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1、10申请公布号CN102068698A43申请公布日20110525CN102068698ACN102068698A21申请号200910189540822申请日20091124A61K47/26200601A61K9/127200601A61K39/39200601A61P31/0020060171申请人深圳先进技术研究院地址518055广东省深圳市南山区西丽深圳大学城学苑大道1068号72发明人马轶凡周冬梅谢晓芳庄燕郑明彬74专利代理机构广州华进联合专利商标代理有限公司44224代理人吴平54发明名称纳米疫苗及其制备方法57摘要本发明提供了一种纳米疫苗及其制备方法，采用新的甘露糖基化的阳离。
2、子脂质体复合物，可以作为疫苗载体及应用于疫苗，这种新的脂质体复合物在阳离子脂中掺入中性磷脂和甘露糖，不但提高了脂质体的免疫佐剂作用和抗原呈递细胞靶向性，而且明显减低其细胞毒作用，提供了一种高效无副作用的新型疫苗载体和佐剂，能显著增强疫苗的免疫效果。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书6页附图3页CN102068700A1/2页21一种甘露糖基化的阳离子脂质体复合物，其特征在于，包括按比例混合的阳离子脂、中性磷脂和甘露糖苷，阳离子脂和中性磷脂的摩尔比为191至218，甘露糖苷与包括阳离子脂和中性磷脂的脂质体的摩尔比为298至2080。2根据权利要求1。
3、所述的甘露糖基化的阳离子脂质体复合物，其特征在于，所述阳离子脂是带有正电荷两性分子，包括带有正电荷的头部和疏水尾部，带正电荷的极性头部含有氨基、季铵盐及多胺等胺类基团，而疏水尾部包括饱和或不饱和脂肪酸链或胆固醇环。3根据权利要求2所述的甘露糖基化的阳离子脂质体复合物，其特征在于，所述阳离子脂包括双十烷基二甲基溴化铵、二油酰三甲基铵丙烷、二油酰丙基氯化三甲铵、二甲氨基乙基氨甲酰基胆固醇和二油酰磷脂酰胆碱醚中的一种或多种的组合。4根据权利要求1至3中任一项所述的甘露糖基化的阳离子脂质体复合物，其特征在于，所述中性磷脂是两性分子，包括磷酸相连的含氨碱或醇类取代基团构成的亲水头和脂肪酸链构成的疏水尾，。
4、表面静电荷基本接近0。5根据权利要求4所述的甘露糖基化的阳离子脂质体复合物，其特征在于，所述中性磷脂包括二油酰磷脂酰胆碱、二豆蔻酰磷脂酰胆碱、二亚油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种或多种的组合。6根据权利要求4所述的甘露糖基化的阳离子脂质体复合物，其特征在于，所述甘露糖苷包括甲基D甘露糖苷、4硝基苯基D吡喃甘露糖苷、4甲基伞形酮基D吡喃甘露糖苷和4氨基苯基D甘露糖苷中的一种或多种的组合。7一种具有免疫佐剂功效的疫苗载体，包裹疫苗抗原，其特征在于，所述疫苗载体为甘露糖基化的阳离子脂质体复合物，包括按比例。
5、混合的阳离子脂、中性磷脂和甘露糖苷，阳离子脂和中性磷脂的摩尔比为191至218，甘露糖苷与包括阳离子脂和中性磷脂的脂质体的摩尔比为298至2080。8根据权利要求7所述的具有免疫佐剂功效的疫苗载体，其特征在于，所述阳离子脂是带有正电荷两性分子，包括带有正电荷的头部和疏水尾部，带正电荷的极性头部含有氨基、季铵盐及多胺等胺类基团，而疏水尾部包括饱和或不饱和脂肪酸链或胆固醇环。9根据权利要求8所述的具有免疫佐剂功效的疫苗载体，其特征在于，所述阳离子脂包括双十烷基二甲基溴化铵、二油酰三甲基铵丙烷、二油酰丙基氯化三甲铵、二甲氨基乙基氨甲酰基胆固醇和二油酰磷脂酰胆碱醚中的一种或多种的组合。10根据权利要求。
6、7至9中任一项所述的具有免疫佐剂功效的疫苗载体，其特征在于，所述中性磷脂是两性分子，包括磷酸相连的含氨碱或醇类取代基团构成的亲水头和脂肪酸链构成的疏水尾，表面静电荷基本接近0。11根据权利要求10所述的具有免疫佐剂功效的疫苗载体，其特征在于，所述中性磷脂包括二油酰磷脂酰胆碱、二豆蔻酰磷脂酰胆碱、二亚油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种或多种的组合。12根据权利要求10所述的具有免疫佐剂功效的疫苗载体，其特征在于，所述甘露糖苷包括甲基D甘露糖苷、4硝基苯基D吡喃甘露糖苷、4甲基伞形酮基D吡喃甘露糖苷和4氨。
7、基苯基D甘露糖苷中的一种或多种的组合。权利要求书CN102068698ACN102068700A2/2页313一种纳米疫苗，包括疫苗抗原和包裹疫苗抗原的脂质体，其特征在于，所述脂质体采用甘露糖基化的阳离子脂质体复合物，包括按比例混合的阳离子脂、中性磷脂和甘露糖苷，阳离子脂和中性磷脂的摩尔比为191至218，甘露糖苷与包括阳离子脂和中性磷脂的脂质体的摩尔比为298至2080。14根据权利要求13所述的纳米疫苗，其特征在于，所述阳离子脂是带有正电荷两性分子，包括带有正电荷的头部和疏水尾部，带正电荷的极性头部含有氨基、季铵盐及多胺等胺类基团，而疏水尾部包括饱和或不饱和脂肪酸链或胆固醇环。15根据权利。
8、要求14所述的纳米疫苗，其特征在于，所述阳离阳离子脂包括双十烷基二甲基溴化铵、二油酰三甲基铵丙烷、二油酰丙基氯化三甲铵、二甲氨基乙基氨甲酰基胆固醇和二油酰磷脂酰胆碱醚中的一种或多种的组合。16根据权利要求13至15中任一项所述的纳米疫苗，其特征在于，所述中性磷脂是两性分子，包括磷酸相连的含氨碱或醇类取代基团构成的亲水头和脂肪酸链构成的疏水尾，表面静电荷基本接近0。17根据权利要求16所述的纳米疫苗，其特征在于，所述中性磷脂包括二油酰磷脂酰胆碱、二豆蔻酰磷脂酰胆碱、二亚油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种。
9、或多种的组合。18根据权利要求16所述的纳米疫苗，其特征在于，所述甘露糖苷包括甲基D甘露糖苷、4硝基苯基D吡喃甘露糖苷、4甲基伞形酮基D吡喃甘露糖苷和4氨基苯基D甘露糖苷中的一种或多种的组合。19根据权利要求16所述的纳米疫苗，其特征在于，所述抗原为各类蛋白、多肽、多糖、DNA或RNA，所述抗原来自于病毒、细菌、其他微生物、肿瘤或基因工程蛋白产物。20根据权利要求13所述的纳米疫苗的制备方法，包括如下步骤取阳离子脂、中性磷脂和甘露糖苷分别溶于氯仿甲醇，然后按比例混合后置于容器中；将容器中的混合物吹干成一层均匀的薄膜，而后进行真空干燥处理；加入含有抗原的缓冲液，然后进行水化处理及水浴超声处理，挤。
10、压过聚碳酸酯膜，放置备用。21根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述氯仿甲醇中氯仿和甲醇的体积比为21。22根据权利要求20的方法，其特征在于，所述容器中的混合物用稳定的氮气流旋转吹干。23根据权利要求20的方法，其特征在于，真空干燥处理是在真空干燥箱中真空干燥过夜，第二天加入含有抗原的PBS缓冲液。24根据权利要求20的方法，其特征在于，加入含有抗原的磷酸盐缓冲液后，放置于4水化12小时，水浴超声10分钟，挤压过聚碳酸酯膜两次，4放置备用。权利要求书CN102068698ACN102068700A1/6页4纳米疫苗及其制备方法【技术领域】0001本发明涉及一种疫苗及其制备方法，特别涉及。
11、一种采用脂质体作为载体的疫苗及其制备方法。0002本发明又涉及一种疫苗载体。0003本发明还涉及一种可应用于疫苗载体的脂质体复合物。【背景技术】0004疫苗是预防和控制传染性疾病发生及发展的重要手段。免疫佐剂又称非特异性免疫增生剂则是疫苗中不可或缺的组成成分，能够有效地促进疫苗诱导的特异性免疫反应。随着疫苗研究的飞速发展，新型的基因工程疫苗正被广泛用于疫苗的研制开发。这种疫苗具有纯度高、特异性强等优点，但是由于其分子小，免疫原性相对较差，迫切需要结合有效的免疫佐剂，以提高疫苗的免疫效力。过去的数十年来，人们在研究中发现和研制了各种新型的免疫佐剂，然而潜在的安全性及稳定性等因素大大制约了免疫佐剂。
12、的推广使用。0005脂质体纳米颗粒是由磷脂双层壳包裹水相核心形成的球形的实体，其结构类似生物膜，是一种生物相容性好且无毒的纳米材料。它可包封水溶性和脂溶性药物，具有减少药物剂量、缓释、及靶向性释放药物等优点，因而被广泛用于纳米抗肿瘤药物的开发。此外，纳米脂质体也是一种优良的抗原载体，不仅能够包裹一系列理化性质不同的抗原及免疫佐剂，保护蛋白多肽抗原不被降解，还可以促进抗原呈递细胞对抗原的吞噬及呈递，提高机体的特异性免疫反应。基于以上这些优点，脂质体纳米颗粒作为一种新型的疫苗载体，正逐渐用于细菌疫苗、病毒疫苗、抗寄生虫疫苗以及抗肿瘤疫苗等研制开发。0006目前最常用的脂质体蛋白疫苗载体是以中性磷脂。
13、和胆固醇为主要成分。这类中性脂质体纳米颗粒虽是一种优良的蛋白载体，却并不能直接促进免疫反应。此外，未经修饰的脂质体靶向性差，不能有效地被抗原呈递细胞如树突状细胞及单核巨噬细胞摄取。0007现有的脂质体疫苗多采用中性脂质体为载体，然而由于中性脂质体本身不能直接促进免疫反应且靶向性差，因此制约了疫苗的免疫效率。采用阳离子脂质取代中性磷脂虽能够促进免疫反应和抗原呈递细胞靶向性，过高的表面电荷却使其具有明显的细胞毒性。0008综上所述，现有的脂质体应用于疫苗载体，有所缺失，难于满足需求。【发明内容】0009有鉴于此，有必要针对现有脂质体疫苗载体的缺陷，提出一种新的甘露糖基化的阳离子脂质体复合物，可以作。
14、为疫苗载体及应用于疫苗，这种新的脂质体复合物在阳离子脂质中掺入中性磷脂和甘露糖，不但提高了脂质体的免疫佐剂作用和抗原呈递细胞靶向性，而且明显减低其细胞毒作用，提供了一种高效无副作用的新型疫苗载体和佐剂，能显著增强疫苗的免疫效果。0010为了实现上述的发明目的，本发明的技术方案如下0011本发明提供了一种甘露糖基化的阳离子脂质体复合物，包括按比例混合的阳离子说明书CN102068698ACN102068700A2/6页5脂、中性磷脂和甘露糖苷，阳离子脂和中性磷脂的摩尔比为191至218，甘露糖苷与包括阳离子脂和中性磷脂的脂质体的摩尔比为298至2080。0012优选地，阳离子脂是是带有正电荷两性。
15、分子，包括带有正电荷的头部和疏水尾部，带正电荷的极性头部含有氨基、季铵盐及多胺等胺类基团，而疏水尾部包括饱和或不饱和脂肪酸链或胆固醇环。0013优选地，阳离子脂包括双十烷基二甲基溴化铵DIDECYLDIMETHYLAMMONIUMBROMIDE，简称DDAB、二油酰三甲基铵丙烷IOLEOYLTRIMETHYLAMMONIUMPROPANE，简称DOTAP、二油酰丙基氯化三甲铵DIOLEOYLPROPYLTRIMETHYLAMMONIUM，简称DOTMA、二甲氨基乙基氨甲酰基胆固醇3NN，NDIMETHYLAMINOETHANECARBAMOYLCHOLESTEROL，简称DCCHOL和二油酰磷。
16、脂酰胆碱醚DIOLEYLETHERPHOSPHATIDYLCHOLINE，简称DOEPC中的一种或多种的组合。0014优选地，中性磷脂是两性分子，包括磷酸相连的取代基团含氨碱或醇类构成的亲水头和脂肪酸链构成的疏水尾，表面静电荷基本接近0。0015优选地，中性磷脂包括二油酰磷脂酰胆碱DIOLEOYLPHATIDYLCHOLINE，简称DOPC、二豆蔻酰磷脂酰胆碱DIMYRISTOYLPHOSPHATIDYLCHOLINE，简称DMPC、二亚油酰磷脂酰胆碱DILINOLEOYLPHOSPHATIDYLCHOLINE，简称DLPC、二棕榈酰磷脂酰胆碱DIPALMITOYLPHOSPHATIDYLCH。
17、OLINE，简称DPPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱DISTEAROYLPHOSPHATIDYLCHOLINE，简称DSPC、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺DIMYRISTOYLPHOSPHATIDYLETHANOLAMINE，DMPE、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DIPALMITOYLPHOSPHATIDYLETHANOLAMINE，简称DPPE和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺DISTEAROYLPHOSPHATIDYLETHANOLAMINE，简称DSPE中的一种或多种的组合。0016优选地，甘露糖苷包括甲基D甘露糖苷METHYLDMANNOPYRANOSIDE、4硝基苯基D吡喃甘露糖苷4NITROPHENYLDMANNOP。
18、YRANOSIDE、4甲基伞形酮基D吡喃甘露糖苷4METHYLUMBELLIFERYLDMANNOPYRANOSIDE和4氨基苯基D甘露糖苷4AMINOPHENYLDMANNOPYRANOSIDE中的一种或多种的组合。0017本发明又提供了一种具有免疫佐剂功效的疫苗载体，包裹疫苗抗原，疫苗载体为甘露糖基化的阳离子脂质体复合物，包括按比例混合的阳离子脂、中性磷脂和甘露糖苷，阳离子脂和中性磷脂的摩尔比为191至218，甘露糖苷与包括阳离子脂和中性磷脂的脂质体的摩尔比为298至2080。0018优选地，阳离子脂是是带有正电荷两性分子，包括带有正电荷的头部和疏水尾部，带正电荷的极性头部含有氨基、季铵盐。
19、及多胺等胺类基团，而疏水尾部包括饱和或不饱和脂肪酸链或胆固醇环。0019优选地，阳离子脂包括DDAB、DOTAP、DODAP、DOTMA和DOEPC中的一种或多种的组合。0020优选地，中性磷脂是两性分子，包括磷酸相连的取代基团含氨碱或醇类构成的亲水头和脂肪酸链构成的疏水尾，表面静电荷基本接近0。0021优选地，中性磷脂包括DOPC、DMPC、DLPC、DPPC、DSPC、DMPE、DPPE和DSPE中的一种或多种的组合。0022优选地，甘露糖苷包括甲基D甘露糖苷、4硝基苯基D吡喃甘露糖苷、说明书CN102068698ACN102068700A3/6页64甲基伞形酮基D吡喃甘露糖苷和4氨基苯基。
20、D甘露糖苷中的一种或多种的组合。0023本发明再提供了一种纳米疫苗，包括疫苗抗原和包裹疫苗抗原的脂质体，脂质体采用甘露糖基化的阳离子脂质体复合物，包括按比例混合的阳离子脂、中性磷脂和甘露糖苷，阳离子脂和中性磷脂的摩尔比为191至218，甘露糖苷与包括阳离子脂和中性磷脂的脂质体的摩尔比为298至2080。0024优选地，阳离子脂是是带有正电荷两性分子，包括带有正电荷的头部和疏水尾部，带正电荷的极性头部含有氨基、季铵盐及多胺等胺类基团，而疏水尾部包括饱和或不饱和脂肪酸链或胆固醇环。0025优选地，阳离子脂包括DDAB、DOTAP、DODAP、DOTMA和DOEPC中的一种或多种的组合。0026优选。
21、地，所述中性磷脂是两性分子，包括磷酸相连的取代基团含氨碱或醇类构成的亲水头和脂肪酸链构成的疏水尾，表面静电荷基本接近0。0027优选地，中性磷脂包括DOPC、DMPC、DLPC、DPPC、DSPC、DMPE、DPPE和DSPE中的一种或多种的组合。0028优选地，甘露糖苷包括甲基D甘露糖苷、4硝基苯基D吡喃甘露糖苷、4甲基伞形酮基D吡喃甘露糖苷和4氨基苯基D甘露糖苷中的一种或多种的组合。0029优选地，抗原为各类蛋白、多肽、多糖、DNA或RNA，所述抗原来自于病毒、细菌、其他微生物、肿瘤或基因工程蛋白产物。0030优选地，疫苗的免疫方式为皮下注射或肌肉注射。0031本发明还提供了一种具有免疫佐。
22、剂功效的疫苗载体的制造方法，包括如下步骤取阳离子脂、中性磷脂和甘露糖苷分别溶于氯仿甲醇，然后按比例混合后置于容器中；将容器中的混合物吹干成一层均匀的薄膜，而后进行真空干燥处理；加入含有抗原的缓冲液，然后进行水化处理及水浴超声处理，挤压过聚碳酸酯膜，冷藏放置备用。0032优选地，氯仿甲醇中氯仿和甲醇的体积比为21。0033优选地，容器中的混合物用稳定的氮气流旋转吹干。0034优选地，真空干燥处理是在真空干燥箱中真空干燥过夜，第二天加入含有抗原的缓冲液。0035优选地，加入含有抗原的磷酸盐PHOSPHATEBUFFEREDSALINE，简称PBS缓冲液后，放置于4水化12小时，水浴超声10分钟，挤。
23、压过聚碳酸酯膜两次，4放置备用。0036由于采用上述的技术方案，本发明的有益效果如下0037本发明的甘露糖基化的阳离子脂质体复合物在阳离子脂中添加一定比例的中性磷脂和甘露糖，合成表面携带正电荷和甘露糖基的阳离子脂质体复合物，不但大大提高了脂质体靶向抗原呈递细胞的能力，而且显著增强了脂质体的免疫佐剂作用。与传统的中性脂质体相比，在功能上有了很大的改善，本发明的阳离子脂质体复合物不但具有强大的免疫佐剂功效，还能更加有效地促进免疫细胞对抗原的摄取呈递，促进疫苗的免疫效果。此外掺入一定比例中性磷脂成份还能明显减低阳离子脂的细胞毒作用，使疫苗更加安全。0038本发明的甘露糖基化的阳离子脂质体复合物应用于。
24、疫苗载体，可以同时包裹一种说明书CN102068698ACN102068700A4/6页7或多种抗原，不仅可以促进抗原的靶向传递，而且显著提高抗原诱导的免疫反应，增强疫苗的免疫效力，且安全无毒副作用。0039本发明的疫苗以一种新型的甘露糖基化阳离子脂质体复合物作为疫苗载体，提高疫苗的免疫效力，构建安全高效的纳米疫苗。【附图说明】0040为更进一步了解本发明的特征及技术内容，请参阅以下有关本发明的附图，然而所附图式仅提供参考与说明用，并非用来对本发明加以限制。0041图1是本发明的以甘露糖基化的阳离子脂质体复合物为载体的纳米疫苗的结构示意图；0042图2是本发明的纳米疫苗的制备方法的流程图；00。
25、43图3是本发明的阳离子脂质体复合物诱导单核细胞活化并表达CD86分子对比图；0044图4是本发明的阳离子脂质体复合物诱导树突状细胞表达CD83对比图；0045图5是本发明的阳离子脂质体复合物促进巨噬细胞对抗原BSAFITC的摄取对比图；0046图6是阳离子脂质体复合物对单核细胞存活率的影响对比图。【具体实施方式】0047下面结合附图，通过对本发明的具体实施方式详细描述，将使本发明的技术方案及其他有益效果显而易见。0048实施例1甘露糖基化的阳离子脂质体复合物0049本发明提出采用甘露糖基化的阳离子脂质体复合物作为新型疫苗载体，构建安全高效的纳米疫苗。0050甘露糖基化的阳离子脂质体复合物的结。
26、构参见图1，包括按比例混合的阳离子脂、中性磷脂和甘露糖苷，阳离子脂和中性磷脂的摩尔比为191至218，甘露糖苷与包括阳离子脂和中性磷脂的脂质体的摩尔比为298至2080。0051阳离子脂是带有正电荷两性分子，包括带有正电荷的头部和疏水尾部，带正电荷的极性头部含有氨基、季铵盐及多胺等胺类基团，而疏水尾部包括饱和或不饱和脂肪酸链或胆固醇环，分子的主链是甘油，甘油的第二个羟基为带正电荷的季铵盐，另两个羟基被饱和或不饱和脂肪酸酯化；阳离子脂包括DDAB、DOTAP、DODAP、DOTMA和DOEPC中的一种或多种的组合。0052中性磷脂是两性分子，包括磷酸相连的取代基团含氨碱或醇类构成的亲水头和脂肪酸。
27、链构成的疏水尾，表面静电荷基本接近0，分子的主链是甘油，甘油的第三个羟基被磷酸酯化，另外两个羟基被饱和或不饱和脂肪酸酯化，磷酸基团又与胆碱或胆胺基团相连；中性磷脂包括DOPC、DMPC、DLPC、DPPC、DSPC、DMPE、DPPE和DSPE中的一种或多种的组合。0053甘露糖苷包括甲基D甘露糖苷、4硝基苯基D吡喃甘露糖苷、4甲基伞形酮基D吡喃甘露糖苷和4氨基苯基D甘露糖苷中的一种或多种的组合。说明书CN102068698ACN102068700A5/6页80054实施例2具有免疫佐剂功效的疫苗载体0055本发明的具有免疫佐剂功效的疫苗载体包裹疫苗抗原，疫苗载体为甘露糖基化的阳离子脂质体复合。
28、物。0056甘露糖基化的阳离子脂质体复合物的结构参见图1，包括按比例混合的阳离子脂、中性磷脂和甘露糖苷，阳离子脂和中性磷脂的摩尔比为191至218，甘露糖苷与包括阳离子脂和中性磷脂的脂质体的摩尔比为298至2080。阳离子脂是带有正电荷两性分子，包括带有正电荷的头部和疏水尾部，带正电荷的极性头部含有氨基、季铵盐及多胺等胺类基团，而疏水尾部包括饱和或不饱和脂肪酸链或胆固醇环，是表面携带正电荷的两性分子，分子的主链是甘油，甘油的第二个羟基为带正电荷的季铵盐，另两个羟基被饱和或不饱和脂肪酸酯化；阳离子脂包括DDAB、DOTAP、DODAP、DOTMA和DOEPC中的一种或多种的组合。中性磷脂是两性分。
29、子，包括磷酸相连的取代基团含氨碱或醇类构成的亲水头和脂肪酸链构成的疏水尾，表面静电荷基本接近0，分子的主链是甘油，甘油的第三个羟基被磷酸酯化，另外两个羟基被饱和或不饱和脂肪酸酯化，磷酸基团又与胆碱或胆胺基团相连；中性磷脂包括DOPC、DMPC、DLPC、DPPC、DSPC、DMPE、DPPE和DSPE中的一种或多种的组合。甘露糖苷包括甲基D甘露糖苷、4硝基苯基D吡喃甘露糖苷、4甲基伞形酮基D吡喃甘露糖苷和4氨基苯基D甘露糖苷中的一种或多种的组合。0057实施例3纳米疫苗0058本发明的纳米疫苗，包括疫苗抗原和包裹疫苗抗原的脂质体，脂质体采用甘露糖基化的阳离子脂质体复合物，抗原为各类蛋白、多肽、。
30、多糖、DNA或RNA，抗原来自于病毒、细菌、其他微生物、肿瘤或基因工程蛋白产物。0059甘露糖基化的阳离子脂质体复合物的结构参见图1，包括按比例混合的阳离子脂、中性磷脂和甘露糖苷，阳离子脂和中性磷脂的摩尔比为191至218，甘露糖苷与包括阳离子脂和中性磷脂的脂质体的摩尔比为298至2080。阳离子脂是带有正电荷两性分子，包括带有正电荷的头部和疏水尾部，带正电荷的极性头部含有氨基、季铵盐及多胺等胺类基团，而疏水尾部包括饱和或不饱和脂肪酸链或胆固醇环，是表面携带正电荷的两性分子，分子的主链是甘油，甘油的第二个羟基为带正电荷的季铵盐，另两个羟基被饱和或不饱和脂肪酸酯化；阳离子脂包括DDAB、DOTA。
31、P、DODAP、DOTMA和DOEPC中的一种或多种的组合。中性磷脂是两性分子，包括磷酸相连的取代基团含氨碱或醇类构成的亲水头和脂肪酸链构成的疏水尾，表面静电荷基本接近0，分子主链是甘油，甘油的第三个羟基被磷酸酯化，另外两个羟基被饱和或不饱和脂肪酸酯化，磷酸基团又与胆碱或胆胺基团相连；中性磷脂包括DOPC、DMPC、DLPC、DPPC、DSPC、DMPE、DPPE和DSPE中的一种或多种的组合。甘露糖苷包括甲基D甘露糖苷、4硝基苯基D吡喃甘露糖苷、4甲基伞形酮基D吡喃甘露糖苷和4氨基苯基D甘露糖苷中的一种或多种的组合。0060这种基于阳离子脂质体复合物的疫苗可以采用皮下注射和肌肉注射等方法对机。
32、体进行免疫。0061实施例4纳米疫苗的制备方法0062参见图2，采用具体制备方法如下0063称取一定量的阳离子脂、中性磷脂和甘露糖苷分别溶于氯仿甲醇21，然后按一定比例混合，置于圆底烧瓶中。用稳定的氮气流旋转吹干，使之成一层均匀的薄膜，而说明书CN102068698ACN102068700A6/6页9后置于真空干燥箱中真空干燥过夜。第二天加入含有抗原的PBS缓冲液，放置于4水化12小时。后经水浴超声10分钟，挤压过聚碳酸酯膜两次，4放置备用。0064实验显示，阳离子脂质体复合物可以显著诱导单核细胞表达CD86一种共刺激分子，提示该复合物促进单核细胞的活化，而中性脂质体对单核细胞活性无明显影响，。
33、参见图3，图中示出本发明的三种实施例，即阳离子脂和中性磷脂的摩尔比分别是191、1010和218时的实验数据与对照数据的对比。0065阳离子脂质体复合物也显著诱导树突状细胞表达CD83，提示该复合物促进树突状细胞的成熟，参见图4。0066此外，阳离子脂质体复合物为抗原BSAFITC的载体，显著提高了抗原呈递细胞小鼠巨噬细胞对抗原的摄取，参见图5，图中示出本发明的三种实施例，即阳离子脂和中性磷脂的摩尔比分别是191、1010和218时的实验数据与对照数据的对比。与游离抗原相比，阳离子脂质体复合物提高巨噬细胞对抗原的吞噬率高达10倍以上，这一结果显示阳离子脂质体复合物是一种高效的抗原载体。0067。
34、图6的结果显示单纯使用阳离子脂明显降低单核细胞的存活率，提示其具有一定的细胞毒性，图中示出本发明的三种实施例，即阳离子脂和中性磷脂的摩尔比分别是191、1010和218时的实验数据与对照数据的对比。而在阳离子脂中掺入中性磷脂制成阳离子脂质体复合物则大大减轻阳离子脂的细胞毒作用，对单核细胞的存活率无明显影响。0068本发明的甘露糖基化的阳离子脂质体复合物不但可以作为疫苗载体，还可以作为免疫佐剂的载体，提高佐剂的免疫促进作用，减少佐剂带来的副作用。本发明的甘露糖基化的阳离子脂质体复合物不仅可以包裹抗原，还可以联合包裹其他佐剂，以进一步提高疫苗的免疫效果。0069可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。说明书CN102068698ACN102068700A1/3页10图1图2说明书附图CN102068698ACN102068700A2/3页11图3图4说明书附图CN102068698ACN102068700A3/3页12图5图6说明书附图CN102068698A。