鹿药中新化合物呋甾皂苷的分离鉴定及其抗肿瘤用途 技术领域 本发明涉及天然药物化学领域， 具体涉及一种新的呋甾皂苷化合物的分离鉴定及 其抗人肺腺癌 SPC-A-1 细胞的活性。
背景技术 鹿药为百合科鹿药属多年生草本植物鹿药 (Smilacina japonica A.Gray) 的干燥 根茎及根， 为民间常用中药。鹿药属植物全世界约有 25 种， 我国有 14 种， 2 变种， 除新疆、 青海、 宁夏和内蒙古， 全国都有分布， 野生资源储量十分丰富。鹿药属植物具有药食两用价 值， 除根茎及根可入药， 地上幼嫩茎叶是人们喜爱的山野菜， 其中鹿药种在全国各地分布最 为广泛。
《中药大辞典》 中记载鹿药性味 “甘、 苦、 温、 无毒” ， 具有补气益肾、 祛风除湿、 活血 调经的功能， 常用于治疗痨伤， 阳痿， 偏、 正头痛， 风湿骨痛， 痈疖肿毒， 跌打损伤， 乳腺炎， 月 经不调等症。 而有关药用成分及现代药理研究几乎是空白， 制约了鹿药资源的开发与利用。
皂苷类化合物是广泛分布于植物界的一类次生代谢产物， 是许多药用植物的有效 成分， 具有防治心脑血管疾病、 抗肿瘤、 抗病毒、 治疗白血病、 免疫调节、 抗炎、 抗过敏、 降血 糖、 抑制生育、 杀虫、 抗真菌、 调节内分泌、 抗氧化、 保肝等多种生物活性和广泛的药理作用。 皂苷化合物是新药研究过程中重要的先导化合物来源而受到研究人员的关注。
本发明通过研究鹿药的化学成分， 并对其中所获得的一种新呋甾皂苷化合物进行 抗肿瘤活性检测， 旨在获得显效的新化合物或先导物质， 并为鹿药的化学成分与生物活性 研究奠定基础， 为更好的研究、 开发、 利用鹿药植物资源提供科学依据。
发明内容
本发明对鹿药设计、 分离得到了一种呋甾皂苷类新化合物， 新化合物结构式为 ：
命名为 ： 26-O-β-D- 吡 喃 葡 萄 糖 基 -(25R)- 呋 甾 -5- 烯 -2β， 12， 17α， 22ξ， 26- 五醇 -12-O- 乙酰基 -3-O-α-L- 吡喃鼠李糖基 -(1 → 2)-β-D- 吡喃葡萄糖苷
{26-O-β-D-glucopyranosyl-(25R)-furost-5-en-3β， 12， 17α， 22ξ， 26-pento l12-O-acetyle-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1 → 2)-β-D-glucopyranoside}。
本发明采用 MTT 法对此新化合物进行了抗肿瘤活性检测， 实验结果显示此化合物 具有抑制人肺腺癌 SPC-A-1 细胞生长的活性， 它的 IC50 值为 7.67μg·mL-1。 附图说明
图 1 新化合物的 ESI-MS 图谱
图 2 新化合物的 IR 图谱
图 3 新化合物的 13C NMR 谱
图 4 新化合物的 1H NMR 谱
图 5 新化合物的 HMQC 谱
图 6 新化合物的 HMBC 谱
图 7 新化合物的 TOCSY 谱 图 8 新化合物的结构式 具体实施方式 实施例一 新化合物的提取、 分离和鉴定
1. 实验材料和方法
1.1 样品
鹿药采自吉林省九台市土门岭地区， 由吉林农业大学中药材学院杨利民教授鉴 定， 将其根茎洗净后自然阴干， 机械粉碎， 备用。
1.2 仪器与试剂
仪器 ： DL-1000E 智能超声波清洗器 ( 上海之信仪器有限公司 )
RE52-99 旋转蒸发器 ( 上海亚荣生化仪器厂 )
Agilent 1100 高效液相色谱仪 ( 美国安捷伦科技有限公司 )
X-4 数字显微熔点测定仪 ( 温度未校正， 北京泰克仪器有限公司 )
FTIR-8400S 傅立叶变换红外光谱仪 (KBr 压片， 日本岛津 )
UV-1700 紫外分光光度计 ( 日本岛津 )
AV400 核磁共振仪 ( 瑞士 Bruker 公司 )
MATLCQ 电喷雾质谱仪 ( 美国 Finigan 公司 )
试剂 ： D101 型大孔吸附树脂 ( 天津市海光化工有限公司 )
柱色谱及薄层色谱用硅胶 ( 青岛海洋化工厂产品 )
HPLC 分析用甲醇、 乙腈为色谱纯 ( 美国 Fisher ChemAlert Guide) ； 水为纯净水 ； 其余试剂均为分析纯。
1.3 提取与分离
取粉碎的鹿药根茎 2.8kg， 加 5 倍体积的 90％乙醇浸泡 12h， 超声提取 40 ～ 50min， 过滤， 滤渣再依次加入 5 倍体积的 80 ％、 70 ％乙醇提取 2 次， 每次 40 ～ 50min， 合并提取 液， 减压浓缩至无醇味， 得棕色浸膏， 将浸膏水溶后过 D101 大孔吸附树脂柱层析， 先用蒸馏 水洗脱至流出液无色， 再依次用 30 ％、 50 ％、 70 ％、 90 ％浓度的乙醇洗脱， 每次洗脱至流出
液无色， 将各洗脱部分分别减压浓缩至干， 取其中 70％乙醇洗脱部分 (12g) 干法上硅胶柱 (200 ～ 300 目， 300g)， 氯仿 - 甲醇 (9 ∶ 1 ～ 2 ∶ 8， V/V) 梯度洗脱， 100mL/ 瓶接收。经薄 层色谱检测， 合并相同组分， 得流分 I、 II、 III、 IV、 V、 VI、 VII7 部分， 流分 III 经反复硅胶柱 色谱分离， 得到 1 个新单体化合物， 经 HPLC 检验纯度达到 97％。
2. 新化合物的理化性质、 波谱数据及结构确定
白色颗粒 ； mp.201 ～ 204℃ ； 易溶于甲醇 ； Libermann-Burchard 反应阳性， Molish 反应阳性， 与 Ehrish 试剂显红色， 提示化合物为呋甾皂苷 ； ESI-MS 给出正离子峰 m/z ： + + 13 977[M+H] ， 917[M-59(AcO)] ， 结 合 C NMR 谱给出分子式为 C47H76O21， 不饱和度为 10， 分配 在皂苷元的 A、 B、 C、 D、 E 5 个环， 3 个糖， 1 个双键和 1 个羰基上 ； IR(KBr)， 3421(OH)， 2931(C-H)， 1735(C ＝ O)， 1629(C ＝ C)， 1458， 1377， 1245， 1047， 977， 956， 918， 892， 864， 838， 810， 798， 其中 977， 918， 892， 864 为甾体皂苷的特征吸收谱带， ( 强度 ： 892 ＞ 918) 但不明 d)， δC17.25， 与其相关的 C-26 位上的两个氢的化学位移相 显， C-27 位甲基 δH0.567(3H， 似 (δH3.39， 3.38) 表明为 25R 构型甾体皂苷。 1
H NMR(C5D5N， 400MHz) 高场区出现甾体骨架的 4 个特征甲基质子信号 δ(ppm) ： 0.57(3H， d， J ＝ 5.6Hz， CH3-27)， 0.84(3H， s， CH3-18)， 0.95(3H， s， CH3-19)， 1.11(3H， d， J 13 在 HMQC 谱显示分别对应的 4 个甲基碳信号 C NMR(C5D5N， 100MHz)δ ： ＝ 7.2Hz， CH3-21)， 17.25， 17.41， 19.52， 9.85。 1
H NMR 低场区有 3 个特征的糖端基质子信号 δ ： 4.78(1H， d， J ＝ 7.6Hz， H-1of 13 Glu)， 4.90(1H， d， J ＝ 7.6Hz， H-1 of 26-O-Glu)， 5.40(1H， s， H-1of Rha)， C NMR 数据及 HMQC 显示 3 个相应的糖端基碳信号分别为 δ ： 99.7， 106.2， 99.4。1H NMR 高场区还有 1 个 鼠李糖的甲基质子信号 1.67(3H， d， J ＝ 6.8Hz， H-6 of Rha)， 对应的碳信号为 18.70， 与标 准糖的甲苷信号及偶合常数比较可知， 化合物有 3 个糖残基， 其中 2 个为葡萄糖， 均为 β 构 型， 1 个为鼠李糖， 为 α 构型， 碳谱中糖的信号没有大于 80ppm 的， 说明糖都为吡喃型糖。 在 HMBC 谱及 TOCSY 谱中显示 δ ： 106.2， 75.3， 78.1， 71.2， 78.6， 67.6 的 6 个碳上相连的氢相 关， 为 1 组葡萄糖碳信号， 此糖为 C-26 位苷化糖 ； 99.7， 99.4 显示为苷元 3 位羟基上连有两 分子糖基， δ99.7 与 δ3.99(H-3， δC77.76) 相关， HMBC 谱及 TOCSY 谱中显示与 δ99.7 为 1 个自旋体系的碳信号为 δ ： 77.6， 76.9， 76.8， 70.2， 61.1， 此为 1 组糖的碳信号， 与碳对应 的氢信号显示氢之间的偶合常数较大， 说明为葡萄糖， 葡萄糖基以 β-1 苷键与苷元 3 位 C 相连， 鼠李糖基以 α-1， 2 苷键与葡萄糖基 C-2 连接。 H NMR 低场区有 1 个烯氢 δ5.18(1H， br s) 信号， 对应 13C NMR 谱中有 2 个双键碳 信号 ： δ122.13 和 δ140.66， 结合 HMQC 显示 δ5.18 与 δ122.13 相关， 因此说明苷元有一 5(6) 个双键， 为Δ ， δ140.66(C-5)， δ122.13(C-6)。 13
C NMR 谱中给出甾体皂苷 C-22 的特征碳信号 δ109.95， 与 δ1.11(CH3-21) 远程 相关， HMQC 显示 C-22 为季碳， F 环开环， C-22 位应连有 1 个羟基 (OH) ； δ90.16 和 δ90.25 为 C16， 17 位由于氧取代而产生的重叠并移向低场的碳信号， δ90.25 与 δ0.84(CH3-18) 和 氢信号 δ1.11(CH3-21) 远程相关， 进一步确定 δ90.25 为 C-17 信号， C-17 连有 1 个 OH。 13
C NMR 最 低 场 有 1 个 δ170.93 羰 基 碳 信 号， 在 HMBC 谱 中 δ170.9 的 羰 基 与 δ2.26(3H， s， CH3-Ac)， δ5.74(δc76.15)， δ1.87(C-11) 的 质 子 相 关， 与同属植物 竹叶菜中分离得到的竹叶菜苷 C 比较， 其 12 位碳的化学位移不同， 在综合质谱中碎片
5917[M-59(AcO)]+， 说明 δ170.9 为乙酰基的羰基碳信号， 此基团连接在甾体母核的 12 位。 通过 HMQC、 HMBC 和 TOCSY 谱对分子中的 C、 H 信号进行了归属 ( 见表 1 和结构式 1)。相关 图谱见附图 1 ～ 7。
通过以上分析确定化合物为 26-O-β-D- 吡喃葡萄糖基 -(25R)- 呋甾 -5- 烯 -3β， 12， 17α， 22ξ， 26- 五醇 -12-O- 乙酰基 -3-O-α-L- 吡喃鼠李糖基 -(1 → 2)-β-D- 吡喃葡 萄糖苷， 结构式见附图 8。
表 1 新化合物的 13C NMR 和 1H NMR 数据 ( 溶剂 ： 氘代吡啶 ) 13 1
Table 1 C NMR and H NMR data of new compound(recorded in pyridine-d5)
实施例二新化合物的抗肿瘤活性检测 1. 实验材料与方法 1.1 仪器与试剂 仪器 ： 96 孔细胞培养板 (Costa 公司 ) 培养箱 (NUAIRΞUS AUTOFLOW CO2Water-Jacketed Incubator) 超净工作台 ( 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 ) Nikon eclipses TS100 TS-2 型脱色摇床 ( 海门市其林贝尔仪器制造有限公司 ) DG5032 型酶联免疫检测仪 ( 南京华东电子集团医疗装备有限责任公司 ) 试剂 ： 新生牛血清 ( 杭州四季青生物工程材料有限公司 ) RPMI-1640( 美国 Gibco 公司 ) 胰蛋白酶、 噻唑蓝 (MTT)、 Trypan Blue(Amresco 公司 ) 5- 氟脲嘧啶 (5-Fu) 和顺铂 (DDP)( 购于长春市吉林大学中日联谊医院 )二甲基亚砜 (DMSO)( 天津市北联精细化学品开发有限公司 )
1.2 细胞株
人肺腺癌 SPC-A-1 细胞株
1.3 受试药物
从 鹿 药 中 分 离 得 到 的 新 化 合 物 26-O-β-D- 吡 喃 葡 萄 糖 基 -(25R)- 呋 甾 -5- 烯 -3β， 12， 17α， 22ξ， 26- 五 醇 -12-O- 乙 酰 基 -3-O-α-L- 吡 喃 鼠 李 糖 基 -(1 → 2)-β-D- 吡喃葡萄糖苷。样品用 DMSO 溶解配制为 2mg·mL-1 的母液备用。用时 加培养液稀释至所需浓度。
1.4 操作步骤
(1) 单细胞悬液的制备 ： 将人肺腺癌 SPC-A-1 细胞株用含 10 ％新生牛血清的 RPMI1640 培养液， 在含 5％ CO2、 37℃饱和湿度的培养箱中培养， 0.25％胰蛋白酶消化传代， 4 调整细胞浓度为 1×10 个 /mL， 制成细胞悬液。
(2) 接种与培养 ： 取细胞悬液接种于 96 孔板上， 100μL/ 孔， 将培养板转入恒温 CO2 培养箱中， 培养 24h。
(3) 加药 ： 吸去培养板中的培养液， 加入含有药物的培养液 200μL， 药物设 6 个不 -1 同终浓度组 (1.25、 2.5、 5.0、 10、 20、 40μg· mL )， 同时设阳性对照组 ( 抗癌药顺铂、 5- 氟脲 -1 -1 嘧啶， 各设 10μg·mL 和 40μg·mL 两个终浓度组 )， 阴性对照组 ( 含溶媒 DMSO 的培养 液 )， 另设调零组 ( 只加培养液 )， 每组设 6 复孔， 加药后置 37℃、 5％ CO2 培养箱中， 继续培 养 48h。
(4) 染色 ： 将含药培养液吸去， 加入体积比为 4 ∶ 1 的无血清培养液和 MTT( 终浓 -1 度 5mg·mL ) 共 100μL， 继续孵育 4h， 小心吸去上清液后每孔加入 150μLDMSO， 放于震荡 器上震荡使结晶完全溶解 (5min)。
(5) 比色 ： 用酶标仪在 570nm 主波长， 630nm 副波长下检测各孔的吸光度 (OD 值 )， 计算细胞生长抑制率。1.5 数据处理
细胞生长抑制率的计算 ：
细胞生长抑制率 (％ ) ＝ (1-OD 值均数加药孔 /OD 值阴性对照 )×100％
2. 实验结果与分析
MTT 法是一种检测细胞生长的方法。 药物对细胞生长的抑制作用以 IC50 表示， 判断 -1 -1 -1 标准 ： IC50 ＞ 100μg· mL ( 无效 ) ； 100μg· mL ＞ IC50 ＞ 30μg· mL ( 弱效 ) ； 30μg· mL-1 ＞ IC50 ＞ 10μg·mL-1 ＜ ( 有效 ) ；IC50 ＜ 10μg·mL-1( 强效 )。
新化合物对人肺腺癌 SPC-A-1 细胞生长的影响见表 2， 结果表明， 从鹿药中提取 分离得到的新化合物对人肺腺癌 SPC-A-1 细胞生长具有抑制作用， 且呈良好的量效线性关 -1 系， 抑制作用随样品浓度增加而增强， 样品浓度为 10μg·mL 时对细胞生长的抑制率达 到 86％， 与同浓度的阳性对照物顺铂的抑制作用接近， 比 5- 氟脲嘧啶的抑制率高， IC50 为 -1 7.67μg·mL ， 说明此新化合物具有强效抗人肺腺癌 SPC-A-1 细胞生长的活性。
表 2 新化合物对人肺腺癌 SPC-A-1 细胞生长的影响
Table 2 Effect of new compound on SPC-A-1 cell
注： [ 小写字母表示 5％显著水平， 大写字母表示 1％极显著水平 ]