能够特异性结合AΒ寡聚体的抗体及其应用.pdf

能够特异性结合 Aβ 寡聚体的抗体及其应用
    【技术领域】
     本发明涉及可特异性地结合 Aβ 寡聚体的抗体及其应用。背景技术 多种证据已显示， 记忆的衰退起因于由可溶性 Aβ 寡聚体触发的突触功能障碍 ( 参见非专利文献 1 和 2)。 Aβ 寡聚体的过量积聚与沉着可触发一系列病理学级联反应， 导 致阿尔茨海默氏病 (AD)。因此， 靶向 Aβ 寡聚体的治疗介入对阻断这些级联反应可能是有 效的。然而， 对于该淀粉状蛋白级联的假说中， 导致神经退行性变， 特别是由 Aβ 寡聚体介 导的神经变性的核心分子， 其实验证据最早来自体外实验 ( 参见非专利文献 3)。该神经变 性未在体内得到直接证实。之前报道的体内实验最大的缺陷在于， 它们无法证明内源 Aβ 寡聚体的突触毒性。这是由于缺乏对构象具有特异性的分子工具 ( 参见非专利文献 4)。在 阿尔茨海默氏病小鼠模型中亦难以解决的问题， 还没有办法在人类脑内解决。因而， 内源 Aβ 的体内神经毒性往往受到忽视。为何在人类内嗅皮质中的 NFT 形成与神经细胞丧失发
     生于老年斑形成之前， 以及 Aβ 如何涉及该机制， 人们都尚不知晓。
     涉及现行发明的现有技术信息如下所示 ：
     [ 非专利文献 1]Klein WL， Trends Neurosci.24 ： 219-224， 2001
     [ 非专利文献 2]Selkoe DJ， Science 298 ： 789-791， 2002
     [ 非专利文献 3]Hass C et al. ： Nature Review 8 ： 101-12， 2007
     [ 非专利文献 4]Lee EB， et al. ： J.Bio1.Chem.281 ： 4292-4299， 2006
     本发明的公开
     [ 本发明需解决的问题 ]
     本发明是鉴于上述情况完成的。本发明的一个目的为提供可特异性地结合 Aβ 寡 聚体的抗体及其应用。更加具体而言， 本发明提供了可特异性地结合 Aβ 寡聚体的抗体， 以 及使用该抗体检测 Aβ 寡聚体的方法， 使用该抗体诊断阿尔茨海默氏病的方法， 以及包含 该抗体的药剂。
     [ 解决该问题的手段 ]
     本发明人产生了这样的单克隆抗体， 它们仅对可溶性淀粉样蛋白 β(Aβ) 寡聚体 具有特异性， 而不识别属于生理性分子的可溶性 Aβ 单体， 此外， 本发明人确证了所述抗体 具有下列功能 ：
     (1) 抗神经毒性活性 ；
     (2) 阻抑 Aβ 淀粉样蛋白原纤维形成的活性 ；
     (3) 仅识别 Aβ 寡聚体的特异性 ；
     (4) 在 AD 脑中捕获 Aβ 寡聚体的能力 ； 以及
     (5) 预防类阿尔茨海默氏病表型 ( 记忆损害， 脑部 Aβ 积聚水平 ) 在 APPswe 转基 因小鼠 (Tg2576) 中发展的能力。
     使用超滤 / 分子筛方法， 在产生的抗体中， 确定了单克隆抗体 1A9 与 2C3 特异性的识别 30kDa 或更大， 主要为 100kDa 或更大的寡聚体， 但不识别大约 4.5kDa 左右的单体。通 过测量两种抗体在已分化为神经细胞的 PC12 细胞中针对 Aβ1-42- 诱导的神经毒性的中和 作用， 确证了它们具有神经毒性中和活性。硫代黄素 T 测定与电子显微镜观察显示所述抗 体具有阻抑 Aβ 淀粉样蛋白原纤维形成的活性。 通过下述方法确证了 1A9 与 2C3 在 AD 脑中 捕获 Aβ 寡聚体的能力， 即使用这些抗体在具有 SDS 稳定性的 4-， 5-， 8- 以及 12- 聚体的存 在下进行免疫沉淀反应。进一步， 为确定在人脑中的体内神经毒性， 对在主要为 Braak NFT I 到 III 期的人类内嗅皮质中所述抗体识别的多聚体的量进行了测量。对据报道在动物研 究中具有神经毒性的 12- 聚体加以特别关注， 结果确证了该多聚物的积聚发生于认知机能 障碍出现之前， 并随着 Braak NFT 期的进展而增加。该结果首次显示， 所述 12- 聚体， 其被 所述抗体所特异性识别， 是一种构象聚合体 (conformational assembly)， 在人脑中导致体 内神经毒性。本发明人亦发现由所述抗体识别的寡聚构象结构存在于脑脊液 (CSF) 中， 并 在 AD 患者中增加。 本发明人将 1A9 或 2C3 与其它神经病症同样地通过静脉内注射进行被动 免疫治疗。经确证 Tg2576 小鼠通过亚慢性被动免疫治疗而受保护免于罹患记忆缺陷， 老年 斑形成， 突触障碍与 Aβ 积聚， 且无有害副作用。本发明人获得的该结果首次说明， 单克隆 1A9 与 2C3 很有希望被选择作为在 Tg2576 小鼠中预防类阿尔茨海默氏病表型的治疗抗体， 其可望通过常规外周静脉内给药显示其效应， 从而无需考虑脑内转移 (brain transfer) 的 问题。
     本发明人亦确证使用所述 1A9 与 2C3 抗体的被动免疫疗法可阻抑老年斑淀粉状蛋 白形成以及肿大变性的神经突形成。进一步， 本发明人发现投入血液的 1A9 与 2C3 中有一 部分转移入脑部。
     如上所述， 本发明人在本文中公开了单克隆 1A9 与 2C3——它们是特异性结合 Aβ 寡聚体的抗体——符合了所有诊断性 / 治疗性抗体的标准， 并且是供诊断 / 预防阿尔茨海 默氏病的治疗抗体的有望候选。
     本发明人成功获取了 E12， 1C10 与 4D3 抗体， 它们与所述 1A9 与 2C3 抗体相似， 不 识别 Aβ 单体， 但可特异性地结合 Aβ 寡聚体， 且发现其中所述 E12 抗体具有阻抑 Aβ 淀粉 样蛋白微纤维形成的活性。
     因此， 本发明认为上述 E12， 1C10 与 4D3 亦为供诊断 / 预防阿尔茨海默氏病的治疗 抗体的有望候选。
     更加具体而言， 本发明提供了下述 ：
     [1] 一种可结合 Aβ 寡聚体的抗体， 其中所述抗体不结合 Aβ 单体 ；
     [2] 一种可结合 Aβ 寡聚体的抗体， 所述 Aβ 寡聚体可结合包含具有 SEQID NO ： 1 的氨基酸序列的 H 链与具有 SEQ ID NO ： 3 的氨基酸序列的 L 链的抗体 ；
     [3] 一种可结合 Aβ 寡聚体的抗体， 所述 Aβ 寡聚体可结合包含具有 SEQID NO ： 21 的氨基酸序列的 H 链与具有 SEQ ID NO ： 23 的氨基酸序列的 L 链的抗体 ；
     [4] 一种可结合 Aβ 寡聚体的抗体， 所述 Aβ 寡聚体可结合包含具有 SEQID NO ： 41 的氨基酸序列的 H 链与具有 SEQ ID NO ： 43 的氨基酸序列的 L 链的抗体 ；
     [5] 下述 (1) 到 (20) 中任一项的抗体 ：
     (1) 一种抗体， 其包含具有 SEQ ID NO ： 9 的氨基酸序列作为 CDR1， SEQ ID NO ： 11 的氨基酸序列作为 CDR2， 以及 SEQ ID NO ： 13 的氨基酸序列作为 CDR3 的 H 链 ；(2) 一种抗体， 其包含具有 SEQ ID NO ： 15 的氨基酸序列作为 CDR1， SEQ ID NO ： 17 的氨基酸序列作为 CDR2， 以及 SEQ ID NO ： 19 的氨基酸序列作为 CDR3 的 L 链 ；
     (3) 一种抗体， 其包含 (1) 的 H 链与 (2) 的 L 链 ；
     (4) 一种抗体， 其包含具有 SEQ ID NO ： 5 的氨基酸序列作为 VH 的 H 链 ；
     (5) 一种抗体， 其包含具有 SEQ ID NO ： 7 的氨基酸序列作为 VL 的 L 链 ；
     (6) 一种抗体， 其包含 (4) 的 H 链与 (5) 的 L 链 ；
     (7) 一种抗体， 其包含具有 SEQ ID NO ： 29 的氨基酸序列作为 CDR1、 SEQ ID NO ： 31 的氨基酸序列作为 CDR2、 以及 SEQ ID NO ： 33 的氨基酸序列作为 CDR3 的 H 链 ；
     (8) 一种抗体， 其包含具有 SEQ ID NO ： 35 的氨基酸序列作为 CDR1， SEQ ID NO ： 37 的氨基酸序列作为 CDR2， 以及 SEQ ID NO ： 39 的氨基酸序列作为 CDR3 的 L 链 ；
     (9) 一种抗体， 其包含 (7) 的 H 链与 (8) 的 L 链 ；
     (10) 一种抗体， 其包含具有 SEQ ID NO ： 25 的氨基酸序列作为 VH 的 H 链 ；
     (11) 一种抗体， 其包含具有 SEQ ID NO ： 27 的氨基酸序列作为 VL 的 L 链 ；
     (12) 一种抗体， 其包含 (10) 的 H 链与 (11) 的 L 链 ；
     (13) 一种抗体， 其包含具有 SEQ ID NO ： 49 的氨基酸序列作为 CDR1， SEQ ID NO ： 51 的氨基酸序列作为 CDR2， 以及 SEQ ID NO ： 53 的氨基酸序列作为 CDR3 的 H 链 ； (14) 一种抗体， 其包含具有 SEQ ID NO ： 55 的氨基酸序列作为 CDR1， SEQ ID NO ： 57 的氨基酸序列作为 CDR2， 与 SEQ ID NO ： 59 的氨基酸序列作为 CDR3 的 L 链 ；
     (15) 一种抗体， 其包含 (13) 的 H 链与 (14) 的 L 链 ；
     (16) 一种抗体， 其包含具有 SEQ ID NO ： 45 的氨基酸序列作为 VH 的 H 链 ；
     (17) 一种抗体， 其包含具有 SEQ ID NO ： 47 的氨基酸序列作为 VL 的 L 链 ；
     (18) 一种抗体， 其包含 (16) 的 H 链与 (17) 的 L 链 ；
     (19) 一种抗体， 其是在 (1) 到 (18) 中任一项的抗体中替换， 缺失， 添加和 / 或插入 一个或多个氨基酸而得到的， 并具有与所述 (1) 到 (18) 中任一项的抗体等价的活性 ； 以及
     (20) 一种抗体， 其可结合 (1) 到 (18) 中任一项的抗体所结合的表位 ；
     [6][5] 所述的抗体， 其中所述抗体为嵌合抗体或人源化抗体 ；
     [7] 一种组合物， 其包含 [1] 到 [6] 任一项所述的抗体与药用载体 ；
     [8] 一种抗认知机能障碍剂， 其包含 [1] 到 [6] 中任一项所述的抗体或 [7] 的组合 物作为活性成分 ；
     [9] 一种阿尔茨海默氏病治疗剂， 其包含 [1] 到 [6] 中任一项所述的抗体或 [7] 的 组合物作为活性成分 ；
     [10] 一种阻抑阿尔茨海默氏病进展的药剂， 其包含 [1] 到 [6] 中任一项所述的抗 体或 [7] 的组合物作为活性成分 ；
     [11] 一种阻抑老年斑形成的药剂， 其包含 [1] 到 [6] 中任一项所述的抗体或 [7] 的组合物作为活性成分 ；
     [12] 一种阻抑 Aβ 积聚的药剂， 其包含 [1] 到 [6] 中任一项所述的抗体或 [7] 的 组合物作为活性成分 ；
     [13] 一种抗神经毒性剂， 其包含 [1] 到 [6] 中任一项所述的抗体或 [7] 的组合物 作为活性成分 ；
     [14] 一种抑制 Aβ 淀粉样蛋白原纤维形成的试剂， 其包含 [1] 到 [6] 中任一项所 述的抗体或 [7] 的组合物作为活性成分 ；
     [15] 一种抗突触毒性剂， 其包含 [1] 到 [6] 中任一项所述的抗体或 [7] 的组合物 作为活性成分 ；
     [16] 一种预防和 / 或治疗认知机能障碍的方法， 其包括将 [1] 到 [6] 中任一项所 述的抗体或 [7] 的组合物作为活性成分施用的步骤 ；
     [17] 一种预防和 / 或治疗阿尔茨海默氏病的方法， 其包括将 [1] 到 [6] 中任一项 所述的抗体或 [7] 的组合物作为活性成分施用的步骤 ；
     [18] 一种阻抑阿尔茨海默氏病进展的方法， 其包括将 [1] 到 [6] 中任一项所述的 抗体或 [7] 的组合物作为活性成分施用的步骤 ；
     [19] 一种阻抑老年斑形成的方法， 其包括将 [1] 到 [6] 中任一项所述的抗体或 [7] 的组合物作为活性成分施用的步骤 ；
     [20] 一种阻抑 Aβ 积聚的方法， 其包括将 [1] 到 [6] 中任一项所述的抗体或 [7] 的组合物作为活性成分施用的步骤 ；
     [21] 一种中和神经毒性的方法， 其包括将 [1] 到 [6] 中任一项所述的抗体或 [7] 的组合物作为活性成分施用的步骤 ； [22] 一种抑制 Aβ 淀粉样蛋白原纤维形成的方法， 其包括将 [1] 到 [6] 中任一项 所述的抗体或 [7] 的组合物作为活性成分施用的步骤 ；
     [23] 一种中和突触毒性的方法， 其包括将 [1] 到 [6] 中任一项所述的抗体或 [7] 的组合物作为活性成分施用的步骤 ；
     [24] 一种检测 Aβ 寡聚体的方法， 其包括使用 [1] 到 [6] 中任一项所述的抗体检 测自受试者收集的试样中所含的 Aβ 寡聚体的步骤 ；
     [25] 一种诊断受试者是否可能为阿尔茨海默氏病患者的方法， 其包括使用 [1] 到 [6] 中任一项所述的抗体在收集自受试者的试样中检测 Aβ 寡聚体 ；
     [26] 一种诊断受试者是否可能为阿尔茨海默氏病患者的方法， 其包括下述步骤 ：
     (a) 使收集自受试者的试样与 [1] 到 [6] 中任一项所述的抗体接触 ； 以及
     (b) 测定所述试样中 Aβ 寡聚体的量，
     其中当步骤 (b) 中测得的量高于健康个体的量时， 确定所述受试者可能为阿尔茨 海默氏病患者 ；
     [27] 一种诊断受试者是否可能为阿尔茨海默氏病患者的方法， 其包括下述步骤 ：
     (a) 使收集自受试者的试样与 [1] 到 [6] 中任一项所述的抗体以及可结合 Aβ 单 体的抗体接触 ； 以及
     (b) 测定所述试样中 Aβ 寡聚体对 Aβ 单体的比例，
     其中当步骤 (b) 中测得的比例高于健康个体的比例时， 确定所述受试者可能为阿 尔茨海默氏病患者 ；
     [28][24] 到 [27] 中任一项所述的方法， 其中所述试样为血液或脑脊液 ；
     [29] 一种用于 [24] 到 [27] 中任一项所述的方法的药剂 ； 以及
     [30] 一种用于 [24] 到 [27] 中任一项所述的方法的试剂盒。
     进一步， 本发明提供了下述 ：
     [31][1] 到 [6] 中任一项所述的抗体或 [7] 的组合物在制备抗认知机能障碍剂中 的应用 ；
     [32][1] 到 [6] 中任一项所述的抗体或 [7] 的组合物在制备阿尔茨海默氏病的治 疗剂中的应用 ；
     [33][1] 到 [6] 中任一项所述的抗体或 [7] 的组合物在制备阻抑阿尔茨海默氏病 的进展的药剂中的应用 ；
     [34][1] 到 [6] 中任一项所述的抗体或 [7] 的组合物在制备阻抑老年斑形成的药 剂中的应用 ；
     [35][1] 到 [6] 中任一项所述的抗体或 [7] 的组合物在制备阻抑 Aβ 积聚的药剂 中的应用 ；
     [36][1] 到 [6] 中任一项所述的抗体或 [7] 的组合物在制备中和 ( 阻抑 ) 神经毒 性的药剂中的应用 ；
     [37][1] 到 [6] 中任一项所述的抗体或 [7] 的组合物在制备抑制 Aβ 淀粉样蛋白 原纤维形成的药剂中的应用 ；
     [38][1] 到 [6] 中任一项所述的抗体或 [7] 的组合物在制备中和 ( 阻抑 ) 突触毒 性的药剂中的应用 ； [39][1] 到 [6] 中任一项所述的抗体或 [7] 的组合物， 用于预防和 / 或治疗认知机 能障碍 ；
     [40][1] 到 [6] 中任一项所述的抗体或 [7] 的组合物， 用于预防和 / 或治疗阿尔茨 海默氏病 ；
     [41][1] 到 [6] 中任一项所述的抗体或 [7] 的组合物， 用于阻抑阿尔茨海默氏病的 进展 ；
     [42][1] 到 [6] 中任一项所述的抗体或 [7] 的组合物， 用于阻抑老年斑形成 ；
     [43][1] 到 [6] 中任一项所述的抗体或 [7] 的组合物， 用于阻抑 Aβ 积聚 ；
     [44][1] 到 [6] 中任一项所述的抗体或 [7] 的组合物， 用于中和 ( 阻抑 ) 神经毒 性；
     [45][1] 到 [6] 中任一项所述的抗体或 [7] 的组合物， 用于抑制 Aβ 淀粉样蛋白原 纤维形成 ；
     [46][1] 到 [6] 中任一项所述的抗体或 [7] 的组合物， 用于中和 ( 阻抑 ) 神经毒 性；
     本发明的效果
     由本发明提供的抗体预期将对以引起阿尔茨海默氏病病理状态的责任分子为对 象的选择性预防 / 治疗方法的建立， 以及阿尔茨海默氏病早期诊断标志的建立产生很大的 贡献。 本发明的发明人获得的证据显示， 即使在靶向脑内病理状态的抗体疗法中， 外周的静 脉内施药已经足够， 无需考虑脑内转移。 从而， 本发明预期将大大加快针对阿尔茨海默氏病 的抗体药物的进展。
     附图简述
     图 1 的照片与图片显示对寡聚体特异性的抗体的生成和特征确定的结果。 A： 免疫 原的电泳。无 Aβ1-42 单体污染的 Aβ1-42 四聚体 ( 红色箭头 ) 使用 SDS-PAGE 分离。泳道
     1： 溶解于 10mM 磷酸缓冲液中的 Aβ1-42 ； 泳道 2 ： 溶解于去离子蒸馏水中的 Aβ1-42。 B： Aβ 淀粉样蛋白， 其不溶于缓冲液， 但可使用甲酸自阿尔茨海默氏病患者的脑中提取出来， 使用 阳性杂交瘤细胞培养物的上清液对其进行免疫沉淀， 并使用蛋白 -G 琼脂糖 (Amersham) 选 择性地分离其免疫复合物。测试了九个克隆 ； 泳道 2( 红色星号 ) 为 1A9 而泳道 6( 红色双 星号 ) 为 2C3。C ： 一个条件化培养基 SEC 的洗脱曲线 (profile)。在所述 24 个经 SEC 收集 的级分中， 对级分 8， 13 与 16 进行 1A9 免疫沉淀。Aβ 免疫反应性使用 4G8 检测。红色箭头 指示三聚体， 而空心箭头指示二聚体。星号 (*) 指示抗小鼠 IgG 轻链。
     图 2 的 照 片 与 图 片 显 示 1A9 与 2C3 的 抗 毒 性 活 性。A 到 F ： 经 NGF 处 理 的 PC12(PC12N) 细胞的代表性图像， 这些细胞在 37℃下在所述抗体存在或不存在的情况下暴 露于无聚合种 (seed-free) 的 Aβ1-42 48 小时 ( 每个小图的左半部分 )。钙黄绿素 AM/PI 染色的代表图， 其中活细胞染为绿色而死细胞染为红色 ( 每个小图的右半部分 )。G ： 与下 列抗体一起暴露于无聚合种的 Aβ1-42(25μM) 的细胞的存活率 ： 非特异性 IgG2b( 实心方 块)； 4G8( 空心三角 ) ； 1A9( 空心方块 ) ； 以及 2C3( 实心圆 )。
     图 3 的照片与图片显示由 1A9 与 2C3 所靶向的毒性 Aβ 聚集聚合体的大小与形态 特征。A ： 对 Aβ1-42(25μM) 的 540000x g 上清使用多个超滤膜进行连续的分子筛过程， 超 滤膜的分子量截留值为 3， 10， 30 与 100kDa(Microcon)。由此被分级的四种类型的滤液如 下命名 ： 级分 1( ＜ 3kDa)， 级分 2(3 到 10kDa)， 级分 3(10 到 30kDa)， 级分 4(30 到 100kDa) ； 以及最后保留的级分 5( ＞ 100kDa)。在上述每个级分中 Aβ1-42 的存在均用 4G8 免疫印 迹法加以检测。B ： 用所述五个级分在 37℃下处理 48 小时的经 NGF 处理的 PC12(PC12N) 细 胞的代表性图像。每个级分的毒性如上面图 2 所述的方法衡量。C ： 经 Aβ1-42 的 540000x g 上清液以及五个级分 ( 级分 1 到 5) 处理的细胞的活力。两次独立实验得到相似的结果。 其值以相对对照的百分比 ( 平均值 ±SD) 表示。D ： 所述五个级分 ( 级分 1 到 5) 的点印迹 分析。使印迹与 A11、 1A9， 2C3 和 4G8 反应。E ： 5 个级分的 AFM 图。在具有最强毒性的级分 5(Fr.5) 中， 除了粒状分子外， 还发现了环形与珠形结构。
     图 4 的照片与图片显示 1A9 与 2C3 阻抑 Aβ 淀粉样蛋白原纤维形成的活性。A ： 通 过 ThT 分析法在 37℃下监视 Aβ1-42 在多种浓度下 (10μM( 空心方块 )， 25μM( 实心菱形 ) 与 50μM( 空心圆 )) 的淀粉样蛋白原纤维形成直至 72 小时。B ： 对于 2C3( 空心圆 )， 观察 到了针对 Aβ1-42 淀粉样蛋白原纤维形成的共存抗体依赖性抑制 (coexsisting antibody dose-dependent inhibition)。与之相对， 1A9( 空心方块 )， 4G8( 实心三角 ) 与非特异性 IgG( 实心方块 ) 抗体并不抑制无种子的 Aβ1-42 的原纤维形成性组装 (ThT 阴性 540000x g 上清 )。 C： 对于 2C3( 空心圆 )， 观察到了针对 Aβ1-42 原纤维形成性组装的共存抗体依赖性 抑制， 且 1A9( 空心方块 ) 于 3μM 亦见到近乎完全的抑制。D ： 预培育 24 小时以供 Aβ1-42 淀粉样蛋白原纤维形成， 此后添加的所有测试抗体均无法使 Aβ1-42 淀粉样蛋白纤维溶解 或解聚。 E到G ： Aβ1-42 在不存在 2C3 与 1A9( 小图 E)、 或存在 2C3( 小图 F)、 或存在 1A9( 小 图 G) 情况下的 EM 图像。
     图 5 的照片与图片为关于与毒性相关的 Aβ1-42 寡聚体。A ： 点印迹分析法 ( 小 图 A 的上半部分 ) ： Aβ1-42 单体 (25μM) 在 37℃下培育特定时间 (0 到 72 小时 )， 并固化 于硝酸纤维素膜上， 并对其用 A11， 1A9， 2C3 或 4G8 进行点印迹分析。对每个抗体测试了免 疫反应性阳性结构的出现。免疫反应性强度分析 ( 小图 A 的下边部分 ) ： 点印迹分析的结果使用 Multi Gauge v 3.0 软件 (Fuji Film， Tokyo) 进行半定量的分析。为将所述寡聚 体形成与淀粉样蛋白原纤维形成相关联， 在同一个时间轴上叠加了 ThT 荧光值 ( 右边的 Y 轴 )。B ： 在 37 ℃下培育 0， 2， 4 与 24 小时后的 Aβ1-42 聚合体， 以及所述 Aβ1-42 聚合体 在进一步培育 48 小时后的变化。所述 Aβ1-42 聚合体通过 4G8 免疫印迹法检测。C ： 上述 多种 Aβ1-42 聚合体的毒性活性。神经细胞的活力通过图 2 中所述 LIVE/DEAD 分析法确 定。D ： 使用多种 Aβ1-42 聚合体 ( 在 37℃下 0 与 2 小时形成的 Aβ1-42 聚合体 (“0h” 与 “2h” )； 以及在 540000x g 下超速离心两小时后收集的 ThT 阳性上清 (“2h sup” ))， 测量 1A9 与 2C3 的抗神经毒性活性。在所述抗体存在或不存在情况下暴露于多种 Aβ1-42 聚合 体的 PC12N 细胞的代表性的图像示于小图 D 的左半部分 (a ： “0h” ； b： “2h” ； c： “2hsup” ； d： “2h sup” +IgG2b ； e： “2h sup” +1A9 ； f： “2h sup” +2C3)。在所述抗体存在或不存在情况下 暴露于多种 Aβ1-42 聚合体的细胞的活力以相对于对照的百分比 ( 平均值 ±SD) 表示， 并 示于小图 D 的右半部分。较之 “0h” Aβ1-42 聚合体， “2h” Aβ1-42 聚合体降低了神经毒性。 “2h sup” 使神经毒性恢复到类似于 “0h” Aβ1-42 聚合体的程度。非特异性的 IgG2b 无法 阻断 “2h sup” Aβ1-42 聚合体的神经毒性诱导。单克隆 1A9 完全抑制了 “2h sup” 诱导的 神经毒性， 而 2C3 抑制该毒性的能力略为低下。在使用所述两种单克隆抗体 (mAb) 的实验 中， 在 mAb ∶ Aβ 比例为 1 ∶＜ 25 到 50 时观察到了所述 mAb 的抗毒性活性。这表明结构 上不同的寡聚性 1A9 或 2C3 聚合体以相对低的浓度存在。 图 6 的照片和图显示可溶性 1A9 或 2C3 寡聚体存在于人类脑中。针对 Aβ 寡聚体 的抗体只有在用蛋白酶 K 预处理后方可在 AD 脑中检出老年斑与血管淀粉样蛋白。 A： 1A9 染 色； B： 2C3 染色 ； 以及 C ： A11 染色。D ： 用 4G8 对经 1A9 或 2C3 免疫沉淀的 Aβ 在可溶于缓 冲液的 AD 脑中 ( 泳道 1， 2， 4 与 5) 与健康对照脑中 ( 泳道 3 与 6) 进行免疫印迹分析。1A9 与 2C3 的代表性结果分别示于所述小图的左边与右边部分。E 与 F ： 在自健康老年人群的 50 个尸体剖检病例中获取的人内嗅皮质中， 可溶性 1A9 免疫反应性 12- 聚体 ( 小图 E) 与可 溶性 2C3- 免疫反应性 12- 聚体 ( 小图 F) 的半定量分析 (BraakNFT I 期或 II 期 ： n ＝ 35 ； Braak NFT III 期或 IV 期 ： n ＝ 13 ； 以及 Braak NFT ＞ IV 期， AD 病例 ： n ＝ 2)。
     图 7-1 的图片显示可溶性 1A9 或 2C3 寡聚体存在于人类 CSF 中。用汇集的全脑 脊液 (CSF)(AD ＝ 10， NC ＝ 10)( 小图 A 与 B) 与汇集的无脂蛋白 (lipoprotein-depleted) CSF(AD ＝ 10， NC ＝ 10)( 小图 C 与 D) 进行尺寸排阻色谱 (SEC)。在小图 A 与 B 中， 通过对 收集的级分进行 BNT77-BA27 与 BNT77-BC05 ELISA 分析， 考察了 Aβ40 与 Aβ42 单体的分 布。小图 C 与 D 显示被 1A9/2C3 混合抗体捕获的 Aβ40 与 Aβ42 单体的存在。
     图 7-2 为图 7-1 的继续。在 12 个 AD 病例 ( 空心圆 ) 与 13 个 NC 病例 ( 实心圆 ) ( 小图 E 与 G) 中测定了寡聚性 1A9 聚合体的量 (1A9-BC05 与 1A9BA27ELISA) 或 2C3 聚合体 的量 (2C3-BC05 与 2C3-BA27 ELISA)。寡聚体 / 单体比例分别示于小图 F(1A9) 与 H(2C3)。
     图 8 的图片显示可通过被动免疫接种治疗来预防 Tg2576 小鼠记忆障碍的发病。 将 13 月龄的 Tg2576 小鼠分为下列三组以实施学习 / 行为测试 ： PBS 施用组 ： n ＝ 10 ； 1A9 施用组 ： n ＝ 13 ； 以及 2C3 施用组 ： n ＝ 11。所有这些测得的值均示为平均值 ±SE。(A) Y- 迷宫测试。在每个组中测定 8 分钟期间的 Y- 迷宫任务中自发改变行为 (spontaneous * alteration behavior)。 单 向 ANOVA 的 结 果 如 下 所 述 ： F(1， 52) ＝ 3.09， p ＜ 0.05 ； 与 施 用 PBS 的 Tg2576 小 鼠 相 比 较 p ＜ 0.05。(B) 新 物 体 识 别 测 试。 保 持 期 (retention
     session) 在训练 24 小时后进行。 在 10 分钟期间的新物体识别测试中测定每组的探查偏好 (exploratorypreference)。双向 ANOVA 的结果如下所述 ： 训练 / 保持， F(1， 64) ＝ 31.53， p ＜ 0.01 ； 动物组， F(2， 64) ～ 7.49， p ＜ 0.01 ； 所述动物组进行的反复训练 / 记忆， F(2， 64) ** ＝ 10.12， p ＜ 0.01 ； 与对应的非训练小鼠相比较 p ＜ 0.01。## 与施用 PBS 的 Tg2576 小 鼠相比较 p ＜ 0.01。(C) 在水迷宫测试中 60 秒期间内对每个组测量游泳路程长度。双向 ANOVA 的结果如下所述 ： 试验， F(9， 320) ＝ 20.46， p ＜ 0.01 ； 动物组， F(2， 320) ＝ 12.59， ** p ＜ 0.01 ； 所述动物组进行的反复试验， F(18， 320) ＝ 1.78， p ＜ 0.05 ； p ＜ 0.05， 与施用 PBS 的 Tg2576 小鼠相比较 p ＜ 0.01。 有条件的恐惧学习测试 (fear-conditioned learning test) ： 确定了背景依赖性 (context dependent)(D) 与线索依赖性 (clue dependent) 僵 直时间 (freezingtime)。双向 ANOVA 结果如下所述 ： 背景依赖性测试， F(2， 32) ＝ 5.94， p * ＜ 0.01 ； 线索依赖性测试， F(2， 32) ＝ 7.33， p ＜ 0.01 ；与施用 PBS 的 Tg2576 小鼠相比较 ** p ＜ 0.05 ； 同样比较 p ＜ 0.01。
     图 9 的图片与照片显示被动免疫疗法可在 Tg2576 中预防脑内 Aβ 积聚。对于三 组 13 月龄的 Tg2576 小鼠 (PBS 施用组 ： n ＝ 10 ； 1A9 施用组 ： n ＝ 13 ； 以及 2C3 施用组 ： n ＝ 11)， 将海马与大脑皮层以三个连续步骤中提取出来， 制备可溶于缓冲液的级分、 可溶于 SDS 的级分、 和可用甲酸 (FA) 抽提的级分。对每个部分进行 Aβ 特异性 ELISA 测定 (WAKO 试剂盒 ： 对 Aβx-40， BNT77-BA27 ； 对 Aβx-42， BNT77-BC05)。 发 现 Aβ40(SDS 与 FA) 与 Aβ42(SDS) 的积聚仅在经 1A9 处理的组中被显著阻抑。A11- 阳性寡聚体 (4- 聚体 ) 的积 聚阻抑作用在来自两个经抗体处理的组中 SDS 可溶性大脑皮层级分中得到了确证。
     图 10 的照片与图片显示在 Tg2576 的血浆与脑中的 Aβ 寡聚体。 A与B ： 作为 ELISA 分析的结果， 在 PBS 施用组与免疫治疗组间未观察到血浆中 Aβx-40 与 Aβx-42 的量有显 著变化。C ： 类似地， 在经测试的三个组中未观察到 Aβ40/Aβ42 比例的变化。D ： 作为使用 汇集的脑组织匀浆进行点印迹分析的结果， 在三个经测试的组间未观察到可溶于生理盐水 的 A11 阳性寡聚体量有变化。海马 ( 左边小图 ) 与大脑皮层 ( 右边小图 )。PBS 施用组 ： n ＝ 10 ； 1A9 施用组 ： n ＝ 13 ； 以及 2C3 施用组 ： n ＝ 11。E ： 根据使用抗寡聚体抗体 A11 的免 疫印迹分析， 在经 SDS 抽提的大脑皮层级分 ( 右边小图 ) 中 Aβ 四聚体的免疫反应性在经 施用 1A9 与 2C3 的组中较之施用 PBS 的组降低。而另一方面， 在海马 ( 左边小图 ) 中未观 察到此现象。F ： 自这些组中每一个收集血液 ( 除去白蛋白的血浆， 小图 F 的上边部分 ； 除 去白蛋白 / 脂蛋白的血浆， 小图 F 的下边部分 )， 并对其进行 A11 点印迹分析。其结果， 发 现 A11 免疫反应性在经施用 1A9 与 2C3 的组中较之 PBS 施用组增加 ( 小图 F)。2C3 寡聚体 的以脂蛋白结合形式存在的比例较之 1A9 寡聚体为高 ( 小图 F 的下边部分 )。进一步， A11 免疫印迹法亦显示在大约 200kDa 处的阳性信号， 其免疫反应性在 1A9 与 2C3 施用组中较之 PBS 施用组明显增加 ( 小图 G)。由这些结果可以想到， 在所述施用抗体的组中获得了仅靶 向 Aβ 寡聚体分子的选择性的治疗功效， 而没有影响到生理分子。
     图 11 的照片与图片显示在 Tg2576 小鼠脑中通过被动免疫接种治疗阻抑了老年斑 淀粉样蛋白形成 (A ： Aβ 特异性抗体染色 ； 以及 B ： 硫代黄素 -S 阳性分析 ) 与肿大变性神经 突形成 (C ： 突触泡蛋白阳性分析 )。
     图 12 的照片显示用 1A9 与 2C3 的被动免疫接种治疗阻抑了突触退行性变。突触 泡蛋白 ( 左边小图 ) 与脑发育调节蛋白 (drebrin)( 右边小图 ) 点状外周细胞 (dot-likeperipheral cell) 中的免疫染色。上图 ： 施用 PBS ； 中图 ： 施用 1A9 ； 以及下图 ： 施用 2C3。
     图 13 的照片显示所述抗体通过被动免疫接种治疗发生脑内转移。显示了在 Tg2576 小鼠脑中施用的抗体的分布。用抗 Aβ 抗体 ( 左边小图 ) 与 IgG( 中间小图 ) 染色。 施用 1A9(A)， 施用 2C3(B)， 以及施用 PBS(C)。
     图 14 的照片通过点印迹分析显示， 单克隆抗体 2C3， E12， 1C10( 同种型 ： IgM)， 以及 4D3 特异于寡聚体 (3-96h)， 但无法识别单体 (0h)。
     图 15 的照片通过点印迹分析显示， E12 抗体， 其类别已通过基因工程从 IgM 变为 IgG2b， 并不识别 Aβ 单体 (0hr)， 但特异于 Aβ 寡聚体 (3-96hr)。
     图 16 的图显示已通过基因工程从 IgM 类别变为 IgG2b 的 E12 抗体针对 Aβ 淀粉样 蛋白原纤维形成的阻抑活性。 以三种不同浓度将该抗体添加于 Aβ1-42 溶液中 (12.5μM)。 在 37℃下培育 24 小时后， 通过 ThT 荧光强度方法测量 Aβ 淀粉样蛋白原纤维形成的水平。 水平轴指示添加的抗体的量， 而垂直轴显示由所述抗体添加而得的淀粉样蛋白原纤维形成 水平相对于作为标准的未添加抗体时的淀粉样蛋白原纤维形成水平的值。
     发明的实施方式
     本发明将在下面更加详细的加以说明。 如上所述， 本发明发明人成功的获取下述抗体， 其可特异性结合 Aβ 寡聚体而非 Aβ 单体。亦即， 本发明提供了可结合 Aβ 寡聚体而非 Aβ 单体的抗体。所述抗体优选为分 离的或纯化的。
     术语 “分离的” 与 “纯化的” 的用于本发明的物质 ( 抗体与其它 ) 时， 指明该物质 实质上不包含至少一种可能存在于其天然来源中的物质。因此 “分离的抗体， ， 与 “提纯的 抗体” 指下述抗体， 即其实质上不包含该抗体 ( 蛋白质 ) 所来源的细胞或组织来源的细胞材 料， 例如烃类， 脂肪或其它污染蛋白质。 当所述抗体为化学合成时， 该术语指下述抗体， 即其 实质上不含有化学前体物质或其它化学物质。 在优选实施方案中本发明的抗体为分离的或 纯化的。
     “抗体” 指具有相同结构特征的糖蛋白。抗体对特定抗原显示结合特异性。在本文 中 “抗原” 指下述蛋白， 其具有可结合相应抗体的能力， 并可在体内诱导抗原 - 抗体反应。
     Aβ 蛋白， 其为淀粉样蛋白的主要构成成分， 为由 40 到 42 个氨基酸组成的肽， 且 已知其由称为淀粉样蛋白前体蛋白 (APP) 的前体蛋白通过蛋白酶的作用产生。除了被收集 于超速离心沉降级分中的淀粉样蛋白原纤维外， 自 APP 产生的淀粉样蛋白分子还包括寡聚 的非纤维性的聚合体 (assembly)， 以及可溶性单体。本发明中的 “Aβ 寡聚体” 指非纤维性 的聚合体。本发明的 “Aβ 寡聚体” 包括， 例如， Aβ40(Aβ1-40) 寡聚体与 Aβ42(Aβ1-42) 寡聚体。举例而言， 本发明的 “Aβ42 寡聚体” 为在 SDS-PAGE 中显示分子量 45 到 160kDa， 并在 Blue Native PAGE 中显示分子量 22.5 到 1035kDa 的分子。使用分子筛时， 所述分子 主要被收集于＞ 100kDa 的保留溶液。当在原子力显微镜下观察时， 所述分子显示混合的形 态， 包括颗粒状、 珠形与环形的分子， 其高度为 1.5 到 3.1nm。在凝胶过滤方法中， 所述分子 可洗脱于分子量为 680kDa 或更高的空体积级分 8 中， 和分子量为 17 到 44kDa 的级分 15 中。
     对在本发明中所用的抗体的来源与形式并无限制， 只要其可结合 Aβ 寡聚体而非 Aβ 单体。
     本发明的 “抗体” 包括单克隆抗体与多克隆抗体两者。本发明的抗体亦包括任何
     类型的抗体， 例如非人动物抗体， 人源化抗体， 嵌合抗体， 人类抗体， 近来描述的迷你抗体 (minibody)， 氨基酸序列被修饰的抗体， 缀合有其它分子 ( 例如， 如聚乙二醇等多聚物 ) 的 修饰抗体， 以及糖链被修饰的抗体。
     在本文中所用的术语 “单克隆抗体” 指下述抗体， 它们是从实质上同质的抗体群体 中获取的。亦即， 构成该群体的各个抗体彼此相同， 除了可能以痕量存在的天然突变体之 外。单克隆抗体具有非常高的特异性， 且识别单一的抗原位点。每个单克隆抗体识别所述 抗原的单一决定簇， 这与常规的 ( 多克隆 ) 抗体制备物不同， 后者通常含有针对不同抗原决 定簇 ( 表位 ) 的不同抗体。
     除上面提及的特异性外， 单克隆抗体亦具有下述优势， 即它们可由未经其它免疫 球蛋白污染的杂交瘤培养物合成。因此 “单克隆” 指明可得自实质上同质的抗体群体的抗 体的特征。该术语并不表示需要任何特定的抗体生产方法。
     基本上， 单克隆抗体可使用已知技术生产。 举例而言， 其可通过最先由 Kohler and Milstein(Nature 256 ： 495-7， 1975) 描述的杂交瘤技术， 或由重组 DNA 方法 (Cabilly et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81 ： 3273-7， 1984) 生成， 但其方法并不仅限于此。举例而 言， 当使用所述杂交瘤方法时， Aβ 寡聚体 ( 例如， 描述于实施例中的 Aβ 四聚体 ) 用作致 敏抗原， 而免疫接种通过常规的免疫接种方法进行。所得的免疫细胞与已知亲本细胞通过 常规细胞融合方法融合， 且可使用常规筛选方法筛选与分离抗体产生细胞。
     本 发 明 所 述 的 单 克 隆 抗 体 可 如 下 所 述 产 生。 首 先， 将 合 成 Aβ1-42(Peptide Institute， Inc.， Osaka) 溶解于去离子蒸馏水或 10mM 磷酸缓冲液溶液， 并在 37℃下培育 18 小时。随后， 用 4-12％ SDS-PAGE 分离该肽， 并通过 CBB 染色显影， 而仅切出未经 Aβ1-42 单体污染的 Aβ1-42 四聚体部分。继之， 对 BALB/c 小鼠在其足垫上用 2.5μg 的以弗氏完 全佐剂乳化的 Aβ1-42 四聚体进行免疫接种。随后， 进行六次的加强免疫 (booster)。利用 鼠蹊部淋巴结， 通过使用聚乙二醇 1500 与 Sp/O-Ag14 细胞融合产生杂交瘤。
     在本发明中， 用致敏抗原免疫接种的动物并无特别限定， 但优选考虑到与供细胞 融合使用的亲本细胞的相容性进行选取。一般而言， 使用啮齿类， 兔形类或灵长类。啮齿类 包括， 例如， 小鼠， 大鼠与仓鼠。兔形类包括， 例如， 家兔。灵长类包括， 例如， 狭鼻 ( 旧大陆 ) 猴， 例如食蟹猴 (Macacafascicularis)， 猕猴 (Macaca mulatta)， 阿拉伯狒狒与黑猩猩。
     动物使用致敏抗原根据抑制方法进行免疫接种。 举例而言， 作为标准方法， 免疫接 种通过腹腔内或皮下对哺乳类注射致敏抗原来进行。
     亲本细胞与前述免疫细胞融合的一个实例为 Sp2/O-Ag14 细胞， 其描述于下面的 实施例。然而可使用多种其它已知细胞系。
     前述免疫细胞与骨髓瘤细胞间的细胞融合可基本上根据已知的方法进行， 包括 Kohler 与 Milstein 的 方 法 (Kohler G.and Milstein C.， MethodsEnzymol.(1981)73， 3-46)。
     以此方式获取的杂交瘤通过对其在常规选择培养基中进行培养而进行选择， 所述 培养基可以举出 HAT 培养基为例， 其含有次黄嘌呤， 氨基蝶呤与胸苷。在上述 HAT 培养基中 的培养通常持续数日至数周以提供充足时间杀灭除所期望的杂交瘤外的细胞 ( 非融合细 胞 )。继之， 可进行常规的有限稀释方法以筛选并单独克隆可产生所期望抗体的杂交瘤。
     在此之后， 将所得的杂交瘤移植到小鼠的腹腔， 并提取含有所期望单克隆抗体的腹水。举例而言， 所述抗体可自所述腹水通过常规的蛋白质分离和 / 或纯化方法进行纯 化， 所述方法例如柱层析 ( 包括但不仅限于亲和层析 )、 过滤、 超滤、 盐析、 透析、 SDS 聚丙烯 酰胺凝胶电泳以及等电聚焦的选择组合 (Antibodies ： A Laboratory manual， Harlow and David， Lane(edit.)， Cold Spring Harbor Laboratory， 1988)。
     蛋白 A 柱与蛋白 G 柱可用于亲和柱。使用的蛋白 A 柱的实例包括 HyperD， POROS 与 Sepharose F.F.(Pharmacia)。
     层析 ( 排除亲和层析 ) 包括离子交换层析， 疏水层析， 凝胶过滤， 反向层析以及吸 附层析 (“Strategies for Protein Purification and Characterization ： ALaboratory Course Manual” ， Daniel R Marshak et al.， Cold Spring HarborLaboratory Press， 1996)。当进行层析时， 可使用液相层析方法例如 HPLC 与 FPLC。
     以该方式制备的产生单克隆抗体的杂交瘤可于常规的培养基中传代培养， 且其可 在液氮中长时间储藏。
     任何哺乳类均可使用的免疫原进行免疫接种以生产抗体。然而， 当通过产生杂交 瘤制备单克隆抗体时， 优选考虑与用于细胞融合以供产生杂交瘤的亲本细胞的相容性。
     一般而言， 啮齿类， 兔形类或灵长类用于免疫接种。啮齿类包括， 例如， 小鼠， 大鼠 与仓鼠。 兔形类包括， 例如， 家兔。 灵长类包括， 例如， 狭鼻 ( 旧大陆 ) 猴， 例如食蟹猴， 猕猴， 阿拉伯狒狒与黑猩猩。
     使用具有人类抗体基因库的转基因动物在本领域是已知的 (Ishida I， etal.， Cloning and Stem Cells 4 ： 91-102， 2002)。和其它动物一样， 为获取人类单克隆抗体， 对所述转基因动物进行免疫接种， 随后自该动物收集抗体产生细胞， 并与骨髓瘤细胞融合 以产生杂交瘤， 且可自这些杂交瘤产生抗蛋白质的人类抗体 ( 参见国际公布 WO92/03918， WO94/02602， WO94/25585， WO96/33735 和 WO96/34096)。
     或者， 用癌基因永生化的淋巴细胞可用于产生单克隆抗体。举例而言， 对于用 EB 病毒等感染的人类淋巴细胞在体外用免疫原进行免疫接种。然后， 将经免疫接种的淋巴细 胞与源自人类， 能够无限分裂的骨髓瘤细胞 (U266， 等 ) 融合， 从而获得产生所期望人类抗 体的杂交瘤 ( 日本公开专利公报 (JP-A) 昭 63-17688)。
     一旦单克隆抗体可通过任何前述方法获取， 所述抗体亦可使用遗传工程方法 ( 参 见， 例 如 Borrebaeck CAK and Larrick JW， Therapeutic MonoclonalAntibodies， MacMillan Publishers， UK， 1990) 制备。举例而言， 重组抗体可通过从抗原产生细胞 ( 如 杂交瘤或经免疫接种的淋巴细胞 ) 克隆出编码期望抗体的 DNA， 并将所克隆的 DNA 插入合适 的载体中， 再将该载体转染入合适的宿主细胞， 来加以制备。 上述重组抗体亦包含于本发明 中。
     本发明的单克隆抗体的实例包括 1A9 单克隆抗体， 2C3 单克隆抗体， E12 单克隆抗 体， 1C10 单克隆抗体与 4D3 单克隆抗体。所述单克隆抗体优选包括下述 (i) 到 (iii) 的抗 体：
     (i) 一种抗体， 其包含具有 SEQ ID NO ： 1 的氨基酸序列的 H 链 ( 重链 ) 与具有 SEQ ID NO ： 3 的氨基酸序列的 L 链 ( 轻链 ) ；
     (ii) 一种抗体， 其包含具有 SEQ ID NO ： 21 的氨基酸序列的 H 链 ( 重链 ) 与具有 SEQ ID NO ： 23 的氨基酸序列的 L 链 ( 轻链 ) ；(iii) 一种抗体， 其包含具有 SEQ ID NO ： 41 的氨基酸序列的 H 链 ( 重链 ) 与具有 SEQ ID NO ： 43 的氨基酸序列的 L 链 ( 轻链 )。
     在一个实施方案中， 本发明的抗体包括迷你抗体。迷你抗体包含抗体片段但缺乏 全抗体的一部分， 且无特别限制， 只要其具有结合抗原的能力。抗体片段的实例包括 Fab， Fab’ ， F(ab’ )2 与 Fv。迷你抗体的实例包括 Fab， Fab’ ， F(ab’ )2， Fv， scFv( 单链 Fv)， 双抗 体 (diabody)， 以及 sc(Fv)2( 单链 (Fv)2)。
     为获取针对本发明蛋白质的多克隆抗体， 对经抗原致敏的哺乳动物， 在确证所期 望的抗体血清水平上升后， 从其取出血液。通过已知方法自血液分离出血清。当使用多克 隆抗体时， 可使用含该多克隆抗体的血清。或者， 若需要， 可自血清分离出含所述单克隆抗 体的级分然后再使用。举例而言， 免疫球蛋白 G 或 M 可如下制备 ： 使用与本发明的蛋白质偶 联的亲和柱获得特异性识别所述蛋白质的级分， 然后使用蛋白 A 或蛋白 G 柱提纯该级分。
     在本发明中， 可结合 Aβ 寡聚体的为结合 1A9， 2C3， E12， 1C10 或 4D3 的抗体。该抗 体优选为下述 (A) 至 (C) 中任一项所述的抗体 ：
     (A) 一种可结合下述 Aβ 寡聚体的抗体， 所述 Aβ 寡聚体可结合包含具有 SEQ ID NO ： 1 的氨基酸序列的 H 链 ( 重链 ) 与具有 SEQ ID NO ： 3 的氨基酸序列的 L 链 ( 轻链 ) 的 抗体 ； (B) 一种可结合下述 Aβ 寡聚体的抗体， 所述 Aβ 寡聚体可结合包含具有 SEQ ID NO ： 21 的氨基酸序列的 H 链与具有 SEQ ID NO ： 23 的氨基酸序列的 L 链的抗体 ；
     (C) 一种可结合下述 Aβ 寡聚体的抗体， 所述 Aβ 寡聚体可结合包含具有 SEQ ID NO ： 41 的氨基酸序列的 H 链与具有 SEQ ID NO ： 43 的氨基酸序列的 L 链的抗体。
     进一步， 本发明提供了本发明所述抗体与之结合的 Aβ 寡聚体。所述抗体优选包 括， 例如， 1A9 单克隆抗体， 2C3 单克隆抗体， E12 单克隆抗体， 1C10 单克隆抗体以及 4D3 单克 隆抗体。上述 Aβ 寡聚体可用作供制备抗体或疫苗的抗原。
     在优选实施方案中， 本发明所述抗体包括， 例如， 下述 (1) 到 (20) 中任一项所述的 抗体 ：
     (1) 一种抗体， 其包含具有 SEQ ID NO ： 9 的氨基酸序列作为 CDR1、 SEQ ID NO ： 11 的氨基酸序列作为 CDR2、 以及 SEQ ID NO ： 13 的氨基酸序列作为 CDR3 的 H 链 ；
     (2) 一种抗体， 其包含具有 SEQ ID NO ： 15 的氨基酸序列作为 CDR1、 SEQ ID NO ： 17 的氨基酸序列作为 CDR2、 以及 SEQ ID NO ： 19 的氨基酸序列作为 CDR3 的 L 链 ；
     (3) 一种抗体， 其包含 (1) 的 H 链与 (2) 的 L 链 ；
     (4) 一种抗体， 其包含具有 SEQ ID NO ： 5 的氨基酸序列作为 VH 的 H 链 ；
     (5) 一种抗体， 其包含具有 SEQ ID NO ： 7 的氨基酸序列作为 VL 的 L 链 ；
     (6) 一种抗体， 其包含 (4) 的 H 链与 (5) 的 L 链 ；
     (7) 一种抗体， 其包含具有 SEQ ID NO ： 29 的氨基酸序列作为 CDR1、 SEQ ID NO ： 31 的氨基酸序列作为 CDR2、 以及 SEQ ID NO ： 33 的氨基酸序列作为 CDR3 的 H 链 ；
     (8) 一种抗体， 其包含具有 SEQ ID NO ： 35 的氨基酸序列作为 CDR1、 SEQ ID NO ： 37 的氨基酸序列作为 CDR2、 以及 SEQ ID NO ： 39 的氨基酸序列作为 CDR3 的 L 链 ；
     (9) 一种抗体， 其包含 (7) 的 H 链与 (8) 的 L 链 ；
     (10) 一种抗体， 其包含具有 SEQ ID NO ： 25 的氨基酸序列作为 VH 的 H 链 ；
     (11) 一种抗体， 其包含具有 SEQ ID NO ： 27 的氨基酸序列作为 VL 的 L 链 ；
     (12) 一种抗体， 其包含 (10) 的 H 链与 (11) 的 L 链 ；
     (13) 一种抗体， 其包含具有 SEQ ID NO ： 49 的氨基酸序列作为 CDR1、 SEQ ID NO ： 51 的氨基酸序列作为 CDR2、 以及 SEQ ID NO ： 53 的氨基酸序列作为 CDR3 的 H 链 ；
     (14) 一种抗体， 其包含具有 SEQ ID NO ： 55 的氨基酸序列作为 CDR1、 SEQ ID NO ： 57 的氨基酸序列作为 CDR2、 以及 SEQ ID NO ： 59 的氨基酸序列作为 CDR3 的 L 链 ；
     (15) 一种抗体， 其包含 (13) 的 H 链与 (14) 的 L 链 ；
     (16) 一种抗体， 其包含具有 SEQ ID NO ： 45 的氨基酸序列作为 VH 的 H 链 ；
     (17) 一种抗体， 其包含具有 SEQ ID NO ： 47 的氨基酸序列作为 VL 的 L 链 ；
     (18) 一种抗体， 其包含 (16) 的 H 链与 (17) 的 L 链 ；
     (19) 一种抗体， 其是 (1) 到 (18) 中任一项的抗体中替换， 缺失， 添加和 / 或插入一 个或多个氨基酸而得到的， 且具有与所述 (1) 到 (18) 中任一项的抗体等价的活性 ； 以及
     (20) 一种抗体， 其可结合 (1) 到 (18) 中任一项的抗体所结合的表位。
     上述 (1) 中 “具有 SEQ ID NO ： 9(E12 抗体 H 链 CDR1 的序列 ) 的氨基酸序列作为 CDR1、 SEQ ID NO ： 11(E12 抗体 H 链 CDR2 的序列 ) 的氨基酸序列作为 CDR2、 以及 SEQ ID NO ： 13(E12 抗体 H 链 CDR3 的序列 ) 的氨基酸序列作为 CDR3 的 H 链” 中 VH 的一个实例， 是具有 SEQ ID NO ： 5(E12 抗体 VH 的序列 ) 的氨基酸序列的 VH。 上述 (2) 中 “具有 SEQ ID NO ： 15(E 12 抗体 L 链 CDR1 的序列 ) 的氨基酸序列作 为 CDR1、 SEQ ID NO ： 17(E12 抗体 L 链 CDR2 的序列 ) 的氨基酸序列作为 CDR2、 以及 SEQ ID NO ： 19(E12 抗体 L 链 CDR3 的序列 ) 的氨基酸序列作为 CDR3 的 L 链” 中 VL 的一个实例， 是 具有 SEQ ID NO ： 7(E12 抗体 VL 的序列 ) 的氨基酸序列的 VL。
     上述 (7) 中 “具有 SEQ ID NO ： 29(1C10 抗体 H 链 CDR1 的序列 ) 的氨基酸序列作 为 CDR1、 SEQ ID NO ： 31(1C10 抗体 H 链 CDR2 的序列 ) 的氨基酸序列作为 CDR2、 以及 SEQ ID NO ： 33(1C10 抗体 H 链 CDR3 的序列 ) 的氨基酸序列作为 CDR3 的 H 链” 中 VH 的一个实例， 是 具有 SEQ ID NO ： 25(1C10 抗体 VH 的序列 ) 的氨基酸序列的 VH。
     上述 (8) 中 “具有 SEQ ID NO ： 35(1C10 抗体 L 链 CDR1 的序列 ) 的氨基酸序列作 为 CDR1、 SEQ ID NO ： 37(1C10 抗体 L 链 CDR2 的序列 ) 的氨基酸序列作为 CDR2、 以及 SEQ ID NO ： 39(1C10 抗体 L 链 CDR3 的序列 ) 的氨基酸序列作为 CDR3 的 L 链” 中 VL 的一个实例， 是 具有 SEQ ID NO ： 27(1C10 抗体 VL 的序列 ) 的氨基酸序列的 VL。
     上述 (13) 中 “具有 SEQ ID NO ： 49(4D3 抗体 H 链 CDR1 的序列 ) 的氨基酸序列作 为 CDR1、 SEQ ID NO ： 51(4D3 抗体 H 链 CDR2 的序列 ) 的氨基酸序列作为 CDR2、 以及 SEQ ID NO ： 53(4D3 抗体 H 链 CDR3 的序列 ) 的氨基酸序列作为 CDR3 的 H 链” 中 VH 的一个实例， 是 具有 SEQ ID NO ： 45(4D3 抗体 VH 的序列 ) 的氨基酸序列的 VH。
     上述 (2) 中 “具有 SEQ ID NO ： 55(4D3 抗体 L 链 CDR1 的序列 ) 的氨基酸序列作为 CDR1、 SEQ ID NO ： 57(4D3 抗体 L 链 CDR2 的序列 ) 的氨基酸序列作为 CDR2、 以及 SEQ ID NO ： 59(4D3 抗体 L 链 CDR3 的序列 ) 的氨基酸序列作为 CDR3 的 L 链” 中 VL 的一个实例， 是具有 SEQ ID NO ： 47(4D3 抗体 VL 的序列 ) 的氨基酸序列的 VL。
     对本发明所述的 E12 抗体， 其全长 H 链的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO ： 1 与 SEQ ID NO ： 2； 其全长 L 链的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO ： 3
     与 SEQ ID NO ： 4； 其 H 链可变区 (VH) 的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO ： 5与 SEQ ID NO ： 6； 其 L 链可变区 (VL) 的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO ： 7 与 SEQ ID NO ： 8； 其 H 链 CDR1 的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO ： 9 与 SEQ IDNO ： 10 ； 其 H 链 CDR2 的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO ： 11 与 SEQ ID NO ： 12 ； 其H链 CDR3 的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于 SEQID NO ： 13 与 SEQ ID NO ： 14 ； 其 L 链 CDR1 的 氨基酸序列与核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO ： 15 与 SEQ ID NO ： 16 ； 其 L 链 CDR2 的氨基酸 序列与核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO ： 17 与 SEQ ID NO ： 18 ； 而其 L 链 CDR3 的氨基酸序列 与核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO ： 19 与 SEQ ID NO ： 20。
     对本发明所述的 1C10 抗体， 其全长 H 链的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO ： 21 与 SEQ ID NO ： 22 ； 其全长 L 链的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO ： 23 与 SEQ ID NO ： 24 ； 其 H 链可变区 (VH) 的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO ： 25 与 SEQ ID NO ： 26 ； 其 L 链可变区 (VL) 的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO ： 27 与 SEQID NO ： 28 ； 其 H 链 CDR1 的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO ： 29 与 SEQ ID NO ： 30 ； 其 H 链 CDR2 的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO ： 31 与 SEQ ID NO ： 32 ； 其 H 链 CDR3 的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO ： 33 与 SEQ ID NO ： 34 ； 其 L 链 CDR1 的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO ： 35 与 SEQ ID NO ： 36 ； 其L链 CDR2 的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO ： 37 与 SEQ ID NO ： 38 ； 而其 L 链 CDR3 的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO ： 39 与 SEQ IDNO ： 40。
     对本发明所述的 4D3 抗体， 其全长 H 链的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO ： 41 与 SEQ ID NO ： 42 ； 其全长 L 链的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO ： 43 与 SEQ ID NO ： 44 ； 其 H 链可变区 (VH) 的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO ： 45 与 SEQ ID NO ： 46 ； 其 L 链可变区 (VL) 的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO ： 47 与 SEQ IDNO ： 48 ； 其 H 链 CDR1 的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO ： 49 与 SEQ ID NO ： 50 ； 其 H 链 CDR2 的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于 SEQID NO ： 51 与 SEQ ID NO ： 52 ； 其 H 链 CDR3 的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO ： 53 与 SEQ ID NO ： 54 ； 其 L 链 CDR1 的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO ： 55 与 SEQ ID NO ： 56 ； 其L链 CDR2 的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO ： 57 与 SEQ ID NO ： 58 ； 而其 L 链 CDR3 的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于 SEQ ID NO ： 59 与 SEQ ID NO ： 60。
     上面提及的 (1) 到 (20) 的抗体并不仅仅包括单价抗体， 亦包括具有两个或更多结 合价的多价抗体。本发明的多价抗体包括其抗原结合位点全部相同的多价抗体， 以及其抗 原结合位点部分或完全不同的多价抗体。
     在一个优选实施方案中， 上面提及的 (19) 的抗体是不具备经修饰的 CDR 的抗体。 举例而言， 上面提及的 (19) 的抗体中所谓 “在 (1) 的抗体中替换， 缺失， 添加， 和 / 或插入 一个或多个氨基酸而得到的， 其具有与 (1) 的抗体等价的活性的抗体” ， 优选为 “具有与 (1) 的抗体等价的活性的， 在 (1) 的抗体中替换、 缺失、 添加和 / 或插入一个或多个氨基酸而得 到的， 且包括具有 SEQ IDNO ： 9 的氨基酸序列作为 CDR1、 SEQ ID NO ： 11 的氨基酸序列作为 CDR2， 与 SEQ ID NO ： 13 的氨基酸序列作为 CDR3 的 H 链的抗体” 。另一个上述 (19) 的抗体 的优选抗体可以类似的方式表述。
     在本文中 “等价的活性” 指关注的抗体具有与本发明抗体相似的生物学或生物化学活性。本发明所述 “活性” 的实例包括与 Aβ 寡聚体但不与 Aβ 单体特异性结合的活性， 抗神经毒性活性， 阻抑 Aβ 淀粉样蛋白原纤维形成的活性， 抗突触毒性的活性， 与抗记忆功 能障碍的活性。
     本领域技术人员周知的制备具有与某多肽等价的活性的多肽的方法包括在该多 肽中导入突变。 举例而言， 本领域技术人员可使用定点诱变等方法 (Hashimoto-Gotoh， T.et al.(1995)Gene 152， 271-275 ； Zoller， MJ， and Smith， M.(1983)Methods Enzymol.100， 468-500 ； Kramer， W.et al.(1984)NucleicAcids Res.12， 9441-9456 ； Kramer W， and Fritz HJ(1987)Methods.Enzymol.154， 350-367 ； Kunkel， TA(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82， 488-492 ； Kunkel(1988)Methods Enzymol.85， 2763-2766) 将合适的突变导入抗体， 来制备 其活性等价于本发明的抗体的活性的抗体。氨基酸突变亦可天然发生。本发明所述的抗体 亦包括下述抗体 ： 其包含在本发明抗体的氨基酸序列中发生一个或更多突变而得到的氨基 酸序列， 且具有与本发明所述抗体活性等价的活性。 在上述突变体中， 突变氨基酸的数量通 常可为 50 个氨基酸或更少， 优选 30 个氨基酸或更少， 且更优选十个氨基酸或更少 ( 例如， 五个氨基酸或更少 )。
     氨基酸残基优选突变为保留所述氨基酸侧链性质的其它氨基酸。举例而言， 氨基 酸根据其侧链性质进行如下分类 ： 疏水氨基酸 (A， I， L， M， F， P， W， Y 与 V)， 亲水氨基酸 (R， D， N， C， E， Q， G， H， K， S 与 T)， 具有脂肪族侧链的氨基酸 (G， A， V， L， I 与 P)， 具有含羟基侧链 的氨基酸 (S， T 与 Y)， 具有含硫原子侧链的氨基酸 (C 与 M)， 具有含羧酸与含酰胺侧链的氨 基酸 (D， N， E 与 Q)， 具有碱性侧链的氨基酸 (R， K 与 H)， 以及具有含芳环侧链的氨基酸 (H， F， Y 与 W)( 氨基酸在括号中以单字母密码表示 )。
     已知具有在某一氨基酸序列中一个或更多氨基酸残基经修饰 ( 缺失， 添加， 和/或 替换为其它氨基酸 ) 而得到的氨基酸序列的多肽可保留其原来的生物学活性 ( 功能 )。
     除上面提及的修饰外， 本发明的抗体可与其它物质缀合， 只要其活性得到保持即 可。所述物质的实例包括肽， 脂质， 糖与糖链， 乙酰基团， 以及天然与合成多聚物。可实施这 些修饰以给予所述抗体额外的功能， 或使其稳定化。
     本发明的抗体的氨基酸序列添加数个氨基酸残基而得的抗体包括含有该抗体的 融合蛋白。在该融合蛋白中， 该抗体与其它肽或蛋白质融合。产生融合蛋白的方法可通过 将编码本发明的抗体的多核苷酸与编码另一多肽或蛋白质的多核苷酸阅读框一致地连接， 并将其插入表达载体， 并将该融合构建体在宿主中表达来进行。本领域技术人员已知的技 术可用于该目的。与本发明的抗体融合的肽或多肽包括， 例如， 已知的肽， 例如 FLAG(Hopp， T.P.et al.， BioTechnology(1988)6， 1204-1210)， 由六个组氨酸 (His) 残基组成的 6x His， 10x His， 流感血凝素 (HA)， 人 c-myc 片段， VSV-GP 片段， p18HIV 片段， T7- 标签， HSV- 标签， E- 标签， SV40T 抗原片段， lck 标签， α- 微管蛋白片段， B- 标签以及蛋白 C 片段 ； 谷胱甘 肽 -S- 转移酶 (GST) ； 免疫球蛋白恒定区域 ； β- 半乳糖苷酶 ； 以及麦芽糖结合蛋白 (MBP)， 等等。编码这些肽或多肽的可市购的多核苷酸可与编码本发明所述抗体的多核苷酸融合， 且可通过表达如是制备的融合多核苷酸来产生所述融合多肽。
     本发明所述的抗体可在氨基酸序列， 分子量， 糖链的存在与否， 结构等方面彼此不 同， 取决于产生该抗体的细胞或宿主， 或者纯化方法。然而， 只要所得抗体具有等价于本发 明抗体活性的活性， 其即包含于本发明中。与上述 (1) 到 (18) 中任一项的抗体所结合的表位结合的抗体可通过本领域技术 人员已知的方法获取。 举例而言， 该抗体可通过下述方法获取 (i) 用常规方法确定该 (1) 到 (18) 中任一项所述的抗体结合的表位， 并使用包含该表位中含有的氨基酸序列的多肽作为 免疫原产生该抗体 ； 或 (ii) 通过常规方法确定所产生的抗体的表位， 并选择其表位与 (1) 到 (18) 中任一项所述抗体的表位相同的抗体。
     上面提及的 (1) 到 (20) 的抗体亦包括任何类型的抗体， 例如上面提及的迷你抗 体， 具有修饰氨基酸序列的抗体， 例如人源化抗体与嵌合抗体， 非人动物抗体， 人抗体， 与其 它分子 ( 例如， 如聚乙二醇的多聚物 ) 缀合的修饰抗体， 以及糖链修饰抗体。
     在一个优选实施方案中， 本发明所述的抗体为修饰抗体， 例如嵌合抗体与人源化 抗体。优选抗体的实例包括 (i) 其可变区源自 E12 抗体、 1C10 抗体或 4D3 抗体， 且其恒定区 源自人类免疫球蛋白的嵌合抗体 ； 以及 (ii) 其 CDR 源自 E12 抗体、 1C10 抗体或 4D3 抗体， 且其 FR 源自人类免疫球蛋白， 且其恒定区源自人类免疫球蛋白的人源化抗体。这些修饰抗 体可使用已知方法产生。
     由于在人类体内嵌合抗体或人源化抗体的抗原性减少， 这样的抗体可用于为治疗 等目的施用于人类。
     嵌合抗体通过组合源自不同动物的序列来产生。嵌合抗体的实例包括这样的 抗体， 其包含小鼠抗体的重链可变区与轻链可变区， 以及人类抗体的重链恒定区和轻 链恒定区。嵌合抗体的产生可使用已知方法进行 ( 参见， 例如， Jones et al.， Nature 321 ： 522-5， 1986 ； Riechmann et al.， Nature 332 ： 323-7， 1988 ； 以 及 Presta， Curr. Opin.Struct.Biol.2 ： 593-6， 1992)。举例而言， 首先， 自抗体产生细胞的 RNA 通过聚合 酶 链 式 反 应 (PCR) 等 方 法 ( 参 见， 例 如， Larrick et al.， “Methods ： a Companion to Methods in Enzymology” ， Vol.2 ： 106， 1991 ； Courtenay-Luck， “Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies” inMonoclonal Antibodies ： Production， Engineering and Clinical Application ； Ritter et al.(eds.)， page 166， Cambridge University Press， 1995， 以 及 Ward etal.， “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies” in MonoclonalAntibodies ： Principles and Applications ； and Birch et al.(eds.)， page 137， Wiley-Liss， Inc.， 1995) 制备编码目标抗体可变区或 CDR 的基因。将所制备的编码可 变区的基因连接于编码恒定区或框架区的基因。 所述编码恒定区或框架区的基因可用类似 于针对 CDR 编码基因的方式确定， 或者， 其可基于已知抗体的序列信息制备。编码嵌合产 物与 CDR 移植产物的 DNA 序列可完全或部分使用寡聚核苷酸合成技术加以合成。举例而 言， 可实施由 Jones 等 (Nature 321 ： 522-5， 1986) 描述的寡聚核苷酸合成。进一步， 在一些 情况下， 可适当地使用定点诱变与聚合酶链式反应。由 Verhoeyen et al.(Science 239 ： 1534-6， 1988) 与 Riechmann et al.(Nature 332 ： 323-7， 1988) 描述的对已知可变区进行 寡核苷酸特异性诱变的技术可用于修饰所述可变区序列， 例如， 以增强嵌合抗体的结合能 力。进一步， 若需要， 可使用 T4 DNA 聚合酶对有缺口的寡聚核苷酸进行酶促填充， 例如， 描 述于 Queen et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 ： 10029-33， 1989 与 WO 90/07861)。
     举例而言， CDR- 移植技术在本领域为已知的 ( “Immunoglobulin genes” ， Academic Press(London)， pp 260-74， 1989 ； and Michael A et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91 ： 969-73， 1994)。使用该技术， 将给定抗体的 CDR 替换为另一个抗体的 CDR。通过这样的替换， 前者抗体的结合特异性改变为后者抗体的结合特异性。 在这样的嵌合抗体中， 其中框架 氨基酸源自人类抗体的称为 “人源化抗体 (CDR- 移植抗体 )” 。当使用抗体治疗人类时， 优 选使用人类抗体或人源化抗体。
     一般而言， 嵌合抗体包括非人哺乳类来源的抗体的可变区与源自人类抗体的恒定 区。另一方面， 人源化抗体包括非人哺乳类来源的抗体的互补决定区 (CDR) 以及源自人类 抗体的框架区与恒定区。
     在产生所述嵌合抗体或人源化抗体后， 可变区 ( 例如， FR) 或恒定区中的氨基酸可 替换为其它氨基酸。
     所述嵌合抗体的可变区或所述人源化抗体的 CDR 的来源并不特别限定。
     源自人类抗体的 C- 区域用于所述嵌合抗体与人源化抗体的 C- 区域。举例而言， Cγ1， Cγ2， Cγ3， Cγ4， Cμ， Cδ， Cα1， Cα2 与 Cε 可用于 H- 链的 C- 区域， 而 Cκ 与 Cλ 可用与 L- 链的 C- 区域。它们的序列是已知的。进一步， 所述人类抗体 C 区域可经修饰以 改善该抗体的稳定性或其产生。
     本发明所述抗体针对抗原 (Aβ 寡聚体 ) 的结合活性可使用例如， 吸光度测定方 法、 酶联免疫吸附分析 (ELISA) 方法、 酶免疫分析 (EIA) 方法、 放射性免疫分析 (RIA) 方法 和 / 或荧光免疫分析方法等方法来测定。在 ELISA 中， 将抗体固化在平板上， 且该抗体的抗 原添加至板上， 并进行预培育。在洗涤后， 将酶底物例如对硝基苯基磷酸添加至板上， 并测 定其吸光度以测量所述目标试样的抗原结合能力。所述测量可使用 BIAcore(Pharmacia) 来进行。
     进一步， 本发明提供了包括上面提及的本发明的抗体与药用载体的组合物。
     如下所述， 本发明强烈暗示单克隆 1A9 与 2C3 抗体为预防类阿尔茨海默氏病表型 的治疗抗体的有望候选。人们已显示记忆衰退与由可溶性 Aβ 寡聚体引起的突触功能障碍 相关 (Klein WL， 2001， Trends Neurosci ； and SelkoeDJ， 2002， Science)。Aβ 寡聚体的过 量积聚与沉着可触发导致阿尔茨海默氏病的复杂下游级联反应。若事实确为如此， 则使用 包含本发明抗体与药用载体的组合物的治疗介入可有效阻断所述病理学级联反应， 并由此 可使阿尔茨海默氏病的治疗成为可能。
     本发明所述的 “治疗” 并不一定针对展示病症或疾病的症候具有完全的治疗或预 防效果， 但可具有部分的效果。
     本发明中的 “治疗阿尔茨海默氏病” 指缓解至少一种可由阿尔茨海默氏病导致的 症状， 其实例包括缓解或阻抑认知机能障碍， 缓解或阻抑老年斑形成， 缓解或阻抑突触功能 障碍， 以及减少或阻抑 Aβ 在脑组织， 血液等处的积聚。在本文中， “认知机能障碍” 包括， 例 如， 记忆障碍， 包括长期 / 短期记忆障碍， 物体认知记忆障碍， 空间记忆障碍与联想及情绪 记忆障碍。
     本发明提供了包含含有本发明的抗体与药用载体的组合物作为活性成分的药物 组合物或药剂。
     在本发明中， 短语 “包含含有本发明的抗体与药用载体的组合物作为活性成分” 意指包含含有本发明的抗体与药用载体的组合物作为主要活性成分， 但并不限定其实际含 量。
     上面体积的药物组合物的实例包括抗认知机能障碍剂， 阿尔茨海默氏病治疗剂，阿尔茨海默氏病进展阻抑剂， 老年斑形成阻抑剂， Aβ 积聚阻抑剂， 抗神经毒性剂 ( 神经毒 性中和剂 )， Aβ 淀粉样蛋白纤维抑制剂， 以及抗突触毒性剂 ( 突触毒性中和剂 )。
     上面提及的本发明的药物组合物还可表现为， 例如， “阻抑阿尔茨海默氏病的方 法” ， 所述方法包括对受试者 ( 个体 ) 施用包含本发明的抗体与药用载体的组合物。在其它 实施方案中， 实例包括阻抑认知机能障碍的方法， 阻抑阿尔茨海默氏病进展的方法。 阻抑老 年斑形成的方法， 阻抑 Aβ 积聚的方法， 中和 ( 阻抑 ) 神经毒性活性的方法， 抑制 Aβ 淀粉 样蛋白原纤维形成的方法， 以及中和 ( 阻抑 ) 突触毒性的方法。在进一步的实施方案中， 实 例包括预防和 / 或治疗认知障碍的方法， 以及预防和 / 或治疗阿尔茨海默氏病的方法。
     本发明亦提供了包含本发明的上述抗体与药用载体的组合物在生产上面提及的 药物组合物中的应用。
     进一步， 本发明涉及下述组合物。
     - 一种包含上述的本发明抗体与药用载体的组合物， 用于预防和 / 或治疗认知障 碍。
     - 一种包含上述的本发明抗体与药用载体的组合物， 用于预防和 / 或治疗阿尔茨 海默氏病。
     - 一种包含上述的本发明抗体与药用载体的组合物， 用于阻抑阿尔茨海默氏病的 进展。
     - 一种包含上述的本发明抗体与药用载体的组合物， 用于阻抑老年斑形成。
     - 一种包含上述的本发明抗体与药用载体的组合物， 用于阻抑 Aβ 积聚。
     - 一种包含上述的本发明抗体与药用载体的组合物， 用于中和 ( 阻抑 ) 神经毒性活 性。
     - 一种包含上述的本发明抗体与药用载体的组合物， 用于阻抑 Aβ 淀粉样蛋白原 纤维形成。
     - 一种包含上述的本发明抗体与药用载体的组合物， 用于中和 ( 阻抑 ) 突触毒性活 性。
     上面提及的本发明的药剂可施用于人类或其它动物。在本发明中， 被施以所述药 剂的非人动物包括小鼠， 大鼠， 豚鼠， 家兔， 鸡， 猫， 狗， 绵羊， 猪， 牛， 猴， 狒狒与黑猩猩。这些 动物优选展示至少一种选自下组的症状 ： 例如， 认知机能障碍， 老年斑形成、 突触功能障碍， 脑组织或血液中的 Aβ 积聚， 等等。
     包含于本发明的药物组合物中的抗体并不特别限定， 只要它们包括于上面提及的 本发明的抗体中， 其实例包括本文所描述的抗体。
     当使用上面提及的本发明的抗体用于药物组合物时， 它们可通过本领域技术人员 已知的方法配制。 举例而言， 视需要， 它们可用水或其它药用液体以可注射的无菌溶液或悬 浮液的形式配制， 且可用于非肠道施用。举例而言， 包含于所述药物组合物中的抗体可与 可接受的载体或介质， 尤其是无菌水， 生理盐水， 植物油， 乳化剂， 悬浮液， 表面活性剂， 稳定 剂， 调味剂， 赋形剂， 溶剂， 防腐剂， 粘合剂等， 并混合为通常需用于接受的药物实践的单位 剂量。短语 “药用” 指该物质是惰性的， 并含有通常用作稀释剂或溶媒的物质。合适的赋形 剂与其配制物描述于， 例如， Remington’ sPharmaceutical Sciences， 16th ed.(1980)Mack Publishing Co.， ed.Oslo et al.。生理盐水与其它含有葡萄糖或佐剂 ( 举例而言， D- 山梨醇， D- 甘露糖， D- 甘露醇 与氯化钠 ) 的等渗溶液可用作供注射的水溶液。它们可与合适的增溶剂， 例如醇类， 更具体 而言， 乙醇与多元醇 ( 丙二醇， 聚乙二醇等 )， 以及非离子表面活性剂 (Polysorbate 80TM， HCO-50 等 ) 一起使用。
     芝麻油或大豆油可用作油性液， 而苯甲酸苄酯或苯甲醇可组合用作增溶剂。缓冲 液 ( 例如， 磷酸缓冲液与乙酸钠缓冲液 )， 镇痛剂 ( 例如， 盐酸普鲁卡因 )， 稳定剂 ( 例如， 苯 甲醇与苯酚 )， 以及抗氧化剂可用于配制剂。制备好的注射液可注入合适的安瓿瓶。
     给药优选为非肠道给药， 具体的例子包括通过注射给药， 经鼻给药， 经肺给药， 以 及经皮给药。 通过注射给药的实例包括系统性或局部性的通过静脉内注射， 肌肉内注射， 腹 膜内注射， 皮下注射等给药。
     所述药物组合物包括药学有效量的活性组分 ( 上面提及的本发明抗体 )。 “药学有 效量 ( 的化合物 )” 指所述的量足以治疗和 / 或预防上述的本发明抗体在其中发挥重要作用 的病症。举例而言， “药用量” 可以是当所述化合物施用于个体 ( 患者 ) 时， 减少 Aβ 积聚、 中和 Aβ 诱导毒性、 减少 Aβ 淀粉样蛋白形成等， 由此治疗或预防由阿尔茨海默氏病造成 的病状所需的量。所述减少或中和可为， 例如， 减少或中和至少大约 5％， 10％， 20％， 30％， 40％， 50％， 75％， 80％， 90％， 95％， 99％或 100％。 确定上面提及的本发明的抗体的上述药学有效量的评估可使用标准的临床方法 进行， 包括组织病理学诊断。
     合适的给药方法可取决于患者的年龄与症状选取。 含有抗体的药物组合物的剂量 可在， 例如， 对于每次给药在每千克体重 0.0001mg 到 1000mg 的范围内选择。或者， 例如， 对 于每个患者所述剂量可在 0.001 到 100000mg/ 体重的范围内选择 ； 然而所述剂量并不一定 限定于这些范围内。尽管剂量与给药方法根据患者的体重， 年龄， 症状等变动， 本领域技术 人员可合适的对它们进行选择。在后面描述的动物实验中， 所述剂量是基于免疫球蛋白大 剂量静注疗法 (400mg/kg)( 该疗法为人类健康保险所涵盖 ) 选取的。
     进一步， 本发明提供了在试样中检测 Aβ 寡聚体 ( 实例包括 Aβ40(Aβ1-40) 与 Aβ42(Aβ1-42)) 的方法。本发明中 “试样” 的实例包括自受试者收集的试样。具体而言， 本方法包括使用本发明的抗体检测收集自受试者的试样中所含的 Aβ 寡聚体的步骤。试 样中的 Aβ 寡聚体的检测可利用， 例如， 使用化学发光的夹心固相酶免疫测定法 (sandwich solid-phase enzymeimmunoassay method)( 化学发光 ELISA)， 使用所得抗体的免疫沉淀方 法、 免疫印迹、 流式细胞计数、 质谱与免疫组织化学分析。
     当通过上面提及的测量方法在收集自受试者的试样中检测出 Aβ 寡聚体时， 所述 受试者是可能的阿尔茨海默氏病患者。举例而言， 当将收集自受试者的试样中 Aβ 寡聚体 的量与来自健康个体进行比较， 且 Aβ 寡聚体的量在受试者中高于在健康个体中时， 该受 试者确定为可能的阿尔茨海默氏病患者。 受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者通常由 医师 ( 包括受医师指导的个人， 本文下同 ) 诊断。通过本诊断方法获得的收集自受试者以 及健康个体的试样中的 Aβ 寡聚体的量的数据对医师进行诊断将是有用的。因此， 本诊断 方法也可表现为， 收集并呈现对医师诊断有用的数据的方法。
     具体而言， 本发明提供了诊断是否受试者为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法， 其中所述方法包括使用本发明的抗体检测自受试者收集的试样中的 Aβ 寡聚体。
     进一步， 本发明提供诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法， 其包 括下述步骤 ：
     (a) 使自受试者收集的试样与本发明的抗体以及与 Aβ 单体结合的抗体相接触 ； 以及
     (b) 测量所述试样中 Aβ 寡聚体对 Aβ 单体的比例，
     其中若步骤 (b) 中测得的比例高于健康个体， 则将所述受试者确定为可能的阿尔 茨海默氏病患者。
     首先， 在本方法中， 使收集自受试者的试样与本发明的抗体和可结合 Aβ 单体的 抗体相接触。在本文中， “接触” 可通过， 例如， 将上面提及的每个抗体添加入收集自受试者 的试样 ( 其置于试管中 ) 来实施。在此情况下， 所述抗体以溶液， 冷冻干燥所得的固体等形 式适宜添加。 当将所述抗体作为水溶液添加时， 所述溶液可纯粹包含所述抗体本身， 或可包 含， 例如， 表面活性剂， 赋形剂， 着色剂， 调味剂， 防腐剂， 稳定剂， 缓冲剂， 助悬剂， 张度剂， 粘 合剂， 崩解剂， 润滑剂， 流动性促进剂或矫味剂。所述抗体添加的浓度并非特别限定。举例 而言， 如使用人类免疫球蛋白配制物， 可适宜使用 500-mg， 1000-mg 与 2500-mg 等冷冻干燥 的配制物。
     然后， 测量前述试样中 Aβ 寡聚体对 Aβ 单体的比例 ( 在本文中， 亦称为 “O/M 指 数” )。为测量该比例， 适宜地使用下述方法。举例而言， 在如下文的实施例中所述， 可使用 比较自相同试样获取的所述寡聚体与单体的 ELISA 值的方法来实施测量。
     然后， 将该比例与健康个体的比例进行比较。当该比例在受试者中较之健康个体 中为高时， 确定该受试者为可能的阿尔茨海默氏病患者。
     本发明的诊断方法既可在体外又可在体内进行， 但其优选在体外进行。
     优选地， 本发明的 “试样” 并不特别限定， 只要其为源自受试者的组织即可。实例 包括受试者的脑 ( 脑实质等 )， 器官与体液 ( 血液， 脑脊液等 )。在本发明中， 所述试样优选 为血液 ( 更优选血浆 ) 或脑脊液。
     进一步， 本发明提供了用于上面提及的在试样中测量 Aβ 寡聚体的方法或诊断受 试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法的药剂。
     在本发明中， 包含抗体的药物组合物可包含于产品与试剂盒中， 所述产品与试剂 盒包含对治疗受试者的病理状态有用的材料。所述产物可包括任何化合物的带标签容器。 合适的容器包括瓶， 小瓶与试管。所述容器可用多种材料制成， 例如玻璃与塑料。容器表面 的标签应指明所述组合物用于治疗或预防所述疾病的一种或更多种症候。 所述标签亦可载 明给药的描述等。
     除上面提及的容器外， 含包括抗体的药物组合物的试剂盒可任选地包括第二容 器， 其储藏药用稀释剂。 所述试剂盒可进一步包括其它从商业或用户角度看期望的材料， 包 括其它缓冲剂， 稀释剂， 填充剂， 注射针头， 注射器， 以及载有用途描述的包装插页。
     若需要， 所述药物组合物可于包装或分配装置中提供， 所述包装或分配装置包含 一个或更多含有活性成分的单位剂量形式。所述包装可包括金属或塑料箔， 或者例如为发 泡包装。所述包装或分配装置可伴有给药说明书。
     在上面提及的药剂与试剂盒中， 除作为活性成分的本发明的抗体外， 还可根据需 要混合， 例如， 灭菌水， 生理盐水， 植物油， 表面活性剂， 脂肪， 助溶剂， 缓冲剂， 蛋白稳定剂(BSA， 明胶等 )， 防腐剂， 封闭溶液， 反应溶液， 反应淬灭溶液， 处理试样的试剂等。
     所有本文引用的现有技术文献通过引用的方式并于本说明书中。
     实施例
     下文中， 通过实施例详细描述本发明， 但并不应认为本发明受实施例的限定。
     方法
     制备单克隆 1A9， 2C3， E12， 1C10 与 4D3
     合成 Aβ1-42(Peptide Institute， Inc.， Osaka) 溶解于蒸馏水或 10mM 磷酸缓冲 液， 并在 37℃下培育 18 小时。然后， 用 SDS-PAGE(4-12％ NuPAGE Tris- 甘油胶 ) 分离肽， 并在用 CBB 染色显现后， 仅切出 Aβ1-42 四聚体而无 Aβ1-42 的污染。
     然后， 对 BALB/c 小鼠用 2.5μg 的经弗氏完全佐剂乳化的 Aβ1-42 四聚体在其足 垫进行免疫接种。 随后， 进行六次的加强免疫接种。 使用小鼠蹊部淋巴结， 通过与 Sp/O-Ag14 细胞使用聚乙二醇 1500 融合产生杂交瘤。
     确定抗体同种型
     纯化的免疫球蛋白的同种型的确定使用 Serotec(Oxford， UK) 小鼠单克隆抗体同 种型确定试剂盒。1A9 与 2C3 的同种型为 IgG2b。
     点印迹分析 ( 初步筛选 )
     初始筛选通过点印迹分析使用硝酸纤维素膜进行， 所述膜上固化了预培育 18 小 时的 2.5μl 的 Aβ1-42(2.5μg/ 点 )。膜上非特异性结合位点用含 5％低脂奶粉、 1％ BSA 与 0.05％ Tween-20 的磷酸缓冲液封闭， 然后将该膜与培养上清一起培育。培养上清中的 Aβ 寡聚体结合抗体通过辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠 F(ab’ )2(1 ∶ 3000 ； Amersham) 检 测， 并使用增强化学发光 (ECL) 试剂盒与 LAS3000 mini(Fujitsu， Tokyo， Japan) 显影。在 400 个克隆中， 对其中 16 个在所述点印迹中为阳性的， 包括 1A9 与 2C3， 进行下述的二次筛 选。
     免疫沉淀与免疫印迹分析 ( 二次筛选 )
     二 次 筛 选 使 用 富 含 Aβ 寡 聚 体 的 淀 粉 样 蛋 白 级 分 (Matsubara E， et al.， Neurobiol Aging， 2004) 进行免疫测定实验 (Ghiso J， et al.， Biochem J， 1993)， 以评估 在初步筛选中选出的 16 个克隆可否在 AD 脑中捕获 Aβ 寡聚体。将一个自 AD 脑制备的、 不溶于缓冲液但可溶于甲酸的级分与组织上清和蛋白 G-Sepharose 一起培育。将被免疫 沉淀的 Aβ 寡聚体使用 NuPAGE4-12 ％ Bis-Tris- 甘氨酸凝胶分离， 并使用含 10 ％甲醇的 10mM 3- 环己基氨基 -1- 丙烷磺酸 (pH11) 在 400mA 下经一小时转移到硝酸纤维素膜或 Immobilon P(Milliipore) 上。膜上的非特异性结合位点用含 5 ％低脂奶粉， 1 ％ BSA 与 0.05％ Tween-20 的磷酸缓冲液在室温下封闭 3 小时。通过免疫印迹法用 4G8(1 ∶ 1000) 或 6E10(1 ∶ 1000) 单克隆抗体如上所述检测经免疫沉淀的 Aβ 寡聚体。自所述 16 个克隆 中选出两个克隆， 1A9 与 2C3， 作为阿尔茨海默氏病治疗抗体的候选。
     抗体
     6E10 与 4G8 单克隆抗体 (Covance Immuno-Technologies， Dedham， MA) 分别识别 人类 Aβ 序列的氨基酸位置 1-16 与 17-24 的表位。特异性识别 Aβ 寡聚体的多克隆抗体 A11 购自 Biosource(Camarillo， CA)。Alex Fluor(AF)488- 或 594- 缀合的山羊抗小鼠 IgG 与 Alex Fluor(AF)488- 缀合的山羊抗大鼠 IgG 购自 Molecular Probes(Eugene， OR)。抗小鼠 IgG2b 购自 Sigma(St.Louis， MO)。抗突触泡蛋白抗体购自 Santa Cruz(Santa Cruz， CA)， 而抗脑发育调节蛋白抗体购自 MBL(Nagoya， Japan)。
     尺寸排阻层析法 (SEC)
     进行了 SEC 以评估 1A9 与 2C3 的尺寸特异性。根据之前报道的方法 (Matsubara E.， et al.， Neurobiol Aging， 25 ： 833-841， 2004)， 可选择性地分离 Aβ 单体与 Aβ 寡聚 体， 或脂蛋白结合的 Aβ 与无脂蛋白的 Aβ。 本发明人使用 Microcon 3kDa 分子量截留滤器 (Millipore Corp.) 将来自过表达 APP/PS1 的 HEK293 细胞的培养上清液浓缩约十倍。然 后， 将浓缩液使用经磷酸缓冲液预平衡的 Superose 12 尺寸排阻柱 (1cmx30cm ； Pharmacia Biotech.， Uppsala， Sweden ； 流速为 0.5ml/min) 分为 28 个 1 毫升的级分。对每个级分的 一半使用 1A9 或 2C3 进行免疫沉淀。使用 4G8 通过免疫印迹法检测所得免疫沉淀物中所含 的 Aβ。
     对汇集自阿尔茨海默氏病患者或与其年龄匹配的健康个体各十例的脑脊液 (CSF) 以及除去脂蛋白的 CSF 在相同条件下进行了分离。Aβ 的收集级分的鉴定通过各个级分的 ELISA 来进行。为评估脂质， 使用标准试剂盒 (Wako， Osaka， Japan) 对总胆固醇进行酶学定 量。在本发明人的实验条件下， CSF 的脂蛋白在级分 7-14 中洗脱， 而级分 15-28 包含无胆 固醇的蛋白质。
     不含种子的 Aβ 溶液的制备
     将合成 Aβ1-42 以 250μM 溶解于 0.02％氨水中。然后， 为制备不含种子的 Aβ 溶 液， 使用 Optima TL 超离心机 (Beckman， USA) 以 540000x g 超离心 3 小时以沉淀未溶解的肽 ( 它们可能充当种子 )。收集所得的上清， 并将其等分并储藏于 -80℃直至使用。试样的制 备是在即将使用前将所述 Aβ 储藏溶液解冻， 并用 Tris 缓冲盐水 (TBS ； 150mM NaCl 与 10mM Tris-HCl(pH7.4)) 将其稀释 10 倍。 所得的 25μM 溶液用于下述的实验。 合成 Aβ1-42(HCL 形式 ； Peptide Institute， Inc.， Osaka) 制备为 50μM。
     Aβ 培育与 ThT 分析 (Yamamoto N， et al.， J Biol Chem， 282 ： 2646-2655， 2007)
     Aβ 溶液 (25μM) 在预定浓度的抗体存在下在 37℃下培育 2 或 24 小时。所述培 育混合物的 ThT 荧光强度使用荧光分光光度计 (RF-5300PC ； Shimadzu Co.， Kyoto， Japan) 确定。使用 1ml 含 5μM ThT 与 50mM 甘氨酸 -NaOH(pH8.5) 的反应混合物， 在激发与发射波 长为 446 与 490nm 的条件下， 为 Aβ 淀粉样蛋白原纤维确定最佳荧光强度。荧光强度在混 合物制备后立即测定。
     进一步， E12 抗体用于阻抑 Aβ 淀粉样蛋白原纤维形成的活性通过下述步骤评价。 将用细胞培养基稀释到 12.5μM 的 Aβ1-42 溶液在所述 E12 抗体存在或不存在的条件下在 37℃下培育 24 小时。形成的淀粉样蛋白纤维的量通过上述 ThT 荧光强度测定法确定。
     Aβ 诱导性神经毒性测定 (Yamamoto N， et al.， J Biol Chem， 282 ： 2646-2655， 2007)
     将大鼠嗜铬细胞瘤 PC12 细胞在含 10 ％热失活的马血清 (Invitrogen) 与 5 ％胎 牛血清 (FBS)(Invitrogen) 的 Dulbecco’ s Modified Eagle Medium(DMEM)(Invitrogen， Carlsbad， CA) 中培育。为诱导其分化为神经细胞， 将 PC12 细胞以 20000 个细胞 /cm2 的密 度铺于经聚 -L- 赖氨酸 (10mg/ml) 包被的培养皿中， 并在添加有 100ng/ml 神经生长因子 (NGF ； Alornone Labs， Jerusalem， Israel) 的 DMEM 中培育六天 (PC12N)。将 PC12N 在 1A9或 2C3 抗体存在或不存在的条件情况下在 4℃下暴露于 25μM 不含种子的 Aβ1-42 或经预 培育的 Aβ1-42 中 48 小时。由 Aβ1-42 诱导的神经毒性通过 Live/Dead 双色荧光测定法 根据供应商的说明 (Molecular Probes， Eugene， Oregon) 来进行评估。
     进一步， E12 抗体的中和 Aβ 诱导性神经毒性的活性通过下述方法评价。首先， 将 人类神经母细胞瘤细胞 (SH-SY5Y) 在含 10％ FBS 的 DMEM 中， 以 150000 细胞 / 孔的密度培 育 24 小时。然后， 将该培养基替换为不含血清、 含 Aβ1-42(12.5μM)、 且添加或未添加 E12 抗体的培养基， 并将所述细胞另行培养 24 小时。为确定由 Aβ1-42 诱导的细胞毒性， 利用 CytoTox96 试剂盒 (Promega) 测定源自死细胞的、 释放到所述培养基的 LDH 的水平。
     超滤与分子筛
     为确定神经毒性 Aβ 寡聚体在 25μM 的尺寸依赖性特征， 使用 Micron3kDa， 10kDa， 30kDa 与 100kDa 截留膜进行连续超滤， 制备四种滤出液 ( ＜ 3kDa， 3 到 10kDa， 10 到 30kDa， 30 到 100kDa) 以及 1 种保留溶液 ( ＞ 100kDa)。对每个级分进行上述的 Aβ 诱导性神经毒 性测定。使 PC12N 暴露于每个级分， 如上所述评价毒性级分。还通过上述点印迹分析鉴定 了由 A11， 1A9， 2C3 或 4G8 所识别的三维结构的分布。对各个级分进行原子力显微镜检查来 鉴定神经毒性寡聚体的形态学特征。
     电子显微镜检查 (EM) 与原子力显微镜检查 (AFM)
     用蒸馏水稀释试样， 并将其喷洒在经碳包被的网格上以进行电子显微镜分析。 所述网格用 1 ％磷酸钨酸负染色， 并在 Hitachi H-7000 电子显微镜 (Tokyo， Japan) 下 用 77kV 的加速电压进行观察。AFM 评价如近来所报道一般进行。将试样滴于新剥开的 云母上。让所述云母静置 30 分钟， 并然后用水洗涤， 并使用 Nanoscope IIIa(Digital Instruments， Santa Barbara， CA， USA) 设为轻敲 (tapping) 模式以分析液体试样。使用的 悬臂 (cantilever) 为 OMCL-TR400PSA(Olympus， Japan)。
     受试者组织与抽提
     本研究基于来自东京都老人综合研究所脑银行 (Tokyo MetropolitanBrain Bank for Aging Research of the Tokyo Metropolitan Institute ofGerontology)(Itabashi， Tokyo， Japan) 的尸体剖检病例 (n ＝ 50 ； 26 位男性与 24 位女性 ) 进行。本研究计划经东 京大学医学部 (the Faculty of Medicine， theUniversity of Tokyo)、 东京都老人综合研 究所东京都老人医疗中心 (the TokyoMetropolitan Geriatric Hospital of the Tokyo Metropolitan Institute ofGerontology)、 以 及 国 立 长 寿 医 疗 研 究 所 (the National Center of Geriatrics andGerontology) 的机构内伦理委员会所批准。已有人报道了受 试者与试样收集的细节 (Katsuno T， Neurology， 64 ： 687-692， 2005)。然而彼研究分析的是 不溶性脑级分， 而在本研究计划中， 本发明人分析了可溶性脑级分， 其在之前的研究中未经 鉴定 (Katsuno T， Neurology， 64 ： 687-692， 2005)。将冻结的组织试样 ( 内嗅皮层的前部 ) 在九倍体积的含蛋白酶抑制剂鸡尾酒的 Tris 缓冲盐水 (TS) 中匀浆。将匀浆在 265000x g 下超离心 20 分钟。对所得上清等分试样的三分之一 (0.5ml) 进行免疫印迹分析。
     免疫组织化学
     Tg2576 小鼠的左脑半球使用低温切片机 (RM 2145 ； Leica， Wetzlar， Germany) 切 为 30μm 厚的矢状切片， 并如前所述 (Wyss-Coray et al.， 2001) 用硫代黄素 S 进行染色。 利用抗突触泡蛋白抗体 (Chemicon， Temecula， CA) 进行肿大变性的神经突的形成的观察。通过在 40 倍放大率下观察来自每个小鼠左半脑的四或五个切片来计数硫代黄素 S 阳性斑 点数与突触泡蛋白阳性的肿大变性神经突数。为观察 Aβ 沉着， 将连续切片用甲酸或蛋白 酶 K 短暂地预处理， 再用 Aβ 免疫染色试剂盒 (Sigma， St.Louis， MO) 进行染色， 使用 ABC elite 试剂盒 (Vector Laboratories) 显现免疫阳性的信号。使用与显微镜连接的数字 照相机记录大脑皮层与海马的图像， 并用简单的 PCI 软件 (CompixImaging System， Lake Oswego， OR) 进行分析。使用共聚焦激光显微镜 (CarlZeiss LSM510) 观察抗体的脑内移行 (translocation)。硫代黄素 S 阳性的菌斑数与突触泡蛋白阳性的肿大变性神经突数以双 盲的方式确定。
     被动免疫疗法与行为分析
     三月龄的雌性非转基因 (non-Tg) 小鼠以及携带并过表达突变体人类 APP 基因的 Tg2576 小鼠购自 Taconics(Germantown， NY， USA)， 所述突变体基因具有家族性 AD 的瑞典 型 (Swedish-type) 双重突变 (K670N 与 M671L)。 这些小鼠在本发明人的动物设施中养育直 至 13 月龄。为确定类阿尔茨海默氏病表型是否受被动免疫预防， 将 1A9 或 2C3(0.4mg/kg/ 周 )， 或 PBS 施用于四月龄的 Tg2576 的尾静脉中， 并延续该给药直至 13 月龄。在第十三个 月， 如前人所述 (Mouri A， FASEB J， 21 ： 2135-2148， 2007) 进行记忆功能评估， 基于下列四个 行为范式 ： (1)Y- 迷宫测试中的短期记忆 ；
     (2) 新物体识别测试 ；
     (3)Morris 水迷宫测试 ； 以及
     (4) 附线索的恐惧条件测试 (contextual fear conditioning test)
     在行为测试三日后， 将所述小鼠处死以供生化与组织学评估。实验结果通过单向 与双向 ANOVA 分析。事后 (post-hoc) 分析使用 Fisher 检验进行。
     脂蛋白的分离与移除
     自 12 个 AD 患者与 13 个 NC 个体收集 CSF。然后， 从 600μl 的每个 CSF 试样中 通过制备性连续密度梯度超离心方法根据先前报道的规程 (Matsubara E， et al.， Ann Neurol， 45 ： 537-541， 1999) 移除脂蛋白。CSF 的密度用 KBr 调整为 1.25g/ml。将所述 CSF 在 100000rpm、 16℃下使用 HitachiRP100AT 离心机超离心 8 小时。对漂浮于密度 1.25g/ml 处的脂蛋白与除去了脂蛋白的 CSF 使用 3kDa 截留膜 (Microcon 3 ； Arnicon， Inc) 进行超 滤， 然后将其冻结储藏或于 4℃下储藏直至使用。
     亦通过亲和层析法使用 PHML-LIPOSORB(Calbiochem， La Jolla， CA) 移除脂蛋白。 每个试样 ( 血浆或脑 ) 与 PHML-LIPOSORB(Calbiochem， La Jolla， CA) 以 1.5 ∶ 1 的比例合 并， 并混合 60 秒。随后将混合物在 3000rpm 下离心 10 分钟。对所得上清 ( 无脂蛋白的试 样 ) 进行 6E10 寡聚体 ELISA。与 PHML-LIPOSORB 结合的脂蛋白结合试样使用 20mM 脱氧胆 酸钠洗脱。 使用 1％琼脂糖凝胶电泳 (Beckmann)， 继以用 FAST-RED 7B(Wako， Osaka， Japan) 染色， 来确证特异性的脂蛋白移除。
     人类 Aβ 的定量
     通 过 夹 心 ELISA 如 前 人 所 详 述 (Matsubara E， et al.， Ann Neurol， 537-541， 1999 ； Matsubara E， et al.， Neurobiol Aging， 25 ： 833-841， 2004) 特异性地对全血浆与 LPDP Aβ 种类进行定量。为分析脑 Aβ 种类， 对溶于 100μl 缓冲液的可溶性 Aβ 种类直
     接进行 ELISA， 而对于以 70 ％甲酸提取物形式存在的不可溶 Aβ 试样， 在 ELISA 前用 1M Tris-HCl(pH 8.0) 中和， 并稀释 1000 倍。通过该分析获得的值用脑湿重校正， 最终表达为 pmol/g。板之间的标准化通过在所有三个板中包括三个标准血清试样来实现。
     Aβ 寡聚体特异性 ELISA
     为了特异性的检测寡聚 Aβ 而非单体 Aβ， 使用了化学发光 ELISA， 即利用化学发 光的夹心固相酶免疫测定。将微孔板用单克隆 1A9(IgG2b 同种型 ) 或 2C3(IgG2b 同种型 )， 或 1A9 与 2C3 的混合物包被。添加 100μl 的不同试样 ( 脑或脑脊液 ) 并在 4℃下连续培育 24 小时。然后， 添加辣根过氧化物酶缀合的 BA27 Fab’ 片段 ( 特异于 Aβ40 的抗 Aβ1-40 ； Wako pure chemical， Osaka， Japan) 或辣根过氧化物酶缀合的 BCO5 Fab’ 片段 ( 特异于 Aβ42 的抗 Aβ35-43 ； Wako pure chemical， Osaka， Japan)， 并在 4℃下培育 24 小时。使用 SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate(Pierce， Rockford， IL， USA)， 用 Veritas Microplate Luminometer(Promega) 对产生的化学发光定量。
     为评估用单克隆 1A9 与 2C3 外周给药的体内效用， 自经给药的小鼠采集血浆与器 官试样， 并使用特异于人类寡聚体的 HRP 标记 6E10(SenetekPLC， Napa， CA， USA) 通过 ELISA 对 Aβ 寡聚体进行分析。为了提高敏感度， 使用上述的化学发光系统进行检测。为避免脂 蛋白结合性 Aβ 单体的干扰， 本发明人使用 PHML-LIPOSORB 以与前述相同的方法预处理了 血浆或器官试样。所得的除去了脂蛋白的试样用于所述分析。
     实施例 1
     制备 Aβ 寡聚体特异性单克隆抗体 (1A9 与 2C3)
     Aβ 寡聚体与单体在溶液中共存。因而， Aβ 单体的移除对于为产生 Aβ 寡聚体特 异性抗体的抗原制备而言非常关键。如图 1A 所示， 本发明人成功的通过 SDS-PAGE 分离了 不含 Aβ 单体污染的 SDS 稳定性 Aβ 四聚体。在用分离所得的 Aβ 四聚体进行体内免疫接 种后， 通过先进行点印迹分析再进行免疫沉淀的两步筛选法， 选取了阳性杂交瘤克隆。 在进 行点印迹分析的 400 个克隆中， 16 个克隆被确定为阳性 ( 阳性率＝ 4％ )。为评估分离所 得阳性克隆针对寡聚体的特异性， 对源自 AD 脑的不溶于磷酸缓冲液但可溶于甲酸 (FA) 的 淀粉样蛋白级分 (Matsubara E et al.， Neurobiol Aging， 25 ： 833-841， 2004)， 使用所述阳 性杂交瘤的细胞培养上清通过免疫沉淀进行了分析 ( 图 1B)。使用抗 Aβ 单克隆抗体 4G8 的免疫印迹分析检出了 Aβ 二聚体、 较前者少量的三聚体、 以及具有聚集 Aβ 分子种类的更 高分子量的弥散 (smear)。亦检出了非常少量的在 SDS 存在下解离出的 Aβ 单体。为了进 一步确证天然 1A9 或 2C3 三维结构 ( 亦即， 寡聚体 ) 的存在， 本发明人试图在经突变体 PS1 cDNA 转染的人类胚胎肾 (HEK)293 细胞的条件化培养基 (CM) 中检出所述寡聚体 (Nakaya Y et al.， J Biol Chem， 280 ： 19070-19077， 2005)。本发明人尝试通过 SEC 对 HEK293 CM 进 行分级分离， 并然后鉴定出寡聚体。如之前报道 (Matsubara E et al.， Neurobiol Aging， 25 ： 833-841， 2004 ； Yamamoto N， et al.， JBiol Chem， 282 ： 2646-2655， 2007)， 该方法可有效 的从单体 ( 级分 14 到 20) 中分离出寡聚体 ( 级分 8 到 13)。当使用单克隆 1A9 进行免疫沉 淀时， 分泌入 CM 的 SDS 稳定性 Aβ 二聚体在级分 8 中被沉淀出来 ( ＞ 680kDa) ； SDS 稳定性 Aβ 二聚体与三聚体在级分 13 中被沉淀出来 (17 到 44kDa) ； 还有非常少量的二聚体在级分 16 中被沉淀出来 ( 图 1C)。当使用 2C3 进行免疫沉淀时获得相似的结果 ( 数据未显示 )。 这些数据说明 1A9 与 2C3 对 Aβ 寡聚体具有确切的特异性， 而不识别 Aβ 单体。实施例 2
     单克隆 1A9 与 2C3 的抗神经毒性活性
     为评估单克隆 1A9 或 2C3 是否能够预防 Aβ 诱导的神经毒性， 将 NGF- 分化的 PC12 细胞 (PC12N) 与 25μM 无种子 (seed free) 的 Aβ1-42(ThT 阴性 540000x g 上清 ) 在所述 单克隆抗体 (mAb) 存在或不存在的条件下在 37℃下培育 48 小时。神经细胞的生存力通过 LIVE/DEAD 分析来确定 ( 图 2)。在 Aβ1-42 存在时， 较之对照测定 ( 图 2A)， 以显著的高水 平检出了神经细胞死亡 ( 图 2B 与 2G)。非特异性 IgG2b( 图 2C 与 2D) 无法在相同条件下 抑制 Aβ1-42 诱导的神经毒性。可市购的 Aβ 特异性单克隆抗体 4G8(IgG2b 同种型 ； 图 2D 与 2G) 具有增强毒性的倾向。单克隆 2C3(IgG2b 同种型 ； 图 2F 与 2G) 以浓度依赖性方式几 乎完全中和了 Aβ1-42 的神经毒性。因此推测从头形成 (de novo-formed) 性的神经毒性 2C3 三维结构为寡聚体形式。与此同时， 1A9(IgG2b 同种型 ； 图 2E 与 2G) 的抗神经毒性活性 落在 2C3 与非特异性 IgG2b 的抗神经毒性活性之间。这表明由 1A9 三维结构与 2C3 寡聚体 具有结构上不同的三维结构。
     实施例 3
     当下， 确定神经毒性 Aβ1-42 寡聚体的准确大小与构象是最紧要的课题之一， 对 此竞争激烈。本发明人成功的分离出可溶性神经毒性 Aβ1-42 分子种类， 并通过超滤与分 子筛 (UC/MS) 将该种类分级分离为下述五个级分 ( 图 3A) ：
     级分 1， ＜ 3kDa 的滤出物 ( 泳道 1) ；
     级分 2， 3 到 10kDa 的滤出物 ( 泳道 2) ；
     级分 3， 10 到 30kDa 的滤出物 ( 泳道 3) ；
     级分 4， 30 到 100kDa 的滤出物 ( 泳道 4) ； 以及
     级分 5， ＞ 100kDa 的保留溶液 ( 泳道 5)。
     使用单克隆 4G8 的免疫印迹分析 ( 图 3A) 揭示 ：
     级分 1 不含有 Aβ( 泳道 1) ；
     级分 2 含有 Aβ 单体 ( 泳道 2) ；
     级分 3( 泳道 3) 含有 Aβ 单体与少量 Aβ 二聚体 ；
     级分 4( 泳道 4) 含有 Aβ 单体到五聚体 ； 以及
     级分 5( 泳道 5) 含有 Aβ 单体到五聚体， 以及 45 到 160kDa 的条带。
     这些数据表明， 2％ SDS 可将高分子量 (HMW) 的 Aβ 寡聚体解聚成 Aβ 单体与低分 子量 (LMW)Aβ 寡聚体。 为评估毒性 Aβ1-42 的尺寸分布， 本发明人测定了各个级分在 37℃ 下与 PC12N 培育 48 小时后的生物学活性。如图 3B 与 3C 所示， 说明了 ： 级分 1 不具毒性， 级 分 2 毒性很弱， 表明 Aβ 单体与二聚体具有毒性的可能性不高。级分 3 到 5 具有显著的毒 性 ( 单向 ANOVA ； p ＜ 0.0001)， 表明神经毒性寡聚体的尺寸理论上相当于三聚体或更高。 使 用寡聚体特异性 A11 抗体的点印迹分析也发现， 上述三个神经毒性级分 (3 到 5) 对 A11 为 阳性的， 这为神经毒性分子为寡聚的提供了旁证 ( 图 3D)。2C3 识别的寡聚体在级分 4 与 5 中检出 ( 图 3D)。从而说明 2C3 实际上与神经毒性 Aβ 寡聚体 ( ＞ 30kDa) 反应。进一步， 大部分 2C3 识别的寡聚体在毒性最高的级分 5( ＞ 100kDa) 中检出， 因此我们认为具有超过 100kDa 的分子量的 2C3 识别的寡聚体显示强神经毒性 ( 图 3D)。同时， 仅仅极少量的 1A9 识别寡聚体分布于最具毒性的级分 5 中。这与 1A9 对神经毒性的中和作用不足的结果 ( 图2E 与 2G) 相符。与之相对的是， 不具有抗神经毒性活性的单克隆 4G8 可检出分布于所有级 分中的 Aβ 种类 ( 图 3D)。这表明在相同的尺寸下寡聚体也可能作为非毒性聚合体共存。
     为进一步评估毒性 - 结构之间的相关性， 对每个级分进行原子力显微镜 (AFM) 观 察。只有在三个呈神经毒性的级分中检出了与其级分大小对应的球状颗粒形态的存在。图 3E 显示非毒性级分 2(Fr.2)， 毒性级分 3(Fr.3) 与 4(Fr.4)， 以及最具毒性的级分 5(Fr.5) 的原子力显微镜图像。毒性级分中清楚可见许多颗粒多聚物分子的形成。具体而言， 可见 级分 5 除了大小不同的粒状分子外， 还包括珠形、 环形分子等混在的不均一的毒性分子。
     实施例 4
     1A9 将 2C3 阻抑 Aβ 淀粉样蛋白原纤维形成的活性
     然后， 本发明人评估了 1A9 与 2C3 是否具有阻抑 Aβ 淀粉样蛋白原纤维形成的活 性。Aβ1-42 淀粉样蛋白原纤维的形成 ( 在 0， 10， 25 与 50μM 下 ) 通过在 37℃下测定 ThT 荧光度 72 小时来评估。在本发明人使用的条件下， 无种子的 Aβ1-42( 通过在 540000x g 下获取的 ThT 阴性上清级分 ) 通过成核依赖性聚合作用聚合为淀粉样蛋白原纤维 ( 图 4A)。 为评估 1A9 与 2C3 阻抑 Aβ 淀粉样蛋白原纤维形成的活性， 本发明人将 25μM 无种子的 Aβ1-42 在所述抗体存在或不存在的条件下在 37℃下培育 48 小时。如图 4B 所示， ThT 荧光 强度以 2C3 浓度依赖性形式改变， 而在单克隆 1A9 与 4G8 与非特异性 IgG2b 存在下均未见 变化。与此同时， 当 Aβ 通过培育两小时进行聚合时， 1A9 及 2C3 都显示几乎完全阻抑所述 原纤维形成的活性 ( 图 4C)。由于 2C3 即使在对 Aβ 的分子比例低的时候亦检出阻抑 Aβ 淀粉样蛋白原纤维形成的活性， 暗示 2C3 具有在 Aβ1-42 淀粉样蛋白原纤维形成早期阶段 抑制从头开始形成的聚合核或种子功能 (seed function) 的能力。通过形态学观察也获得 了相似的结果。如图 4E(Aβ42 自身 ) 与图 4F(Aβ42+2C3， 25 ： 3) 所示， 电子显微镜 (EM) 观 察说明 Aβ 淀粉样蛋白纤维的形成在单克隆 2C3 的存在下受部分抑制， 而在 1A9 存在下仅 发生微弱的抑制作用 ( 图 4G)。与此同时， 所述测试抗体对于通过 24 小时培育预先形成的 Aβ1-42 淀粉样蛋白原纤维均不显示裂解或解聚作用 ( 图 4D)。
     实施例 5
     1A9 与 2C3 靶向的毒性相关寡聚体
     为说明 Aβ1-42 寡聚化与淀粉样蛋白原纤维形成间的结构与动力学联系， 通过使 用 A11， 1A9， 2C3 与 4G8 的点印迹分析了聚合的时间进程。 如图 5A 所示， 大部分 A11 抗体 - 反 应性寡聚体在聚合作用的时滞 (lag time) 期 (0-8 小时 ) 形成， ThT 荧光强度相对较弱。在 接下来的纤维延伸期 (8 到 24 小时 ) 中， A-11 免疫应答性寡聚体的水平达到平台， 并然后 保持恒定 ( 大约为峰值水平的 20％ ) 直至 72 小时 ( 平台期 )。有人表明， 抗寡聚体 A11 抗 体并不识别淀粉样蛋白原纤维， 可使用该抗体特异性地观察 Aβ 寡聚体形成 (Kayed R， et al.， Science 300， 486-489， 2003)。因此， 现在的结果表明 Aβ 寡聚体形成发生于淀粉样蛋 白原纤维形成之前， 且存在一个不直接进入淀粉样蛋白原纤维形成通路的寡聚化状态。 2C3 识别的寡聚体与 A11 识别的寡聚体在动力学上类似， 但 1A9 识别的寡聚体的动力学不同。 1A9 识别的寡聚体在四个小时后方检出， 随后可见 1A9 的免疫反应性随时间增加到两倍。 这 就表明 1A9 识别的寡聚体形成较慢。与此相对的是， 揭示了 2C3 识别寡聚体在时滞期 (0 到 8 小时 ) 瞬时出现， 然后在 8 到 72 小时以非常微量的寡聚状态 ( 少于 5％ ) 存在。由本发 明人获取的上述数据表明 A11-， 1A9- 与 2C3 识别寡聚体可能具有结构上和免疫学上不同的三维结构或稳定性， 而且 2C3 识别的寡聚体较之 1A9 识别的寡聚体而言相对不稳定。
     为 鉴 定 所 述 从 头 合 成 的 毒 性 聚 合 状 态， 将 PC12N 在 37 ℃ 下 暴 露 于 无 种 子 的 Aβ1-42(0 小时 )， 或经 2、 4 或 24 小时预培育的 Aβ1-42 48 小时 ( 图 5B)， 并检验其神经 毒性活性。如图 5B 所示， 使用 4G8 的免疫印迹分析揭示在 0 小时时点已经存在了单体到三 聚体。所述 2 或 4 小时的预培育导致形成除所述单体到五聚体外， 还得到了 45 到 160kDa 的高分子量 (HMW) 弥散物。在 24 小时的时点， 所述 HMW 弥散物急骤减少， 且形成了两类主 要组分 ： 无法进入凝胶而残留于孔中高分子量种类， 与少量单体。所述 HMW 弥散物在进一 步在 37℃下培育 48 小时后消失。如图 3A 与 5C 所示， 分子筛实验揭示， 无种子的 Aβ1-42 被转化为 100kDa 或更大的分子种类， 并显示最强的毒性。在 SDS-PAGE 上显示， 所述毒性 分子除所述单体到五聚体种类外， 亦包括呈现 45 到 160kDa 的高分子量 (HMW) 弥散形式的 分子种类， 且毒性多聚物在 SDS 的存在下可轻易的解离为低分子量种类。然而当将无种子 的 Aβ1-42 预培育 2 小时与 4 小时时， 从头开始形成的 Aβ 寡聚体的神经毒性活性分别减 少了约 12.5％与 26％ ( 图 5C)。该结果表明在 Aβ 聚合作用早期阶段从头开始形成的 Aβ 寡聚体水平为神经毒性的决定性因素， 且所述形成在 0-2 小时的期间内达到峰值， 然后随 着时间推移形成的 Aβ 寡聚体量减少。或者， 也存在这样的可能， 即 Aβ 淀粉样蛋白原纤维 的从头开始聚合的核或淀粉样蛋白原纤维自身具有中和神经毒性的效果。本发明人培育 Aβ1-42 两小时， 然后通过在 540000x g 下超离心 3 小时移除不可溶的 Aβ 聚合核与淀粉样 蛋白原纤维。在 540000x g 下超离心所得的上清与沉淀展示相似水平的硫代黄素 T 信号， 表明 540000x g 上清中也含有可溶性 ThT 阳性可溶性 Aβ 聚合体 ( 表明 ThT 结合带来形成 富含 β 片层的结构变化而非原纤维形成 )。当仅将该可溶性聚合体暴露于 PC12N 时， 所述 神经毒性恢复且增强 ( 图 5D)。这表明不可溶的 Aβ1-42 自身具有抗毒性活性。在上述状 况下， 单克隆 1A9 完全中和了由富含 β 片层结构的可溶性 Aβ 寡聚体诱导的神经毒性， 且 该中和活性较之 2C3 的为高。与此同时， 非特异性的 IgG2b 自身对培养 PC12N 的生存无影 响。由此， 推测神经毒性 1A9 识别的聚合体本质上为可溶性毒性寡聚体， 其由于一些结构变 化略微稳定化， 而神经毒性 2C3 识别的多聚物本质上为短命的寡聚中间体， 其由于在聚合 过程早期巨大的结构变化而非常的不稳定。
     实施例 6
     单克隆 1A9 与 2C3 在脑实质中识别 Aβ 寡聚体
     在实证了 1A9 与 2C3 的特异性与生物学活性之后， 本发明人进一步在脑中通过免 疫组织化学检出了 1A9 与 2C3 聚合体。本发明人实施了常规免疫组织化学方法以通过甲醛 固定， 以及甲酸， SDS 或微波处理脑切片以增强免疫反应。所有所述增强方法都无法使所述 两个抗体展示任何针对 AD 脑的免疫反应性。 从而， 本发明人用蛋白酶 K 预处理所述切片， 该 酶已知可改善免疫染色 (Wrzolek MA， et al.， Am J Pathol， 141 ： 343-355， 1992)。其结果， 许多老年斑被 1A9( 图 6A)， 2C3( 图 6B) 与 A11( 图 6C) 所染色。与从本发明人进行的体外 实验获得的发现， 即 Aβ 淀粉样蛋白原纤维可中和 Aβ 寡聚体诱导的神经毒性结合起来看， 上述结果表明老年斑充当隔离并储藏 Aβ 寡聚体的防御性仓库， 因此该仓库的内部抗体难 以到达。确实， 使用 1A9 与 2C3 的免疫沉淀确认， 由老年斑构成的淀粉样蛋白级分中存在由 所述两种抗体识别的 Aβ 寡聚体。从而， 证明了本发明人的假说与体内证据一致 ( 参见图 1B)。为进一步评估 “可溶性” 1A9- 与 2C3- 识别的聚合体在脑内的存在， 本发明人使用 所述两种抗体进行了免疫沉淀实验。 使用 Tris 缓冲盐水 (TBS) 制备脑匀浆以避免在提取可 溶性寡聚体过程中的化学修饰。用 1A9 从来自 AD 脑大脑皮层的 TBS 试样中免疫沉淀出了 具有四聚体， 五聚体， 八聚体与十二聚体分子量的寡聚体 ( 图 6D， 泳道 2)， 而在对照健康脑 中所述寡聚体的水平低于检测限 ( 泳道 3)。 四聚体， 五聚体与八聚体的强度虽在 1A9( 泳道 2) 与单克隆 4G8/6E10 混合物 ( 泳道 1) 间相似， 1A9 似较之 4G8/6E10 回收了较多量的十二 聚体。用 2C3 进行的免疫沉淀显示了相似的结果 ( 图 6， 第 4-6 道 )。然后， 本发明人鉴定 了在人类内嗅皮质中导致体内神经毒性的分子。众所周知在一般高龄人群中， 该病变中神 经元纤维缠结 (NFT) 与神经细胞丧失发生于老年斑形成之前。本发明人提出这样的假说， 即针对 1A9 与 2C3 识别的聚合体有功能的仓库 ( 例如老年斑 ) 的缺乏对内嗅皮层神经元是 有害的， 而且是记忆紊乱的可能原因。通过使用单克隆 1A9 与 2C3 的免疫印迹确定了之前 报道的 50 个尸体剖检病例中可溶于缓冲液的级分中的十二聚体水平。所述 50 个病例包括 两个 AD 病例， 35 个 Braak NFT I 到 II 期的病例与 13 个 NFT III 到 IV 期的病例 (Katsuno et al.， Neurology， 64 ： 687-692， 2005)。如图 6E(1A9) 与 6F(2C3) 所示， 1A9 或 2C3 免疫 反应性十二聚体相对于肌动蛋白的免疫活性在 AD 患者中较之健康对照组 (Braak NFT I 到 II 期 ) 与轻度认知障碍组 (Braak NFT III 到 IV 期 ) 显著为高。有趣的是， 所述十二聚体 在健康对照组 (Braak NFT I 到 II 期 ) 与轻度认知障碍组 (Braak NFT III 到 IV 期 ) 的内 嗅皮质中分别以约 40％与 60％的水平积聚 ( 在 AD 比例中该水平为 100％ )( 图 6E 与 6F)。 该结果表明 12 聚体的积聚发生于认知机能障碍病发之前， 且随 Braak NFT 分期的推进而增 加， 暗示 1A9 与 2C3 免疫反应性十二聚体是导致体内神经毒性的聚合体。
     实施例 7
     单克隆 1A9 与 2C3 在脑脊液中识别 Aβ 寡聚体
     导致体内神经毒性的 Aβ 聚合体 ( 可溶性 1A9 与 2C3 免疫反应性十二聚体 ) 在脑 实质中被发现。 据此， 本发明人推测， CSF 亦含有所述聚合体。 为证实这一点， 本发明人将自 十个 AD 患者与作为对照的十个年龄匹配的健康个体汇集的 CSF 通过 SEC 进行分级分离， 并 通过 Aβ 寡聚体特异性夹心 ELISA 对这些级分进行分析， 其中在捕获与检测系统中使用单 克隆 BC05 或 BA27。BC05/BC05 寡聚体 ELISA 在级分 13 中检测出可溶性 Aβ1-42， 而 BA27/ BA27ELISA 在级分 7-14 中检测出可溶性 Aβ1-40( 数据未显示 )。 然而， 在每个 ELISA 中， 吸 光度 (450nm 处的 O.D.) 低至无法敏感地在 CSF 中检测出少量 Aβ 寡聚体。 在相同级分中通 过 BNT77ELISA 检测出 Aβ 单体， 显示结合有脂蛋白的 Aβ 单体 ( 级分 7 到 14) 与无脂蛋白 的 Aβ 单体 ( 级分 15 到 17) 在所述级分中与 Aβ 寡聚体共存 ( 图 7-1A 与 7-1B)(Matsubara E， et al.， Neurobiol Aging， 25 ： 833-841， 2004)。在 AD 中结合有脂蛋白的 Aβ 单体的水 平与健康对照相似， 而在 AD 中无脂蛋白的 Aβ-40 单体 ( 图 7-1A) 与 Aβ42 单体 ( 图 7-1B) 较之年龄匹配的健康对照为低。本发明人亦发现在将 ELISA 设计为使用 HRP 标记的 BC05 或 BA27 作为捕获抗体时， 除所述寡聚体外， 与脂蛋白结合的 Aβ 单体亦可被检出。该问题 在现有技术文献中未被注意 (Lee EB， et al.， J Biol Chem， 281 ： 4292-4299， 2006)， 后者描 6E10/6E10 ELISA)。因为所述寡聚体和与脂 述了与本文所述方法相似的分析方法 ( 例如， 蛋白结合的 Aβ 单体在 SEC 中洗脱的保留时间相似， 无法通过寡聚体 ELISA 在捕获与检测 中使用相同的抗体对它们进行区分。从而， 揭示了在使用 Aβ 寡聚体 - 非选择性抗体分析Aβ 寡聚体时， 含脂蛋白的 CSF 不适于用作测试试样。
     为克服这些现有技术方法的缺点， 本发明人改进了用于 ELISA 的检测抗体与试 样。原先 CSF 中去除脂蛋白， 将所得的去除了脂蛋白的 CSF(LPD-CSF) 用作测定试样。Aβ 寡聚体特异性 1A9 与 2C3 用作 ELISA 的检测抗体。进一步， 建立了化学发光 ELISA 以增强 敏感度。将汇集的 LPD-CSF( 图 7-1C 到 D) 通过 SEC 分级分离， 且对于每一级分通过化学发 光 ELISA 分析其 Aβ 寡聚体分布， 其中使用 1A9 或 2C3 作为检测抗体。如图 7-1C 到 D 所示， Aβ 寡聚体在 SEC 级分 12 到 15( 相对较大的 Aβ， 其分子量范围为 18 到 108kDa， 其对应于 四聚体到二十四聚体的尺寸 )。在所有 AD 患者来源的、 其中所述寡聚体可检出的级分中， 1A9 与 2C3 识别的寡聚体水平均变高。 为评估所述 Aβ 寡聚体作为治疗标志的有用性， 对来 自 AD 患者 LPD-CSF 中与来自年龄匹配健康对照中的 Aβ 寡聚体水平进行比较， 尽管仅分析 了少数病例。如图 7-2G 所示， 由 Aβx-42 组成的 2C3 识别的寡聚体在 AD 患者组中较之正 常对照组显著增加 ( 非参数分析 ； p ＝ 0.0103)。与之相对， 对于由 Aβx-40 组成的 2C3 识 别的寡聚体， 在所述两组间并无显著差异。另一方面， 由 Aβx-42 组成的 1A9 识别的寡聚体 的水平在 AD 中较之在对照中为高， 尽管该差异在统计上并非显著。对于由 Aβx-40 组成的 1A9 识别的寡聚体， 两组之间并无显著差异 ( 图 7-2E)。自 Aβ 单体变为寡聚体的结构变化 发生在 Aβ 聚合过程的最早阶段。Aβ 寡聚体与单体间的比例 (O/M 指数 ) 可用作反映 AD 病理特征的临床指标。如图 7-2F 与 7-2H 所示， Aβ42 与 Aβ40 的 O/M 指数在 AD 患者组中 较之健康对照组均有显著提高 (1A9， 对 Aβ42 为 p ＝ 0.0137， 而对 Aβ40 为 p ＝ 0.0429 ； 2C3， 对 Aβ42 为 p ＝ 0.0012 而对 Aβ4-0 为 p ＝ 0.0051)。上述结果显示 1A9 与 2C3 阳性 的三维结构不但以 Aβ 寡聚体的形式存在于 LPD-CSF 中， 且在 AD 患者中增加。此外， 本发 明人获取的结果说明 ： 从不带脂蛋白的可溶性 Aβ 到寡聚中间体的结构转换发生于 AD 患者 的 CSF 中， 且所述寡聚体可作为有用于诊断散发性 AD 的生物学标志。
     实施例 8
     使用单克隆 1A9 与 2C3 的被动免疫疗法阻止在 Tg2576 中记忆紊乱的发病
     为评估基于 1A9(n ＝ 13) 或 2C3(n ＝ 11) 给药的被动免疫疗法的体内预防 / 治疗 效果， 本发明人将 1A9 或 2C3(0.4mg/kg/ 周 ) 或 PBS 通过尾静脉在 4 到 13 个月龄期间施用 于 Tg2576 小鼠。对 13 个月龄时的记忆功能以以下四种类型的学习 / 行为范式加以评估 ：
     (1)Y 迷宫测试中的短期记忆 ( 图 8A) ；
     (2) 新物体识别测试中的物体认识记忆 ( 图 8B) ；
     (3) 水迷宫测试中的空间记忆 ( 图 8C) ； 以及
     (4) 附线索的恐惧条件测试中的联想情感记忆 ( 图 8D)。
     较之施用 1A9 与 2C3 的 Tg2576 小鼠， 施用 PBS 的 Tg2576 小鼠显示显著的学习与 行为障碍 ( 图 8A 到 8D)。与施用 PBS 的 Tg2576 小鼠 (n ＝ 10) 不同， 施用 1A9 或 2C3 的 Tg2576 小鼠的记忆功能与之前测得的其年龄匹配的未经施用的野生型同龄组小鼠的记忆 功能之间不能区分。由此可见， 在施用 1A9 或 2C3 的 Tg2576 小鼠中， 本应发生减损的短期 与长期记忆——在施用 PBS 的组中发生了这样的减损——得以保持。亦即， 发明人获得了 支持下述观点的证据， 即如果在记忆障碍发病之前进行靶向 Aβ 寡聚体的被动免疫疗法， 可能预防记忆障碍发病， 特别是 AD 发病。进一步， 上述结果代表了首次发现的体内证据， 其 直接指明 Aβ 寡聚体是记忆障碍发病分子。实施例 9
     单克隆 1A9 在 Tg2576 的脑中阻止 Aβ 积聚
     对经施用 PBS 的 Tg2576 小鼠 (n ＝ 10) 与在 4 到 13 月龄期间经被动免疫疗法处 理的 Tg2576 小鼠 (1A9 给药组， n ＝ 13 ； 2C3 给药组， n ＝ 11) 在所述学习 / 行为实验后进行 解剖。积聚于脑中 ( 大脑皮层 ： 海马 ) 的 Aβ 量在下述三个通过连续提取制备的级分 ( 每 个提取物 150mg) 中测定 ： 在含蛋白酶抑制剂的 Tris 缓冲液中的可溶性级分 ； 2％ SDS 可溶 性淀粉样蛋白级分 ； 以及 2％ SDS- 不可溶但 70％甲酸可溶性淀粉样蛋白级分。我们认为， Tris 缓冲液级分中包含非积聚性的生理性 Aβ 分子， 而 2％ SDS 可溶性 Aβ 中包含在淀粉样 蛋白原纤维形成之前的散在老年斑、 免疫细胞化学上无法检出的 Aβ、 以及经过三维结构变 化的、 积聚性的可溶性寡聚 Aβ。利用 Aβ40- 与 Aβ42 末端特异性 ELISA( 特异于 Aβ40 的 BNT77/BA27， 特异于 Aβ42 的 BNT77/BC05， WAKO 试剂盒 ) 分别对 Aβ 进行定量。主要组分 为非积聚性生理性 Aβ 分子的 Tris 缓冲液级分中的 Aβ 浓度在这三组之间并无显著差别 ( 图 9A 与 9C， Aβx-40 ； 图 9B 与 9D， Aβx-42)。在脑中可溶性 Aβ 的积聚量 (SDS 级分 ) 方 面， 仅于 1A9 给药组中确认了显著的针对 Aβx-40 和 Aβx-42 在大脑皮层中积聚的阻抑作 用 ( 图 9E， Aβx-40 ； 图 9F， Aβx-42)。未在海马中观察到积聚阻抑作用 ( 图 9G， Aβx-40 ； 图 9H， Aβx-42)。与此同时， 在脑中不可溶 Aβ 的积聚量 (FA 级分 ) 方面， 仅于 1A9 给药 组中观察到了显著的针对 Aβx-40 在大脑皮层中积聚的阻抑作用 ( 图 9I， Aβx-40 ； 图 9J， Aβx-42)。未在海马中观察到积聚阻抑作用 ( 图 9K， Aβx-40 ； 图 9L， Aβx-42)。对 SDS 可 溶性级分的 A11 免疫印迹分析显示在所述两个抗体处理组中对大脑皮层中 A-11 阳性寡聚 体 ( 四聚体 ) 积聚的阻抑作用 ( 图 9M)。
     实施例 10
     用 1A9 与 2C3 的被动免疫疗法增加血浆 Aβ
     下列三组间在血浆 Aβ 浓度方面并无显著差异 ： 施用 PBS 的 Tg2576 小鼠 (n ＝ 10)， 以及在 4 到 13 月龄期间经被动免疫疗法处理的 Tg2576 小鼠 (1A9 给药组， n ＝ 13 ； 2C3 给药组， n ＝ 11)( 图 10A， Aβx-40 ； 图 10B， Aβx-42)。Aβ40/42 比例亦无显著差异 ( 图 10C)。
     为了说明在 Tg2576 小鼠中使用 1A9 与 2C3 的被动免疫疗法针对 AD 样表型的预 防作用背后隐藏的机理， 本发明人在汇集的脑匀浆中评估了可溶于与不可溶于生理盐水的 Aβ 寡聚体的存在， 以及 Aβ 寡聚体在外周血与血浆中的存在。在所述处理组之间在汇集 的脑匀浆中可溶于生理盐水的 Aβ 寡聚体的量方面并无差异 ( 图 10D)， 另一方面， 不可溶 Aβ 寡聚体的量在 1A9 与 2C3 处理组中显示为减少 ( 图 10E)。进一步， 对各处理组内汇集 的血浆 ( 除去白蛋白的血浆， 小图 F 上段 ； 除去白蛋白 / 脂蛋白的血浆， 小图 F 的下段 ) 通 过 A11 点印迹分析其所含的 Aβ 寡聚体。其结果显示来自 PBS 给药 Tg2576 小鼠的血浆中 存在所述寡聚体 ( 图 10F)。在在被动免疫治疗组中， 血浆中的 A11- 阳性寡聚体较之 PBS 给 药组清楚地增加 ( 图 10F)。2C3 识别的寡聚体以脂蛋白结合形式存在的比例较之 1A9 识别 的寡聚体为高 ( 小图 F 的下段 )。进一步， 通过 A11 免疫沉淀考察血浆 Aβ 寡聚体。结果 发现， 与 PBS 给药组相比， 接受被动免疫治疗的 Tg2576 小鼠中约 200kDa 的寡聚体发生了增 加 ( 图 10G)。血浆 Aβ 寡聚体在被动免疫治疗组中的这种增加可视为直接反映了脑内清 除 (cerebral clearance) 的增加。从而， 本发明人获得了下述证据， 即静脉内被动免疫疗法的直接靶分子不但存在于脑中， 亦存在于血液中， 可通过在外周位点的作用增强寡聚体 的选择性脑内清除。亦即， 本发明人显示了静脉内被动免疫疗法在临床上的有用性。
     实施例 11
     使用 1A9 与 2C3 的被动免疫疗法可阻抑淀粉样蛋白老年斑与肿大变性神经突形成
     在被动免疫疗法组中免疫组织化学 Aβ 沉着受阻抑 ( 图 11A)。硫代黄素 S 染色阳 性老年斑淀粉样蛋白数在大脑皮层与海马中也均显著受阻抑 ( 图 11B， 上段 ) ； 该减少在组 织学上也是明显的 ( 图 11B， 下段 )。突触泡蛋白阳性肿大变性神经突形成在被动免疫治疗 组中亦显著的受阻抑 ( 图 11C)。
     实施例 12
     使用抗突触泡蛋白或抗脑发育调节蛋白抗体的免疫染色分析
     1A9 与 2C3 在大脑新皮质中阻抑了前突触与后突触的变性 ( 图 12)。
     实施例 13
     抗体的脑内移行
     使用共焦聚激光显微镜评估了 Aβ 沉着与脑内小鼠 IgG 的存在 / 位置。其结果显 示， 在散在老年斑存在的区域中， 小鼠 IgG 存在的位置几乎与沉着 Aβ 无关。该小鼠 IgG 仅 见于被动免疫疗法组 (1A9( 图 13A) 与 2C3( 图 13B)) 中， 但非 PBS 给药组 ( 图 13C) 中。由 此可见， 施用于血液的抗体中一部分转移到了脑中。 该结果显示 ： 转移到脑内的抗体直接中 和可溶性 Aβ 聚合体毒性的， 且进一步可溶性 Aβ 聚合体以与所述抗体的复合物的形式被 清除到血中， 来发挥预防记忆障碍的效果。因而认为其治疗系基于复合作用机制。
     实施例 14
     不识别其它 Aβ 单体但为寡聚体特异性的抗体 (E12， 1C10 与 4D3)
     1C10 与 4D3 是来自在 386 个含通过对小鼠重新免疫接种所得的杂交瘤的孔中 24 个阳性细胞孔的两种强阳性的细胞。自合成 Aβ1-40(HCl 形式 ) 制备 50μM 无种子的 Aβ1-40( 单体 )， 其可容易地从无规卷曲结构形成 β 片层结构 ； 将其在 37℃下培育 0 到 96 小时以产生寡聚体， 并通过点印迹法来检查所述抗体的寡聚体特异性。经确证， 如同上述 2C3 的结果， E12， 1C10 与 4D3( 均为 IgM 同种型 ) 并不与单体反应， 但对寡聚体是特异性的 ( 图 14)。
     实施例 15
     同种型变为 IgG2b 的 E12 抗体的免疫点印迹分析
     对 E12 进行免疫点印迹分析， 其同种型通过常规方法变为 IgG2b。其结果， 发现所 得 E12 抗体 (IgG2b 同种型 ) 是不识别 Aβ 单体 (0 小时 )， 但可特异性地结合 Aβ 寡聚体 ( 图 15) 的抗体。进一步， 确证该抗体的特征并未因同种型变化而改变。
     实施例 16
     同种型变为 IgG2b 的 E12 抗体的 Aβ 淀粉样蛋白原纤维形成阻抑活性
     为评估所述 E12 抗体 (IgG2b 同种型 ) 是否具有阻抑 Aβ 淀粉样蛋白原纤维形成 的活性， Aβ 淀粉样蛋白原纤维形成通过上述 ThT 荧光强度分析方法在溶液 ( 培养基 ) 中 检测， 溶液组成与用于 Aβ 诱导神经毒性实验的相同。其结果， 观察到 Aβ 淀粉样蛋白原纤 维形成在 1.5μM 所述 E12 抗体的存在下受阻抑 ( 图 16)。
     讨论本发明人所得数据显示单克隆 1A9 与 2C3 特异性地识别导致毒性活性与神经纤维 形成活性的可溶性 Aβ 的 “神经毒性表位” 与 “聚合作用表位” 。因为单克隆 1A9 与 2C3 不 与为生理性分子的可溶性 Aβ 单体反应， 可得出下述结论， 即具有由 1A9 或 2C3 识别的表位 的三维结构是可溶性寡聚聚合体特有的。 使用超滤与分子筛的实验揭示， 1A9 与 2C3 免疫反 应性寡聚体的尺寸大于 100kDa( ＞ 20 聚体 )。通过 AFM 的形态学观察结果说明毒性多聚体 在形态学上为异质的 ( 颗粒状， 珠形与环形 )。
     为实证所述毒性聚合体实际上为展示体内突触毒性的生物活性分子， 本发明人用 靶向 1A9 与 2C3 识别的毒性聚合体的抗 Aβ 寡聚体被动免疫疗法对幼 Tg2576 小鼠在其记忆 障碍发生之前进行处理。本发明人首次提出了支持下述结论的证据， 即在 Tg2576 小鼠中天 然发生的年龄依赖性记忆恶化可通过被动免疫疗法使用抗 Aβ 寡聚体特异性抗体 (1A9 与 2C3) 来预防。 在本文中， 通过 Y 迷宫测试评估的短期记忆障碍类似于在轻度认知障碍 (MCI) 与早期 AD 中观察到的 Aβ 积聚相关记忆障碍。对经 1A9 与 2C3 分别给药的 Tg2576 小鼠， 所述 Y- 迷宫测试显示良好的、 几乎正常的结果。当通过新物体识别任务， Morris 水迷宫与 附线索的恐惧条件任务评估时， 依赖所述抗 Aβ 寡聚体抗体长期记忆保持近乎正常。
     较之 PBS 处理组， 抗体处理的小鼠组中见到了血液中 A11 阳性寡聚体的选择性增 加， 该现象与所述抗体预防记忆障碍发病的能力 ( 记忆保持能力 ) 相一致。 1A9 抗体处理亦 展示了阻抑大脑 Aβ 积聚的作用。2C3 抗体处理显示了较之 1A9 抗体处理较高的 A-11 阳性 寡聚体血液水平。然而 2C3 抗体处理的大脑 Aβ 积聚阻抑功能并不清楚。相应的， 1A9 识 别的寡聚体视为较之 2C3 识别的寡聚体对大脑 Aβ 积聚具有更大的作用。所述聚合体在大 脑 Aβ 积聚中所起的作用可基于下述假定加以解释 ： 神经毒性 1A9 聚合体是构象较为稳定 的可溶性有毒寡聚体， 而神经毒性 2C3 聚合体为非常不稳定、 短命的寡聚中间体， 其出现于 聚合过程的早期阶段， 其构象非常易于变化。
     本发明人在本文中公开了抗寡聚体抗体对阿尔茨海默氏病的体内预防作用， 这是 第一个直接证明体内形成的有毒 Aβ 寡聚体能抑制神经细胞的功能， 由此诱导阿尔茨海默 氏病的症状的证据。
     本发明人获取的数据也是支持 Aβ 在人类大脑中展示体内神经毒性这一观点的 第一个证据。众所周知人类内嗅皮层为易受 AD 影响的区域。在此区域内， NFT 形成与神经 细胞丧失发生于老年斑形成之前。因此， 内嗅皮层是被普遍接受的淀粉样蛋白级联假说无 法适用的一个例外区域。然而该不一致长期以来受人忽略， 无人研究。
     本发明人提出并验证了下述假说， 即迄今为止未被鉴定的、 不可见的 Aβ 寡聚体， 在内嗅皮质中有害于神经细胞并导致记忆障碍。 为验证该假说， 本发明人针对主要为 Braak NFT I 到 III 期的高龄人， 半定量地分析了他们内嗅皮层中的 1A9 与 2C3 免疫反应性十二聚 体。1A9 与 2C3 免疫反应性 12 聚体在 Braak NFT I 到 II 期的健康个体的内嗅皮质中已经 存在， 且随着 BraakNFT 分期的进展而增加。在 AD 中发现所述 12 聚体显著增加。从而， 说 明 1A9 与 2C3 免疫反应性 12 聚体的出现发生于人类大脑中认知机能障碍发病之前。另一 方面， 通过生物化学与免疫组织化学技术， 阐明了老年斑含有 1A9 与 2C3 免疫反应性 Aβ 寡 聚体。而且， 揭示了不溶化的淀粉样蛋白原纤维自身具有中和神经毒性的活性。这些发现 表明， 当存在 Aβ 寡聚体但无老年斑形成时， Aβ 寡聚体发挥体内毒性， 从而可为记忆障碍 的原因。如上所述， 本发明人的数据首次了直接证明记忆障碍的原因为在体内由内源 Aβ 寡聚体造成的突触功能障碍。尽管之前使用过主动免疫疗法 (Janus D， 2000， Nature ； Morgan D， 2000， Nature) 与被动免疫疗法 (Bard F， 2222， Nat med ； DeMattos RB， PNAS， 2001)， 如何阻止学习能力丧失与记忆障碍的机理仍然仅为猜测。 一个广泛提出的可能性是 所述抗体通过血脑屏障到达脑部， 并在体内直接中和作为记忆缺陷原因的可溶性 Aβ 寡聚 体。第二个可能性， 即所谓 “库理论 (sink theory)” ， 认为所述抗体在外周耗尽外周血 Aβ 池， 并从而激活 Aβ 自脑中的清除。DeMattos 等人报道外周施用的抗 Aβ 抗体不仅运输大 脑 Aβ 单体， 且亦运输 Aβ 二聚体进入血浆， 并亦将脑 Aβ 运输入 CSF(DeMattos RB et al.， PNAS， 98 ； 8850-8855， 2001)。本发明人亦揭示 Aβ 寡聚体存在于人类 CSF 中， 且在 AD 患者 中增加。从而确认了 Aβ 寡聚体可用作 AD 的诊断标记。进一步， 本发明人首次提供了支持 下述观点的证据， 即 Aβ 寡聚体存在于 Tg2586 小鼠的血浆中， 并且， 在特异性捕获并中和 Aβ 寡聚体的通过静脉内注射的被动免疫疗法中， 无需向脑内递送抗体， 且在外周位点亦即 血管作用即可实现 Aβ 寡聚体从脑到血液中的清除。此外， 本发明人首次提出了下述证据， 即被动免疫疗法不但可阻抑老年斑形成， 而且还可阻抑淀粉样蛋白老年斑介导的间接神经 细胞损伤 ( 肿大变性的神经突形成 )。这些结果确证所述 Aβ 寡聚体为阿尔茨海默氏病发 病的分子基础， 且使用寡聚体特异性抗体的选择性控制使人们不但可能从治疗性的视点控 制阿尔茨海默氏病， 从预防性的视点控制阿尔茨海默氏病也成为可能。 进一步， 我们证实了 所施用抗体的一部分转移入脑部。这表明阻抑记忆障碍的效果是多种作用联合施加的， 这 些作用例如对脑中可溶性 Aβ 寡聚体的直接中和， 通过新生 Fc 受体将抗体 -Aβ 寡聚体免 疫复合物运输到血液中 (DeaneR， 2005， J Neurosci)， 以及上述 “库” 作用。
     建立准确的发病前诊断以识别具有罹患 AD 高风险的病例对涉及预防 / 治疗策略 而言非常重要。本文所报道的在 AD 中 CSF 中 O/M 比例的显著增加， 期望其为发病前诊断标 志的有力候选。
     产业应用性
     本发明所提供的抗体可用于， 例如， 对阿尔茨海默氏病基于静脉内注射的预防性 被动免疫治疗， 并作为对该疾病发病前诊断， 疾病监视， 药物功效监视 / 评价等的生物学标 志。
     进一步， 本发明所述的抗体可望对阿尔茨海默氏病预防 / 治疗方法以及早期诊断 标志的建立产生极大的贡献， 其中上述预防 / 治疗方法对引发该疾病的病理学状况的分子 具有选择性。本发明人获取了支持下述结论的证据 ： 抗体疗法， 即使其以脑内病理学状况 为靶标， 亦可令人满意地通过外周静脉内给药来达成， 而无需考虑所述抗体的脑内转移。 此 外， 本发明人获得了证据显示 ： 即使在外周静脉内给药疗法中， 被施用的抗体的一部分转移 到脑内， 并产生直接效应， 同样无需考虑所述抗体的脑内转移。从而， 本发明可望大大加快 阿尔茨海默氏病抗体疗法的进展。37101965365 A CN 101965366序列 序列表表1/26 页<110> 伊缪纳斯制药株式会社 (IMMUNAS PHARMA.INC.) 独立行政法人国立长寿医疗研究中心 (JAPAN AS REPREsENTED BY PRESIDENT OF NATIONAL CENTER FOR GERIATRICS AND GERONTOLOGY) <120> 能够特异性结合 Aβ 寡聚体的抗体及其应用 <130>M7-X0601P <140>PCT/JP2008/068848 <150>2008-10-17 <150>JP 2007-272015 <151>2007-10-19 <150>US 61/085,540 <151>2008-08-01 <160>60 <170>PatentIn version 3.4 <210>1 <211>454 <212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>1 Glu Val Gln Leu 1 Ser Leu Lys Leu 20 Gly Met Ser Trp 35 Ala Thr lle SerVal Glu Ser Gly Gly 5 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Val Arg Gln Thr Pro 40 Ser Gly Gly Ser TyrAsp Leu Val Lys Pro 10 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Asp Lys Arg Leu Glu 45 Thr Tyr Tyr Pro AspGly Gly 15 Ser Tyr Trp Val Ser Val50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr38101965365 A CN 101965366序列表75 Thr Ala Met Tyr Tyr 95 Tyr Trp Gly Gln Gly 110 Pro Pro Ser Val Tyr 125 Ser Ser Val Thr Leu 140 Val Thr Val Thr Trp 155 Phe Pro Ala Leu Leu 175 Thr Val Pro Ser Ser 190 Ala His Pro Ala Ser 205 Gly Pro Ile Ser Thr 220 Lys Cys Pro Ala Pro 235 Pro Pro Asn Ile Lys 255 Thr Cys Val Val Val 270 Ser Trp Phe Val Asn 285 His Arg Glu Asp Tyr 300 Ile Gln His Gln Asp 315 Asn Asn Lys Asp Leu 335 Lys Gly Leu Val Arg 350 Glu Gln Leu Ser Arg 365 Phe Asn Pro Gly Asp 380 80 Cys Thr Pro Gly Asn 160 Gln Thr Ser Ile Asn 240 Asp Asp Asn Asn Trp 320 Pro Ala Lys Ile2/26 页65 Leu Gln Met Ser Ser 85 Ala Arg His Arg Glu 100 Leu Val Thr Val Ser 115 Leu Ala Pro Gly Cys 130 Cys Leu Val Lys Gly 145 Ser Gly Ser Leu Ser 165 Ser Gly Leu Tyr Thr 180 Trp Pro Ser Gln Thr 195 Thr Thr Val Asp Lys 210 Asn Pro Cys Pro Pro 225 Leu Glu Gly Gly Pro 245 Val Leu Met Ile Ser 260 Val Ser Glu Asp Asp 275 Val Glu Val His Thr 290 Ser Thr Ile Arg Val 305 Met Ser Gly Lys Glu 325 Ser Pro Ile Glu Arg 340 Pro Gln Val Tyr Ile 355 Asp Val Ser Leu Thr 37070 Leu Lys Ser Glu Asp 90 Val Arg Pro Trp Ala 105 Ala Ala Lys Thr Thr 120 Gly Asp Thr Thr Gly 135 Tyr Phe Pro Glu Ser 150 Ser Ser Val His Thr 170 Met Ser Ser Ser Val 185 Val Thr Cys Ser Val 200 Lys Leu Glu Pro Ser 215 Cys Lys Glu Cys His 230 Ser Val Phe Ile Phe 250 Leu Thr Pro Lys Val 265 Pro Asp Val Gln Ile 280 Ala Gln Thr Gln Thr 295 Val Ser Thr Leu Pro 310 Phe Lys Cys Lys Val 330 Thr Ile Ser Lys Ile 345 Leu Pro Pro Pro Ala 360 Cys Leu Val Val Gly 37539101965365 A CN 101965366序列表Glu Glu Asn Tyr Lys 395 Tyr Phe Ile Tyr Ser 415 Thr Asp Ser Phe Ser 430 Tyr Leu Lys Lys Thr 445 Asp 400 Lys Cys Ile3/26 页Ser Val Glu Trp Thr 385 Thr Ala Pro Val Leu 405 Leu Asn Met Lys Thr 420 Asn Val Arg His Glu 435 Ser Arg Ser Pro Gly 450Ser Asn Gly His Thr 390 Asp Ser Asp Gly Ser 410 Ser Lys Trp Glu Lys 425 Gly Leu Lys Asn Tyr 440 Lys<210>2 <211>1365 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>2 gaggtgcagc tcctgtgcag ccagacaaga ccagacagtg ctgcaaatga gaggtacgcc acaacacccc gtgactctgg tctggatccc actatgagca agcgttgctc atttcaacaa ctcgagggtg tccctgacac cagatcagct gaggattaca atgagtggca agaaccatct ccagcagagc cctggagaca accgcaccag acaagcaagttggtggagtc cctctggatt ggctggagtg tgaaggggcg gcagtctgaa cctgggctta catcagtcta gatgcctggt tgtccagcag gctcagtgac acccagccag tcaacccctg gaccatccgt ccaaggtcac ggtttgtgaa acagtactat aggagttcaa caaaaattaa agttgtccag tcagtgtgga tcctggactc gggagaaaaccgggggagac cactttcagt ggtcgcaacc attcaccatc gtctgaggac ctggggccaa tccactggcc caagggctac tgtgcacacc tgtcccctcc cagcaccacg tcctccatgc cttcatcttc gtgtgtggtg caacgtggaa ccgggtggtc atgcaaggtc agggctagtc gaaagatgtc gtggaccagc tgacggttct agattccttcttagtgaagc agctatggca attagtagtg tccagagaca acagccatgt gggactctgg cctgggtgtg ttccctgagt ttcccagctc agcacctggc gtggacaaaa aaggagtgtc cctccaaata gtggatgtga gtacacacag agcaccctcc aacaacaaag agagctccac agtctcactt aatgggcata tacttcatat tcatgcaacg40ctggagggtc tgtcttgggt gtggtagtta atgccaagaa attactgtgc tcactgtctc gagatacaac cagtgactgt tcctgcagtc caagtcagac aacttgagcc acaaatgccc tcaaggatgt gcgaggatga ctcagacaca ccatccagca acctcccatc aagtatacat gcctggtcgt cagaggagaa atagcaagct tgagacacgacctgaaactc tcgccagact cacctactat caccctgtac aagacatagg tgcagccaaa tggttcctcc gacttggaac tggactctac cgtcacctgc cagcgggccc agctcctaac actcatgatc cccagacgtc aacccataga ccaggactgg acccatcgag cttgccgcca gggcttcaac ctacaaggac caatatgaaa gggtctgaaa60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320101965365 A CN 101965366序列表4/26 页aattactacc tgaagaagac catctcccgg tctccgggta aatga <210>3 <211>214 <212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>3 Asp Ile Val Met 1 Asp Arg Val Ser 20 Val Ala Trp Tyr 35 Tyr Ser Ala Ser 50 Ser Gly Ser Gly 65 Glu Asp Leu Ala Thr Phe Gly Gly 100 Pro Thr Val Ser 115 Gly Ala Ser Val 130 Asn Val Lys Trp 145 Asn Ser Trp Thr Ser Thr Leu Thr 180 Thr Cys Glu Ala 195 Phe Asn Arg Asn 210 <210>4 <211>645411365Thr Gln Ser Gln Lys 5 Val Thr Cys Lys Ala 25 Gln Gln Lys Pro Gly 40 Tyr Arg Tyr Ser Gly 55 Thr Asp Phe Thr Leu 70 Glu Tyr Phe Cys Gln 85 Gly Thr Lys Leu Glu 105 Ile Phe Pro Pro Ser 120 Val Cys Phe Leu Asn 135 Lys Ile Asp Gly Ser 150 Asp Gln Asp Ser Lys 165 Leu Thr Lys Asp Glu 185 Thr His Lys Thr Ser 200 Glu CysPhe Met Ser Thr Ser 10 Ser Gln Asn Val Gly 30 Gln Ser Pro Lys Ala 45 Val Pro Asp Arg Phe 60 Thr Ile Ser Asn Val 75 Gln Tyr Asn Ser Tyr 90 Ile Lys Arg Ala Asp 110 Ser Glu Gln Leu Thr 125 Asn Phe Tyr Pro Lys 140 Glu Arg Gln Asn Gly 155 Asp Ser Thr Tyr Ser 170 Tyr Glu Arg His Asn 190 Thr Ser Pro Ile Val 205Val Gly 15 Thr Asn Leu Ile Thr Gly Gln Ser 80 Pro Tyr 95 Ala Ala Ser Gly Asp Ile Val Leu 160 Met Ser 175 Ser Tyr Lys Ser101965365 A CN 101965366序列表5/26 页<212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>4 gacattgtga gtcacctgca gggcaatctc cgcttcacag gaagacttgg gggaccaagc tccagtgagc cccaaagaca aacagttgga ttgaccaagg tcaacttcactgacccagtc aggccagtca ctaaagcact gcagtggatc cagagtattt tggaaataaa agttaacatc tcaatgtcaa ctgatcagga acgagtatga ccattgtcaatcaaaaattc gaatgtgggt gatttactcg tgggacagat ctgtcagcaa acgggctgat tggaggtgcc gtggaagatt cagcaaagac acgacataac gagcttcaacatgtccacat actaatgtag gcatcctacc ttcactctca tataacagct gctgcaccaa tcagtcgtgt gatggcagtg agcacctaca agctatacct aggaatgagtcagtaggaga cctggtatca ggtacagtgg ccatcagcaa atccgtacac ctgtatccat gcttcttgaa aacgacaaaa gcatgagcag gtgaggccac gttagcagggtcagc acagaaacca agtccctgat tgtgcagtct gttcggaggg cttcccacca caacttctac tggcgtcctg caccctcacg tcacaagaca60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 645<210>5 <211>118 <212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>5 Glu Val Gln Leu 1 Ser Leu Lys Leu 20 Gly Met Ser Trp 35 Ala Thr Ile Ser 50 Lys Gly Arg Phe 65 Leu Gln Met SerVal Glu Ser Gly Gly 5 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Val Arg Gln Thr Pro 40 Ser Gly Gly Ser Tyr 55 Thr Ile Ser Arg Asp 70 Ser Leu Lys Ser Glu 85 Ala Arg His Arg Glu Val Arg Pro Trp 100 105 Leu Val Thr Val Ser Ala 115Asp Leu Val Lys Pro 10 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Asp Lys Arg Leu Glu 45 Thr Tyr Tyr Pro Asp 60 Asn Ala Lys Asn Thr 75 Asp Thr Ala Met Tyr 90 Ala Tyr Trp Gly Gln 110Gly Gly 15 Ser Tyr Trp Val Ser Val Leu Tyr 80 Tyr Cys 95 Gly Thr42101965365 A CN 101965366序列表6/26 页<210>6 <211>354 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>6 gaggtgcagc tcctgtgcag ccagacaaga ccagacagtg ctgcaaatga gaggtacgcctggtggagtc cctctggatt ggctggagtg tgaaggggcg gcagtctgaa cctgggcttacgggggagac cactttcagt ggtcgcaacc attcaccatc gtctgaggac ctggggccaattagtgaagc agctatggca attagtagtg tccagagaca acagccatgt gggactctggctggagggtc tgtcttgggt gtggtagtta atgccaagaa attactgtgc tcactgtctccctgaaactc 60 tcgccagact 120 cacctactat 180 caccctgtac 240 aagacatagg 300 tgca 354<210>7 <211>107 <212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>7 Asp Ile Val Met 1 Asp Arg Val Ser 20 Val Ala Trp TyrThr Gln Ser Gln Lys 5 Val Thr Cys Lys Ala 25 Gln Gln Lys Pro Gly 40 Tyr Ser Gly 55 Phe Thr Leu Phe Cys Gln Lys Leu Glu 105Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 10 15 Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 30 Gln Ser Pro Lys 45 Val Pro Asp Arg 60 Thr Ile Ser Asn 75 Gln Tyr Asn Ser 90 Ile Lys Ala Leu Ile Phe Thr Gly Val Gln Ser 80 Tyr Pro Tyr 9535 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg 50 Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70 Glu Asp Leu Ala Glu Tyr 85 Thr Phe Gly Gly Gly Thr 100<210>8 <211>321 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus)43101965365 A CN 101965366序tgacccagtc aggccagtca ctaaagcact gcagtggatc cagagtattt tggaaataaa tcaaaaattc gaatgtgggt gatttactcg tgggacagat ctgtcagcaa a列表cagtaggaga cctggtatca ggtacagtgg ccatcagcaa atccgtacac cagggtcagc acagaaacca agtccctgat tgtgcagtct gttcggaggg7/26 页<400>8 gacattgtga gtcacctgca gggcaatctc cgcttcacag gaagacttgg gggaccaagcatgtccacat actaatgtag gcatcctacc ttcactctca tataacagct60 120 180 240 300 321<210>9 <211>5 <212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>9 Ser Tyr Gly Met Ser 1 5 <210>10 <211>15 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>10 agctatggca tgtct <210>11 <211>10 <212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>11 Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr 1 5 10 <210>12 <211>30 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus)1544101965365 A CN 101965366序列表8/26 页<400>12 accattagta gtggtggtag ttacacctac <210>13 <211>9 <212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>13 His Arg Glu Val Arg Pro Trp Ala Tyr 1 5 <210>14 <211>27 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>14 catagggagg tacgcccctg ggcttac <210>15 <211>11 <212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>15 Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala 1 5 10 <210>16 <211>33 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>16 aaggccagtc agaatgtggg tactaatgta gcc <210>17 <211>745302733101965365 A CN 101965366序列表9/26 页<212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>17 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 1 5 <210>18 <211>21 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>18 tcggcatcct accggtacag t <210>19 <211>9 <212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>19 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210>20 <211>27 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>20 cagcaatata acagctatcc gtacacg <210>21 <211>461 <212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>21 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln462127101965365 A CN 101965366序列表10 Gly Tyr Ser Ile Thr 30 Pro Gly Asn Lys Leu 45 Asn Asn Tyr Asn Pro 60 Thr Ser Lys Asn Gln 75 Asp Thr Ala Thr Tyr 90 Asp Gly Gly Leu Tyr 110 Thr Val Ser Ser Ala 125 Pro Gly Cys Gly Asp 140 Val Lys Gly Tyr Phe 155 Ser Leu Ser Ser Ser 170 Leu Tyr Thr Met Ser 190 Ser Gln Thr Val Thr 205 Val Asp Lys Lys Leu 220 Cys Pro Pro Cys Lys 235 Gly Gly Pro Ser Val 250 Met Ile Ser Leu Thr 270 Glu Asp Asp Pro Asp 285 Val His Thr Ala Gln 300 Ile Arg Val Val Ser 315 15 Ser Gly Glu Trp Ser Leu Phe Phe 80 Tyr Cys 95 Tyr Phe Lys Thr Thr Thr Pro Glu 160 Val His 175 Ser Ser Cys Ser Glu Pro Glu Cys 240 Phe Ile 255 Pro Lys Val Gln Thr Gln Thr Leu 32010/26 页1 Ser Leu Ser Leu 20 Tyr Tyr Trp Asn 35 Met Gly Tyr Lys 50 Lys Asn Arg Ile 65 Leu Lys Leu Asn Ala Arg Glu Ala 100 Asp Tyr Trp Gly 115 Thr Pro Pro Ser 130 Gly Ser Ser Val 145 Ser Val Thr Val Thr Phe Pro Ala 180 Val Thr Val Pro 195 Val Ala His Pro 210 Ser Gly Pro Ile 225 His Lys Cys Pro Phe Pro Pro Asn 260 Val Thr Cys Val 275 Ile Ser Trp Phe 290 Thr His Arg Glu 3055 Thr Cys Ser Val Thr 25 Trp Ile Arg Gln Phe 40 Arg Tyr Asp Gly Ser 55 Ser Ile Thr Arg Asp 70 Ser Val Thr Thr Glu 85 Tyr Tyr Tyr Arg Tyr 105 Gln Gly Thr Thr Leu 120 Val Tyr Pro Leu Ala 135 Thr Leu Gly Cys Leu 150 Thr Trp Asn Ser Gly 165 Leu Leu Gln Ser Gly 185 Ser Ser Thr Trp Pro 200 Ala Ser Ser Thr Thr 215 Ser Thr Ile Asn Pro 230 Ala Pro Asn Leu Glu 245 Ile Lys Asp Val Leu 265 Val Val Asp Val Ser 280 Val Asn Asn Val Glu 295 Asp Tyr Asn Ser Thr 31047101965365 A CN 101965366序列表Lys Glu Phe Lys Cys 335 Glu Arg Thr Ile Ser 350 Tyr Ile Leu Pro Pro 365 Leu Thr Cys Leu Val 380 Trp Thr Ser Asn Gly 395 Val Leu Asp Ser Asp 415 Lys Thr Ser Lys Trp 430 His Glu Gly Leu Lys 445 Pro Gly Lys 460 Lys Lys Pro Val His 400 Gly Glu Asn11/26 页Pro Ile Gln His Gln 325 Val Asn Asn Lys Asp 340 Ile Lys Gly Leu Val 355 Ala Glu Gln Leu Ser 370 Gly Phe Asn Pro Gly 385 Thr Glu Glu Asn Tyr 405 Ser Tyr Phe Ile Tyr 420 Lys Thr Asp Ser Phe 435 Tyr Tyr Leu Lys Lys 450Asp Trp Met Ser Gly 330 Leu Pro Ser Pro Ile 345 Arg Ala Pro Gln Val 360 Arg Lys Asp Val Ser 375 Asp Ile Ser Val Glu 390 Lys Asp Thr Ala Pro 410 Ser Lys Leu Asn Met 425 Ser Cys Asn Val Arg 440 Thr Ile Ser Arg Ser 455<210>22 <211>1386 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>22 gatgtacagc acctgctctg tttccaggaa aacccatctc ctgaagttga tactactata ctcacagtct ggagatacaa tcagtgactg ctcctgcagt ccaagtcaga aaacttgagc cacaaatgcc atcaaggatgttcaggagtc tcactggcta acaaactgga tcaaaaatcg attctgtgac ggtacgacgg cctcagccaa ctggttcctc tgacttggaa ctggactcta ccgtcacctg ccagcgggcc cagctcctaa tactcatgataggacctggc ctccatcacc atggatgggc aatctccatc tactgaggac gggcctatac aacaacaccc cgtgactctg ctctggatcc cactatgagc cagcgttgct catttcaaca cctcgagggt ctccctgacactcgtgaaac agtggttatt tacaaaaggt actcgtgaca acagctacat tactttgact ccatcagtct ggatgcctgg ctgtccagca agctcagtga cacccagcca atcaacccct ggaccatccg cccaaggtca48cttctcagtc actggaactg acgacggtag catctaagaa attactgtgc actggggcca atccactggc tcaagggcta gtgtgcacac ctgtcccctc gcagcaccac gtcctccatg tcttcatctt cgtgtgtggttctgtctctc gatccggcag caataactac ccagtttttc aagagaggcc aggcaccact ccctgggtgt cttccctgag cttcccagct cagcacctgg ggtggacaaa caaggagtgt ccctccaaat ggtggatgtg60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840101965365 A CN 101965366序acccagacgt aaacccatag accaggactg cacccatcga tcttgccgcc tgggcttcaa actacaagga tcaatatgaa agggtctgaa ccagatcagc agaggattac gatgagtggc gagaaccatc accagcagag ccctggagac caccgcacca aacaagcaag aaattactac列表acaacgtgga tccgggtggt aatgcaaggt aagggctagt ggaaagatgt agtggaccag ctgacggttc cagattcctt ccatctcccg agtacacaca cagcaccctc caacaacaaa cagagctcca cagtctcact caatgggcat ttacttcata ctcatgcaac gtctccgggt12/26 页agcgaggatg gctcagacac cccatccagc gacctcccat caagtataca tgcctggtcg acagaggaga tatagcaagc gtgagacacg aaatgatggtttgtga aacagtacta aaggagttca tcaaaaatta cagttgtcca atcagtgtgg gtcctggact tgggagaaaa ctgaagaaga900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1386<210>23 <211>214 <212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>23 Asp Ile Gln Met 1 Asp Arg Val Thr 20 Leu Asn Trp Tyr 35 Tyr Phe Thr Ser 50 Ser Gly Ser Gly 65 Glu Asp Ile Ala Thr Phe Gly Gly 100 Pro Thr Val Ser 115 Gly Ala Ser Val 130 Asn Val Lys Trp 145 Asn Ser Trp ThrThr Gln Thr Thr Ser 5 Ile Ser Cys Arg Ala 25 Gln Gln Lys Pro Asp 40 Arg Leu His Ser Gly 55 Thr Asp Tyr Ser Leu 70 Thr Tyr Phe Cys Gln 85 Gly Thr Lys Leu Glu 105 Ile Phe Pro Pro Ser 120 Val Cys Phe Leu Asn 135 Lys Ile Asp Gly Ser 150 Asp Gln Asp Ser Lys 16549Ser Leu Ser Ala Ser 10 Ser Gln Asp Ile Ser 30 Gly Thr Val Lys Leu 45 Val Pro Ser Arg Phe 60 Thr Ile Ser Asn Leu 75 Gln Gly Asn Thr Leu 90 Ile Lys Arg Ala Asp 110 Ser Glu Gln Leu Thr 125 Asn Phe Tyr Pro Lys 140 Glu Arg Gln Asn Gly 155 Asp Ser Thr Tyr Ser 170Leu Gly 15 Asn Tyr Leu Ile Ser Gly Glu His 80 Pro Tyr 95 Ala Ala Ser Gly Asp Ile Val Leu 160 Met Ser 175101965365 A CN 101965366序列表13/26 页Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr 180 185 190 Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210>24 <211>645 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>24 gatatccaga atcagttgca gatggaactg aggttcagtg gaagatattg gggaccaagc tccagtgagc cccaaagaca aacagttgga ttgaccaagg tcaacttcactgacacagac gggcaagtca ttaaactcct gcagtgggtc ccacttactt tggaaataaa agttaacatc tcaatgtcaa ctgatcagga acgagtatga ccattgtcaatacatcctcc ggacattagc gatctacttc tggaacagat ttgccaacag acgggctgat tggaggtgcc gtggaagatt cagcaaagac acgacataac gagcttcaacctgtctgcct aattatttaa acatcaagat tattctctca ggtaatacgc gctgcaccaa tcagtcgtgt gatggcagtg agcacctaca agctatacct aggaatgagtctctgggaga actggtatca tacactcagg ccattagcaa ttccgtacac ctgtatccat gcttcttgaa aacgacaaaa gcatgagcag gtgaggccac gttagcagagtcacc gcagaaacca agtcccatca cctggagcat gttcggaggg cttcccacca caacttctac tggcgtcctg taccctcacg tcacaagaca60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 645<210>25 <211>125 <212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>25 Asp Val Gln Leu 1 Ser Leu Ser Leu 20 Tyr Tyr Trp Asn 35 Met Gly Tyr Lys 50Gln Glu Ser Gly Pro 5 Thr Cys Ser Val Thr 25 Trp Ile Arg Gln Phe 40 Arg Tyr Asp Gly Ser 5550Gly Leu Val Lys Pro 10 Gly Tyr Ser Ile Thr 30 Pro Gly Asn Lys Leu 45 Asn Asn Tyr Asn Pro 60Ser Gln 15 Ser Gly Glu Trp Ser Leu101965365 A CN 101965366序列表Ser Lys Asn Gln Phe 75 Thr Ala Thr Tyr Tyr 95 Gly Gly Leu Tyr Tyr 110 Val Ser Ser 125 Phe 80 Cys Phe14/26 页Lys Asn Arg Ile Ser 65 Leu Lys Leu Asn Ser 85 Ala Arg Glu Ala Tyr 100 Asp Tyr Trp Gly Gln 115Ile Thr Arg Asp Thr 70 Val Thr Thr Glu Asp 90 Tyr Tyr Arg Tyr Asp 105 Gly Thr Thr Leu Thr 120<210>26 <211>375 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>26 gatgtacagc acctgctctg tttccaggaa aacccatctc ctgaagttga tactactata ctcacagtctttcaggagtc tcactggcta acaaactgga tcaaaaatcg attctgtgac ggtacgacgg cctcaaggacctggc ctccatcacc atggatgggc aatctccatc tactgaggac gggcctatacctcgtgaaac cttctcagtc tctgtctctc agtggttatt actggaactg gatccggcag tacaaaaggt acgacggtag caataactac actcgtgaca catctaagaa ccagtttttc acagctacat attactgtgc aagagaggcc tactt tgact actggggcca aggcaccact60 120 180 240 300 360 375<210>27 <211>107 <212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>27 Asp Ile Gln Met 1 Asp Arg Val Thr 20 Leu Asn Trp Tyr 35 Tyr Phe Thr Ser 50 Ser Gly Ser Gly 65Thr Gln Thr Thr Ser 5 Ile Ser Cys Arg Ala 25 Gln Gln Lys Pro Asp 40 Arg Leu His Ser Gly 55 Thr Asp Tyr Ser Leu 7051Ser Leu Ser Ala Ser 10 Ser Gln Asp Ile Ser 30 Gly Thr Val Lys Leu 45 Val Pro Ser Arg Phe 60 Thr Ile Ser Asn Leu 75Leu Gly 15 Asn Tyr Leu Ile Ser Gly Glu His 80101965365 A CN 101965366序列表15/26 页Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210>28 <211>321 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>28 gatatccaga atcagttgca gatggaactg aggttcagtg gaagatattg gggaccaagctgacacagac gggcaagtca ttaaactcct gcagtgggtc ccacttactt tggaaataaatacatcctcc ggacattagc gatctacttc tggaacagat ttgccaacag actgtctgcct aattatttaa acatcaagat tattctctca ggtaatacgcctctgggaga actggtatca tacactcagg ccattagcaa ttccgtacaccagagtcacc gcagaaacca agtcccatca cctggagcat gttcggaggg60 120 180 240 300 321<210>29 <211>6 <212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>29 Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn 1 5 <210>30 <211>18 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>30 agtggttatt actggaac <210>31 <211>9 <212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus)5218101965365 A CN 101965366序列表16/26 页<400>31 Tyr Lys Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Asn 1 5 <210>32 <211>27 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>32 tacaaaaggt acgacggtag caataac <210>33 <211>16 <212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>33 Glu Ala Tyr Tyr Tyr Arg Tyr Asp Gly Gly Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 15 <210>34 <211>48 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>34 gaggcctact actataggta cgacgggggc ctatactact ttgactac <210>35 <211>11 <212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>35 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10274853101965365 A CN 101965366序列表17/26 页<210>36 <211>33 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>36 agggcaagtc aggacattag caattattta aac <210>37 <211>7 <212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>37 Phe Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210>38 <211>21 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>38 ttcacatcaa gattacactc a <210>39 <211>9 <212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>39 Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210>40 <211>27 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus)332154101965365 A CN 101965366序列表18/26 页<400>40 caacagggta atacgcttcc gtacacg <210>41 <211>455 <212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>41 Glu Val Lys Leu 1 Ser Met Lys Leu 20 Trp Met Asn Trp 35 Ala Glu Ile Arg 50 Ser Val Lys Gly 65 Val Tyr Leu Gln Tyr Cys Thr Arg 100 Thr Ser Val Thr 115 Pro Leu Ala Pro 130 Gly Cys Leu Val 145 Asn Ser Gly Ser Gln Ser Gly Leu 180 Thr Trp Pro Ser 195 Ser Thr Thr Val 210 Ile Asn Pro Cys 22527Glu Glu Ser Gly Gly 5 Ser Cys Val Ala Ser 25 Val Arg Gln Ser Pro 40 Leu Lys Ser Asn Asn 55 Arg Phe Thr Ile Ser 70 Met Asn Asn Leu Arg 85 Glu Leu Arg Tyr Ala 105 Val Ser Ser Ala Lys 120 Gly Cys Gly Asp Thr 135 Lys Gly Tyr Phe Pro 150 Leu Ser Ser Ser Val 165 Tyr Thr Met Ser Ser 185 Gln Thr Val Thr Cys 200 Asp Lys Lys Leu Glu 215 Pro Pro Cys Lys Glu 23055Gly Leu Val Arg Pro 10 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Glu Lys Gly Leu Glu 45 Tyr Ala Thr His Tyr 60 Arg Asp Asp Ser Lys 75 Ala Glu Asp Thr Gly 90 Met Asp Tyr Trp Gly 110 Thr Thr Pro Pro Ser 125 Thr Gly Ser Ser Val 140 Glu Ser Val Thr Val 155 His Thr Phe Pro Ala 170 Ser Val Thr Val Pro 190 Ser Val Ala His Pro 205 Pro Ser Gly Pro Ile 220 Cys His Lys Cys Pro 235Gly Gly 15 Asn Tyr Trp Val Ala Glu Ser Ser 80 Ile Tyr 95 Gln Gly Val Tyr Thr Leu Thr Trp 160 Leu Leu 175 Ser Ser Ala Ser Ser Thr Ala Pro 240101965365 A CN 101965366序列表Phe Pro Pro Asn Ile 255 Val Thr Cys Val Val 270 Ile Ser Trp Phe Val 285 Thr His Arg Glu Asp 300 Pro Ile Gln His Gln 315 Val Asn Asn Lys Asp 335 Ile Lys Gly Leu Val 350 Ala Glu Gln Leu Ser 365 Gly Phe Asn Pro Gly 380 Thr Glu Glu Asn Tyr 395 Ser Tyr Phe Ile Tyr 415 Lys Thr Asp Ser Phe 430 Tyr Tyr Leu Lys Lys 445 Lys Val Asn Tyr Asp 320 Leu Arg Arg Asp Lys 400 Ser Ser Thr19/26 页Asn Leu Glu Gly Gly 245 Asp Val Leu Met Ile 260 Asp Val Ser Glu Asp 275 Asn Val Glu Val His 290 Ash Ser Thr Ile Arg 305 Trp Met Ser Gly Lys 325 Pro Ser Pro Ile Glu 340 Ala Pro Gln Val Tyr 355 Lys Asp Val Ser Leu 370 Ile Ser Val Glu Trp 385 Asp Thr Ala Pro Val 405 Lys Leu Asn Met Lys 420 Cys Asn Val Arg His 435 Ile Ser Arg Ser Pro 450Pro Ser Val Phe Ile 250 Ser Leu Thr Pro Lys 265 Asp Pro Asp Val Gln 280 Thr Ala Gln Thr Gln 295 Val Val Ser Thr Leu 310 Glu Phe Lys Cys Lys 330 Arg Thr Ile Ser Lys 345 Ile Leu Pro Pro Pro 360 Thr Cys Leu Val Val 375 Thr Ser Asn Gly His 390 Leu Asp Ser Asp Gly 410 Thr Ser Lys Trp Glu 425 Glu Gly Leu Lys Asn 440 Gly Lys 455<210>42 <211>1368 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>42 gaagtgaagc tcctgtgttg ccagagaagg cattatgcggttgaggagtc cctctggatt ggctcgagtg agtctgtgaatggaggaggc cactttcagt ggttgctgaa agggaggttcttggtgcgac aactactgga attagattga accatctcaa56ctggaggatc tgaactgggt aatctaataa gggatgattccatgaaactc ccgccagtct ttatgcaaca caaaagtagt60 120 180 240101965365 A CN 101965366序aaatgaacaa atgctatgga ccccatcagt tgggatgcct ccctgtccag gcagctcagt ctcacccagc caatcaaccc gtggaccatc cacccaaggt gctggtttgt acaacagtac gcaaggagtt tctcaaaaat agcagttgtc acatcagtgt cagtcctgga agtgggagaa acctgaagaa cttaagagct ctactggggt ctatccactg ggtcaagggc cagtgtgcac gactgtcccc cagcagcacc ctgtcctcca cgtcttcatc cacgtgtgtg gaacaacgtg tatccgggtg caaatgcaag taaagggcta caggaaagat ggagtggacc ctctgacggt aacagattcc gaccatctcc列表gcatttatta cagtcaccgt gtggagatac agtcagtgac ctctcctgca ggccaagtca aaaaacttga gtcacaaatg atatcaagga tgagcgagga cagctcagac tccccatcca aagacctccc cacaagtata cttgcctggt atacagagga tatatagcaa acgtgagaca gtaaatga ctgtaccagg ctcctcagcc aactggttcc tgtgacttgg gtctggactc gaccgtcacc gcccagcggg cccagctcct tgtactcatg tgacccagac acaaacccat gcaccaggac atcacccatc catcttgccg cgtgggcttc gaactacaag gctcaatatg cgagggtctg20/26 页gtctacctgc gaactacggt aaaacaacac tccgtgactc aactctggat tacactatga tgcagcgttg cccatttcaa aacctcgagg atctccctga gtccagatca agagaggatt tggatgagtg gagagaacca ccaccagcag aaccctggag gacaccgcac aaaacaagca aaaaattactgaagacactg caaggaacct gcccctgggt tacttccctg accttcccag tccagcacct acggtggaca tgcaaggagt ttccctccaa gtggtggatg gaagtacaca gtcagcaccc gtcaacaaca gtcagagctc gtcagtctca agcaatgggc tcttacttca ttctcatgca cggtctccgg300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1368<210>43 <211>214 <212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>43 Asp Ile Gln Met 1 Glu Thr Val Thr 20 Leu Ala Trp Tyr 35 Tyr Asn Ala Lys 50 Ser Gly Ser Gly 65 Glu Asp Phe GlyThr Gln Ser Pro Ala 5 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Gln Gln Lys Gln Gly 40 Thr Leu Ala Asp Gly 55 Thr Gln Tyr Ser Leu 70 Ser Tyr Tyr Cys Gln 85 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu57Ser Leu Ser Ala Ser 10 Ser Gly Asn Ile His 30 Lys Ser Pro Gln Leu 45 Val Pro Ser Arg Phe 60 Lys Ile Asn Ser Leu 75 His Phe Trp Ser Thr 90 Ile Lys Arg Ala AspVal Gly 15 Asn Tyr Leu Val Ser Gly Gln Pro 80 Pro Arg 95 Ala Ala101965365 A CN 101965366序列表110 Leu Thr Ser Gly 125 Pro Lys Asp Ile Asn Gly Val Leu 160 Tyr Ser Met Ser 175 His Asn Ser Tyr 190 Ile Val Lys Ser 20521/26 页100 Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro 115 Gly Ala Ser Val Val Cys Phe 130 135 Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp 145 150 Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp 165 Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys 180 Thr Cys Glu Ala Thr His Lys 195 Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210>44 <211>645 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>44 gacatccaga atcacatgtc ggaaaatctc aggttcagtg gaagattttg ggcaccaagc tccagtgagc cccaaagaca aacagttgga ttgaccaagg tcaacttcac105 Pro Ser Ser Glu Gln 120 Leu Asn Asn Phe Tyr 140 Gly Ser Glu Arg Gln 155 Ser Lys Asp Ser Thr 170 Asp Glu Tyr Glu Arg 185 Thr Ser Thr Ser Pro 200tgactcagtc gagcaagtgg ctcagctcct gcagtggatc ggagttatta tggaaatcaa agttaacatc tcaatgtcaa ctgatcagga acgagtatga ccattgtcaatccagcctcc gaatattcac ggtctataat aggaacacaa ctgtcaacat acgggctgat tggaggtgcc gtggaagatt cagcaaagac acgacataac gagcttcaacctatctgcat aattatttag gcaaaaacct tattctctca ttttggagta gctgcaccaa tcagtcgtgt gatggcagtg agcacctaca agctatacct aggaatgagtctgtgggaga catggtatca tagcagatgg agatcaacag ctcctcggac ctgtatccat gcttcttgaa aacgacaaaa gcatgagcag gtgaggccac gttagaactgtcacc gcagaaacag tgtgccatca cctgcagcct gttcggtgga cttcccacca caacttctac tggcgtcctg taccctcacg tcacaagaca60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 645<210>45 <211>119 <212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus)58101965365 A CN 101965366序列表Gly Leu Val Arg Pro 10 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Glu Lys Gly Leu Glu 45 Tyr Ala Thr His Tyr 60 Arg Asp Asp Ser Lys 75 Ala Glu Asp Thr Gly 90 Met Asp Tyr Trp Gly 110 Gly Gly 15 Asn Tyr Trp Val Ala Glu Ser Ser 80 Ile Tyr 95 Gln Gly22/26 页<400>45 Glu Val Lys Leu 1 Ser Met Lys Leu 20 Trp Met Asn Trp 35 Ala Glu Ile Arg 50 Ser Val Lys Gly 65 Val Tyr Leu GlnGlu Glu Ser Gly Gly 5 Ser Cys Val Ala Ser 25 Val Arg Gln Ser Pro 40 Leu Lys Ser Asn Asn 55 Arg Phe Thr Ile Ser 70 Met Asn Asn Leu Arg 85 Tyr Cys Thr Arg Glu Leu Arg Tyr Ala 100 105 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210>46 <211>357 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>46 gaagtgaagc tcctgtgttg ccagagaagg cattatgcgg gtctacctgc gaactacggtttgaggagtc cctctggatt ggctcgagtg agtctgtgaa aaatgaacaa atgctatggatggaggaggc cactttcagt ggttgctgaa agggaggttc cttaagagct ctactggggtttggtgcgac aactactgga attagattga accatctcaa gaagacactg caaggaacctctggaggatc tgaactgggt aatctaataa gggatgattc gcatttatta cagtcaccgtcatgaaactc ccgccagtct ttatgcaaca caaaagtagt ctgtaccagg ctcctca60 120 180 240 300 357<210>47 <211>107 <212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>47 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 1559101965365 A CN 101965366序列表Ser Gly Asn Ile His 30 Lys Ser Pro Gln Leu 45 Val Pro Ser Arg Phe 60 Lys Ile Asn Ser Leu 75 His Phe Trp Ser Thr 90 Ile Lys Asn Tyr Leu Val Ser Gly Gln Pro 80 Pro Arg 9523/26 页Glu Thr Val Thr 20 Leu Ala Trp Tyr 35 Tyr Asn Ala Lys 50 Ser Gly Ser Gly 65 Glu Asp Phe GlyIle Thr Cys Arg Ala 25 Gln Gln Lys Gln Gly 40 Thr Leu Ala Asp Gly 55 Thr Gln Tyr Ser Leu 70 Ser Tyr Tyr Cys Gln 85 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 100 105 <210>48 <211>321 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>48 gacatccaga atcacatgtc ggaaaatctc aggttcagtg gaagattttg ggcaccaagctgactcagtc gagcaagtgg ctcagctcct gcagtggatc ggagttatta tggaaatcaatccagcctcc gaatattcac ggtctataat aggaacacaa ctgtcaacat actatctgcat aattatttag gcaaaaacct tattctctca ttttggagtactgtgggaga catggtatca tagcagatgg agatcaacag ctcctcggacaactgtcacc gcagaaacag tgtgccatca cctgcagcct gttcggtgga60 120 180 240 300 321<210>49 <211>5 <212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>49 Asn Tyr Trp Met Asn 1 5 <210>50 <211>15 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus)60101965365 A CN 101965366序列表24/26 页<400>50 aactactgga tgaac <210>51 <211>12 <212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>51 Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His 1 5 10 <210>52 <211>36 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>52 gaaattagat tgaaatctaa taattatgca acacat <210>53 <211>8 <212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>53 Glu Leu Arg Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 <210>54 <211>24 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>54 gaactacggt atgctatgga ctac <210>55 <211>1161153624101965365 A CN 101965366序列表25/26 页<212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>55 Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210>56 <211>33 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>56 cgagcaagtg ggaatattca caattattta gca <210>57 <211>7 <212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>57 Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp 1 5 <210>58 <211>21 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>58 aatgcaaaaa ccttagcaga t <210>59 <211>9 <212>PRT <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>59 Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Arg Thr623321101965365 A CN 101965366序列表26/26 页1 5 <210>60 <211>27 <212>DNA <213> 小家鼠 (Mus musculus) <400>60 caacattttt ggagtactcc tcggacg27