因总数的 5.9％， 而且这些转录因子在调节植物生长发育以及对外界环境的响 应方面起着重要作用。
     DREB(dehydration responsive element binding protein) 转录因子是存在于植 物中， 与 DRE(dehydration responsive element) 顺式作用元件相结合， 调控对干旱、 高盐、 低温等逆境应答相关基因表达的蛋白质。
     DREB 类转录因子的发现是近年来植物抗逆性研究方面最具突破性的进展之一。 它 在植物应答干旱、 高盐及低温胁迫信号的过程中起重要的调控作用。
     自从 1997 年， Thotnashow 研究小组和 1998 年刘强等率先从拟南芥中分离克隆出 CBF1(DREB1B)， CBF2， (DREB1C) 和 CBF3(DREB1A)3 个 CBF/DREB1 类转录因子以来， 植物中的 这类转录因子的研究受到了广泛的关注。 大多数转录因子基因的表达受到外界刺激和生长 发育进程的诱导， DREB 基因介导复杂的胁迫信号传递网络， 参与多种不同的信号传递。大 部分 DREB 基因的表达都受干旱、 高盐、 低温等逆境胁迫的诱导， 但是不同种类的 DREB 转录 因子可能有不同的表达机制， 即使是同一种类的， 也可能有不同的表达机制， 在植物对逆境 胁迫与激素应答反应中发挥不同的调控作用。目前尚未见关于海岛棉 DREB 转录因子基因 的相关报道。
     发明内容 本发明的目的在于提供一种海岛棉 DREB 转录因子基因， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。
     本发明的第二个目的在于提供一种海岛棉 DREB 转录因子， 由 SEQ ID NO ： 1 所示核 苷酸序列编码， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 2 所示。
     本发明的第三个目的在于提供含有所述海岛棉 DREB 转录因子基因的植物表达载 体。
     本发明的第四个目的在于提供用所述植物表达载体转化的植物细胞、 组织或植株。 本发明的第五个目的在于所述海岛棉 DREB 转录因子基因在培育抗逆植物， 尤其 是耐旱植物品种中的应用。
     本发明的技术路线为 ：
     1) 取海岛棉新海 16 叶片 ；
     2) 从叶片提取基因组 DNA 和总 RNA ；
     3) 用总 RNA 进行逆转录反应， 得到 cDNA， 以 cDNA 为模板 PCR 扩增 DREB 转录因子 基因， 命名为 ： XHDREB ；
     4) 构建 pC-XHDREB 植物表达载体， 用根癌农杆菌转化烟草， 获得转 XHDREB 基因烟 草， 采用干旱模拟实验验证转 XHDREB 基因烟草， 因 XHDREB 的过表达而具有耐旱、 耐盐、 抗冷 能力。
     本发明克隆了一种海岛棉 DREB 转录因子基因 XHDREB， 构建 pC-XHDREB 植物表达载 体， 用根癌农杆菌转化烟草， 获得转 XHDREB 基因烟草， 采用干旱模拟实验验证转 XHDREB 基 因烟草， 因 XHDREB 的过表达而具有耐旱、 耐盐、 抗冷能力。
     附图说明 图 1 海岛棉 DREB 基因 PCR 扩增电泳图， 泳道 ： cDNA 的扩增产物、 泳道 2 ： DNA 的扩 增产物、 泳道 M ： DNA 标准分子量 DL2000 ；
     图 2 重组质粒 pC-XHDREB 构建流程图
     图 3 转基因烟草的 PCR 检测电泳图， 泳道 1 ： 阳性对照、 泳道 2-9 ： 转基因植株、 泳道 10 ： 阴性对照、 泳道 M ： DNA 标准分子量 DL2000 ；
     图 4A-4D 转基因烟草的耐旱性分析结果图， 图 4A ： 干旱处理 3d 的转 XHDREB 基因 烟草、 图 4B ： 干旱处理 3d 的非转基因烟草、 图 4C ： 复水恢复生长 3d 的转 XHDREB 基因烟草、 图 4D ： 复水恢复生长 3d 的非转基因烟草 ；
     图 5A-5D 转基因烟草的耐盐性分析结果图， 图 5A ： 200mmol/L NaCl 连续处理 3d 的 转 XHDREB 基因烟草、 图 5B ： 200mmol/LNaCl 连续处理 3d 的非转基因烟草、 图 5C ： 恢复生长 3d 后的转 XHDREB 基因烟草、 图 5D ： 恢复生长 3d 后的非转基因烟草 ；
     图 6A-6D 转基因烟草的耐低温性分析结果图， 图 6A ： 4℃处理 24h 的转 XHDREB 基 因烟草、 图 6B ： 4℃处理 24h 的非转基因烟草、 图 6C ： 室温下恢复培养 3d 后的转 XHDREB 基因 烟草、 6D ： 室温下恢复培养 3d 后的非转基因烟草。
     具体实施方式
     以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。
     工具酶和试剂
     (1) 限制性内切酶， 修饰酶及试剂盒 ： T4 DNA 连接酶， Taq 酶， 反转录酶 AMV， DNA 回 收纯化试剂盒均购自北京天根生物技术公司。质粒小量提取试剂盒购自博大泰克公司， 其 它化学试剂购自北京鼎国公司。
     (2) 其他药品 ： 琼脂糖， Tris， 焦碳酸二乙酯 (DEPC) 为北京鼎国公司产品。蛋白胨， 酵母提取物， 氯仿， 异戊醇， 乙醇， 异丙醇， NaCl， CaCl2 等均为国产分析纯试剂。 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚半乳糖苷 (X-gal)， 异丙基硫代 -β-D 半乳糖苷 (IPTG)， 氨苄青霉素等 购自北京鼎国公司。DNA 分子量标准 Mark Ladder 2000 购自北京天根生物技术公司。
     溶液的配置
     (1) 植 物 基 因 组 DNA 提 取 缓 冲 液 500mL ： 0.35mol/L 葡 萄 糖 ； 0.1mol/L Tris-HCl(pH 8.0) ； 5mmol/L Na-EDTA(pH 8.0) ； 2％ PVP ； 1％ β-Me
     (2) 植物基因组 DNA 提取裂解液 500mL ： 1.4mmol/L NaCl ； 0.1mol/L Tris-HCl(pH 8.0) ； 20mmol/L Na-EDTA(pH 8.0) ； 2％ CTAB ； 2％ PVP ； 1％ β-Me
     (3) 植物基因组 DNA 溶解液 TE(pH 8.0)1L ： 10mmol/L Tris-HCl ； 1mmol/LEDTA(pH 8.0)
     (4) 植物基因组 DNA 电泳缓冲液 50×TBE(500mL) ： Tris 121.0g ； 冰醋酸 28.5mL ； 0.5mol/L EDTA 50.0mL(pH 8.0) ； 1mol/L Tris-HCl(pH 8.0)500.0mL ； Tris 60.0g ； 水 400.0mL ； 浓 HCl 21.0mL
     培养基
     (1)LB 液体培养基 ： 胰蛋白胨 10.0g， 酵母提取物 5.0g， NaCl 10.0， pH 7.0 定容到 1000mL。
     (2)LB 固体培养基 ： 胰蛋白胨 10.0g， 酵母提取物 5.0g， NaCl 10.0g， 琼脂粉 15.0g， pH 7.0 定容到 1000mL。
     (3)LB 选择培养基 ： 在 LB 铺平板前， 待培养基温度降到 50℃左右， 加入抗生素至浓 度为 100mg/L， 摇匀后铺平板。
     主要仪器
     PCR 扩增仪 (Tachne T312)， 高速冷冻离心机 (Hettich MIKRO 200R)， 电泳设备 (Bio RAD)， 凝胶成像系统 (Bio RAD)。
     实施例 1 海岛棉 XHDREB 基因的克隆
     1、 植物材料的培养
     海岛棉 (Gossypium barbadense L.) 新海 16， 种子用灭菌的蒸馏水浸泡， 在 37℃ 保温箱中放置 48h， 露白后再用灭菌的蒸馏水清洗干净， 挤掉种皮后置于 1/2 MS 培养基中， 于 25℃、 光照强度 2500 Lux 和 12h 光周期条件下培养。一周后， 从无菌苗上摘取叶片存于 液氮以提取基因组 DNA， RNA。
     2、 海岛棉基因组 DNA 的提取
     提取方法参照 CTAB 法， 具体步骤如下 ：
     取叶片 3 ～ 5g， 在液氮中研磨后， 装入 1.5ml 离心管 ； 在 1.5ml 离心管中加入 800μL 的 DNA 提取缓冲液 (65 ℃预热 )， 并加入 50μL β- 疏基乙醇， 混匀后 65 ℃水浴 20min， 中间混匀几次 ； 加入 300μL 5mmol/L 醋酸钾 (pH 7.0) 混匀， 冰浴 20 ～ 60min 后， 在 室温下解冻 ； 加入 300μL 的 DNA 提取裂解液， 混匀， 65℃水浴 20min， 中间混匀几次， 室温、 10000rpm 离心 10min ； 吸取上清置于一个新的 1.5ml 离心管中， 加入 600μL 氯仿∶异戊醇 (24 ∶ 1) 混匀， 10000rpm 离心 10min ； 取上清置于一个新的 1.5ml 离心管中， 加入等体积 4℃ 预冷的异丙醇。轻轻混匀， -20℃冰浴 30min 以上 ； 6000rpm 离心 5min， 弃上清， 用 70％乙醇 洗涤沉淀 2 次， 无水乙醇洗 1 次， 吹干 ； 加入 50μL TE 溶解 DNA。3、 海岛棉总 RNA 的提取
     用改良的热酚法提取海岛棉 ( 新海 16) 叶片总 RNA， 具体方法如下 ：
     将 4mL 提取缓冲液 ( 用前加入 PVP 及 β- 疏基乙醇 ) 与 4mL 酚 - 氯仿加入离心管 中， 混匀后， 置于 65℃水浴锅中水浴 20min ； 取海岛棉叶片 1 ～ 2g， 在液氮中研磨后转入装 有提取缓冲液及酚 - 氯仿混合物的离心管中， 旋涡振荡 30s ； 4℃， 12000rpm 高速离心 5min 后， 将上清移至另一离心管中加入 4mL 酚 - 氯仿混合液， 混匀， 离心， 重复该操作一到两次， 然后取上清 ； 加入等体积的 4mol/L 的 LiCl， 混匀， -20℃放置 2h 以上， 12000rpm 离心 20min ； 弃上清， 用 70％乙醇洗涤沉淀， 然后将沉淀溶解于 0.5mL 的 TE 中， 将混合液转入 1.5mL 的 离心管中 ； 加入等体积的酚 - 氯仿混合液抽提一到两次， 将上清转入另一离心管中， 加入 1/10 体积 3mol/L 醋酸钠 (pH 5.3) 和 2 ～ 3 倍体积的无水乙醇， 混匀， -20℃放置 1 ～ 2h， 14000rpm， 4 ℃离心 5min， 用 70 ％乙醇洗涤沉淀， 室温放置 2 ～ 3min ； 加 200 ～ 500μL 的 DEPC 水， 溶解沉淀， -80℃保存备用。
     提取的海岛棉叶片总 RNA 通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性， 紫外分光光度仪检 测能见两条明显 RNA 条带则表明样品可用。
     4、 海岛棉 XHDREB 转录因子基因全长的获得和克隆 第一链 cDNA 的合成
     按 Promega 公司反转录试剂盒说明书进行。分为预变性与反转录两部分， 预变性 反应体系见表 1， 反应条件为 70℃温育 5min， 立即置冰上 10min。 反转录反应体系见表 2， 反 应条件为 25℃、 5min， 42℃、 1h， 70℃、 15min 灭活反转录酶， -20℃冰箱保存反转录产物。
     表 1 预变性反应体系
     表2反转录反应各成分海岛棉 XHDREB 基因 PCR 克隆
     分别以海岛棉 ( 新海 16)cDNA 与基因组 DNA 为模板， P1 和 P2 为引物， 进行 PCR 反 应， 反应体系见表 3， 扩增得到 cDNA 和基因组 DNA 全长并克隆测序。 并将获得的基因命名为
     6101984059 A CN 101984061说PCR 反应体系明书5/7 页XHDREB。
     表3反应条件： 94 ℃、 3min ； 94 ℃、 1min， 50 ℃、 45s， 72 ℃、 1min(35 个 循 环 ) ； 72 ℃、 10min， 4℃冷却， -20℃保存。
     扩增引物序列如下 ：
     P1 ： 5′ -ATGGATTTTTTAGTTCAAGATTA-3′
     P2 ： 5′ -TTAAATAGAATAACTCCATAAAGGT-3′
     分别以其 cDNA 与基因组 DNA 为模板， 用特异性引物 P1、 P2 进行 PCR 扩增， 获得相 同大小的特异性条带， 参见图 1， 表明海岛棉 XHDREB 基因内部没有内含子。
     XHDREB 基因核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。
     XHDREB 基因编码的蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 2 所示。
     实施例 2 pC-DREB 植物表达载体的构建
     请 参 阅 图 2，用 KI 和 Pst I 内 切 酶 对 XHDREB 基 因 片 段 和 表 达 载 体 PCAMBIA2300-35SOCS 进行酶切， 将切下的 XHDREB 基因插入到 pCAMBIA2300-35SOCS 表达 载体的 CaMV35S 启动子和 OCS 终止子之间， 构建了植物表达载体 pC-DREB。植物表达载体 pCAMBIA2300-35SOCS， 以 pCAMBIA2300 为基础构建， 添加了 35S 启动子和多酶切位点。
     双酶切海岛棉 DREB 基因片段
     用设计带 KI 和 Pst I 酶切位点的引物 DR-1、 DR-2， 对海岛棉 cDNA 文库进行 PCR 扩增， 回收扩增产物得到带有 KI 和 Pst I 酶切位点的 XHDREB 基因片段。 然后用 KI， Pst I 对回收的基因片段进行双酶切， 酶切体系见表 4。
     引物序列如下 ：
     上游引物 DR-1 ： 5′ -GGGGTACCATGGATTTTTTAGTTCAAGATTA-3′ ；
     下游引物 DR-2 ： 5′ -AACTGCAGTTAAATAGAATAACTCCATAAAGGT-3′ ；
     划线部分为添加的 KI， Pst I 酶切位点， 引物由上海生工合成。
     表 4 XHDREB 基因酶切反应体系
     用 1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测， 然后用北京天根生物技术公司 DNA 回收纯化 试剂盒回收双酶切后的 XHDREB 基因片段。
     实施例 3 利用农杆菌介导的转化法获得转 XHDREB 基因烟草
     1、 农杆菌感受态细胞的制备
     挑 取 EHA105 单 菌 落 接 种 于 5mLYEB 液 体 培 养 基 ( 含 链 霉 素 100mg/mL， 利福平 100mg/mL) 中， 28 ℃， 250rpm 培养过夜 ； 吸取 2mL 培养物转入 50mLYEB 液体培养基中， 继 续培养至 OD600 值为 0.6 ； 将菌液转至无菌离心管中， 冰浴 30min， 5000rpm 离心 5min ； 用 1.7mL20mmol/L 无菌 CaCl2 重悬菌体， 加入 300μL 无菌甘油， 混匀后， 按每管 200μL 分装于 无菌 1.5mL 微量离心管中， -70℃保持备用。
     2、 冻融法将重组质粒 PC-XHDREB 转入农杆菌
     在灭菌的 1.5mL 离心管中加入 200μL 新鲜制备的 EHA105 感受态细胞及 10μL 阳 性重组质粒， 混匀后冰浴 1h ； 将离心管移入 42℃水浴锅中， 水浴 60s( 切忌振荡 ) ； 立即将离 心管置于冰中， 2 ～ 3min 后再移入 37℃水浴锅中水浴 5min ； 向离心管中加入 37℃ 800μL YEB 液体培养基， 在 37℃恒温振荡器上以 260r/min 培养 1h ； 4000rpm 离心 5min， 弃上清， 剩 余菌体用于涂 YEB 琼脂平板 ； 取剩余菌体均匀涂布于 YEB 选择培养基 ( 含链霉素 100mg/mL， 卡那霉素 100mg/mL， 利福平 100mg/mL) 表面， 待菌体完全被吸收后， 将平板倒置于 28℃培养 箱中培养 48h， 待培养基上长出单菌落后， 进行菌落 PCR， 筛选阳性重组子， PCR 加样体系及 反应体系参照第 2 章 ； 挑取筛选出的阳性菌落， 在 YEB 液体培养基中， 28℃培养 48h， 然后将 菌液制备成甘油菌， -20℃保存， 用于后续实验。
     3、 烟草的遗传转化及植株再生
     采用农杆菌介导法转化烟草， 获得转 XHDREB 基因烟草。
     1) 取 -20℃冰箱内保存的农杆菌菌液 100μL 接种到 3mLYEB 液体培养基中， 28℃， 180rpm 过夜培养。取活化菌液 200μL 加灭菌的 50 ％甘油 200μL 保存于离心管中， 放 于 -20℃冰箱中备用。取活化菌液或上述备用菌液 100μL 加入 10mL 的 YEB 液体培养基中， 28℃， 180rpm 振荡培养至 OD600 值为 0.6 ～ 0.8。将菌液分装到 50mL 三角瓶中， 用于侵染 ；
     2) 取烟草无菌苗叶片剪出叶圆盘， 预培养 2 ～ 3d， 将经过预培养处理的叶盘放入 活化后的农杆菌菌液中， 浸泡 10 ～ 15min ；
     3) 用灭菌的吸水纸将侵染过的叶盘表面菌液吸干后， 将叶盘放于分化培养基上， 25℃， 暗培养 48h ；
     4) 暗培养结束后， 将叶盘放于选择分化培养基上培养， 以后每 10 ～ 15d 继代一 次；
     5) 选择培养 2 ～ 3 周后， 叶盘周围分化出抗性芽， 待抗性芽长至 2 ～ 3cm， 切下插
     入到选择生根培养基中， 进行生根培养， 得到转 XHDREB 基因烟草。
     4、 转基因烟草植株的鉴定及检测
     转基因烟草的 DNA 检测
     提取转基因烟草叶片总 DNA， 以非转基因烟草总 DNA 为阴性对照， 进行 PCR 扩增反 应， 扩增体系及反应体系参见实施例 1。
     分别取扩增产物在 1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测， 可以得到约 650bp 的条带， 说 明 XHDREB 基因已整合至烟草基因组， 电泳结果参见图 3。
     5、 过表达 XHDREB 转基因烟草的抗逆模拟实验及功能鉴定
     1) 转基因烟草的抗旱性分析
     以非转基因烟草作对照， 将转 XHDREB 基因阳性烟草与对照在室温下进行自然干 旱 3d， 然后复水 3d， 观察其外形。
     如图 4A 和 4B 所示， 干旱处理 3d 后， 转基因与非转基因烟草都出现了萎蔫现象， 转 基因烟草的叶片边缘开始卷曲但叶片的萎蔫程度不是很严重， 而非转基因烟草除了心叶跟 从上往下数第二片叶还保持一定膨压其余叶片都发生萎蔫。如图 4C 和 4D 所示， 复水恢复 生长 3d 后， 可以看出转基因烟草叶片的恢复程度明显好于野生型， 转基因烟草的叶片都恢 复了膨压， 而非转基因烟草只有心叶和第二、 三层叶片恢复了膨压， 其余叶片都处于萎蔫状 态。由此可见， XHDREB 基因在烟草中的过量表达确实能够提高转基因植草对干旱胁迫的抗 性。
     2) 转基因烟草的耐盐性分析
     以非转基因的烟草苗作对照， 将转 XHDREB 基因阳性烟草与对照用 200mmol/LNaCl 连续处理 3d， 然后在正常条件下恢复生长 3d 后， 观察其外形。
     如图 5A 和 5B 所示， 用 200mmol/L NaCl 连续处理 3d 后， 非转基因烟草的叶片只有 最下层的两片发生萎蔫， 其余叶片都保持一定的膨压， 而与转基因烟草相比非转基因烟草 除了心叶和第二层叶片仍保持一定膨压， 其余叶片全部发生萎蔫。如图 5C 和 5D 所示， 在正 常条件下恢复生长 3d 后， 可以看到转基因烟草叶片的恢复程度明显好于非转基因烟草。结 果表明 ： 转 XHDREB 基因烟草的耐盐性得到了提高。
     3) 转基因烟草的抗冷性分析
     以非转基因烟草苗作对照， 将转 XHDREB 基因阳性烟草与对照在 4℃培养箱中连续 24h 处理， 然后在室温下恢复培养 3d， 观察其外形。
     背景技术 转录因子 (transcription factor， TF) 又称为反式作用因子， 是指可以与真核生 物基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异性结合的蛋白， 通过他们之间以及与其它相 关蛋白之间的相互作用激活或抑制某些基因的转录。 根据结合方式的不同可以把转录因子 分为两类 ： 一类是普遍性转录因子， 另一类是特异性转录因子， 普遍性转录因子能够和启动 子的核心序列 TATA 框结合， 可以激活所有基因的转录， 而特异性转录因子与 DNA 序列上的 其它调节元件结合， 只能激活特定的基因。 自从 1987 年 Paz-Ares 首次报道了玉米转录因子 基因后， 迄今从高等植物中分离出的调控干旱、 低温、 高盐、 激素、 生长发育及病原反应等相 关基因表达的转录因子已达数百种。 研究发现在拟南芥中编码转录因子的基因至少有 1533 个， 约占其基因总数的 5.9％， 而且这些转录因子在调节植物生长发育以及对外界环境的响 应方面起着重要作用。
     DREB(dehydration responsive element binding protein) 转录因子是存在于植 物中， 与 DRE(dehydration responsive element) 顺式作用元件相结合， 调控对干旱、 高盐、 低温等逆境应答相关基因表达的蛋白质。
     DREB 类转录因子的发现是近年来植物抗逆性研究方面最具突破性的进展之一。 它 在植物应答干旱、 高盐及低温胁迫信号的过程中起重要的调控作用。
     自从 1997 年， Thotnashow 研究小组和 1998 年刘强等率先从拟南芥中分离克隆出 CBF1(DREB1B)， CBF2， (DREB1C) 和 CBF3(DREB1A)3 个 CBF/DREB1 类转录因子以来， 植物中的 这类转录因子的研究受到了广泛的关注。 大多数转录因子基因的表达受到外界刺激和生长 发育进程的诱导， DREB 基因介导复杂的胁迫信号传递网络， 参与多种不同的信号传递。大 部分 DREB 基因的表达都受干旱、 高盐、 低温等逆境胁迫的诱导， 但是不同种类的 DREB 转录 因子可能有不同的表达机制， 即使是同一种类的， 也可能有不同的表达机制， 在植物对逆境 胁迫与激素应答反应中发挥不同的调控作用。目前尚未见关于海岛棉 DREB 转录因子基因 的相关报道。
     DREB(dehydration responsive element binding protein) 转录因子是存在于植 物中， 与 DRE(dehydration responsive element) 顺式作用元件相结合， 调控对干旱、 高盐、 低温等逆境应答相关基因表达的蛋白质。
     DREB 类转录因子的发现是近年来植物抗逆性研究方面最具突破性的进展之一。 它 在植物应答干旱、 高盐及低温胁迫信号的过程中起重要的调控作用。
     自从 1997 年， Thotnashow 研究小组和 1998 年刘强等率先从拟南芥中分离克隆出 CBF1(DREB1B)， CBF2， (DREB1C) 和 CBF3(DREB1A)3 个 CBF/DREB1 类转录因子以来， 植物中的 这类转录因子的研究受到了广泛的关注。 大多数转录因子基因的表达受到外界刺激和生长 发育进程的诱导， DREB 基因介导复杂的胁迫信号传递网络， 参与多种不同的信号传递。大 部分 DREB 基因的表达都受干旱、 高盐、 低温等逆境胁迫的诱导， 但是不同种类的 DREB 转录 因子可能有不同的表达机制， 即使是同一种类的， 也可能有不同的表达机制， 在植物对逆境 胁迫与激素应答反应中发挥不同的调控作用。目前尚未见关于海岛棉 DREB 转录因子基因 的相关报道。
    发明内容 本发明的目的在于提供一种海岛棉 DREB 转录因子基因， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。
     本发明的第二个目的在于提供一种海岛棉 DREB 转录因子， 由 SEQ ID NO ： 1 所示核 苷酸序列编码， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 2 所示。
     本发明的第三个目的在于提供含有所述海岛棉 DREB 转录因子基因的植物表达载 体。
     本发明的第四个目的在于提供用所述植物表达载体转化的植物细胞、 组织或植株。 本发明的第五个目的在于所述海岛棉 DREB 转录因子基因在培育抗逆植物， 尤其 是耐旱植物品种中的应用。
     本发明的技术路线为 ：
     1) 取海岛棉新海 16 叶片 ；
     2) 从叶片提取基因组 DNA 和总 RNA ；
     3) 用总 RNA 进行逆转录反应， 得到 cDNA， 以 cDNA 为模板 PCR 扩增 DREB 转录因子 基因， 命名为 ： XHDREB ；
     4) 构建 pC-XHDREB 植物表达载体， 用根癌农杆菌转化烟草， 获得转 XHDREB 基因烟 草， 采用干旱模拟实验验证转 XHDREB 基因烟草， 因 XHDREB 的过表达而具有耐旱、 耐盐、 抗冷 能力。
     本发明克隆了一种海岛棉 DREB 转录因子基因 XHDREB， 构建 pC-XHDREB 植物表达载 体， 用根癌农杆菌转化烟草， 获得转 XHDREB 基因烟草， 采用干旱模拟实验验证转 XHDREB 基 因烟草， 因 XHDREB 的过表达而具有耐旱、 耐盐、 抗冷能力。
    附图说明 图 1 海岛棉 DREB 基因 PCR 扩增电泳图， 泳道 ： cDNA 的扩增产物、 泳道 2 ： DNA 的扩 增产物、 泳道 M ： DNA 标准分子量 DL2000 ；
     图 2 重组质粒 pC-XHDREB 构建流程图
     图 3 转基因烟草的 PCR 检测电泳图， 泳道 1 ： 阳性对照、 泳道 2-9 ： 转基因植株、 泳道 10 ： 阴性对照、 泳道 M ： DNA 标准分子量 DL2000 ；
     图 4A-4D 转基因烟草的耐旱性分析结果图， 图 4A ： 干旱处理 3d 的转 XHDREB 基因 烟草、 图 4B ： 干旱处理 3d 的非转基因烟草、 图 4C ： 复水恢复生长 3d 的转 XHDREB 基因烟草、 图 4D ： 复水恢复生长 3d 的非转基因烟草 ；
     图 5A-5D 转基因烟草的耐盐性分析结果图， 图 5A ： 200mmol/L NaCl 连续处理 3d 的 转 XHDREB 基因烟草、 图 5B ： 200mmol/LNaCl 连续处理 3d 的非转基因烟草、 图 5C ： 恢复生长 3d 后的转 XHDREB 基因烟草、 图 5D ： 恢复生长 3d 后的非转基因烟草 ；
     图 6A-6D 转基因烟草的耐低温性分析结果图， 图 6A ： 4℃处理 24h 的转 XHDREB 基 因烟草、 图 6B ： 4℃处理 24h 的非转基因烟草、 图 6C ： 室温下恢复培养 3d 后的转 XHDREB 基因 烟草、 6D ： 室温下恢复培养 3d 后的非转基因烟草。
    具体实施方式
     以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。
     工具酶和试剂
     (1) 限制性内切酶， 修饰酶及试剂盒 ： T4 DNA 连接酶， Taq 酶， 反转录酶 AMV， DNA 回 收纯化试剂盒均购自北京天根生物技术公司。质粒小量提取试剂盒购自博大泰克公司， 其 它化学试剂购自北京鼎国公司。
     (2) 其他药品 ： 琼脂糖， Tris， 焦碳酸二乙酯 (DEPC) 为北京鼎国公司产品。蛋白胨， 酵母提取物， 氯仿， 异戊醇， 乙醇， 异丙醇， NaCl， CaCl2 等均为国产分析纯试剂。 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚半乳糖苷 (X-gal)， 异丙基硫代 -β-D 半乳糖苷 (IPTG)， 氨苄青霉素等 购自北京鼎国公司。DNA 分子量标准 Mark Ladder 2000 购自北京天根生物技术公司。
     溶液的配置
     (1) 植 物 基 因 组 DNA 提 取 缓 冲 液 500mL ： 0.35mol/L 葡 萄 糖 ； 0.1mol/L Tris-HCl(pH 8.0) ； 5mmol/L Na-EDTA(pH 8.0) ； 2％ PVP ； 1％ β-Me
     (2) 植物基因组 DNA 提取裂解液 500mL ： 1.4mmol/L NaCl ； 0.1mol/L Tris-HCl(pH 8.0) ； 20mmol/L Na-EDTA(pH 8.0) ； 2％ CTAB ； 2％ PVP ； 1％ β-Me
     (3) 植物基因组 DNA 溶解液 TE(pH 8.0)1L ： 10mmol/L Tris-HCl ； 1mmol/LEDTA(pH 8.0)
     (4) 植物基因组 DNA 电泳缓冲液 50×TBE(500mL) ： Tris 121.0g ； 冰醋酸 28.5mL ； 0.5mol/L EDTA 50.0mL(pH 8.0) ； 1mol/L Tris-HCl(pH 8.0)500.0mL ； Tris 60.0g ； 水 400.0mL ； 浓 HCl 21.0mL
     培养基
     (1)LB 液体培养基 ： 胰蛋白胨 10.0g， 酵母提取物 5.0g， NaCl 10.0， pH 7.0 定容到 1000mL。
     (2)LB 固体培养基 ： 胰蛋白胨 10.0g， 酵母提取物 5.0g， NaCl 10.0g， 琼脂粉 15.0g， pH 7.0 定容到 1000mL。
     (3)LB 选择培养基 ： 在 LB 铺平板前， 待培养基温度降到 50℃左右， 加入抗生素至浓 度为 100mg/L， 摇匀后铺平板。
     主要仪器
     PCR 扩增仪 (Tachne T312)， 高速冷冻离心机 (Hettich MIKRO 200R)， 电泳设备 (Bio RAD)， 凝胶成像系统 (Bio RAD)。
     实施例 1 海岛棉 XHDREB 基因的克隆
     1、 植物材料的培养
     海岛棉 (Gossypium barbadense L.) 新海 16， 种子用灭菌的蒸馏水浸泡， 在 37℃ 保温箱中放置 48h， 露白后再用灭菌的蒸馏水清洗干净， 挤掉种皮后置于 1/2 MS 培养基中， 于 25℃、 光照强度 2500 Lux 和 12h 光周期条件下培养。一周后， 从无菌苗上摘取叶片存于 液氮以提取基因组 DNA， RNA。
     2、 海岛棉基因组 DNA 的提取
     提取方法参照 CTAB 法， 具体步骤如下 ：
     取叶片 3 ～ 5g， 在液氮中研磨后， 装入 1.5ml 离心管 ； 在 1.5ml 离心管中加入 800μL 的 DNA 提取缓冲液 (65 ℃预热 )， 并加入 50μL β- 疏基乙醇， 混匀后 65 ℃水浴 20min， 中间混匀几次 ； 加入 300μL 5mmol/L 醋酸钾 (pH 7.0) 混匀， 冰浴 20 ～ 60min 后， 在 室温下解冻 ； 加入 300μL 的 DNA 提取裂解液， 混匀， 65℃水浴 20min， 中间混匀几次， 室温、 10000rpm 离心 10min ； 吸取上清置于一个新的 1.5ml 离心管中， 加入 600μL 氯仿∶异戊醇 (24 ∶ 1) 混匀， 10000rpm 离心 10min ； 取上清置于一个新的 1.5ml 离心管中， 加入等体积 4℃ 预冷的异丙醇。轻轻混匀， -20℃冰浴 30min 以上 ； 6000rpm 离心 5min， 弃上清， 用 70％乙醇 洗涤沉淀 2 次， 无水乙醇洗 1 次， 吹干 ； 加入 50μL TE 溶解 DNA。3、 海岛棉总 RNA 的提取
     用改良的热酚法提取海岛棉 ( 新海 16) 叶片总 RNA， 具体方法如下 ：
     将 4mL 提取缓冲液 ( 用前加入 PVP 及 β- 疏基乙醇 ) 与 4mL 酚 - 氯仿加入离心管 中， 混匀后， 置于 65℃水浴锅中水浴 20min ； 取海岛棉叶片 1 ～ 2g， 在液氮中研磨后转入装 有提取缓冲液及酚 - 氯仿混合物的离心管中， 旋涡振荡 30s ； 4℃， 12000rpm 高速离心 5min 后， 将上清移至另一离心管中加入 4mL 酚 - 氯仿混合液， 混匀， 离心， 重复该操作一到两次， 然后取上清 ； 加入等体积的 4mol/L 的 LiCl， 混匀， -20℃放置 2h 以上， 12000rpm 离心 20min ； 弃上清， 用 70％乙醇洗涤沉淀， 然后将沉淀溶解于 0.5mL 的 TE 中， 将混合液转入 1.5mL 的 离心管中 ； 加入等体积的酚 - 氯仿混合液抽提一到两次， 将上清转入另一离心管中， 加入 1/10 体积 3mol/L 醋酸钠 (pH 5.3) 和 2 ～ 3 倍体积的无水乙醇， 混匀， -20℃放置 1 ～ 2h， 14000rpm， 4 ℃离心 5min， 用 70 ％乙醇洗涤沉淀， 室温放置 2 ～ 3min ； 加 200 ～ 500μL 的 DEPC 水， 溶解沉淀， -80℃保存备用。
     提取的海岛棉叶片总 RNA 通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性， 紫外分光光度仪检 测能见两条明显 RNA 条带则表明样品可用。
     4、 海岛棉 XHDREB 转录因子基因全长的获得和克隆 第一链 cDNA 的合成
     按 Promega 公司反转录试剂盒说明书进行。分为预变性与反转录两部分， 预变性 反应体系见表 1， 反应条件为 70℃温育 5min， 立即置冰上 10min。 反转录反应体系见表 2， 反 应条件为 25℃、 5min， 42℃、 1h， 70℃、 15min 灭活反转录酶， -20℃冰箱保存反转录产物。
     表 1 预变性反应体系
    
    
    表2反转录反应各成分海岛棉 XHDREB 基因 PCR 克隆
     分别以海岛棉 ( 新海 16)cDNA 与基因组 DNA 为模板， P1 和 P2 为引物， 进行 PCR 反 应， 反应体系见表 3， 扩增得到 cDNA 和基因组 DNA 全长并克隆测序。 并将获得的基因命名为
     6101984059 A CN 101984061说PCR 反应体系明书5/7 页XHDREB。
    
    表3反应条件： 94 ℃、 3min ； 94 ℃、 1min， 50 ℃、 45s， 72 ℃、 1min(35 个 循 环 ) ； 72 ℃、 10min， 4℃冷却， -20℃保存。
     扩增引物序列如下 ：
     P1 ： 5′ -ATGGATTTTTTAGTTCAAGATTA-3′
     P2 ： 5′ -TTAAATAGAATAACTCCATAAAGGT-3′
    分别以其 cDNA 与基因组 DNA 为模板， 用特异性引物 P1、 P2 进行 PCR 扩增， 获得相 同大小的特异性条带， 参见图 1， 表明海岛棉 XHDREB 基因内部没有内含子。
     XHDREB 基因核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。
     XHDREB 基因编码的蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 2 所示。
     实施例 2 pC-DREB 植物表达载体的构建
     请 参 阅 图 2，用 KI 和 Pst I 内 切 酶 对 XHDREB 基 因 片 段 和 表 达 载 体 PCAMBIA2300-35SOCS 进行酶切， 将切下的 XHDREB 基因插入到 pCAMBIA2300-35SOCS 表达 载体的 CaMV35S 启动子和 OCS 终止子之间， 构建了植物表达载体 pC-DREB。植物表达载体 pCAMBIA2300-35SOCS， 以 pCAMBIA2300 为基础构建， 添加了 35S 启动子和多酶切位点。
     双酶切海岛棉 DREB 基因片段
     用设计带 KI 和 Pst I 酶切位点的引物 DR-1、 DR-2， 对海岛棉 cDNA 文库进行 PCR 扩增， 回收扩增产物得到带有 KI 和 Pst I 酶切位点的 XHDREB 基因片段。 然后用 KI， Pst I 对回收的基因片段进行双酶切， 酶切体系见表 4。
     引物序列如下 ：
     上游引物 DR-1 ： 5′ -GGGGTACCATGGATTTTTTAGTTCAAGATTA-3′ ；
     下游引物 DR-2 ： 5′ -AACTGCAGTTAAATAGAATAACTCCATAAAGGT-3′ ；
     划线部分为添加的 KI， Pst I 酶切位点， 引物由上海生工合成。
     表 4 XHDREB 基因酶切反应体系
    
    用 1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测， 然后用北京天根生物技术公司 DNA 回收纯化 试剂盒回收双酶切后的 XHDREB 基因片段。
     实施例 3 利用农杆菌介导的转化法获得转 XHDREB 基因烟草
     1、 农杆菌感受态细胞的制备
     挑 取 EHA105 单 菌 落 接 种 于 5mLYEB 液 体 培 养 基 ( 含 链 霉 素 100mg/mL， 利福平 100mg/mL) 中， 28 ℃， 250rpm 培养过夜 ； 吸取 2mL 培养物转入 50mLYEB 液体培养基中， 继 续培养至 OD600 值为 0.6 ； 将菌液转至无菌离心管中， 冰浴 30min， 5000rpm 离心 5min ； 用 1.7mL20mmol/L 无菌 CaCl2 重悬菌体， 加入 300μL 无菌甘油， 混匀后， 按每管 200μL 分装于 无菌 1.5mL 微量离心管中， -70℃保持备用。
    2、 冻融法将重组质粒 PC-XHDREB 转入农杆菌
     在灭菌的 1.5mL 离心管中加入 200μL 新鲜制备的 EHA105 感受态细胞及 10μL 阳 性重组质粒， 混匀后冰浴 1h ； 将离心管移入 42℃水浴锅中， 水浴 60s( 切忌振荡 ) ； 立即将离 心管置于冰中， 2 ～ 3min 后再移入 37℃水浴锅中水浴 5min ； 向离心管中加入 37℃ 800μL YEB 液体培养基， 在 37℃恒温振荡器上以 260r/min 培养 1h ； 4000rpm 离心 5min， 弃上清， 剩 余菌体用于涂 YEB 琼脂平板 ； 取剩余菌体均匀涂布于 YEB 选择培养基 ( 含链霉素 100mg/mL， 卡那霉素 100mg/mL， 利福平 100mg/mL) 表面， 待菌体完全被吸收后， 将平板倒置于 28℃培养 箱中培养 48h， 待培养基上长出单菌落后， 进行菌落 PCR， 筛选阳性重组子， PCR 加样体系及 反应体系参照第 2 章 ； 挑取筛选出的阳性菌落， 在 YEB 液体培养基中， 28℃培养 48h， 然后将 菌液制备成甘油菌， -20℃保存， 用于后续实验。
     3、 烟草的遗传转化及植株再生
     采用农杆菌介导法转化烟草， 获得转 XHDREB 基因烟草。
     1) 取 -20℃冰箱内保存的农杆菌菌液 100μL 接种到 3mLYEB 液体培养基中， 28℃， 180rpm 过夜培养。取活化菌液 200μL 加灭菌的 50 ％甘油 200μL 保存于离心管中， 放 于 -20℃冰箱中备用。取活化菌液或上述备用菌液 100μL 加入 10mL 的 YEB 液体培养基中， 28℃， 180rpm 振荡培养至 OD600 值为 0.6 ～ 0.8。将菌液分装到 50mL 三角瓶中， 用于侵染 ；
     2) 取烟草无菌苗叶片剪出叶圆盘， 预培养 2 ～ 3d， 将经过预培养处理的叶盘放入 活化后的农杆菌菌液中， 浸泡 10 ～ 15min ；
     3) 用灭菌的吸水纸将侵染过的叶盘表面菌液吸干后， 将叶盘放于分化培养基上， 25℃， 暗培养 48h ；
     4) 暗培养结束后， 将叶盘放于选择分化培养基上培养， 以后每 10 ～ 15d 继代一 次；
     5) 选择培养 2 ～ 3 周后， 叶盘周围分化出抗性芽， 待抗性芽长至 2 ～ 3cm， 切下插
     入到选择生根培养基中， 进行生根培养， 得到转 XHDREB 基因烟草。
     4、 转基因烟草植株的鉴定及检测
     转基因烟草的 DNA 检测
     提取转基因烟草叶片总 DNA， 以非转基因烟草总 DNA 为阴性对照， 进行 PCR 扩增反 应， 扩增体系及反应体系参见实施例 1。
     分别取扩增产物在 1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测， 可以得到约 650bp 的条带， 说 明 XHDREB 基因已整合至烟草基因组， 电泳结果参见图 3。
     5、 过表达 XHDREB 转基因烟草的抗逆模拟实验及功能鉴定
     1) 转基因烟草的抗旱性分析
     以非转基因烟草作对照， 将转 XHDREB 基因阳性烟草与对照在室温下进行自然干 旱 3d， 然后复水 3d， 观察其外形。
     如图 4A 和 4B 所示， 干旱处理 3d 后， 转基因与非转基因烟草都出现了萎蔫现象， 转 基因烟草的叶片边缘开始卷曲但叶片的萎蔫程度不是很严重， 而非转基因烟草除了心叶跟 从上往下数第二片叶还保持一定膨压其余叶片都发生萎蔫。如图 4C 和 4D 所示， 复水恢复 生长 3d 后， 可以看出转基因烟草叶片的恢复程度明显好于野生型， 转基因烟草的叶片都恢 复了膨压， 而非转基因烟草只有心叶和第二、 三层叶片恢复了膨压， 其余叶片都处于萎蔫状 态。由此可见， XHDREB 基因在烟草中的过量表达确实能够提高转基因植草对干旱胁迫的抗 性。
     2) 转基因烟草的耐盐性分析
     以非转基因的烟草苗作对照， 将转 XHDREB 基因阳性烟草与对照用 200mmol/LNaCl 连续处理 3d， 然后在正常条件下恢复生长 3d 后， 观察其外形。
     如图 5A 和 5B 所示， 用 200mmol/L NaCl 连续处理 3d 后， 非转基因烟草的叶片只有 最下层的两片发生萎蔫， 其余叶片都保持一定的膨压， 而与转基因烟草相比非转基因烟草 除了心叶和第二层叶片仍保持一定膨压， 其余叶片全部发生萎蔫。如图 5C 和 5D 所示， 在正 常条件下恢复生长 3d 后， 可以看到转基因烟草叶片的恢复程度明显好于非转基因烟草。结 果表明 ： 转 XHDREB 基因烟草的耐盐性得到了提高。
     3) 转基因烟草的抗冷性分析
     以非转基因烟草苗作对照， 将转 XHDREB 基因阳性烟草与对照在 4℃培养箱中连续 24h 处理， 然后在室温下恢复培养 3d， 观察其外形。
     如图 6A-6D 所示， 4℃处理 24h 非转基因烟草的萎蔫程度明显大于转基因烟草， 在 室温下恢复培养 3d 后， 非转基因烟草已经完全萎蔫， 叶片发黑接近死亡， 而转基因烟草的 叶片大部分都恢复正常。由此可见， XHDREB 基因在烟草中的过量表达对转基因烟草的抗冷 性具有一定的提高。9101984059 A CN 101984061
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