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1、(10)授权公告号 CN 101797220 B (45)授权公告日 2011.12.07 CN 101797220 B *CN101797220B* (21)申请号 201010141124.3 (22)申请日 2010.04.06 A61K 9/00(2006.01) A61K 47/48(2006.01) A61K 47/36(2006.01) A61K 31/282(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (73)专利权人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38 号 (72)发明人 胡富强 杜永忠 袁弘 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有。
2、限公 司 33200 代理人 张法高 CN 1883708 A,2006.12.27, 权利要求 1-6. CN 101066461 A,2007.11.07, 实施例 1. Horacio Cabral et al.Optimization of (1,2-diamino-cyclohexane) platinum(II)-loaded polymeric micelles directed to improved tumor targeting and enhanced antitumor activity.Journal of Controlled Release .2007, 第 12。
3、1 卷第 149 页 第 2.4 栏， 第 152 页第 3.3 栏至第 153 页第 4 栏 . (54) 发明名称 奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束及应用 (57) 摘要 本发明提供一种奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂酸 嫁接物胶束， 由 0.5壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物、 0.009-0.02奥沙利铂、 0-0.2卵磷脂和水所组 成。通过 (1) 探头超声法 (2) 薄膜分散法， (3) 卵 磷脂介导薄膜分散法分别制备获得。壳聚糖 - 硬 脂酸嫁接物胶束具有聚合物胶束体内的被动靶向 和肿瘤细胞的快速摄取功能， 通过壳聚糖 - 硬脂 酸嫁接物胶束对奥沙利铂的包封， 可大大提高分 子靶标位于肿瘤细。
4、胞内的奥沙利铂的细胞内药物 浓度， 提高细胞毒性并逆转多药耐药， 提高奥沙利 铂的临床抗肿瘤效力。可在制备抗肿瘤药物中的 应用。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张朝磊 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 2 页 CN 101797220 B1/1 页 2 1. 一种奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束， 其特征在于， 由壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物、 奥沙利铂、 卵磷脂和水所组成， 其中壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物占总重量的 0.5、 奥沙利铂占 总重量的 0.009-0.02、 卵磷脂占总重量的 0-0.2、 水占总重。
5、量的 99.27-99.49， 各组 分含量之和为百分之百 ； 壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物由平均分子量 1.5kD 51kD 的低分子量 壳聚糖， 与硬脂酸化学嫁接形成， 壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物中壳寡糖的氨基取代度为 1 50； 所述的一种奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束的制备方法是， 先获得壳聚糖 - 硬脂 酸嫁接物， 再通过三种方法分别制备奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束 ： (1) 壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物制备 ： 取壳聚糖 0.5g， 精密称量， 加 30mL 去离子水 80下 搅拌溶解， 称取硬脂酸 0.825g 和碳二亚胺 5.5g， 搅拌溶解溶于 17mL 无水乙醇溶液中。
6、， 加热 至 80， 在 400rpm 磁力搅拌条件下将上述乙醇溶液加入壳聚糖溶液中， 80恒温搅拌反应 4 小时， 冷却至室温， 将终反应液置透析袋中， 蒸馏水透析 3 天， 透析液冷冻干燥后， 以无水 乙醇洗涤去除残留的硬脂酸， 得壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物 ； (2) 奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束制备 ： A. 探头超声法 取 25mg 壳寡糖 - 硬脂酸嫁接物， 加入 5mL 去离子水， 冰浴探头 400w 超声 10 次， 得 5mg/ mL的胶束溶液， 加入0.5mL药物浓度为5mg/mL的奥沙利铂水溶液， 冰浴条件下探头400W超 声 50 次， 得奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂。
7、酸嫁接物胶束溶液 ； B. 薄膜分散法 取 25mg 壳寡糖 - 硬脂酸嫁接物， 精密称定， 加入 0.5mL 药物浓度为 5mg/mL 的奥沙利铂 水溶液中， 水浴超声溶解后加入 0.75mL 无水乙醇溶液， 45下旋转蒸发除去溶剂， 得到载 药胶束薄膜， 将其用 5mL 去离子水分散， 得奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束溶液 ； C. 卵磷脂介导薄膜分散法 取 25mg 壳寡糖 - 硬脂酸嫁接物， 精密称定， 加入 0.5mL 药物浓度为 5mg/mL 的奥沙利铂 水溶液中， 水浴超声溶解后加入浓度为 10mg/mL 的卵磷脂乙醇溶液 0.75mL， 45下旋转蒸 发除去溶剂， 得到载。
8、药胶束薄膜， 将其用 5mL 去离子水分散， 得奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂酸嫁 接物胶束溶液。 2. 根据权利要求 1 所述的一种奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束在制备抗乳腺癌、 肝癌、 卵巢癌、 白血病的药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 101797220 B1/7 页 3 奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束及应用 技术领域 0001 本发明属奥沙利铂靶向制剂的制备与应用， 具体涉及奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂酸嫁 接物胶束的制备及其应用。 背景技术 0002 化学疗法是目前治疗癌症的一种重要手段。 然而大多数化学治疗药物都缺乏体内 特异的生物分布， 由此导致对正常的细胞及器官造成毒。
9、副作用， 从而使它们的临床应用受 到限制。此外， 肿瘤细胞对药物的耐药性以及多药耐药性也成为导致肿瘤化疗失败的一个 很重要的因素。 0003 铂类药物是一种具有光谱抗癌活性的化疗药物， 也被称为 DNA 烷化剂。奥沙利铂 是第三代铂类抗肿瘤药物， 它通过使DNA交叉连接及抑制DNA合成达到杀死癌细胞的目的。 然而奥沙利铂本身缺乏对肿瘤组织的靶向性， 在肿瘤组织中的药物分布量很少， 而且与红 细胞之间的有高度隔离， 使得其治疗效力大大降低， 同时也导致了高发性的药物毒副反应 如末梢的感觉神经病变以及血小板减少症等， 从而限制了奥沙利铂的临床应用。此外， 在 治疗过程中肿瘤组织对奥沙利铂耐受性的产。
10、生也成为导致其化疗失败的一个主要原因。 因 此， 开发具有靶向性的新型药物传递系统就显得尤为重要。 过去十几年里已有关于脂质体、 纳米颗粒等作为药物载体的报导， 值得一提的是近年来新发展起来的聚合物胶束， 被认为 是一种具有很大潜力的新型药物载体。 0004 聚合物胶团 (polymeric micelles， PMs) 由两亲性的聚合物在水性环境中自发 形成， 它以疏水性嵌段作为内核， 亲水性嵌段作为外壳， 具有独特的核 - 壳结构。其内核可 为难溶性药物提供储库， 亲水性外壳可使得它在水性环境中很好地分散， 并可对其进行理 化性质修饰从而得到我们所期望的特性。聚合物胶束由于其疏水性表面以及。
11、较小的粒径 (10-100nm)， 可以逃避单核巨噬细胞的吞噬。 聚合物胶团自身可通过 “增强的渗透及滞留效 应” (enhanced permeabilityand retention effect) 即 EPR 效应实现被动靶向， 将药物聚 集到肿瘤组织。聚合物胶团还可以通过配体修饰， 实现对肿瘤组织的主动靶向。目前， 已有 将聚合物胶束作为奥沙利铂药物载体的报道。Cabral 等制备了聚乙二醇和聚谷氨酸的嵌 段共聚物 PEG-b-P(Glu)， 用其包裹奥沙利铂得到的载药胶团， 其体内抗肿瘤活性结果显 示， 与游离药物相比， 该载药胶团大大提高了药物的抗肿瘤活性， 并且具有很好的对肿瘤组。
12、 织的分布， 其在肿瘤组织中的药物浓度与游离药物相比提高了 20 倍。由于奥沙利铂具有一 定的水溶性， 用聚合物胶束进行包裹还存在一些困难， 关于这方面的报道并不是很多。 0005 壳聚糖是一种具有低毒、 高生物相容性、 可体内降解的阳离子型载体材料。 将硬脂 酸 (stearic acid， SA) 嫁接到壳聚糖 (chitosan， CSO) 的主链上， 得到两亲性壳聚糖 - 硬脂 酸嫁接物 (stearic acid-grafted chitosan oligosaccharide， CSO-SA)。研究发现壳聚 糖 - 硬脂酸嫁接物可在水性介质中通过自聚集形成胶束， 并具有快速细胞摄取。
13、的功能。本 发明采用壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束包封第三代铂类抗肿瘤药物奥沙利铂， 制备奥沙利铂 壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束细胞内给药制剂， 通过提高肿瘤细胞内的药物浓度， 提高细胞 说 明 书 CN 101797220 B2/7 页 4 毒性并逆转多药耐药， 为提高奥沙利铂的临床抗肿瘤效力提供可能。 发明内容 0006 本发明的一个目的是提供一种奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束， 是为分子靶 标位于细胞内的奥沙利铂， 提供一种靶向给药载体材料， 由壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物、 奥沙利 铂、 卵磷脂和水所组成， 其中壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物占总重量的 0.5、 奥沙利铂占总重量 的 0.0。
14、09-0.02、 卵磷脂占总重量的 0-0.2、 水占总重量的 99.27-99.49 ； 壳聚糖 - 硬 脂酸嫁接物由平均分子量1.5kD51kD的低分子量壳聚糖， 与C10C22的脂肪酸化学嫁接 形成， 壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物中壳寡糖的氨基取代度为 1 50。当壳聚糖 - 硬脂酸嫁 接物浓度超过临界胶束浓度时， 在水性介质中可自发形成嫁接物胶束， 胶束具备被细胞快 速摄取的功能。本发明的嫁接物胶束的组成已为专利 “表面修饰疏水改性壳寡糖聚合物给 药胶团及其制备方法” ( 专利号 ： ZL200610051601.0) 所涵盖。 0007 本发明的奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束通过以。
15、下制备方法获得 ： 0008 首先采用专利号 ： ZL200610051601.0 的方法合成壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物 ： 取壳 聚糖 0.5g， 精密称量， 加 30mL 去离子水 80下搅拌溶解， 称取硬脂酸 0.825g 和碳二亚胺 (EDC)5.5g， 搅拌溶解溶于 17mL 无水乙醇溶液中， 加热至 80。在 400rpm 磁力搅拌条件下 将上述乙醇溶液加入壳聚糖溶液中， 80恒温搅拌反应4小时， 冷却至室温(25)， 将终反 应液置透析袋中， 蒸馏水透析 3 天。透析液冷冻干燥后， 以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂 酸， 得壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物。然后通过下述三种方法分别制备奥沙利铂。
16、壳聚糖 - 硬脂酸 嫁接物胶束 ： 0009 (1) 探头超声法 ： 取 25mg 壳寡糖 - 硬脂酸嫁接物， 精密称定， 加入 5mL 去离子水， 冰浴探头超声 10 次 (400w， 工作 2s 停 3s)， 得 5mg/mL 的胶束溶液。加入 0.5mL 药物浓度为 5mg/mL 的奥沙利铂水溶液。冰浴条件下探头超声 50 次 (400W， 工作 2s 停 3s)， 得奥沙利铂 壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束溶液。 0010 (2) 薄膜分散法 ： 取 25mg 壳寡糖 - 硬脂酸嫁接物， 精密称定， 加入 0.5mL 药物浓度 为 5mg/mL 的奥沙利铂水溶液中， 水浴探头超声 ( 同。
17、 a) 溶解后加入 0.75mL 无水乙醇溶液。 45下旋转蒸发除去溶剂， 得到载药胶束薄膜， 将其用 5mL 去离子水分散， 得奥沙利铂壳聚 糖 - 硬脂酸嫁接物胶束溶液。 0011 (3) 卵磷脂介导薄膜分散法 ： 取 25mg 壳寡糖 - 硬脂酸嫁接物， 精密称定， 加入 0.5mL 药物浓度为 5mg/mL 的奥沙利铂水溶液中， 水浴超声溶解后加入溶度为 10mg/mL 的卵 磷脂乙醇溶液0.75mL。 45下旋转蒸发除去溶剂， 得到载药胶束薄膜， 将其用5mL去离子水 分散， 得奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束溶液。 0012 本发明的另一个目的是提供奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂酸嫁。
18、接物胶束在制备抗肿瘤 药物中的应用。尤其在在制备抗乳腺癌、 大肠癌、 肝癌、 卵巢癌、 白血病药物中的应用。与奥 沙利铂溶液剂相比， 通过奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束给药， 可显著提高肿瘤细胞 内的药物浓度， 提高细胞毒性并逆转多药耐药。 0013 本发明的有益之处是 ： 壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束具有聚合物胶束体内的被动靶 向和肿瘤细胞的快速摄取功能， 通过壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束对奥沙利铂的包封， 可大 大提高分子靶标位于肿瘤细胞内的奥沙利铂的细胞内药物浓度， 提高细胞毒性并逆转多药 说 明 书 CN 101797220 B3/7 页 5 耐药， 为提高奥沙利铂的临床抗肿瘤效。
19、力提供可能。 0014 附图表说明 0015 图 1 为奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束对不同肿瘤细胞的生长抑制曲线。 0016 图 2 为敏感和耐药肿瘤细胞内药物浓度的经时变化。 具体实施方式 0017 本发明结合附图和实施例作进一步的说明。 0018 实施例一 0019 1) 低分子量壳聚糖的制备 0020 取市售分子量为450kDa的壳聚糖(脱乙酰度为95)90g， 加至3000mL1.25(v/ v) 的盐酸水溶液中， 55 60温度条件下， 溶涨 2 小时后， 加入 5的纤维素酶 (w/w)， 在 55 60温度条件下进行降解。控制反应温度和时间， 得低分子量壳聚糖。所得降解反应。
20、 液， 使用 50Kda 和 10Kda 超滤膜 (Biomax-10， Millipore Co.， USA) 超滤分级后， 取分子量 1050Kda超滤液冷冻干燥。 凝胶渗透色谱法测定壳聚糖分子量， 采用TSK-gel G3000SW色 谱柱， 0.1mol/L醋酸钠(pH6.0)为流动相， 以分子量0.73， 5.9， 11.8， 47.3， 212.0， 788.0Kda 的葡聚糖标样制备洗脱曲线， 用该洗脱曲线计算壳聚糖分子量。经测定所得壳聚糖的重均 分子量为 18.0kDa。 0021 2) 壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物合成 0022 取上述壳聚糖 0.5g， 精密称量， 加 30mL。
21、 去离子水 80下搅拌溶解， 称取硬脂酸 0.825g 和碳二亚胺 (EDC)5.5g， 搅拌溶解溶于 17mL 无水乙醇溶液中， 加热至 80。在 400rpm 磁力搅拌条件下将上述乙醇溶液加入壳聚糖溶液中， 80恒温搅拌反应 4 小时， 冷 却至室温 (25 )， 将终反应液置透析袋中， 蒸馏水透析 3 天。透析液冷冻干燥后， 以无水乙 醇洗涤去除残留的硬脂酸， 得壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物。 0023 采用 2， 4， 6- 三硝基苯磺酸 (2， 4， 6-trinitrobenzenesulfonic acid， TNBS) 法测 定壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物的氨基取代度 (substit。
22、ution degree， SD)。取同分子量的壳聚 糖 10mg， 置于 10ml 的容量瓶中， 用去离子水定容， 即得到 1mg/ml 的壳聚糖储备液， 分别取 0、 10、 50、 100、 200、 300、 400、 500l， 用去离子水定容至 2.0ml， 加入 4碳酸氢纳 2.0ml 和 0.1三硝基苯磺酸2.0ml， 于37水浴孵育2h。 加入2.0mol/L盐酸2ml， 摇匀， 超声赶走气 泡， 利用紫外分光光度计在 344nm 处测定吸光度， 制备标准曲线。另精密称定嫁接物 10mg， 置于 10ml 容量瓶中， 去离子水定容。取 300l， 同法操作， 测定 344nm。
23、 处的吸光度， 按标准 曲线计算聚合物的氨基取代度为 6.89 0024 采用芘荧光法测定壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物的临界胶束浓度。取 0.0012mg/ml 芘的 丙酮溶液 0.5ml 放入 10ml 的试管中， 50下挥干丙酮。配制 0.001mg/ml 1mg/ml 不同浓 度的嫁接物溶液， 分别取 5ml 加入到上述试管中 ( 芘终浓度为 710-7mol/L)， 室温水浴超 声30min。 扫描芘的激发光谱和发射光谱， 测定在374nm和385nm荧光强度， 并以测定I375/ I385 倾斜率的突然变化确定该嫁接物的临界胶束浓度为 0.119mg/mL。 0025 采用微粒粒度及表面。
24、电位分析仪， 测定壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束的粒径和表面 电位。经测定， 1mg/mL 的壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束的粒径和表面电位分别为 34.8nm 和 50.8mV。 说 明 书 CN 101797220 B4/7 页 6 0026 3) 奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束制备 0027 取25mg壳寡糖-硬脂酸嫁接物， 精密称定， 加入5mL去离子水， 冰浴探头超声10次 (400w， 工作 2s 停 3s)， 得 5mg/mL 的胶束溶液。加入 0.5mL 药物浓度为 5mg/mL 的奥沙利铂 水溶液。冰浴条件下探头超声 50(400W， 工作 2s 停 3s)， 得奥沙利铂壳。
25、聚糖 - 硬脂酸嫁接物 胶束溶液。 1mg/mL壳聚糖-硬脂酸嫁接物浓度的奥沙利铂壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的粒 径、 电位及通过电感耦合等离子质谱仪 (ICP-MS) 测得的药物包封率和载药量结果见表 1。 壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的数均粒径为30.4nm， 电位为50.3mV， 药物包封率为18.1， 药 物负载量为 1.78。 0028 实施例二 0029 1) 低分子量壳聚糖的制备 0030 取市售分子量为450kDa的壳聚糖(脱乙酰度为95)90g， 加至3000mL1.25(v/ v) 的盐酸水溶液中， 55 60温度条件下， 溶涨 2 小时后， 加入 5的纤维素酶 (w/w)， 在。
26、 55 60温度条件下进行降解。控制反应温度和时间， 得低分子量壳聚糖。所得降解反应 液， 使用 50Kda 和 10Kda 超滤膜 (Biomax-10， Millipore Co.， USA) 超滤分级后， 取分子量 1050Kda超滤液冷冻干燥。 凝胶渗透色谱法测定壳聚糖分子量， 采用TSK-gel G3000SW色 谱柱， 0.1mol/L醋酸钠(pH6.0)为流动相， 以分子量0.73， 5.9， 11.8， 47.3， 212.0， 788.0Kda 的葡聚糖标样制备洗脱曲线， 用该洗脱曲线计算壳聚糖分子量。经测定所得壳聚糖的重均 分子量为 18.0kDa。 0031 2) 壳聚糖。
27、 - 硬脂酸嫁接物合成 0032 取上述壳聚糖 0.5g， 精密称量， 加 30mL 去离子水 80下搅拌溶解， 称取硬脂酸 0.825g 和碳二亚胺 (EDC)5.5g， 搅拌溶解溶于 17mL 无水乙醇溶液中， 加热至 80。在 400rpm 磁力搅拌条件下将上述乙醇溶液加入壳聚糖溶液中， 80恒温搅拌反应 4 小时， 冷 却至室温 (25 )， 将终反应液置透析袋中， 蒸馏水透析 3 天。透析液冷冻干燥后， 以无水乙 醇洗涤去除残留的硬脂酸， 得壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物。 0033 采用 2， 4， 6- 三硝基苯磺酸 (2， 4， 6-trinitrobenzenesulfonic a。
28、cid， TNBS) 法测 定壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物的氨基取代度 (substitution degree， SD)。取同分子量的壳聚 糖 10mg， 置于 10ml 的容量瓶中， 用去离子水定容， 即得到 1mg/ml 的壳聚糖储备液， 分别取 0、 10、 50、 100、 200、 300、 400、 500l， 用去离子水定容至 2.0ml， 加入 4碳酸氢纳 2.0ml 和 0.1三硝基苯磺酸2.0ml， 于37水浴孵育2h。 加入2.0mol/L盐酸2ml， 摇匀， 超声赶走气 泡， 利用紫外分光光度计在 344nm 处测定吸光度， 制备标准曲线。另精密称定嫁接物 10mg， 置。
29、于 10ml 容量瓶中， 去离子水定容。取 300l， 同法操作， 测定 344nm 处的吸光度， 按标准 曲线计算聚合物的氨基取代度为 6.89 0034 采用芘荧光法测定壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物的临界胶束浓度。取 0.0012mg/ml 芘的 丙酮溶液 0.5ml 放入 10ml 的试管中， 50下挥干丙酮。配制 0.001mg/ml 1mg/ml 不同浓 度的嫁接物溶液， 分别取 5ml 加入到上述试管中 ( 芘终浓度为 710-7mol/L)， 室温水浴超 声30min。 扫描芘的激发光谱和发射光谱， 测定在374nm和385nm荧光强度， 并以测定I375/ I385 倾斜率的突然变。
30、化确定该嫁接物的临界胶束浓度为 0.119mg/mL。 0035 采用微粒粒度及表面电位分析仪， 测定壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束的粒径和表面 电位。经测定， 1mg/mL 的壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束的粒径和表面电位分别为 34.8nm 和 说 明 书 CN 101797220 B5/7 页 7 50.8mV。 0036 3) 奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束制备 0037 取 25mg 壳寡糖 - 硬脂酸嫁接物， 精密称定， 加入 0.5mL 药物浓度为 5mg/mL 的奥沙 利铂水溶液中， 水浴超声溶解后加入 0.75mL 无水乙醇溶液。45下旋转蒸发除去溶剂， 得 到载药胶束薄膜。
31、， 将其用 5mL 去离子水分散， 得奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束溶液。 1mg/mL 壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物浓度的奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束的粒径、 电位及 通过电感耦合等离子质谱仪(ICP-MS)测得的药物包封率和载药量结果见表1。 壳聚糖-硬 脂酸嫁接物胶束的数均粒径为 44.9nm， 电位为 51.8mV， 药物包封率为 41.3， 药物负载量 为 3.97。 0038 实施例三 0039 1) 低分子量壳聚糖的制备 0040 取市售分子量为450kDa的壳聚糖(脱乙酰度为95)90g， 加至3000mL1.25(v/ v) 的盐酸水溶液中， 55 60温度条件下，。
32、 溶涨 2 小时后， 加入 5的纤维素酶 (w/w)， 在 55 60温度条件下进行降解。控制反应温度和时间， 得低分子量壳聚糖。所得降解反应 液， 使用 50Kda 和 10Kda 超滤膜 (Biomax-10， Millipore Co.， USA) 超滤分级后， 取分子量 1050Kda超滤液冷冻干燥。 凝胶渗透色谱法测定壳聚糖分子量， 采用TSK-gel G3000SW色 谱柱， 0.1mol/L醋酸钠(pH6.0)为流动相， 以分子量0.73， 5.9， 11.8， 47.3， 212.0， 788.0Kda 的葡聚糖标样制备洗脱曲线， 用该洗脱曲线计算壳聚糖分子量。经测定所得壳聚糖。
33、的重均 分子量为 18.0kDa。 0041 2) 壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物合成 0042 取上述壳聚糖 0.5g， 精密称量， 加 30mL 去离子水 80下搅拌溶解， 称取硬脂酸 0.825g 和碳二亚胺 (EDC)5.5g， 搅拌溶解溶于 17mL 无水乙醇溶液中， 加热至 80。在 400rpm 磁力搅拌条件下将上述乙醇溶液加入壳聚糖溶液中， 80恒温搅拌反应 4 小时， 冷 却至室温 (25 )， 将终反应液置透析袋中， 蒸馏水透析 3 天。透析液冷冻干燥后， 以无水乙 醇洗涤去除残留的硬脂酸， 得壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物。 0043 采用 2， 4， 6- 三硝基苯磺酸 (2， 4。
34、， 6-trinitrobenzenesulfonic acid， TNBS) 法测 定壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物的氨基取代度 (substitution degree， SD)。取同分子量的壳聚 糖 10mg， 置于 10ml 的容量瓶中， 用去离子水定容， 即得到 1mg/ml 的壳聚糖储备液， 分别取 0、 10、 50、 100、 200、 300、 400、 500l， 用去离子水定容至 2.0ml， 加入 4碳酸氢纳 2.0ml 和 0.1三硝基苯磺酸2.0ml， 于37水浴孵育2h。 加入2.0mol/L盐酸2ml， 摇匀， 超声赶走气 泡， 利用紫外分光光度计在 344nm 处测。
35、定吸光度， 制备标准曲线。另精密称定嫁接物 10mg， 置于 10ml 容量瓶中， 去离子水定容。取 300l， 同法操作， 测定 344nm 处的吸光度， 按标准 曲线计算聚合物的氨基取代度为 6.89 0044 采用芘荧光法测定壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物的临界胶束浓度。取 0.0012mg/ml 芘的 丙酮溶液 0.5ml 放入 10ml 的试管中， 50下挥干丙酮。配制 0.001mg/ml 1mg/ml 不同浓 度的嫁接物溶液， 分别取 5ml 加入到上述试管中 ( 芘终浓度为 710-7mol/L)， 室温水浴超 声30min。 扫描芘的激发光谱和发射光谱， 测定在374nm和385n。
36、m荧光强度， 并以测定I375/ I385 倾斜率的突然变化确定该嫁接物的临界胶束浓度为 0.119mg/mL。 0045 采用微粒粒度及表面电位分析仪， 测定壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束的粒径和表面 说 明 书 CN 101797220 B6/7 页 8 电位。经测定， 1mg/mL 的壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束的粒径和表面电位分别为 34.8nm 和 50.8mV。 0046 3) 奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束制备及其理化性质测定 0047 取 25mg 壳寡糖 - 硬脂酸嫁接物， 精密称定， 加入 0.5mL 药物浓度为 5mg/mL 的奥沙 利铂水溶液中， 水浴超声溶解后加入。
37、溶度为 10mg/mL 的卵磷脂乙醇溶液 0.75mL。45下旋 转蒸发除去溶剂， 得到载药胶束薄膜， 将其用 5mL 去离子水分散， 得奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂 酸嫁接物胶束溶液。 1mg/mL壳聚糖-硬脂酸嫁接物浓度的奥沙利铂壳聚糖-硬脂酸嫁接物 胶束的粒径、 电位及通过电感耦合等离子质谱仪 (ICP-MS) 测得的药物包封率和载药量结 果见表1。 壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的数均粒径为95.7nm， 电位为51.8mV， 药物包封率为 47.2， 药物负载量为 3.50。 0048 4) 奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束在抗肿瘤治疗中的应用 0049 采用大肠癌 (SGC-7901) 。
38、细胞、 卵巢 (SKOV3) 癌细胞、 肝癌 (BEL-7402) 细胞、 白血 病 (K562) 细胞、 乳腺癌 (MCF-7) 细胞和耐阿霉素乳腺癌 (MCF-7/Adr) 细胞为模型细胞， 以 游离药物作对照， 通过四唑盐比色法 (MTT 法 ) 考察奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束 对肿瘤细胞的细胞毒性， 评价奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束的抗肿瘤活性。细胞 以含 10新生牛血清的 RPMI-1640 培养液培养在培养瓶中， 置于 37培养箱中， 通入 5 CO2( 相对湿度为 95 )， 2 天换一次培养液， 并于倒置显微镜下观察细胞生长状态， 待细胞 生长至近融合时， 用。
39、胰蛋白酶消化， 将细胞按 10000/ 孔的密度接种于 96 孔培养板中， 培养 24h， 待细胞贴壁生长后， 吸去培养液， 用 PBS 冲洗一遍， 然后加入新鲜的培养液， 同时分别 加入不同浓度的奥沙利铂载药胶团及游离奥沙利铂溶液， 每个浓度设 3 个平行孔， 并设阴 性对照孔， 继续培养 48h 后， 每孔中加入 5mg/ml MTT 水溶液 20l， 再培养 4h， 吸去孔内培 养液， 每孔中再加入 DMSO100l 溶解紫色结晶产物， 37振摇 30min 后， 用酶标仪在 570nm 测定吸光度。细胞毒性结果见表 2 和图 1。结果显示， 通过嫁接物胶束介导可显著增加奥 沙利铂药物对。
40、肿瘤细胞的毒性， 并可以实现逆转耐药， 其逆转倍数约为 5.72 倍。图 1A 中， SGC-7901 细胞 ： ( ) 游离药物和 ( ) 实施例三载药胶束 ； SKOV3 细胞 ： ( ) 游离药物 和 ( ) 实施例三载药胶束 ； BEL-7402 细胞 ： ( ) 游离药物和 ( ) 实施例三载药胶束 ； K562 细胞 ： ( ) 游离药物和 ( ) 实施例三载药胶束。图 1B 中， MCF-7 细胞 ： ( ) 游离 药物和 ( ) 实施例三载药胶束 ； MCF-7/Adr 细胞 ： ( ) 游离药物和 ( ) 实施例三载药 胶束。Log C 表示药物浓度的对数。 0050 5) 。
41、奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束的细胞内经时药物浓度测定 0051 当MCF-7和MCF-7/Adr细胞成对数生长时， 把他们按100,000/孔的密度接种在24 孔培养板中， 继续培养24小时， 待细胞贴壁生长后， 向其中加入奥沙利铂壳聚糖-硬脂酸嫁 接物胶束胶团(恒定药物浓度为20g/ml)， 并以同浓度的游离药物作对照， 于37分别孵 育 2h、 4h、 6h、 8h、 12h 后， 弃去原培养液， 用冰 PBS(pH7.4) 冲洗 3 次， 终止药物的摄取和除去 粘附在细胞膜上的药物。向细胞中加入 50l 胰酶， 将粘附在培养板上的细胞消化下来， 然 后向其中加入 950l PBS。
42、， 收集细胞悬液， 用电感耦合等离子质谱仪 (ICP-MS) 测定各时间 点细胞内奥沙利铂的浓度。 0052 细胞悬液中蛋白浓度校正 ： 取上述细胞悬液20uL， 加入96孔培养板中， 加入200uL 的 BCA 工作液， 37下放置 30min 以上。用酶联检测仪在 570nm 处测定吸光值。根据已知 说 明 书 CN 101797220 B7/7 页 9 浓度的牛血清白蛋白制作标准曲线， 并用该曲线计算细胞悬液中的蛋白浓度。 0053 细胞内的药物浓度经时测定结果见图2。 结果显示， 通过嫁接物胶束介导可显著增 加肿瘤细胞内的药物浓度 ； 在短时间内， 细胞内药物浓度随着孵育时间的延长而增。
43、加。 与肿 瘤细胞共孵育 12h 后， MCF-7 细胞中以嫁接物胶束形势给药的细胞内药物浓度与以游离药 物形式给药相比提高了 4.57 倍 ； MCF-7/Adr 细胞中以嫁接物胶束形势给药的细胞内药物浓 度与以游离药物形式给药相比提高了 4.77 倍。 0054 表 1 不同方法制得的奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束理化性质 0055 0056 PI 代表数均粒径的分散指数 0057 表 2 奥沙利铂壳聚糖 - 硬脂酸嫁接物胶束对不同肿瘤细胞的 IC50值 0058 0059 IC50： 表示半数细胞致死浓度。 说 明 书 CN 101797220 B1/2 页 10 图 1A 图 1B 说 明 书 附 图 CN 101797220 B2/2 页 11 图 2 说 明 书 附 图 。