技术领域
本发明属于中药领域，具体涉及治疗猪传染性胃肠炎的中药组合物，还涉及由该组合物 制成的提取物和制剂，以及中药组合物的应用。
背景技术
猪传染性胃肠炎是由冠状病毒科、冠状病毒属的猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）引起的一种急性接触性消化道传染病。TGEV是一种RNA 病毒，各年龄的猪都易感，新生仔猪死亡率高（几乎可达100%），5周龄以上仔猪死亡率低， 但经感染后的猪生产性能下降，饲料报酬率下降，给养猪业造成了较大的经济损失。
目前，由TGEV猪传染性胃肠炎在一些地方有流行的趋势，并混合其他细菌继发感染， 给养猪业造成严重危害。一旦发病，可以造成仔猪的大量死亡。采用西药治疗虽然能暂时延 缓病情，但治标不治本，且要投入大批资金，降低养猪效益。中草药在抗病毒方面，有着独 到的优势，而且中草药价格低廉、毒副作用小、来源广，选择中草药抗病毒不仅节约成本， 而且能在较短的时问内控制病情，减少动物死亡，进而提高养殖效益。因此，急需一种抗猪 传染性胃肠炎病毒病的中药组合物，降低TGEV对猪生产性能的影响，提高养殖效益。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种治疗猪传染性胃肠炎的中药组合物，配方合 理，能够抗猪传染性胃肠炎病毒；本发明的目的之二在于提供所述中药组合物的提取物，提 取物中含有中药组合物的全部有效成分，便于吸收；本发明的目的之三在于提供中药组合物 的提取物的制备方法，制备方法简单，活性成分损失小，便于大规模生产；本发明的目的之 四在于提供含有中药组合物的提取物的制剂，服用方便，便于携带；本发明的目的之五在于 提供中药组合物的应用。
为实现上述发明目的，提供如下技术方案：
抗猪传染性胃肠炎病毒的中药组合物，按重量份计由白术20～60份，黄芩10～50份，茯 苓10～50份，黄芪10～80份，煨木香10～40份，广藿香10～60份，干姜5～40份和甘草5～25 份组成。
优选的，按重量份计由白术30～50份，黄芩20～40份，茯苓20～40份，黄芪30～60份， 煨木香20～30份，广藿香20～50份，干姜10～30份和甘草10～20份组成。
更优选的，按重量份计由白术40份，黄芩30份，茯苓30份，黄芪45份，煨木香25份， 广藿香35份，干姜20份和甘草15份组成。
本发明中药组合物的各原料具有如下性质和功效：
白术为菊科植物白术（Atractylodes macrocephala Koidz.）的干燥根茎；味苦、甘，性温； 归脾、胃经；功能健脾益气，燥湿利水，止汗，安胎；主治脾虚食少，腹胀泄泻，痰饮眩悸， 水肿，自汗，胎动不安。
黄芩为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根；味苦，性寒；归肺、 胆、脾、大肠、小肠经；功能清热燥湿，泻火解毒，止血，安胎；主治湿温、暑温胸闷呕恶， 湿热痞满，泻痢，黄疸，肺热咳嗽，高热烦渴，血热吐衄，痈肿疮毒，胎动不安。
茯苓为多孔菌科真菌茯苓（Poria cocos(Schw.)Wolf）的干燥菌核；味甘、淡、性平，入 药具有利水渗湿、益脾和胃、宁心安神之功用。现代医学研究：茯苓能增强机体免疫功能， 茯苓多糖有明显的抗肿瘤及保肝脏作用。
广藿香为唇形科植物广藿香（Pogostemon cablin(Blanco)Benth.）的干燥地上部分；味辛， 性微温；归脾、胃、肺经；功能芳香化浊，开胃止呕，发表解暑；主治湿浊中阻，脘痞呕吐， 暑湿倦怠，胸闷不舒，寒湿闭暑，腹痛吐泻，鼻渊头痛。
煨木香为菊科植物木香（Radix Aucklandiae lappa Decne.）的干燥根。味苦，性温，归脾； 大肠、三焦经，主治行气止痛，调中导滞，主胞胁胀满足，脘腹胀痛，哎吐泄泻，痢疾后重。
干姜为姜科植物姜（Rhizoma Zingiberis officinale Rosc.）的干燥根茎；味辛，性热。归脾、 胃、心、肺经。温中散寒，回阳通脉，燥湿消痰，温肺化饮。主治脘腹冷痛；呕吐；泄泻， 亡阳厥逆；寒饮喘咳；寒湿痹痛。
甘草为豆科植物甘草（Radix Glycyrrhiza uralensis Fisch）、胀果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat.）或光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）的干燥根及根茎，甘草气微，味甜而特殊。功能 主治清热解毒，祛痰止咳、脘腹等。
黄芪为豆科植物蒙古黄芪（Astragalus memeranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao）或膜荚黄芪（Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.）的干燥根的多糖提取物；黄芪味 甘，性微温；归肺、脾经；功能补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮生肌。现代药理研究结果 显示：黄芪多糖是黄芪的主要有效部位，具有增强免疫功能、诱导机体产生干扰素、保护心 血管系统、调节血糖、降血压等多种药理活性，其中对免疫功能的促进和调节作用尤为明显。
2.利用所述的中药组合物制备的提取物。
3.所述提取物的制备方法，包括如下步骤：
a.挥发油提取及包被
取处方量的白术和广藿加入提取罐中，加入相当于药材总重量5-8倍的水，加热回收蒸 馏液，对蒸馏液进行二次蒸发回流，待蒸馏液相当于药材总重量1/10～2/10时停止蒸馏，回收 蒸馏液，得挥发油；然后将挥发油用β-糊精包被，得挥发油包合物；
b.黄芩、茯苓、黄芪、煨木香、干姜、甘草的提取：
取处方量的黄芩、茯苓、黄芪、煨木香、干姜、甘草，加入相当于药材总重量5-8倍的 体积分数为50%的乙醇，蒸发回流2-3小时，收集提取滤液，滤液用乙醇回收塔回收乙醇， 剩余液体记为提取液A；然后再加入相当于原料总重量3-5倍的水，煎煮提取2-3小时，收集 提取滤液，记为提取液B；
c.将步骤b所得提取液A和提取液B混合，然后浓缩成清膏状，冷却后加入步骤a所得 挥发油包合物，混合均匀，得中药组合物的提取物。
4.含有权利要求4所述提取物的制剂。
优选的，所述制剂为颗粒剂。
更优选的，按重量份计由如下组分组成：中药组合物的提取物100-180份，药渣100-140 份，填充剂60-130份，粘合剂120-230份和矫味剂0.5-2.5份。其中药渣由以下方法制得：取 处方量的黄芩、茯苓、黄芪、煨木香、干姜、甘草，加入相当于药材总重量5-8倍的体积分 数为50%的乙醇，蒸发回流2-3小时，收集滤渣；然后再加入相当于原料总重量3-5倍的水， 煎煮提取2-3小时，得药渣。
更优选的，所述填充剂为磷酸氢二钙、玉米淀粉、糖粉和乳糖中的一种或多种；所述粘 合剂为玉米淀粉、糊精和纤维素中的一种或多种；所述矫味剂为糖精钠、蔗糖和青草香精中 的一种或多种。
5.所述的中药组合物在制备治疗猪传染性胃肠炎的药物中的应用。
本发明公开的中药组合物还可以用于制备抗猪传染性胃肠炎病毒的药物，也可以用于制 备治疗免疫功能低下的药物。
本发明的有益效果在于：本发明公开了治疗猪传染性胃肠炎的中药组合物，其原料易得， 具有扶正祛邪、健脾燥湿、清热止痢的功效；本发明还公开了利用中药组合物制备的制剂， 其制备方法简单，将中药组合物按常规方法提取后与填充剂、粘合剂和矫味剂等辅料混合制 成颗粒剂，添加辅料后使固体分散载体处于高度分散状态，增加中药组合物的生物利用率； 制备的颗粒剂对TGEV具有直接灭活作用、阻滞作用、吸附抑制、穿入抑制、复制抑制等功 效，其中直接灭活作用和抑制病毒复制效果较好，能够提高因猪传染性胃肠炎病毒所损伤的 细胞的保护能力；并能有效地提高免疫低下小鼠的碳粒廓清能力，增大免疫器官指数和血清 溶血素，增强T、B淋巴细胞的转化能力而提高免疫功能的效果。
说明书附图
图1为不同浓度的中药组合物颗粒剂对PK-15细胞的毒性影响。
图2为中药组合物颗粒剂抑制TGEV致Vero细胞病变作用。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
一种治疗猪传染性胃肠炎病的中药组合物，处方如下：
处方1：白术20g，黄芩10g，茯苓10g，黄芪10g，煨木香10g，广藿香10g，干姜5g 和甘草5g。
处方2：白术30g，黄芩20g，茯苓20g，黄芪30g，煨木香20g，广藿香20g，干姜10g 和甘草10g。
处方3：白术40g，黄芩30g，茯苓30g，黄芪45g，煨木香25g，广藿香35g，干姜20g 和甘草15g。
处方4：白术50g，黄芩40g，茯苓40g，黄芪60g，煨木香30g，广藿香50g，干姜30g 和甘草20g。
处方5：白术60g，黄芩50g，茯苓50g，黄芪80g，煨木香40g，广藿香60g，干姜40g 和甘草25g。
实施例2
为了提高便于吸收，将中药组合物用水或醇等溶剂提取有效成分制得提取物，其制备方 法为：
方法1：
a.提取挥发油及包被：
取处方量的白术和广藿加入提取罐中，加入相当于药材总重量5倍的水，加热回收蒸馏 液，对蒸馏液进行二次蒸发回流，待蒸馏液相当于药材总重量1/10时停止蒸馏，回收蒸馏液， 得挥发油；
称取相当于挥发油重量1/5的β-环糊精，然后加入相当于β-糊精重量15倍的蒸馏水，加 热溶解后加入所得挥发油，在40℃条件下以600rpm速度搅拌1小时，再在4℃条件下冷藏 24小时，过滤，收集沉淀，将沉淀于50℃条件下烘干，得挥发油包合物；
b.黄芩、茯苓、黄芪、煨木香、干姜、甘草的提取：
取处方量的黄芩、茯苓、黄芪、煨木香、干姜、甘草加入提取罐中，然后加入相当于药 材总重量5倍的体积分数为50%的乙醇，蒸发回流2小时，收集提取滤液，滤液用乙醇回收 塔回收乙醇，剩余液体记为提取液A；
继续往提取罐中加入相当于原料总重量3倍的水，煎煮提取2小时，收集提取滤液，记 为提取液B，药渣烘干，粉碎后备用，记为药渣A；
c.将步骤b所得提取液A和提取液B混合，然后浓缩成清膏状，冷却后加入步骤a所得 挥发油包合物，混合均匀，记为混合物C，即为中药组合物的提取物。
方法2：
a.提取挥发油及包被：
取处方量的白术和广藿加入提取罐中，加入相当于药材总重量8倍的水，加热回收蒸馏 液，对蒸馏液进行二次蒸发回流，待蒸馏液相当于药材总重量2/10时停止蒸馏，回收蒸馏液， 得挥发油；
称取相当于挥发油重量1/5的β-环糊精，然后加入相当于β-糊精重量15倍的蒸馏水，加 热溶解后加入所得挥发油，在40℃条件下以600rpm速度搅拌1小时，再在4℃条件下冷藏 24小时，过滤，收集沉淀，将沉淀于50℃条件下烘干，得挥发油包合物；
b.黄芩、茯苓、黄芪、煨木香、干姜、甘草的提取：
取处方量的黄芩、茯苓、黄芪、煨木香、干姜、甘草加入提取罐中，然后加入相当于药 材总重量8倍的体积分数为50%的乙醇，蒸发回流3小时，收集提取滤液，滤液用乙醇回收 塔回收乙醇，剩余液体记为提取液A；
继续往提取罐中加入相当于原料总重量5倍的水，煎煮提取3小时，收集提取滤液，记 为提取液B，药渣烘干，粉碎后备用，记为药渣A；
c.将步骤b所得提取液A和提取液B混合，然后浓缩成清膏状，冷却后加入步骤a所得 挥发油包合物，混合均匀，记为混合物C，即为中药组合物的提取物。
本实施例所得中药组合物的提取物中含有中药组合物的全部有效成分。
实施例3
为了便于贮存和携带，服用方便，将中药组合物或其提取物制成各种适用于临床治疗需 要的制剂，在制剂中可加入药剂学上可接受的载体，制剂的方法为常规方法。例如，可以将 中草药组合物中的各种中药材直接粉碎成细粉，制成散剂，或者加入粘合剂制成丸剂；可以 将中草药组合物的提取物与药剂学上可接受的载体制成胶囊、片剂、颗粒剂等等。这些提取 物和制剂与中草药组合物具有相同的治疗作用。
以下以实施例2制得的混合物C和药渣A为原料，制备颗粒剂，具体处方为：
配方1：混合物C100g，药渣A100g，磷酸氢二钙60g，玉米淀粉120g，糖精钠0.5g。
配方2：混合物C120g，药渣A110g，磷酸氢二钙80g，玉米淀粉150g，糖精钠1g。
配方3：混合物C140g，药渣A120g，磷酸氢二钙90g，玉米淀粉180g，糖精钠1.5g。
配方4：混合物C160g，药渣A130g，磷酸氢二钙100g，玉米淀粉210g，糖精钠2g。
配方5：混合物C180g，药渣A140g，磷酸氢二钙130g，玉米淀粉230g，糖精钠2.5g。 颗粒剂的制备方法，具体步骤如下：
（1）将配方量2/5的玉米淀粉在夹层锅内制成淀粉浆，备用；
（2）将配方量的糖精钠溶于混合物C中，然后加入处方量的药渣A、磷酸氢二钙与余下的 玉米淀粉，混合均匀，得混合物D；
（3）将步骤（2）所述的混合物D中加入步骤（1）制备的淀粉浆中，搅拌均匀后，转到 制粒机上制粒，制粒后在60℃条件下烘10～12小时，然后置于整粒机内整粒，即得中药组合 物颗粒剂。
本实施例中，磷酸氢二钙为填充剂，可以用相同重量的玉米淀粉、糖粉或乳糖替换，也 可以用相同重量的磷酸氢二钙、玉米淀粉、糖粉和乳糖的混合物替换；玉米淀粉为粘合剂， 可以用相同重量的糊精或纤维素替换，也可以用相同重量的玉米淀粉、糊精和纤维素的混合 物替换；糖精钠为矫味剂，可以用相同重量的蔗糖或青草香精替换，也可以用相同重量的蔗 糖、糖精钠和青草香精混合物替换。
实施例4
不同辅料配方制成的中药组合物颗粒剂相关指标检测
以实施例3所制成的颗粒剂分别按照药典进行粒度、水分和溶化性检测，具体实施如下：
1、粒度的检测（采用双分筛法）
根据《中华人民共和国兽药典》2010年版第二部规定，不能通过1号筛（10目）和能通 过5号筛（80目）颗粒总和，不得超过15%。
方法：称取中药组合物颗粒剂30g，置于多层药筛中，震摇多层筛保持水平状态过筛， 左右往返，边筛动边轻叩3分钟，取不能通过1号筛（10目）和能通过5号筛（80目）颗粒， 称定重量，计算所占百分比，结果如表1所示。
表1、不同辅料配方制成的中药组合物颗粒剂粒度检查结果
由表1可知，辅料配方1～5制成的中药组合物颗粒不能通过1号筛（10目）和能通过5 号筛（80目）颗粒和粉末之和均未超过15%，符合药典规定。
2、水分检查（采用烘干法）
根据《中华人民共和国兽药典》2010年版第二部规定，颗粒剂水分不得超过6%。
方法：取中药组合物颗粒剂2g，平铺于干燥至恒重的称量瓶中，厚度不超过5mm，精密 称定，打开瓶盖在105℃温度下干燥3小时，将瓶盖盖好，移置干燥器中，冷却30分钟，精 密称定，再在105℃干燥1小时，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止，根 据减失的重量，计算供试品中含水量，结果如表2所示。
表2、不同辅料配方制成的中药组合物颗粒剂水分检查结果
由表2可知，辅料按照配方1和配方2制成的中药组合物颗粒剂的含水量超过6%，不符 合药典规定；按照配方3、配方4和配方5制成的颗粒剂水分含量均未超过6%，符合药典规 定。
3、溶化性检查
根据《中华人民共和国兽药典》2010年版第二部规定，颗粒剂均不得有焦屑等异物。
方法：取中药组合物颗粒剂10g，加热水200mL，搅拌5分钟，立即观察，结果如表3 所示。
表3、不同辅料配方制成的中药组合物颗粒剂溶化性结果
如表3所示，辅料配方1～3制成的中药组合物颗粒剂溶化后呈混悬状，无焦屑物，符合 药典规定。其中配方4的中药组合物颗粒剂有部分批次出现沉渣，配方5的中药组合物颗粒 剂3个批次均有沉渣不符合药典规定。
因此，辅料配方3制成的中药组合物颗粒剂在颗粒度、水分含量和颗粒溶化性等方面均 符合药典规定。
应用实施例：
一、不同处方中药组合物颗粒剂对免疫功能低下的小鼠的影响
依据实施例4结果，选择辅料配方3制备5个处方中药组合物颗粒剂，并将其溶解为混 悬状按以下进行实施。
选取健康小鼠160只，随机分为8组，每组20只。取140只小鼠用于构建免疫低下小鼠 模型，具体方法为：腹腔注射0.2mL环磷酰胺，1次/天，注射量按80mg/kg，共3天；余下 20只小鼠腹腔注射相同量的蒸馏水，作为空白对照组。将构建的免疫低下小鼠模型随机分为 模型组、阳性药物对照组（黄芪多糖注射液，0.15g/kg）、处方1-5组（每只给药量为：1.4g 生药/kg），1次/天，连续给药3天；空白对照组，模型组给予等量蒸馏水。治疗后，各组一 半小鼠眼框采血，血液用于碳粒廓清指数测定；取各组另一半小鼠脾脏、胸腺用于免疫指数 测定（mg/g）及T、B淋巴细胞转化试验。
（1）免疫器官指数的测定
方法：称小鼠重量，取脾脏和胸腺，称湿质量，并按下列公式计算脾指数和胸腺指数， 结果如表4所示。
脾指数=脾质量/体重(mg/g)；胸腺指数=胸腺质量/体重(mg/g)。
表4、不同处方中药组合物颗粒剂对小鼠免疫器官指数的影响
组别 剂量(g/kg) 脾脏指数（mg/g） 胸腺指数（mg/g） 空白对照组 — 4.706±0.24 1.156±0.01 模型组 — 3.215±0.57△ 0.856±0.14△△ 阳性药物对照组 0.15 5.323±0.53** 1.880±0.05** 处方1 1.4 3.832±0.83** 1.380±0.32** 处方2 1.4 3.380±0.60 1.230±0.15* 处方3 1.4 4.832±0.83** 1.389±0.01** 处方4 1.4 4.832±0.83** 1.580±0.21** 处方5 1.4 3.250±0.82 1.339±0.18*
注：与模型对照组比较“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01；与空白对照组比较“△△”表示P<0.01。
由表4可知，处方1-5组的小鼠在给药后脾脏指数和胸腺指数增加，其中处方3和处方4 的增加效果最明显，P<0.01。因此，处方1-5的中药组合物颗粒剂能够治疗免疫低下的小鼠， 并且处方3和处方4治疗效果较好。
（2）碳粒廓清指数测定
各组小鼠于末次给药1小时后按尾静脉注射体积分数为25%的印度墨汁，注射剂量按 10mL/kg，然后分别在2分钟和10分钟从鼠眼球后静脉丛取血20μL，立刻吹入2mL质量分 数为0.1%的Na2CO3溶液中，取血完毕后以于570nm测吸光度（OD），校零溶液为等体积的 质量分数为0.1%的Na2CO3，按下式计算碳粒廓清指数K，然后经体质量及肝脾质量换算后 得校正廓清指数指数α值，结果如表5所示。
K=（lgA1－lgA2）/（t2－t1）
α=K1/3·体重/（肝重+脾重）
其中，A1、A2分别代表先后2次所采血样测得的吸光度，t2－t1代表2次采血的时间间隔。
表5、不同处方中药组合物颗粒剂对小鼠碳粒廓清指数的影响
组别 剂量(g/kg) 碳粒廓清指数α值 空白对照组 — 5.125±0.08 模型组 — 3.420±0.52△△ 阳性药物对照组 0.15 4.892±0.44* 处方1 1.4 4.520±0.20* 处方2 1.4 4.530±0.28* 处方3 1.4 4.571±0.03* 处方4 1.4 4.225±0.38* 处方5 1.4 4.420±0.28*
由表5可知，处方1-5组在给药后吞噬指数α均有增加效果，其中处方3增加效果最明显。
（3）T淋巴细胞、B淋巴细胞转化试验测定
在无菌条件下取脾，然后用PBS缓冲液冲洗两遍。用无菌的研磨器研磨后取浆液，然后 于1000r/min条件下离心5分钟，弃上清液；再加入5mL pH为7.2的Tris NH4Cl，轻轻吹打， 使红细胞完全破裂，再在1000r/min条件下离心5min，弃上清液；沉淀用PBS缓冲液冲洗1 次，再以1000r/min离心5min，弃上清液；最后用含体积分数为10%的新生牛血清及质量分 数为2%的庆大霉素的RPM II640全培养液重悬细胞，调整脾细胞浓度为3×106个/mL，备用。
T淋巴细胞转化试验：参照改进的MTT比色分析法，取96孔细胞培养板，每孔加脾细 胞悬液200μL，刀豆蛋白A15μL（终浓度为6mg/L），8复孔，于37℃5%的CO2培养箱中培 养72小时。在培养结束前4小时弃上清100μL，加人MTT液20μL继续培养4h，吸去上清 液，每孔加入DMSO150μL终止反应，将96孔板移入平板震荡器，水平震荡10min，使MTT 还原产物完全溶解，用酶联免疫检测仪于630nm波长处测定每孔吸光度（OD值），结果如表 6所示。
B淋巴细胞转化试验：其方法与T淋巴细胞转化试验相同，区别在于将15μL刀豆蛋白 换成20μL脂多糖，加入后终浓度为50mg/L。用酶联免疫检测仪于630nm波长处测定每孔吸 光度（OD值），结果如表6所示。
表6、中药组合物颗粒剂对小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响
组别 剂量(g/kg) T淋巴细胞OD630值 B淋巴细胞OD630值 空白对照组 — 0.421±0.05 0.391±0.04 模型组 — 0.251±0.07△ 0.127±0.02△ 阳性药物对照组 0.15 0.403±0.02* 0.364±0.04** 处方1 1.4 0.320±0.16* 0.282±0.02** 处方2 1.4 0.427±0.12* 0.235±0.02** 处方3 1.4 0.520±0.02** 0.371±0.04** 处方4 1.4 0.480±0.16* 0.332±0.03** 处方5 1.4 0.467±0.15* 0.330±0.12**
由表6可知，处方1-5的中药组合物颗粒剂均能增加T、B淋巴细胞的转化能力，但处方 3效果最好。
二、中药组合物颗粒剂对猪传染性胃肠炎治疗临床试验
2013年1月，重庆市荣昌县某猪场仔猪出现不食、呕吐、腹泻，有些严重脱水的临床症状， 发病仔猪共120头。经诊断此病为传染性胃肠炎，宜扶正祛邪，健脾燥湿，清热止痢。
治疗方案：将发病仔猪随机分成6组，每组20头，试验组采用中药组合物颗粒剂拌料饲喂， 剂量为2g/kg体重，另一组采用白头翁散拌料饲喂，剂量为2g/kg体重，试验周期为一周，结果 如表7所示。
表7、中药组合物颗粒剂对猪传染性胃肠炎临床试验
由表7可知，在用药后的第2天部分仔猪的临床症状得到明显的好转，在用药后第3天、第 4天、第5天、第6天，处方1-5组均有头仔猪得到治愈，白头翁散组分别有4头、8头、13头、 15头仔猪得到治愈。到用药后第6天，处方1～5组和白头翁散组分别有14头、15头、17头、16 头、15头和15头仔猪被治愈，治愈率分别达到70%、75.5%、85%、80%和75.5%。因此，中 药组合物颗粒剂对猪传染性胃肠炎有治疗效果，并且处方3效果最好，治愈率达85%。
三、不同浓度中药组合物颗粒剂对免疫功能低下的小鼠的影响
1、免疫器官指数的测定
选取健康小鼠120只，随机分为6组，每组20只。取100只小鼠用于构建免疫低下小鼠 模型，具体方法为：腹腔注射0.2mL环磷酰胺，1次/天，注射量按80mg/kg，共3天；余下 20只小鼠腹腔注射相同量的蒸馏水，作为空白对照组。将构建的免疫低下小鼠模型随机分为 模型组、阳性药物对照组（黄芪多糖注射液，0.15g/kg）、中药组合物颗粒剂高剂量组（处方 3，1.4g生药/kg）、中药组合物颗粒剂中剂量组（处方3，1.0g生药/kg）、中药组合物颗粒 剂低剂量组（处方3，0.6g生药/kg），1次/天，连续给药3天；空白对照组，模型组给予等 量蒸馏水。治疗后，各组一半小鼠眼框采血，血液用于碳粒廓清指数测定；取各组另一半小 鼠脾脏、胸腺用于免疫指数测定（mg/g）及T、B淋巴细胞转化试验，测得的脾指数和胸腺 指数，结果如表8所示。
表8、不同剂量中药组合物颗粒剂对小鼠免疫指数的影响
组别 剂量(g/kg) 脾脏指数（mg/g） 胸腺指数（mg/g）
空白对照组 — 4.706±0.24 1.156±0.01 模型组 — 3.215±0.57△ 0.856±0.14△△ 阳性药物对照组 0.15 5.323±0.53** 1.880±0.05** 中药组合物颗粒剂高剂量组 1.4 4.832±0.83** 1.389±0.01** 中药组合物颗粒剂中剂量组 1.0 3.351±0.53 1.239±0.16* 中药组合物颗粒剂低剂量组 0.6 3.285±0.39 1.192±0.13
由表8所示，模型组小鼠脾脏指数和胸腺指数降低，与空白对照组比差异极显著（P<0.01）， 中药组合物颗粒剂高剂量治疗后，小鼠脾脏指数、胸腺指数与空白对照组比差异不显著，趋 向于正常；具有提高免疫低下小鼠的脾脏指数和胸腺指数，并且各剂量组有一定量效关系。
2、碳粒廓清指数测定
各组小鼠于末次给药1小时后尾静脉注射体积分数为25%的印度墨汁10mL/kg，然后分 别在2分钟和10分钟于每鼠眼球后静脉丛取血20μL，立刻吹入2mL质量分数为0.1%的 Na2CO3溶液中，取血完毕后于570nm测吸光度（OD），校零溶液为等体积的质量分数为0.1% 的Na2CO3。按下式计算廓清指数K，然后经体质量及肝脾质量换算后，得校正廓清指数α值， 结果如表9所示。
K=（lgA1－lgA2）/（t2－t1）
α=K1/3·体重/（肝重+脾重）
其中，A1、A2分别代表先后2次所采血样测得的吸光度，t2－t1代表2次采血的时间间隔。
表9、不同剂量中药组合物颗粒剂对小鼠碳粒廓清指数的影响
组别 剂量(g/kg) 碳粒廓清指数α值 空白对照组 — 5.125±0.08 模型组 — 3.420±0.52△△ 阳性药物对照组 0.15 4.892±0.44* 中药组合物颗粒剂高剂量组 1.4 4.571±0.03* 中药组合物颗粒剂中剂量组 1.0 4.529±0.18* 中药组合物颗粒剂低剂量组 0.6 4.002±0.16*
由表9可知，模型组小鼠碳清值α降低，与空白对照组比差异极显著（P<0.01），中药组 合物颗粒剂高剂量治疗后，吞噬指数α上升，并且各剂量组之间存在一定量效关系。
3、T淋巴细胞、B淋巴细胞转化试验测定
在无菌条件下取脾，然后用PBS缓冲液冲洗两遍。用无菌的研磨器研磨后取浆液，然后 于1000r/min条件下离心5分钟，弃上清液；再加入5mL pH为7.2的Tris NH4Cl，轻轻吹打， 使红细胞完全破裂，再在1000r/min条件下离心5min，弃上清液；沉淀用PBS缓冲液冲洗1 次，再以1000r/min离心5min，弃上清液；最后用含体积分数为10%的新生牛血清及质量分 数为2%的庆大霉素的RPM II640全培养液重悬细胞，调整脾细胞浓度为3×106个/mL，备用。
T淋巴细胞转化试验：参照改进的MTT比色分析法，取96孔细胞培养板，每孔加脾细 胞悬液200μL，刀豆蛋白A15μL（终浓度为6mg/L），8复孔，于37℃5%的CO2培养箱中培 养72小时。在培养结束前4小时弃上清100μL，加人MTT液20μL继续培养4h，吸去上清 液，每孔加入DMSO150μL终止反应，将96孔板移入平板震荡器，水平震荡10min，使MTT 还原产物完全溶解，用酶联免疫检测仪于630nm波长处测定每孔吸光度（OD值），结果如表 10所示。
B淋巴细胞转化试验：其方法与T淋巴细胞转化试验相同，区别在于将15μL刀豆蛋白 换成20μL脂多糖，加入后终浓度为50mg/L。用酶联免疫检测仪于630nm波长处测定每孔吸 光度（OD值），结果如表10所示。
表10、中药组合物颗粒剂对小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响
组别 剂量(g/kg) T淋巴细胞OD630值 B淋巴细胞OD630值 空白对照组 — 0.421±0.05 0.391±0.04 模型组 — 0.251±0.07△ 0.127±0.02△ 阳性药物对照组 0.15 0.403±0.02* 0.364±0.04** 中药组合物颗粒剂高剂量组 1.4 0.520±0.02** 0.371±0.04** 中药组合物颗粒剂中剂量组 1.0 0.427±0.12* 0.235±0.02** 中药组合物颗粒剂低剂量组 0.6 0.313±0.03 0.218±0.01*
由表10可知，模型组小鼠T淋巴细胞和B淋巴细胞转化能力降低，与空白对照组比差 异显著（P<0.05）；因此，中药组合物颗粒剂明显增加T、B淋巴细胞的转化能力，且各剂量 组有一定量效关系，表明中药组合物颗粒剂能提高小鼠的免疫功能。
四、中药组合物体外抗TGEV作用研究
1、中药组合物对猪肾细胞毒性作用
将猪肾细胞（PK-15，由中国科学院典型培养物保藏中心武汉细胞所提供，编号：GDC061） 悬液稀释成1×105个/mL接入96孔细胞培养板，每孔200μL，长满单层后，吸弃培养液，再 分不同浓度药物组，正常细胞对照组，正常细胞对照组只加细胞维持液，不同浓度药物组分 别加入含800mg/L，400mg/L，200mg/L，100mg/L，50mg/L，25mg/L，12.5mg/L，6.3mg/L 中药组合物的维持液，置培养箱中培养，每日观察细胞形态变化，72h后，在避光条件下每 孔加20μL的MTT，37℃孵育4h，吸弃上清液，每孔加150μL的二甲基亚砜（DMSO），充 分震荡混匀，检测490nm处的吸光值（OD值）。细胞存活率（%）=药物组OD值/正常细胞 对照组OD值×100%。用线性回归计算该复方中药对PK-15细胞的半数中毒浓度（TC50），结 果如图1所示。
由图1可知，药物浓度C＞100mg/L时，细胞开始出现圆缩，脱落，甚至死亡，且存活 率显著低于正常组，P<0.05；药物浓度C≤100mg/L时，细胞存活率与空白相比差异不显著， P>0.05，其最大无毒浓度为100mg/L。用线性回归算出该复方中药对PK-15细胞的TC50为 302.16mg/L。
2、中药组合物对猪传染性胃肠炎病毒病的治疗效果研究
试验设病毒对照组、正常细胞对照组和药物组。病毒对照组只感染猪传染性胃肠炎病毒 （TGEV，西南大学荣昌校区预防教研室宋振辉博士惠赠），正常细胞对照组只加细胞维持液， 药物组将药液和病毒液等体积混合后，每孔100μL加到单层PK-15细胞的96孔板上，每日 观察细胞病变效应（CPE），CPE判定方法：“-”为无细胞病变；“+”为1%-25%的细胞出现病 变；“++”为26%-50%的细胞出现病变；“+++”为51%-75%的细胞出现病变；“++++”为76%-100% 的细胞出现病变。在培养72h后，用MTT法检测490nm处的吸光值（OD值），计算病毒对 细胞的损伤抑制率，损伤抑制率=（药物组OD值-病毒对照组OD值）/（正常细胞对照组OD 值-病毒对照组OD值）×100%，用线性回归计算出药物对病毒的半数抑制浓度（IC50），结果 如图2所示。
由图2可知，药物抑制细胞CPE作用有量效关系，当浓度达到12.5mg/L时，药物抗TGEV 活性较好（细胞病变抑制率达45.5%）。药物浓度高于12.5mg/L时对病毒有明显的抑制作用， 与病毒组相比差异显著（P<0.05），详见表11，通过线性回归计算得到药物的IC50为17.36mg/L， 两种方法试验，抗病毒效果一致。
表11、不同浓度药物对TGEV致PK-15细胞的损伤抑制率
3、中药组合物抗TGEV效果的评价
方法：将上述试验所得结果TC50和IC50进行分析，计算其治疗指数（TI），TI=TC50/IC50， 结果如表12所示。
表12、中药组合物抗TGEV活性结果
药物 TC50（mg/L） IC50（mg/L） TI 药物 302.16 17.36 17.41
由表12可知，该药物的治疗指数TI为17.41，说明其对TGEV有一定的治疗效果。
4、中药组合物抑制TGEV感染PK-15细胞试验
试验设病毒对照组、空白对照组和中药组合物组，以中药组合物最大无毒浓度为高浓度， 按倍比稀释法稀释成5个浓度，每个浓度6个重复，分别做以下5个试验，每个试验重复3 次。
对病毒的直接灭活作用：取100TCID50的TGEV病毒液与不同浓度中药组合物药液培养液 等体积混合，37℃作用90分钟然后超速离心去除中药成分，沉淀用PBS洗涤后再超速离心沉 淀病毒颗粒，病毒沉淀以DMEM培养液重悬，接种至单层PK-15细胞上，培养1-3天，检测细 胞存活率，结果如表13所示。
表13、中药组合物对病毒的直接灭活作用
预处理细胞对病毒阻滞试验：将PK-15单层细胞用含不同浓度中药组合物的培养液培养3 天，弃培养液，PBS清洗2次后加100TCID50的TGEV病毒液100μL接种，37℃孵育1h，用PBS 清洗以去除未吸附的病毒，加含体积分数为0.5%胎牛血清的细胞维持液，培养1-3天，检测细 胞存活率，结果如表14所示。
表14、中药组合物对病毒阻滞试验结果
对病毒吸附细胞抑制试验：将含不同浓度中药组合物培养液分别接入已长满单层细胞的 96孔板内，每孔100μL，37℃孵育2h后，弃药液，接入100TCID50病毒液每孔100μL，37℃孵 育2h。用PBS洗单层细胞，去除未吸附的病毒和中药成分，加入含0.5%胎牛血清的细胞维持 液，培养1-3天，检测细胞存活率，结果如表15所示。
表15、中药组合物对病毒吸附细胞抑制试验结果
对病毒穿入抑制试验：将单层的PK-15细胞接种TGEV病毒液，置4℃吸附1h，用PBS洗单 层细胞，去除未吸附的病毒。吸附病毒的细胞分别用含不同浓度中药组合物培养液37℃培养0、 15、30、60分钟后加入蛋白酶K反应20分钟，用1mmol/L的苯甲基磺酰氟（PMSF）终止反应， 用PBS洗单层细胞2次，加入含0.5%胎牛血清的细胞维持液，培养1-3天，检测细胞存活率， 结果如表16所示。
表16、中药组合物对病毒穿入抑制试验结果
对病毒复制抑制试验：以100TCID50的TGEV病毒液感染形成单层的PK-15细胞，每孔100 μl，37℃孵育2h后弃病毒液，用PBS洗单层细胞，将感染细胞在不同浓度中药组合物下培养 1-3天，检测细胞存活率，结果如表17所示。
表17、中药组合物对病毒复制抑制试验
由表13～17可知，各浓度组对细胞均有一定的保护作用，其中直接灭活作用和复制抑制 试验效果比较明显，且浓度C=100mg/L，与病毒对照相比差异极显著，P<0.01，中药组合物 浓度C≥25mg/L，细胞保护率均超过50%。而阻滞试验、吸附试验和穿入试验，中药组合物 浓度需要达到100mg/L才出现显著的保护作用，表明中药组合物在体外抗TGEV主要是通过 对病毒的直接灭活和对病毒复制抑制。
上述结果表明，本发明的中药组合物对猪传染性胃肠炎病毒有一定治疗效果，在其体外 抗TGEV试验中，药物对PK-15细胞毒性小，TC50为302.16mg/L，对TGEV有一定的治疗 效果，IC50为17.36mg/L，毒副作用小，并能有效地提高动物机体的免疫力，在临床上可以 有效治疗猪传染性胃肠炎，并且达到高效、安全、经济地防治猪传染性胃肠炎病毒病的目的。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述 优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和 细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。