技术领域
本发明提供一种重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗(简称乙卡联合 苗)，特别提供了重组乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)与卡介菌(BCG) 菌液的配比处方、冷冻干燥工艺，同时还提供了涉及该联合疫苗的保 护剂、接种剂量、接种途径，属于疫苗生产制备工艺技术领域。
技术背景
乙型肝炎和结核病均为传染性疾病，通过接种相应的疫苗，预防 乙型肝炎和结核病一直很有成效。根据计划免疫规定，新生儿在出生 24小时内必须接种乙型肝炎疫苗和卡介苗。现行使用的卡介苗为冻 干制剂，上臂三角肌处皮内接种，现行使用的重组乙型肝炎疫苗为液 体疫苗，含铝佐剂和防腐剂，上臂三角肌肌内接种，这两种疫苗均为 单价疫苗，需同日分别接种。因为接种途径不同，以及现行的乙型肝 炎疫苗含有防腐剂，因此，与卡介苗不能简单地混合使用，必须两针 分别接种，这不仅给新生儿带来痛苦，也给接种增加了许多不便。乙 型肝炎疫苗与卡介苗合为一针接种的问题成为本发明要实现的目的。
发明内容
本发明提供一种重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗，使新生儿由原来 的两针接种简化为一针接种，可达到原来接种两针的预防效果。
本发明还提供一种重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗的冻干剂型。
本发明进一步提供了一种重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗生产工 艺，适合于工业化生产。
重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗，其特征在于每支成品含以下组分 及含量：
乙型肝炎表面抗原 5微克～20微克
卡介菌 80微克～120微克
明胶 0.8～1.2毫克
蔗糖 8～12毫克
氯化钾 0.8～1.2毫克
谷氨酸钠 0.8～1.2毫克
氯化钠 0.8～0.9毫克
pH6.0～7.5
本发明重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗的具体制备方法，包括以下 步骤：
(1)提供的卡介菌原液每毫升含以下成份及含量
卡介菌 800～1200微克
明胶 8～12毫克
蔗糖 80～120毫克
氯化钾 8～12毫克
谷氨酸钠 8～12毫克
余量为注射用水
(2)提供重组乙型肝炎病毒表面抗原原液每毫升含以下成份及含量
重组乙型肝炎病毒表面抗原50～200微克。
氯化钠 8～9毫克
余量为注射用水
(3)在步骤(1)和步骤(2)中所述两种原液按1∶1比例混合，得 到联合疫苗半成品。
(4)在步骤(3)中得到的重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗半成品进行 分装，每支0.2毫升。
(5)在步骤(4)中得到的分装品冷冻干燥，步骤为：干箱预冻3～4 小时，制品冻结7～8小时，逐渐升温真空干燥8～10小时，恒温 真空干燥7～8小时，全过程累计25～30小时，制备出重组乙型 肝炎卡介苗联合疫苗成品。
重组乙型肝炎卡介菌联合疫苗的使用剂量及注射部位
小剂量重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗，每支含乙型肝炎病毒表面 抗原5微克和卡介菌80～120微克，用0.2毫升注射用水溶解，取0.1 毫升，上臂外侧三角肌中部略下处的皮肤皮内注射。
中剂量重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗，每支含乙型肝炎病毒表面 抗原10微克和卡介菌8～120微克，用0.2毫升注射用水溶解，取 0.1毫升，上臂外侧三角肌中部略下处的皮肤皮内注射。
大剂量重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗，每支含乙型肝炎病毒表面 抗原20微克和卡介菌80～120微克，用0.2毫升注射用水溶解，取 0.1毫升，上臂外侧三角肌中部略下处的皮肤皮内注射。
重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗与单价卡介苗免疫效果比较
实验组分别接种按本发明方法制备的三种规格乙卡联合苗，对照 组接种同批卡介苗，每组接种4只豚鼠。5周时接种结核菌素纯蛋白 衍生物(PPD)，24～72小时判定反应局部硬结直径。重复实验三次。
接种PPD后24小时后判定结果(见表1)，各实验组与同批对照 组相比较，结果相近，t检验p＞0.05，无显著性差异。重组HBsAg对 卡介苗免疫效果无影响。
表1 PPD皮内试验结果
HBsAg 组别 疫苗 剂量 反应直径(mm) x±s p
μg/支 实验1-1组 乙卡联合苗 5 8 12 14 8.5 10.6±2.86 p＞0.05 实验1-2组 乙卡联合苗 10 11.5 9 13 8.5 10.5±2.12 实验1-3组 乙卡联合苗 20 10 11 10.5 7 9.6±1.79 对照1 卡介苗 0 10.5 9.5 9 13 10.5±1.77 实验2-1组 乙卡联合苗 5 11.5 10 12 9 10.6±1.37 p＞0.05 实验2-2组 乙卡联合苗 10 14 8 12 8.5 10.1±2.71 实验2-3组 乙卡联合苗 20 10.5 14 11 9.5 11.2±1.93 对照2 卡介苗 0 14 12 10.5 8 11.1±2.52 实验3-1组 乙卡联合苗 5 9 8.5 7 10 8.6±1.25 p＞0.05 实验3-2组 乙卡联合苗 10 6.5 8 12 9 8.8±2.32 实验3-3组 乙卡联合苗 20 7.5 8.5 10 8 8.5±1.08 对照3 卡介苗 0 7.5 6.5 10 11.5 8.8±2.28
重组乙型肝炎卡介菌联合疫苗与单价重组乙型肝炎疫苗免疫效 果比较
按本发明方法制备的联合疫苗取消了原单价重组乙型肝炎疫苗 中铝佐剂及防腐剂，而以卡介苗作为抗原同时又作为HBsAg的佐剂， 本研究旨在探讨这种改变对重组乙肝表面抗原免疫原性的影响。
对照组按0、1、2程序接种重组乙型肝炎疫苗，按10μg/只剂量， 腹腔接种豚鼠。
每次实验组设三组，初免时分别皮内接种含HBsAg 2.5μg(5μg/ 支规格)、5μg(10μg/支规格)、10μg(20μg/支规格)三种剂量的重 组乙型肝炎卡介苗联合疫苗；对照组初免时，腹腔接种单价重组乙型 肝炎疫苗10μg/只。第二针、第三针的加强免疫，各组相同，都是采 用单价重组乙型肝炎疫苗10μg/只，。每次免疫后1个月采血，ELISA 方法检测血清抗体滴度。结果见表1、2、3。
表2实验组(2.5μg)与对照组(10μg)免疫效果比较
血清抗体几何平均滴度(GMT±S) 组别 S1 S2 S3 试验组 66±0.13(n＝9) 9164±0.47(n＝10) 17811±0.33(n＝9) 对照组 151±0.25(n＝8) 5596±0.43(n＝10) 11271±0.23(n＝11)
t＝3.14 t＝1.05 t＝1.28
p＜0.01 p＞0.05 p＞0.05 *S1、S2、S3分别为第一针、第二针、第三针免疫后抗体几何平均值
表3实验组(5μg)与对照组(10μg)免疫效果比较
血清抗体几何平均滴度(GMT±S) 组别 S1 S2 S3 试验组 74±0.22(n＝8) 10950±0.38(n＝9) 16882±0.42(n＝8) 对照组 151±0.25(n＝8) 5596±0.43(n＝10) 11271±0.23(n＝11)
t＝2.72 t＝1.56 t＝1.31
P＜0.05 P＞0.05 P＞0.05
表4实验组(10μg)与对照组(10μg)免疫效果比较
血清抗体几何平均滴度(GMT±S) 组别 S1 S2 S3 试验组 85±0.32(n＝9) 12561±0.59(n＝10) 18756±0.43(n＝9) 对照组 151±0.25(n＝8) 5596±0.43(n＝10) 11271±0.23(n＝11)
t＝2.43 t＝1.82 t＝1.56
P＜0.05 P＞0.05 P＞0.05
从表2、表3、表4结果可见，2.5μg、5μg、10μg三种接种剂 量的重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗第一针免疫结果，其抗体几何平均 滴度均低于单价10μg乙型肝炎疫苗腹腔免疫对照组，但第二针、第 三针加强免疫后，实验组(联合疫苗组)抗体滴度迅速上升，而且高 于对照组，其结果证明，卡介苗对乙型肝炎疫苗的全程免疫效果不仅 无不良影响，而且，还有增强免疫效果的作用。
不同剂量重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗对乙型肝炎病毒表面抗 原免疫效果的影响
按本发明方法制备三种规格的该联合疫苗，分别含重组乙型肝炎 病毒表面抗原为5μg/支、10μg/支、20μg/支，含卡介苗均为80～120μg /支。三种规格的联合疫苗用0.2毫升注射用水溶解，取0.1毫升皮内 注射，接种“PPD皮内试验”阴性的豚鼠，并按10μg/只剂量腹腔接 种重组乙型肝炎疫苗进行加强免疫，ELISA方法检测血清抗体滴度。 结果从表5可见，三种接种剂量的联合疫苗其免疫效果相近，不论初 免，还是加强免疫，各组抗体几何平均滴度均无显著性差异。
表5重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗三种接种剂量免疫效果比较
血清抗体几何平均滴度(GMT±S) 接种剂量 S1 S2 S3 10μg 85±0.32(n＝9) 12561±0.59(n＝10) 18756±0.43(n＝9) 5μg 74±0.22(n＝8) 10950±0.38(n＝9) 16882±0.42(n＝8) 2.5μg 66±0.13(n＝90) 9164±0.47(n＝10) 17811±0.33(n＝9)
t＝0.68 t＝1.04 t＝1.31
P＞0.05 P＞0.05 P＞0.05
重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗安全试验
取该联合疫苗及同批原液的卡介苗，注射用水溶解，选用“PPD 皮内试验阴性”、体重300～400g的同性豚鼠，试验组皮下接种50人 份联合疫苗，对照组皮下接种50人份卡介苗，每两周称重一次，观 察6周后，解剖检查。
三批联合疫苗试验结果，豚鼠体重增加，解剖观察肝、脾、肺、 肾、大网膜、肠系膜等脏器与卡介菌组无区别，均无结核病变。
本发明的积极效果在于，制备的重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗， 使新生儿接种一针疫苗，可预防乙型肝炎、结核病两种疾病，达到接 种两针原有单价疫苗的效果。
本发明的积极效果还在于，本发明在制备重组乙型肝炎卡介苗联 合疫苗过程中，不是简单地将两种疫苗混合，而是将重组乙型肝炎病 毒表面抗原蛋白与卡介苗菌体两者自然联合，去除了现行使用的乙型 肝炎疫苗中铝佐剂、甲醛和硫柳汞等不良成分，提高安全性；在该联 合疫苗中，兼用卡介苗的强免疫佐剂作用，既增强体液免疫，又增强 细胞免疫，使其效果优于单价乙型肝炎疫苗。同时由于卡介菌的特殊 性，必须皮内接种，这也成为该联合疫苗唯一的接种途径，而皮内接 种一般为刺激机体免疫反应的最有效途径，它以低剂量接种达到相同 或超过其它途径高剂量接种的效果。
本发明的积极效果还在于：该联合疫苗改变了现行使用的乙型肝 炎疫苗的液体剂型为冻干剂型，提高了乙型肝炎表面抗原的热稳定 性，液体乙型肝炎疫苗通常在37℃15天，效力就显著下降，甚至降 为原始效力的一半。由于该联合疫苗含有冻干保护剂，使乙型肝炎病 毒表面抗原热稳定性得到提高，37℃30天，ELISA检测未见下降，结 果见表6。
表6联合疫苗37℃30天ELISA检测结果
样品组 规格HBsAg量 原始结果 37℃30天结果
ug/支
1 5 6.72 6.32
2 10 10.83 11.51
3 20 19.65 21.33
具体实施方式
实施例1：
重组乙型肝炎病毒表面抗原原液的制备
按《中国生物制品规程》2000版“重组(CHO细胞)乙型肝炎 疫苗制检规程”进行。将适宜代数的含乙型肝炎病毒表面抗原基因的 工程细胞CHO-C28扩增、传代，接种15L转瓶或生物反应器，37℃ 培养，收获培养液，纯化HBsAg，其纯度达95％以上，除菌过滤，用 生理盐水稀释至50～200μg/ml。
实施例2：
卡介苗原液的制备
按《中国生物制品规程》2000版“皮内注射用卡介苗制检规程” 进行，菌种在苏通马铃薯培养基、胆汁马铃薯培养基以及液体苏通培 养基上传代、培养。收集菌膜压干，低温下研磨，加入保护剂稀释成 0.8～1.2mg/m1浓度。
实施例3：
重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗冷冻干燥保护剂的制备
按下列配方配置冷冻干燥保护剂：
成分 含量(％)
明胶 0.8～1.0
蔗糖 8～12
氯化钾 0.8～1.2
谷氨酸钠 0.8～1.2
余量为注射用水
pH 6.0～7.5
实施例4：
重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗半成品的制备
其半成品组份及每毫升含量：
乙型肝炎表面抗原 25微克～100微克
卡介菌 400微克～600微克
明胶 4～6毫克
蔗糖 40～60毫克
氯化钾 4～6毫克
谷氨酸钠 4～6毫克
余量为注射用水
pH 6.0～7.5
实施例5：
重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗成品的制备
首先干箱预冻-40℃3～4小时，再将重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗 半成品分装0.2毫升/支，-40℃冷冻7～8小时，逐渐升温真空干燥8～10 小时，30～35℃恒温真空干燥7～8小时，全过程累计25～30小时，即 得冷冻干燥的重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗成品。冻干后成品为白色 疏松体，水份≤3％(g/g)。