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用于治疗 A 型血友病患者的去甘露糖基化的重组因子 VIII
    技术领域 本发明涉及基本上无免疫原性的或具有低免疫原性的修饰的因子 VIII(FVIII)。 本发明还涉及包括编码所述修饰的 FVIII 的 DNA 的核酸构建体， 以及涉及在宿主细胞或 生物体中表达和产生所述修饰的 FVIII 的方法。本发明还涉及向受试者给药所述修饰的 FVIII 以治疗出血失调的方法。
     背景技术 人因子 VIII ： C(FVIII) 是凝固因子， 在 X 染色体连锁的出血失调的 A 型血友病中 缺失 FVIII， 这是患病男性出血性发病和死亡的主要原因。通常， 以输入全血来治疗血友病 患者。最近， 以衍生自人血浆的 FVIII 浓缩物制剂来治疗。然而， 使用血浆衍生的产品易使 血友病患者暴露于可能患病毒传播的疾病 ( 例如肝炎和 AIDS) 的风险中。用来减少此种风 险的昂贵的纯化方案增加了治疗成本。由于血浆衍生的 FVIII 的成本增加和供应限制， 使 患者只能依请求而进行短暂地治疗， 而不能进行预防性治疗。重组产生的 FVIII 在纯度和 安全性方面比血浆衍生的 FVIII 具有本质上的优点， 而且增加了可用性， 因此， 许多研究的 努力方向集中于重组产生的 FVIII 的开发。由于 FVIII 的不稳定性质 ( 尤其在激活以后 )， 不论血浆衍生的还是重组产生的 FVIII 都必需以大量和重复的蛋白剂量施用， 以实现治疗 的有利效果。然而， 患者给药的 FVIII 蛋白的量与抑制它的活性的抗体的发生相关联。根 据此种已知的免疫原性， 开发用作治疗试剂的新的重组形式的 FVIII 的一个目的是开发减 少或消除此种免疫应答的产品。在血液凝固的内在途径中， FVIII 作为辅助因子起作用， 以 通过因子 IXa 来促进因子 X 的激活， 这一反应在钙离子的存在下发生在带负电荷的磷脂表 面上。
     所述 FVIII 分子分为 6 个结构域 ： 3 个 A 结构域 (A1、 A2、 A3)、 1 个富含糖类的非 必须中心结构域 (B 结构域 )、 以及 2 个 C 结构域 (C1、 C2)( 见图 5)。FVIII 以异型二聚体 的形式被分泌到血浆中， 该异型二聚体包括重链 (A1-A2-B 结构域 ) 和轻链 (A3-C1-C2 结构 域 )， 该重链和轻链通过 A1 结构域和 A3 结构域之间的非共价二价金属离子键合而连接。 在 血浆中， 通过结合冯维勒布兰德 (von Willebrand) 因子而使 FVIII 稳定。更具体地， 所述 FVIII 的轻链以非共价相互作用结合于冯维勒布兰德因子氨基末端的初级结合位点。通过 凝血酶的蛋白水解激活， FVIII 被激活成为 2 个重链片段 (50kDa 的片段 A1 和 43kDa 的片段 A2) 和轻链 (73kDa 的链 A3-C1-C2) 的异型三聚体。因此， FVIII 的激活形式 (FVIIIa) 由 A1 亚基和游离的 A2 亚基组成， 所述 A1 亚基通过二价金属离子键合与凝血酶切割的 A3-C1-C2 轻链相连接， 所述游离的 A2 亚基通过离子缔合 (ion association) 与所述 A1 结构域相连 接。所述 FVIIIa 异型三聚体是不稳定的， 通过在生理条件下 A2 亚基的解离而迅速失活。 所述 FVIII 分子包括 25 个能够进行 N- 连接的糖基化的共有序列 (consensus sequences) (Asn-Xxx-Thr/Ser)， 其中的 20 个共有序列已经被糖基化 (1)。
     FVIII 蛋白可以被功能性的定义为能够补充衍生自患 A 型血友病患者的血浆中的 凝固缺陷的因子。为了进行 A 型血友病的治疗， 从人类或猪的血浆中纯化了 FVIII， 并且最
     近通过重组 DNA 技术产生了 FVIII。例如， US4,965,199 公开了在哺乳动物宿主细胞中产生 治疗量的 FVIII 的重组产品的方法。也报道过在 CHO( 中国仓鼠卵巢 ) 细胞和 BHKC( 幼年 仓鼠肾细胞 ) 中表达人 FVIII， 并且最近在临床试验中证明了缺失 B 结构域的 FVIII 的功效 (US4,868,112， 参考文献 2)。
     商 业 上 可 获 得 的 治 疗 性 FVIII 产 品 包 括 ： 血 清 衍 生 的 FVIII(pdFVIII) 和 重 组 FVIII(rFVIII) 产 品， 例 如， 全 长 rFVIII(Kogenate B ayer， AdVate Baxter， CSL-Behring) 和缺失 B 结构域的 rFVIII( Wyeth)。
     然而， 尽管可获得治疗级的 FVIII， 但对于具有增强特性的 FVIII 类似物的需求仍 然很高。 事实上， 以治疗性 FVIII(pdFVIII 或 rFVIII) 来治疗 A 型血友病患者， 15-30％的情 况下会导致抗 FVIII 抗体 ( 抑制因子 ) 的出现， 该抗 FVIII 抗体 ( 抑制因子 ) 能中和治疗上 施用的 FVIII 的促凝血活性 (3， 4)。抑制因子的出现被认为是对重复施用的外源 FVIII 蛋 白的异源免疫应答反应。某些血友病患者对外源的重组因子 VIII 特别敏感， 并且产生抗因 子 VIII 的抗体从而限制了它们的治疗功效。因此， FVIII 抑制因子的产生代表主要的医药 障碍和严重的社会关注， 因为产生 FVIII 抑制因子的患者对常规替换治疗产生抵抗。FVIII 抑制因子的出现不仅导致治疗成本增加 3 倍 (5)， 而且严重影响患者的生活质量， 增加发病 率和死亡率。在这点上， 特别需要提供在受试人体中具有减少或缺少的诱导免疫应答的可 能性的 FVIII。另外， 特别需要提供在受试人体中具有增加的循环时间的 FVIII， 这对于慢 性疾病和复发疾病 ( 例如 A 型血友病的情况 ) 特别有利。
     FVIII 指导的特异性免疫应答的第一个步骤是通过抗原呈递细胞 (APCs) 进行 的 FVIII 的内吞作用。树突状细胞 (DCs) 被认为是引发天然 T 细胞并起始相应的抗原 特异性免疫应答的最有效的 APC(6， 7)。通过 DCs 进行的抗原内吞， 通常由大胞饮作用 (macropinocytosis) 或受体介导的内吞作用来实现。 事实上， 所述 DC 表面上存在无数内吞 的受体， 其中大部分依赖于二价金属 ( 主要是钙 ) 的存在。 许多内吞的受体依赖于它们暴露 的糖类识别结构域 (CRDs) 对存在于所述抗原 (S) 上的糖残基是特异性的， 被称为 C 型凝集 素受体 (CLRs)。 因此， 抗原上的甘露糖残基可以被 DC 表面上的一系列甘露糖敏感性 CLRs 所 识别， 所述甘露糖敏感性 CLRs 包括 ： 甘露糖受体 (MR， CD206)、 捕获非整合蛋白的树突状细 胞特异性 ICAM3(DC-SIGN， CD209)、 树突状细胞相关 C 型凝集素 (dectin)、 DEC-205(CD205)。 甘露聚糖为这些甘露糖敏感性 CLRs( 尤其是 MR 和 DC-SIGN) 的配体 (9-11)。DCs 上的 DC-SIGN 分子使 ICAM-3 固定在 T 细胞上。 这种特异性相互作用可能在起始 DCs 和 T 细胞之间 的免疫突触中起主要作用。因此淋巴细胞的激活可能被阻断性抗 DC-SIGN 抗体 (blocking antibody anti-DC-SIGN) 所抑制。
     几种处理可以减轻 FVIII 免疫应答的后果。例如使用如下的处理 ： 去氨加压素 (desmopressin)( 一种合成激素， 可以刺激 FVIII 的产生 )、 凝固促进剂 ( 例如凝血酶原 - 复 合体浓缩物或激活的凝血酶原 - 复合体浓缩物 )、 重组的 VIIa 因子、 或灌注 FVIII 以诱导耐 受性。
     一种新的方法是使用能够与其它抗体的可变区相互作用的抗 - 独特型抗体， 用该 方法来中和所述抑制因子抗体 (12)。因此， 分离了针对抗 -FVIII C1 结构域的 IgG4κ 单 克隆人抗体， 该抗体阻断了 FVIII 辅助因子的活性以及 FVIII 与冯维勒布兰德因子 (vWF) 的连接 (13)。同样， 分离了抗 FVIII C2 结构域的人单克隆抗体 BO2C11(IgG4κ)(14)， 该抗体能够抑制 FVIII 与 vWF 以及磷脂的连接。因此， 所述抗体能够完全抑制天然的和激活的 FVIII 的促凝血活性。另一个单克隆抗体的实例是针对 FVIII A2 结构域的 BOIIB2， 该抗体 阻断了 99％的 FVIII 活性。 然而， 所述 FVIII 诱导的免疫应答是多克隆的应答， 并且使用针 对抗 FVIII 抗体的抗独特型抗体进行处理， 仅可以部分地中和所述 FVIII 的免疫应答。
     本申请人最近证明了 FVIII 上以甘露糖为末端的糖基化介导了通过未成熟的人 树突状细胞 (DCs) 进行的 FVIII 内部化。这些结果表明阻断位于 FVIII 上的甘露糖基化的 糖类与 DCs 甘露糖受体之间的相互作用， 可以减少 FVIII 的内部化以及进一步呈递给 FVIII 特异性 T 细胞。因此， 可以通过减少 FVIII 与甘露糖敏感性受体的相互作用的能力来实现 FVIII 免疫原性的降低。
     此外， 本发明人惊奇地发现， 修饰的 FVIII( 其中选自天冬酰胺 239(Asn239) 和天 冬酰胺 2118(Asn2118) 的一个或多个氨基酸被取代或缺失 ) 当被 DCs 所呈递时激活 T 细胞 的能力基本上被减少或消除了， 从而有可能为患者提供非免疫原性或低免疫原性的治疗性 FVIII。 发明内容 本发明提供了包括修饰的 FVIII 多肽的 FVIII 蛋白， 其特征在于， 相对于未修饰的 相应 FVIII 多肽， 所述修饰的 FVIII 多肽的相互作用能力和被具有内吞能力的细胞所内吞 的能力降低或消失。
     在特定实施方式中， 本发明提供了修饰的 FVIII 多肽， 该多肽与具有内吞能力的 细胞的表面受体相互作用的能力降低或消失， 特别是提供了当表面受体是甘露糖敏感性受 体时， 所述能力降低或消失的修饰的 FVIII 多肽， 并且更特别地是提供了当表面受体选自 由甘露糖受体 (MR， CD206)、 捕获非整合蛋白的树突状细胞特异性 ICAM3(DC-SIGN， CD209)、 树突状细胞相关 C 型凝集素 (dectin) 和 DEC-205(CD205) 所组成的组中时， 所述能力降低 或消失的修饰的 FVIII 多肽。在特定实施方式中， 具有内吞能力的细胞是抗原呈递细胞 (APCs)， 特别是树突状细胞、 巨噬细胞、 内皮细胞或 B 淋巴细胞。
     在另一个特定实施方式中， 本发明提供了一种修饰的 FVIII 多肽， 该修饰的 FVIII 多肽在人体中的免疫原性基本降低或消除。
     在另一方面， 本发明的修饰的 FVIII 多肽是基本上去糖基化的， 更特别地， 本发明 的修饰的 FVIII 是基本上以甘露糖残基为末端的多糖结构的去糖基化的 FVIII 多肽。
     更特别地， 本发明的修饰的 FVIII 多肽包括在具有共有序列 Asn-Xxx-Thr/Ser 的 糖基化共有位点中的至少一个氨基酸的取代或缺失， 其中， Xxx 代表任意氨基酸。更特别 地， 本发明的修饰的 FVIII 多肽包括选自由天冬酰胺 239、 天冬酰胺 2118、 丝氨酸 241 和苏 氨酸 2120 所组成的组中 的至少一个氨基酸的取代或缺失， 参考 SEQ ID No ： 2 所示的全长 人 FVIII 多肽序列。在特定实施方式中， 天冬酰胺 239 被选自由丙氨酸、 甘氨酸、 丝氨酸、 谷氨酰胺、 苏氨酸、 天冬氨酸或谷氨酸所组成的组中的氨基酸所取代。 在又一个特定实施方 式中， 天冬酰胺 2118 被选自由丙氨酸、 丝氨酸、 谷氨酰胺、 苏氨酸、 天冬氨酸或谷氨酸所组 成的组中的氨基酸所取代。在另一个实施方式中， 天冬酰胺 239 被丙氨酸所取代， 和 / 或天 冬酰胺 2118 被丙氨酸所取代。在又一个实施方式中， 天冬酰胺 239 被谷氨酰胺所取代， 和 / 或天冬酰胺 2118 被谷氨酰胺所取代。在另一个实施方式中， 天冬酰胺 239 被丙氨酸所取
     代， 和 / 天冬酰胺 2118 被谷氨酰胺所取代。在另一个实施方式中， 天冬酰胺 239 被谷氨酰 胺所取代， 和天冬酰胺 2118 被丙氨酸所取代。在另一个特定实施方式中， 本发明的修饰的 FVIII 多肽包括 ： (i)SEQ ID No ： 6 所示的氨基酸序列和 / 或 (ii)SEQ ID No ： 8 所示的氨基 酸序列中的至少一种。 在又一个特定实施方式中， 本发明的修饰的 FVIII 多肽包括 ： (i)SEQ ID No ： 12 所示的氨基酸序列和 / 或 (ii)SEQ ID No ： 14 所示的氨基酸序列中的至少一种。 在另一个特定实施方式中， 本发明的修饰的 FVIII 多肽包括 ： (i)SEQ ID No ： 6 所示的氨基 酸序列和 (ii)SEQ ID No ： 14 所示的氨基酸序列。 在又一个特定实施方式中， 本发明的修饰 的 FVIII 多肽包括 ： (i)SEQ ID No ： 12 所示的氨基酸序列和 (ii)SEQ ID No ： 8 所示的氨基 酸序列。
     在另一方面， 本发明的修饰的 FVIII 多肽是具有促凝血活性的 FVIII 蛋白。
     在另一方面， 本发明的修饰的 FVIII 多肽还包括 ： 全部或部分的 SEQ IDNo ： 10 所 示的 B 结构域的缺失。在另一个优选实施方式中， 本发明的修饰的 FVIII 多肽仅部分地缺 失所述 B 结构域， 更优选地， 本发明的修饰的 FVIII 多肽仍含有所述 B 结构域的至少起始的 226 个氨基酸 ( 参考 SEQ ID No ： 10)。
     本发明的另一个目的是提供编码 FVIII 蛋白的分离的核酸分子或修饰的分离的 核酸序列， 所述 FVIII 蛋白包含本发明的修饰的 FVIII 多肽。在一个特定实施方式中， 所述 编码 FVIII 蛋白的核酸序列包括 ： (i)SEQ ID No ： 5 所示的核酸序列和 / 或 (ii)SEQ ID No ： 7 所示的核酸序列中的至少一种。 在又一个特定实施方式中， 所述编码 FVIII 蛋白的核酸序 列包括分离的核酸分子， 该分离的核酸分子能够在高严格性条件下与 (i)SEQ ID No ： 5 所示 的核酸序列和 / 或 (ii)SEQ ID No ： 7 所示的核酸序列中的至少一种进行杂交。
     在另一个特定实施方式中， 所述编码 FVIII 蛋白的核酸序列包括 (i)SEQID No ： 11 所示的核酸序列和 / 或 (ii)SEQ ID No ： 13 所示的核酸序列中的至少一种。在又一个特定 实施方式中， 所述编码 FVIII 蛋白的核酸序列包括分离的核酸分子， 该分离的核酸分子能 够在高严格性条件下与 (i)SEQ ID No ： 11 所示的核酸序列和 / 或 (ii)SEQ ID No ： 13 所示 的核酸序列中的至少一种进行杂交。
     在另一个特定实施方式中， 所述编码 FVIII 蛋白的核酸序列包括 (i)SEQID No ： 5 所示的核酸序列和 (ii)SEQ ID No ： 13 所示的核酸序列中的至少一种。在又一个特定实施 方式中， 所述编码 FVIII 蛋白的核酸序列包括分离的核酸分子， 该分离的核酸分子能够在 高严格性条件下与 (i)SEQ ID No ： 5 所示的核酸序列和 (ii)SEQ ID No ： 13 所示的核酸序列 中的至少一种进行杂交。
     在另一个特定实施方式中， 所述编码 FVIII 蛋白的核酸序列包括 (i)SEQID No ： 11 所示的核酸序列和 (ii)SEQ ID No ： 7 所示的核酸序列中的至少一种。 在又一个特定实施方 式中， 所述编码 FVIII 蛋白的核酸序列包括分离的核酸分子， 该分离的核酸分子能够在高 严格性条件下与 (i)SEQ ID No ： 11 所示的核酸序列和 (ii)SEQ ID No ： 7 所示的核酸序列中 的至少一种进行杂交。
     本发明还提供了一种表达载体， 其中， 该表达载体含有本发明的分离的核酸分子 或编码本发明的修饰的 FVIII 多肽的分离的核酸分子。
     本发明的另一个目的是提供一种宿主细胞， 其中， 该宿主细胞被含有本 发明的分 离的核酸分子的表达载体所转染， 从而表达 FVIII 蛋白或本发明的修饰的 FVIII 多肽。本发明还提供了一种非人转基因生物， 其中， 该非人转基因生物能够表达本发明 的 FVIII 蛋白， 并且所述生物特别地选自微生物、 非人动物或植物， 更特别是哺乳动物。
     本发明的另一个目的是提供含有本发明公开的 FVIII 蛋白的组合物， 特别是药物 组合物或冻干的组合物， 该组合物还含有药用可接受的载体。
     本发明的另一个目的是提供产生根据本发明的 FVIII 蛋白的方法， 该方法包括以 下步骤 ： 使被本发明的核酸分子或编码本发明的 FVIII 蛋白的核酸分子转化或转染的宿主 细胞在培养基中生长 ； 从所述宿主细胞和 / 或培养基中分离由所述核酸分子表达得到的 FVIII 蛋白。
     本发明还提供了根据本发明的 FVIII 蛋白用于治疗出血性疾病的应用， 特别是以 FVIII 缺乏为特征的疾病， 更特别是 A 型血友病和获得性 A 型血友病。
     在一个特定实施方式中， 本发明提供了本发明的 FVIII 蛋白在制造用于治疗 A 型 血友病和获得性 A 型血友病的药物中的应用， 以及提供了治疗患者的 A 型血友病的方法， 该 方法包括将根据本发明的 FVIII 蛋白按患者的需要以凝固的有效量对患者给药。 附图说明
     图1： FVIII 甘露糖敏感性地进入树突状细胞 (DCs)。
     (A)DCs 以 5mM EDTA、 1mg/ml 甘 露 聚 糖 或 1mg/ml D- 半 乳 糖 在 37 ℃ 预 培 养 30 分钟， 然后加入 FVIII(40μg/ml) 培养 2 小时。报告的值表示相对的抗原摄入， 定义为 37℃ 4℃ 37℃ 4℃ [( MFIinh- MFImedium)/( MFImediumMFImedium)]×100， 其中， “MFIinh” 代表在抑制因子存 在下检测的 MFI。 结 果获得自 12 个供体， 统计学显著性基于原始数据以不成对司徒顿 t 检 验 (Student′ s test) 来计算。
     (B) 甘露聚糖抑制 DCs 的内吞。将 DCs 以甘露聚糖 (1mg/ml) 预培养， 然后添加葡 聚糖 -FITC(50μg/ml) 或萤光黄 (200μg/ml) 培养 2 小时。
     图2： DCs 对 FVIII 的甘露糖敏感性摄入， 导致 FVIII 衍生的肽向 FVIII 特异性 CD4+T 细胞的呈递。
     (A) 从 DRB1*1501/DRB5*01 健康供体产生的 DCs 在单独培养基或存在甘露聚糖 (1mg/ml) 或抗 CD206IgG(10μg/ml) 的培养基中培养 (10000 个细胞 / 孔 )， 然后与 FVIII 特 异性 T 细胞克隆 D9E9(5000 个细胞 / 孔 ) 在多种剂量的 FVIII(5.56、 2.78 或 1.39μg/ml) 以及 20U/ml 的 rhIL-2 存在下于 37℃共同培养 20 小时。通过在培养上清中释放的 IFN-γ 来评价 T 细胞的激活。结果来自于 3-8 个独立实验中的一个有代表性的实验。IFN-γ 的产 量随单独实验中所使用的不同批次的 D9E9 和不同来源的供体 DCs 而变化。
     (B) 从 MHC-II 匹配的供体产生的 DCs 以甘露聚糖 (1mg/ml) 或抗 CD206IgG(10μg/ ml) 预培养， 然后添加 FVIII(5.56μg/ml) 或 I2144-T2161 肽 (SEQ ID No ： 9)(2μg/ml) 以及 D9E9。对于各处理， IFN-γ 的产生表示为相对于各单独实验获得的最大值 (* ： P ＜ 0.0001， 用曼恩 - 惠特尼检验 (Mann-Whitney test) 评估 )。结果来自 3 个独立的实验。
     (C) 人 FVIII 特异性 HLA 匹配的 B 细胞系 LE2E9 和 BO2C11、 或 DCs 在 FVIII(10μg/ ml) 和 D9E9 存在下培养。
     图3： 位于 B 结构域以外的预计的甘露糖残基在由 DCs 内吞 FVIII 而引起 T 细胞 激活的过程中起重要作用。(A)DCs 以甘露聚糖 (1、 5、 10、 100 和 1000μg/ml) 预培养， 之后加入 FVIII(40μg/ ml， 143nM，实 心 圆 圈 ) 和 BDD-FVIII(24.31μg/ml， 143nM，空 心 圆 圈 )、或 葡 聚 糖 -FITC(50μg/ml)。 通过流式细胞仪分析抗原的摄入。 相对于无甘露聚糖的条件计算各 条件的抑制百分比。
     (B) 用 7.5％ SDS-PAGE 分离天然的或内源 F1(EndoF1) 处理的 BDD-FVIII(3.7μg/ ml)， 并 转 移 到 硝 酸 纤 维 素 膜 上。 转 移 的 蛋 白 用 Protogold 显 示， 或 者 以 10μg/ml CTLD4-7-Fc 培育， 并使用碱性磷酸酶偶联的抗人 IgG。使用轻链 (LC) 和重链 (HC) 特异性 单克隆抗 FVIII IgGs 进行印迹来鉴定轻链和重链 ( 未显示 )。
     (C) 经 EndoF1 处理的 BDD-FVIII 减少 T 细胞的激活。结果以 3 个独立实验中的 一个具有代表性的实验来表示。IFN-γ 的产量随不同实验中所使用的不同批次的 D9E9 和 不同来源的人 DCs 而变化。为了将 3 套实验进行统计学的比较， 将 IFN-γ 的产生相对于各 单独实验所获得的最大值进行均一化 (normalized)。T 细胞激活的均一化水平的差异在 “培养基” 和 “EndoF1 处理” 之间是统计学上显著的， 用 ANOVA 和费希尔 PSLD 检验来评估 (P ＜ 0.0001， 数据未显示 )。
     图4： 通过野生型或突变的 FVIII 轻链激活 FVIII 特异性 T 细胞克隆 (D9E9)。 (A) 和 (B) 证实了 FVIII 的野生型轻链甘露糖敏感性地进入 DC 会导致 T 细胞激活。 用 EndoF1 处理纯化的血清衍生的 FVIII 轻链 ( 野生型 LCh)。随后将天然的野生型 Lch、 在 甘露聚糖 (1mg/ml) 存在下的野生型轻链和 EndoF1 处理的野生型轻链加入到 DCs( 图 A) 中 或加入到 FVIII 特异性 B 细胞克隆 (BO2C11， 图 B) 中， 与 D9E9 细胞共培养 20 小时。通过以 ELISA 测量培养上清中的 IFN-γ 来评估 D9E9 的激活。
     (C) 和 (D) 是由 FVIII 轻链的定位诱变引起的 D9E9 失活。所述 BO2C11B 细胞克 隆和单核细胞衍生的 DCs 在野生型 Lch 存在下 ( 图 C) 或在突变的 Asn2118Ala LCh 存在下 ( 图 D) 与 D9E9 一起培养。Asn2118 被 Ala 残基取代除去了一个 N- 甘露糖基化的位点。20 小时后， 通过测量培养上清中的 IFN-γ 来评估 D9E9 的激活。
     图5： 全长 FVIII 结构的图示。
     全长异型二聚体的人 FVIII(SEQ ID No ： 2) 由 2332 个氨基酸组成， 包括对应于 1-1648 位残基的 “重链” 并含有 A1-a1-A2-a2-B 结构域， 以及包括对应于 1649-2332 位残基 的 “轻链” 并含有 a3-A3-C1-C2 结构域 ( 氨基酸残基数指 SEQ ID No ： 2 中所示的氨基酸序 列 )。所述 FVIII 分子含有 25 个可以进行 N- 连接糖基化的共有序列 (Asn-Xxx-Thr/Ser)， 其中的 20 个已经被糖基化 (1)。
     图6： 天然的全长人 FVIII 的氨基酸序列 (SEQ ID No ： 1 所示 )。
     有下划线的氨基酸序列对应于天然的全长人 FVIII 的含起始 19 个氨基酸的信号 肽。经典的全长异型二聚体的人 FVIII(SEQ ID NO ： 2) 的氨基酸数起始于 20 位点的丙氨酸 残基。以粗体表示的氨基酸残基相应于共有的糖基化位点， 在本发明中这些氨基酸优选被 修饰。B 结构域相应于 SEQ ID No ： 1 所示的氨基酸序列中的 760-1667 位点范围的氨基酸 序列， 并在图 6 中公开。天然的轻链在实施例 6 中用作对照， 指 “纯化的血浆衍生的 FVIII 的轻链” ， 相应于 SEQ ID No ： 1 所示的氨基酸序列中的 1668-2351 位点范围的氨基酸序列， 并在图 6 中公开。
     天然的人 FVIII 的重链相应于 SEQ ID No ： 1 所示的氨基酸序列中的 19-759 位点
     范围的氨基酸序列， 并在图 6 中公开。
     图7： BDD(B 结构域缺失 )- 人 FVIII
     因子 VIII 的 B 结构域对于促凝血活性是不必要的。图 7 公开了当从 SEQID No ： 2 所示的全长人 FVIII 中除去 B 结构域时获得的 B 结构域缺失的人 FVIII 的相应的氨基酸序 列和核酸序列。所述氨基酸序列和核酸序列一起列出， 从而使各氨基酸 ( 上面 ) 对应于相 应的核酸密码子 ( 下面 )。相应于 BDD- 人 FVIII 的氨基酸序列和核酸序列彼此独立地编号 ( 编号在序列右侧显示 )。 图 7 中公开的 BDD- 人 FVIII 的氨基酸序列相应于 SEQ ID No ： 4 所示的序列。图 7 中公开的 BDD- 人 FVIII 的核酸序列相应于 SEQ ID No ： 3 所示的序列。 以粗体表示的氨基酸残基 ( 或相应的核酸残基 ) 对应于在本发明中优选被修饰的共有糖基 化位点。符号 “*” 置于终止密码子上方。
     图8： 在 239 位点以 Ala 取代 Asn 而修饰的人 FVIII 重链 ( 参考 SEQ EDNo ： 2 所示 的全长人 FVIII 序列 )。
     图 8 公开了本发明的特定实施方式中的修饰的人 FVIII 重链所对应的氨基酸序列 和核酸序列。 所述氨基酸序列和核酸序列一起列出， 从而使各氨基酸 ( 上面 ) 对应于相应的 核酸密码子 ( 下面 )。相应于修饰的人 FVIII 重链的氨基酸序列和核酸序列彼此独立地编 号 ( 编号在序列右侧显示 )。图 8 中公开的修饰的人 FVIII 重链的氨基酸序列相应于 SEQ ID No ： 6 所示的序列。图 8 中公开的修饰的人 FVIII 重链的核酸序列相应于 SEQ ID No ： 5 所示的序列。以粗体表示的氨基酸残基 ( 丙氨酸 )( 或相应的核酸密码子 ) 对应于在本发 明的实施方式中被修饰的糖基化位点 (Asn239)。 图9： 在 2118 位点以 Ala 取代 Asn 而修饰的人 FVIII 轻链 ( 参考 SEQ EDNo ： 2所 示的全长人 FVIII 序列 )。
     图 9 公开了本发明的特定实施方式中的修饰的人 FVIII 轻链所对应的氨基酸序列 和核酸序列。 所述氨基酸序列和核酸序列一起列出， 从而使各氨基酸 ( 上面 ) 对应于相应的 核酸密码子 ( 下面 )。相应于修饰的人 FVIII 轻链的氨基酸序列和核酸序列彼此独立地编 号 ( 编号在序列右侧显示 )。图 9 中公开的修饰的人 FVIII 轻链的氨基酸序列相应于 SEQ ID No ： 8 所示的序列。图 9 中公开的修饰的人 FVIII 重链的核酸序列相应于 SEQ ID No ： 7 所示的序列。以粗体表示的氨基酸残基 ( 丙氨酸 )( 或相应的核酸密码子 ) 对应于在本发 明的实施方式中被修饰的糖基化位点 (Asn2118)。
     图 10 ： 通过野生型或突变的 FVIII 轻链在小鼠中产生抗 FVIII IgG。
     将纯化的血清衍生的人 FVIII 轻链 (wtLCh) 和突变的 FVIII 的 LCh(Asn2118Ala LCh) 静脉注射 (0.2μg 蛋白溶于 200μL PBS 中 ) 到 FVIII 缺失的小鼠中， 注射四次， 每次间 隔一周。第四次注射后的一周， 对小鼠进行取血， 并用 FVIII 特异性 ELISA 来检测抗 FVIII IgG 的水平。 以 1 ∶ 90 稀释的小鼠血清在包被人 FVIII 的 ELISA 平板中培养。 (Recombinate， Baxter) 用过氧化物酶偶联的抗鼠 IgG 和其底物 (OPD) 来显示结合的 IgG。用分光光度计 (Tecan Genyos) 测量在 492nm 的吸光度来确定结合强度。
     图 11 ： 3 种具有甘露糖残基末端的多糖结构的图示。
     具体实施方式
     此处所用 “FVIII 蛋白” 指含有至少一个 FVIII 多肽 ( 但不限于此种多肽 ) 的氨基酸分子。因此， 本发明的 FVIII 多肽代表至少约 50％、 优选 60％、 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或 100％的本发明的 FVIII 蛋白的氨基酸含量。当所述 FVIII 蛋白中所述 FVIII 多肽的比例不是 100％时， 所述 FVIII 蛋白可以含有任意另外的氨 基酸序列， 从而所述 FVIII 蛋白应被认为是嵌合蛋白。所述 FVIII 蛋白所包含的附加的氨 基酸序列可以共价地或非共价地连接于所述 FVIII 多肽， 并且可以相应于或起源于任意天 然的或合成的多肽。这些附加的氨基酸序列可以充当酶或活性蛋白质、 用于细胞运输的信 号序列、 移位、 输出、 分泌， 或者它们可以行使其它酶和 / 或加工蛋白质的识别序列的作用。
     此处所用 “FVIII 多肽” 指具有凝固活性和与 SEQ ID No ： 2 的全长的人因子 VIII 相比具有类似的凝血酶活性谱的多肽， 该多肽与 SEQ ID No ： 2 所示的多肽序列的 1-740 和 1689-2332 区域具有至少约 60％、 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或 100％的同一性。特别应当理解的是， 多种突变体和保守氨基酸改变、 以及特定的非 保守氨基酸改变， 都是可以允 许的， 只要该变体因子 VIII 具有凝固活性即可。也允许片段 化和特定的糖基化， 并且优选甚至允许所述因子 VIII 多肽全部任意地改变， 只要该多肽保 留其特异性的活性即可。
     此处所用 “FVIII 多肽” 也指具有凝固活性和与 SEQ ID No ： 2 的全长的人因子 VIII 相比具有类似的凝血酶活性谱的多肽， 该多肽与 SEQ ID No ： 2 所示的全长的人因子 VIII 具有 至少约 60％、 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或 100％的同一性。特 别应当理解的是， 多种突变体和保守氨基酸改变、 以及特定的非保守氨基酸改变， 都是可以允 许的， 只要该变体因子 VIII 具有凝固活性即可。也允许片段化和特定的糖基化， 并且优选甚 至允许所述因子 VIII 多肽全部任意地改变， 只要该多肽保留其特异性的活性即可。
     此处所用 “修饰的 FVIII 多肽” 可以包括在全长 FVIII 或 BDD-FVIII 非必需区域中 任意数量的氨基酸或天然氨基酸的改变， 包括在该多肽分子的任意其它区域中的取代和 / 或插入和 / 或缺失， 只要该多肽变体包括与 SEQ ID No ： 2 所示的多肽序列的至少约 1-740 和 / 或 1689-2332 区域具有至少约 60％、 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％ 或 99％的同一性的序列， 并且变异的存在不妨碍所述变体 FVIII 的活性。
     此处所用 “修饰的 FVIII 多肽” 包括与指定参比序列 ( 即 SEQ ID No ： 2 所示的全 长的人因子 VIII) 具有 60 ％、 70 ％、 75 ％、 80 ％、 85 ％、 90 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％、 99 ％、 100％的序列同一性的氨基酸序列。
     此处所用的术语 “修饰的” 指与参比序列 ( 例如全长因子 VIII 序列 ) 相比其氨基 酸序列有所不同的分子。所述氨基酸改变可以是在天然或全长的氨基酸序列中的取代、 插 入、 缺失或任意所需的这些改变的组合。 所述取代可以是单个的， 其中所述分子中仅有一个 氨基酸被取代 ； 或者所述取代可以是多个的， 其中在同一分子中两个或多个氨基酸被取代。
     为了改进或改变本发明的 FVIII 多肽的特性， 可以使用氨基酸工程。可以使用本 领域技术人员熟知的重组 DNA 技术来产生包括单个或多个氨基酸取代、 缺失、 添加的新的 突变体多肽或融合蛋白。此类修饰的多肽例如可以显示增加的 / 降低的活性或增加的 / 降 低的稳定性。 另外， 至少在特定的纯化和储存条件下， 所述修饰的多肽可以以更高的产量被 纯化， 并且相对于天然多肽显示出更好的溶解性。
     此处所用的术语 “多肽” 不仅包括全长蛋白质分子， 而且还包括其片段， 这些片段 单独或与其它片段一起在凝固测定中产生 FVIII 的促凝血活性。应当理解本发明的新的蛋白质产品的合成多肽也在本发明的范围之内， 并且可以根据标准合成方法来制备。也应当 理解在此处所用的氨基酸编号系统中， 氨基酸残基 1 是天然成熟 FVIII 蛋白的第一个残基。 还应当理解的是， 术语 “结构域” 指本领域技术人员公知的 FVIII 的近似区域。
     本申请中使用的氨基酸符号包括如下 ： 本申请中通篇使用了氨基酸的单个字母缩 写或三个字母缩写， 它们可以互换使用， 含义如下 ： A 或 Ala ＝丙氨酸 ； R 或 Arg ＝精氨酸 ； N 或 Asn ＝天冬酰胺 ； D 或 Asp ＝天冬氨酸 ； C 或 Cys ＝半胱氨酸 ； Q 或 Gln ＝谷氨酰胺 ； E或 Glu ＝谷氨酸 ； G 或 Gly ＝甘氨酸 ； H 或 His ＝组氨酸 ； I 或 Ile ＝异亮氨酸 ； L 或 Leu ＝亮氨 酸； K 或 Lys ＝赖氨酸 ； M 或 Met ＝甲硫氨酸 ； F 或 Phe ＝苯丙氨酸 ； P 或 Pro ＝脯氨酸 ； S或 Ser ＝丝氨酸 ； T 或 Thr ＝苏氨酸 ； W 或 Trp ＝色氨酸 ； Y 或 Tyr ＝酪氨酸 ； 以及 V 或 Val ＝ 缬氨酸。
     此外， 此处所用 “修饰的 FVIII 多肽的修饰” 不限于精确列举的指定的数目或位 点， 只要所述实现功能和结果相同即可。从人全长因子 VIII 的 N 末端或 C 末端或其它部分 的几个氨基酸位点可以被插入、 添加或缺失， 只要保留其功能性活性 ( 例如凝血酶剪切或 促凝血功能 ) 即可。本发明的范围还包括展现相同或相似生物学活性的蛋白质或其片段或 衍生物， 以及包括在翻译中或翻译后被不同地修饰的衍生物， 所述修饰包括通过糖基化、 蛋 白水解切 割、 与抗体分子或其它细胞配体连接等等。
     此处所用 “片段” 指保留有用的和功能性的特性的部分的多肽。例如在本发明中 所用的所述因子 VIII 多肽片段具有凝血的功能。
     此处所用的具有因子 VIII 的促凝血活性的蛋白是在体外、 先体外后体内或体内 的模型系统中可以引起因子 V 激活的蛋白质。作为非限制性实例， 该定义包括全长重组人 因子 VIII 和 B 结构域缺失的因子 VIII。 此处所用的术语 “促凝血活性” 和 “有活性的” FVIII 可以互换使用， 指在凝固测定中表现出促凝血活性的一种或多种多肽或蛋白质。此处所用 的术语 FVIII 可以包括 FVIIIa， 并且本领域技术人员应当从上下文中理解所述术语是用于 指哪个术语 ( 凝血酶激活前的 FVIII 或凝血酶激活的 FVIII(FVIIIa))。此处所用 “以甘露 糖残基为末端的多糖结构去糖基化的 FVIII 多肽” 指缺失一个或多个以甘露糖残基为末端 的多糖结构的 FVIII 多肽或修饰的 FVIII 多肽。
     此处所用 “以甘露糖残基为末端的多糖结构” 指在远离多肽主链的位点以一个或 多个甘露糖残基糖基化的多肽结构， 该甘露糖残基被称为末端甘露糖残基。 术语 “以甘露糖 残基为末端的多糖结构” 包括单分支 (antennary) 和多触角多分支结构， 在远离多肽主链的 位置具有一个或多个甘露糖残基， 更特别地， 所述 “以甘露糖残基为末端的多糖结构” 包括 寡甘露糖型多肽结构 ( 图 11)。
     此处所用 “末端甘露糖残基” 指远离多肽主链的甘露糖残基， 该甘露糖残基在糖基 化位点终止了多糖结构的一个分支 ( 图 11)。
     此处所述的术语 “能够在高严格性条件下杂交” 指在高严格性条件下退火的 DNA 链与目的 DNA 互补。同样， “能够在低严格性条件下杂交” 指在低严格性条件下退火的 DNA 链与目的 DNA 互补。退火过程的 “高严格性条件” 可以包括例如高温度和 / 或低盐含量， 在 此条件下不支持错配碱基对之间的氢键连接。 “低严格性条件” 可以包括比高严格性条件更 低的温度和 / 或更高的盐 浓度。 此条件允许两条链基本互补但不完全互补的两条 DNA 链进 行退火， 例如编码相同蛋白质但由于遗传密码的简并性而具有不同序列的 DNA 链。 促进 DNA杂交的合适的严格性条件例如为本领域技术人员公知的在约 45 ℃下以 6*SSC 处理， 然后 在 50℃下以 2*SSC 洗涤， 或者可以在现代分子生物学方法 John Wiley&Sons， N.Y.(1989)， 6.31-6.3.6 中找到。例如， 在所述洗涤步骤中的盐浓度可以选自约在 50℃下的 2*SSC 的低 严格性到约在 50℃下的 0.2*SSC 的高严格性。另外， 所述洗涤步骤中的温度可以从低严格 性的约 22℃的室温增加到高严格性条件的约 75℃。其它严格性参数的描述见 Maniatis， T.， 等， 分子克隆 ： 实验室手册， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring N， Y.， (1982)， 387-389 页 ； 也见 Sambrook J. 等， 分子克隆 ： 实验室手册， 第二版， Volume 2， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring， N.Y.8.46-8.47 页 (1989)。
     此处所用 “载体” 包括药用可接受的载体、 赋形剂或稳定剂， 在细胞或哺乳动物暴 露于所使用的剂量和浓度时， 该载体对所述细胞或哺乳动物是无毒的。通常所述药用可接 受的载体是水性 pH 缓冲溶液。所述药用可接受的载体的实例包括但不限于例如磷酸缓冲 液、 柠檬酸缓冲液和其它有机酸缓冲液 ； 包括抗坏血酸在内的抗氧化剂 ； 低分子量 ( 低于 约 10 个残基 ) 多肽 ； 蛋白质， 例如血清白蛋白、 明胶或免疫球蛋白 ； 亲水聚合物， 例如聚乙 烯吡咯烷酮 ； 氨基酸， 例如甘氨酸、 谷氨酰胺、 天冬酰胺、 精氨酸或赖氨酸 ； 单糖、 二糖和其 它糖类， 包括葡萄糖、 甘露糖、 或糊精 ； 螯合剂， 例如 EDTA ； 糖醇， 例如甘露糖醇或山梨糖醇 ； 形成补偿离子的盐， 例如钠 ； 和 / 或非离子表面活性剂， 例如 TWEEN(R)、 聚乙二醇 (PEG) 和 PLURONICS(R)。
     此处所用 “有效量” 足够实现有益效果和预期的临床或生物化学结果的量。 有效量 可以被施用一次或多次。为了本发明的目的， 抑制因子化合物的有效量为足够减轻、 改进、 稳定、 逆转、 减慢或延迟疾病进程的量。在本发 明的优选实施方式中， 所述 “有效量” 定义 为能够影响血液凝固的化合物的量。
     此处所用 “宿主细胞” 包括单个细胞或细胞培养物， 其可以作为或已经成为本发明 的载体的容纳者。 宿主细胞包括单个宿主细胞的后代， 并且由于天然的、 随机的或有意的突 变和 / 或改变， 所述后代可以不需要与原始母细胞完全同一 ( 在形态学上或在总 DNA 补体 (complement) 上 )。宿主细胞包括在体内或先体外后体内以包含编码血管生成因子的多核 苷酸的载体转染或感染的细胞。
     此处所用 “纯化的” 或 “分离的” 指从天然环境移出的生物分子， 它们是分离的或 隔离的， 并且不含与它们天然连接的其它组分。
     此处所用 “治疗” 是获得有益的或预期的临床效果的过程。为了本发明的目的， 有 益的或预期的临床效果包括但不限于症状的缓和、 疾病程度的减轻、 疾病状态的稳定 ( 即 不恶化 )、 疾病进程的延迟或减慢、 疾病状态的改善或减轻和好转 ( 部分或全部 )， 无论是可 检测到的还是无法检测的。 “治疗” 还可以指与不接受治疗而预期的存活期相比延长存活 期。 “治疗” 指治疗和预防措施。需要治疗的人包括已经有病症的人以及要预防病症的人。 “减轻” 疾病指与不进行治疗的情况相比， 疾病状态的程度和 / 或不希望的临床表型被减弱 和 / 或进程的时间被减慢或延长。
     此处所用 “载体” 、 “多核苷酸载体” 、 “构建体” 和 “多核苷酸构建体” 可互换使用。 本发明的多核苷酸载体可以以任意几种形式， 包括但不限于 RNA、 DNA、 包裹在反转录病毒外 壳中的 RNA、 包裹在腺病毒外壳中的 DNA、 包裹在其它病毒或类病毒形式 ( 例如单纯疱疹病 毒和腺相关病毒 (AAV)) 中的 DNA、 包裹在脂质体中的 DNA、 DNA 与多溶素的复合物、 DNA 与合成的聚阳离子分子的复合物、 DNA 与包括聚乙二醇 (PEG) 在内的化合物的复合物 ( 在免疫 学上 “遮盖” DNA 分子和 / 或增加半衰期 )、 或 DNA 与非病毒 蛋白的缀合物。优选地， 所述 多核苷酸为 DNA。
     当选择用于以本发明的载体 ( 包括编码 FVIII 衍生物的序列和例如二氢叶酸还原 酶 (DHFR) 蛋白 ) 转染的优选宿主细胞时， 合适的是根据使用的 DHFR 蛋白的类型来选择宿 主。 如果使用野生型 DHFR 蛋白， 优选选择缺乏 DHFR 的宿主细胞， 由此使编码 DHFR 的序列可 以用作在选择性培养基 ( 缺乏次黄嘌呤、 甘氨酸和胸腺嘧啶核苷 ) 中成功转染的标记。另 一方面， 如果使用与氨甲喋呤 (MTX) 有低结合亲和力的 DHFR 蛋白作为调节序列， 那么需要 使用 DHFR 抗性细胞。突变的 DHFR 对 MTX 有抗性， 因此， 如果宿主细胞本身对 MTX 敏感， 则 使用含 MTX 的培养基来进行筛选。或者， 可以使用野生型 DHFR 基因作为宿主细胞中的扩增 标记， 如果使用第二个药物筛选标记 ( 例如潮霉素 (hygromycin) 抗性 )， 则该宿主细胞不缺 乏 DHFR。下述实施例描述了使用对 MTX 有抗性的 CHO 细胞 (CHO-DBX11 细胞 ) 作为宿主细 胞， 以及使用 CMV 和 SV40 启动子作为调节序列来分别驱动 FVIII 衍生物和 DHFR 的产生的 载体。 其它筛选标记包括携带药物抗性的基因， 所述药物例如新霉素、 潮霉素和氨甲喋呤。
     此处所用 “DNA” 不仅包括 A、 T、 C 和 G 碱基， 而且也包括这些碱基的任意类似物或 修饰的形式， 例如甲基化的核苷、 内部修饰的核苷 ( 例如不带电的键合和硫代、 使用糖类似 物和修饰和 / 或改变主链结构 ( 例如聚酰胺 ))。 在另一方面， 本发明提供了分离的核酸分子， 该分离的核酸分子包括在严格性杂 交条件下能够与上述本发明的核酸分子的一部分杂交的多核苷酸。如上所述， 杂交的多核 苷酸用作探针和引物。与编码所述 FVIII 多肽的序列杂交的多核苷酸的部分， 可以由上述 5’ 和 3’ 碱基位置或核苷酸碱基的大小来精确地表示， 或以同样方式精确地排除。同样， 与 FVIII 多肽杂交的多核苷酸部分也可以用作探针和引物。优选的本发明的杂交的多核苷酸 是在本领域已知的杂交测定 ( 例如 Southern 印迹分析和 Northern 印迹分析 ) 中标记和使 用时展现最大信号强度的多核苷酸， 尽管存在等摩尔量的异源序列。
     此处所用的修饰的核酸序列包括由核苷酸的取代、 缺失或添加产生的核酸序列。 所述取代、 缺失或添加可以包括一个或多个核苷酸。氨基酸序列的改变会产生保守的或非 保守的氨基酸取代、 缺失或添加。 其中， 尤其优选不改变本发明的多肽或其部分的特性和活 性的沉默的取代、 添加和缺失。在这点上， 还优选保守的取代。
     本发明涉及序列在表达载体中的应用， 以及用于转染宿主细胞和细胞系， 可以是 原核细胞或真核细胞。本发明还涉及由表达载体表达的多肽的纯化。所述表达载体可以含 有多种易于纯化的分子标签。之后获得的表达构建体可以转化到所选择的任意宿主细胞 中。通过本领域众所周知的已建立的方法来分离宿主细胞的裂解液。
     在特定实施方式中， 通过基因治疗的方式， 施用包括编码所述 FVIII 蛋白或修饰 的因子 VIII 多肽的序列的核酸， 以治疗、 抑制或预防与本发明的多肽的表达和 / 或活性异 常相关的疾病或失调。基因治疗指通过向受试者施用表达的或可表达的核酸而进行的治 疗。在本发明的实施方式中， 所述核酸产生它们编码的蛋白质从而介导治疗作用。
     根据本发明可以使用任意本领域可获得的用于基因治疗的方法。在优选的方面， 核酸序列可以编码因子 VIII 多肽， 其中所述核酸序列是在合适宿主中表达所述多肽的表 达载体的一部分。 特别地， 此类核酸序列具有与编码多肽的区域可操作地连接的启动子， 所
     述启动子可以是可诱导的或者组成型的， 并且任选地可以是组织特异性的。在另一个特定 实施方式中， 使用的核酸分子中编码多肽的序列和任意其它所需序列的旁侧是可以在基因 组的所需位点促进同源重组的区域， 由此提供编码抗体的核酸的染色体内表达。所述核酸 可以被直接或间接地运送到患者体内， 当直接的情况下， 患者直接暴露于所述核酸或携带 核酸的载体， 当间接的情况下， 首先在体外以所述核酸 转化细胞， 然后将细胞移植到患者 体内。这两种途径已知分别为体内基因治疗或先体外后体内基因治疗。
     在特定实施方式中， 直接在体内施用所述核酸序列， 该核酸序列表达以产生编码 产物。这可以通过本领域内许多已知的方法中的任意方法来完成， 例如通过将所述核酸序 列构建为合适的核酸表达载体的一部分， 并施用它们以使它们进入细胞内， 例如通过使用 有缺陷或削弱的反转录病毒或其它病毒载体 ； 或通过直接注射单纯的 DNA、 或以脂质活细 胞表面受体活转染试剂包被、 或包裹在脂质体、 微粒体活微囊体中 ； 或通过施用与肽连接的 所述核酸序列从而进入核 ； 通过施用与配体连接的所述核酸序列从而经受受体介导的内吞 ( 可以用来靶向特异性表达受体的细胞类型 ) 等等。
     或者， 所述核酸可以被引入细胞内， 并通过同源重组整合到宿主细胞 DNA 中以进 行表达。在特定实施方式中， 使用含有编码所述多肽的核酸序列的病毒载体。在基因治疗 中所使用的编码所述多肽的核酸序列被克隆到一个或多个载体中， 该载体利于将所述基因 运送到患者体内。可以使用的病毒载体的实例为反转录病毒、 腺病毒和腺相关病毒。反转 录病毒含有病毒基因组正确包装盒整合到宿主细胞 DNA 中所需要的成分。 其它基因治疗的途径包括通过一定方法将基因转移到组织培养的细胞中， 所述方 法例如电穿孔、 脂质体、 磷酸钙介导的转染或病毒感染。通常， 转移的方法包括将可筛选标 记转移到所述细胞中。 然后将所述细胞置于筛选条件下以分离已经摄入并表达转移的基因 的那些细胞。然后将那些细胞递送给患者。在该实施方式中， 在将获得的重组细胞在体内 施用之前， 向细胞中引入所述核酸。 此种引入可以通过本领域公知的任意方法进行， 包括但 不限于转染、 电穿孔、 显微注射、 病毒感染或含所述核酸序列的噬菌体载体、 细胞融合、 染色 体介导的基因转移、 微细胞介导的基因转移、 原生质体 (spheroplast) 融合等等。本领域中 已知许多技术可以用于向细胞内引入外 源基因， 并且可以根据本发明使用这些技术， 只要 受体细胞的发育和生理功能不被破坏即可。所述技术应能够向细胞中稳定转移核酸， 从而 使所述核酸能够被所述细胞所表达， 并且优选是可遗传和可以被所述细胞的后代表达。
     为了进行基因治疗而引入核酸的细胞包括任意所需的、 可获得的细胞类型， 并且 包括 ( 但不限于 ) 上皮细胞、 内皮细胞、 角质细胞、 成纤维细胞、 肌细胞、 肝细胞、 血液细胞 ( 例如 T 淋巴细胞、 B 淋巴细胞、 单核细胞、 巨噬细胞、 嗜中性粒细胞、 嗜曙红细胞、 巨核细胞、 粒细胞 )、 多种干细胞或祖细胞 ( 特别是造血干细胞或祖细胞， 例如获自骨髓、 脐带血、 外周 血、 胎肝等等 )。
     在一个实施方式中， 本发明涉及对血液凝固疾病的治疗。 在此方面， 本发明的治疗 性化合物可以施用于患有该疾病或倾向于患有该疾病的人类患者， 提供刺激血液凝固的化 合物。特别地， 所述疾病可以是血友病， 特别是 A 型血友病。治疗性化合物的制剂通常是本 领域内公知的， 并且可以参考 Remington′ s Pharmaceutical Sciences， 17th ed.， Mack Publishing Co.， Easton.Pa.， USA。
     可以调节剂量以提供最佳的治疗反应。例如， 可以每天施用几个分开的剂量或可
     以按治疗的紧急情况所指示的适当地减少剂量。可以以方便的方式施用活性化合物， 例如 通过口服、 静脉内 ( 水溶的 )、 肌肉内、 皮下、 鼻内、 真皮内或栓剂途径或灌输 ( 例如施用缓慢 释放分子通过腹腔进入的途径或通过使用体外敏感的细胞 ( 如单核细胞或树突状细胞 ) 并 转移给接收者 )。 依赖于施用途径， 所述 FVIII 蛋白或所述修饰的 FVIII 多肽可能需要被包 被到材料中以防御酶、 酸和其它使所述成分失活的天然条件的作用。
     适合于注射用途的药物形式包括无菌的水溶液 ( 水溶的 ) 或分散剂， 以及用于临 时制备无菌注射溶液或分散剂的无菌粉末。 在所有情况下， 所述形式必须是无菌的， 并且必 须是流动的以易于注射。必须在制备和储存条件下 稳定， 并且必须不受微生物 ( 例如细菌 和真菌 ) 污染作用的影响。载体可以是溶剂或分散的培养基， 该培养基还有例如水、 乙醇、 多羟基化合物 ( 例如丙三醇、 丙二醇和液体聚乙二醇等等 )， 合适的它们的混合物以及植物 油。可以维持适当的流动性， 例如通过使用包被 ( 例如卵磷脂 )、 在分散剂的情况下通过维 持所需的粒径以及通过使用表面活性剂 (superfactants)。可以通过多种抗细菌和抗真菌 试剂 ( 例如氯丁醇 (chlorobutanol)、 苯酚、 山梨酸、 theomersal 等等 ) 来防御微生物的作 用。在许多情况下， 优选包括等渗试剂， 例如糖类或氯化钠。可以通过使用延长吸收的试剂 组合物 ( 例如单硬脂酸镁和明胶 ) 以延长所述可注射的组合物的吸收。
     对于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况， 优选的制备方法是真空干燥和 冷冻干燥技术， 以产生活性组分的粉末， 其中在先前无菌过滤的溶液中添加任意额外的所 需成分。
     当所述肽被如上所述合适地保护时， 所述活性化合物可以例如与惰性稀释液或与 可吸收的食用载体一起通过口服施用， 或者可以制成硬壳或软壳胶囊， 或者可以压成片剂， 或者可以直接与日常食物混合。
     对于口服治疗性施用， 所述活性化合物可以与赋形剂混合并以可吸收的片剂、 口 腔片剂、 锭剂 (troches)、 胶囊、 西也剂 (elixirs)、 悬浮剂、 糖浆、 缓释剂 (wafers) 的形式使 用。
     所 述 片 剂、 丸 剂、 胶囊等还可以包括如下成分： 粘 合 剂， 例如黄蓍胶 (gumtragacanth)、 阿拉伯树胶、 玉米淀粉或明胶 ； 赋形剂， 例如磷酸二钙 ； 分解剂， 例如玉 米淀粉、 马铃薯淀粉、 褐藻酸等等 ； 润滑剂， 例如硬脂酸镁 ； 以及可以加入甜味剂， 例如蔗 糖、 乳糖或糖精 ； 或加入调味剂， 例如薄荷油、 冬青油或樱桃调味剂。 当剂量单位形式为胶囊 时， 除上述类型以外， 可以含有液体载体。 多种其它材料可以作为包被存在或另外修饰所述 剂量单位的外观形式。例如， 片剂、 丸剂或胶囊可以用虫胶、 糖类或两者来包被。糖浆或西 也剂可以包含所述活性化合物、 作为甜味剂的蔗糖、 作为防腐剂的甲基对羟基苯甲酸酯和 丙基对羟基苯甲酸酯、 染料和调味剂 ( 例如樱桃或桔子香料 )。当然， 用于制备任意剂量单 位形式的任意材料应当是在所使用的量下具有药用纯度的和基本无毒的。另外， 所述活性 化合物可以与持续释放的制剂混合。
     此处所用 “药用可接受的载体和 / 或稀释剂” 包括任意和所有溶剂、 分散介质、 抗 细菌和抗真菌包被、 等渗试剂和延缓吸收的试剂等等。对于药用活性物质的此类介质和试 剂的使用是本领域内众所周知的。除了与活性成分不相容的任意常规介质或试剂以外， 可 以预期在所述治疗组合物中使用介质或试剂。所述组合物种还可以混合辅助活性成分。
     为了易于施用和剂量均匀， 制备剂量单位形式的经肠胃外组合物尤其有利。此处所用剂量单位形式指适合用于被治疗的哺乳动物受试者的单一剂量的物理上分离的单位 ； 每个单位包括预定量的活性材料和所需的药用载体， 所述活性材料的量是计算出的能够产 生所希望的治疗效果的量。本发明的剂量单位形式的规格直接取决于 (a) 所述活性材料的 独特特性和要实现的特定治疗效果， 以及 (b) 本领域内配制在活受试者 ( 具有身体健康被 削弱的疾病情况 ) 中用于治疗疾病的此类活性材料的内在限制。
     为了方便和有效的施用， 在剂量单位形式中将有效量的主要的活性成分与合适的 药用可接受的载体混合。
     如果组合物的施用可以被受体动物所耐受， 则该组合物被称为 “药用或生理上可 接受的” ， 并适合于施用给该动物。如果施用的量是生理学上有意义的， 那么此类试剂被称 为以 “药用有效量” 施用。如果试剂的存在导致接受的患者在生理上发生可检测的改变， 则 该试剂是生理学上有意义的。
     在特定实施方式中， 哺乳动物细胞培养是表达外源 DNA 以产生本发明中公开的功 能性人 FVIII 衍生物的方法。特别地， 通常用于产生重组蛋白质 的哺乳动物细胞有例如中 国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞系、 幼年仓鼠肾 (BHK) 细胞系、 COS 细胞系、 HKB11( 肾细胞和 B 细胞 的混合细胞 ； ATCC#CRL-12568)、 COS-1(ATCC CRL 1650) 和马丁达比 (Madin Darby) 犬肾 (MDCK) 细胞系。此类细胞的表达载体通常包括 ( 如需要 ) 一个或多个复制起始位点、 位于 要表达的基因之前的启动子、 以及任意需要的核糖体结合位点、 RNA 剪接位点、 多腺苷酸化 位点和转录终止序列。
     为了用于哺乳动物细胞， 可以通过病毒材料在所述表达载体上提供调节功能。例 如通常使用的启动子衍生自延伸因子 -1(EF-1)、 猿病毒 40(SV40)(15)、 巨细胞病毒 (CMV) (16) 和来自腺病毒 2 的主要晚期启动子 (17)。此外， 还可能以及通常预期的是利用通常连 接于预期基因序列的启动子或调节序列， 只要此类调节序列适合于宿主细胞系统。
     细胞启动子包括小鼠基因启动子 (IS)、 小鼠 VH 启动子 (19) 和小鼠金属硫蛋白启 动子 (20)。 表达载体还可以包括位于启动子下游和 FVIII 序列本身的插入位点上游的一套 RNA 剪接位点。优选的 RNA 剪接位点可以获自腺病毒和 / 或免疫球蛋白基因。表达载体还 可以包括位于 FVIII cDNA 序列的一套 RNA 剪接位点。所述表达载体还可以包括位于插入 位点下游的多腺苷酸化信号。特别优选的多腺苷酸信号包括来自 SV40 的早期或晚期多腺 苷酸化信号 (Kaufman and Sharp， ibid.)、 来自腺病毒 5Elb 区域的多腺苷酸化信号或人生 长激素基因终止子 (21)。 所述表达载体还可以包括位于所述启动子和所述 RNA 剪接位点之 间的非编码的病毒前导序列， 例如腺病毒 2 三重前导序列 ； 以及增强子序列， 例如 SV40 增强 子。
     根据本发明产生的修饰的 FVIII 可以通过在抗 FVIII 抗体柱上进行亲和色谱法 而纯化。可以通过常规的化学纯化方法进行额外的纯化， 例如高效液相色谱法 (HPLC)。其 它纯化方法是本领域内公知的， 包括柠檬酸钡沉淀法， 并且可以用于纯化所述新的修饰的 FVIII。基本纯化的修饰的 FVIII 可以用 于制药用途。一旦被部分纯化或按预期同质化， 所述修饰的 FVIII 即可以用于制药。
     此处所用的 I2144-T2161 肽是 SEQ ID NO ： 9 所示的合成的肽。该肽是非甘露糖基化 的， 因此， 甘露糖不影响该肽通过抗原呈递细胞 (APC)( 如树突状细胞 (DCs)) 受体介导的内 吞作用。此处所用 D9E9 细胞是由 Marc Jacquemin 开发的人 FVIII 特异性 CD4+T 细胞克隆 ( 参考 Jacquemin， Blood 2003)。当这些细胞与抗原呈递细胞共同培养时产生 IFN-γ， 所 2144 2161 述抗原呈递细胞先前内吞了 FVIII 或 FVIII 衍生的肽 I -T 。
     此处所用 LE2E9 细胞是由 Marc Jacquemin 开发的人 FVIII 特异性 B 细胞克隆 ( 参考 Peerlinck， Blood 1999)。这些细胞产生识别 FVIII 的 C1 结构域的人 FVIII 特异性 IgG4。
     此处所用的 BO2C11 细胞是由 Marc Jacquemin 开发的人 FVIII 特异性 B 细胞克隆 ( 参考 Jacquemin， Blood 1998)。这些细胞产生识别 FVIII 的 C2 结构域的人 FVIII 特异性 IgG4。
     此处所用的 CTLD4-7Fc 分子为包括鼠巨噬细胞甘露糖受体 (CD206) 的 4-7 结构域 的嵌合结构。 所述 CTLD4-7Fc 分子由 Luisa Martinez-Pomares 产生 (Linehan 2001 Eur J Immunol)。
     此处所用的树突状细胞 (DC) 是专门的抗原呈递细胞， 其特征为具有多种特异性 的表面标记 (CD1a、 CD11c、 HLA-DR、 CD80、 CD86、 CD83、 CD40 等 ) 和功能 ( 抗原的内吞、 将抗 原呈递到 T 淋巴细胞 )。
     此处所用抗 CD206PAM-1 抗体为针对所述人巨噬细胞甘露糖受体 (CD206) 的特 异 性 抗 体。 该 抗 体 由 P.Allavena 产 生 ( 细 胞 免 疫 学 实 验 室 Laboratory of Cellular Immunology， Institute Mario Negri， Milan， Italy)。
     以下序列相应于 SEQ ID No ： 1 所示的氨基酸序列， 即相应于含有 19 个氨基酸的信 号肽的天然全长人因子 VIII 的氨基酸序列 ：
     MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTD
     HLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKV FPG
     GSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFD EGK
     SWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLV RNH
     RQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDS EMD
     VVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRF MAY
     TDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPI LPG
     EIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSV FDE
     NRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFF SGY
     TFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISA YLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGL DLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKV SNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLM ESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSV ILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLP RWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTN LHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRS STNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELE IVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIY VLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENT KPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATES TPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAK TERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAV WDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQ PYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIG VCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDT LVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIG HAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAP HGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHP SIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKE20SLS
     SST
     NSQ
     WQN
     ESA
     LDN
     LND
     KRI
     LTR
     VLP
     SAK
     QGR
     ERL
     ASR
     PLL
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     THY
     CN 101970481 A说明书17/37 页WLQ
     VDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYL RIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
     以下序列相应于 SEQ ID No ： 2 所示的氨基酸序列， 即相应于不含 19 个氨基酸的信 号肽的全长人因子 VIII 的氨基酸序列 ：
     ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWM GLLGPT
     IQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKEN GPMASD
     PLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQD RDAASA
     RAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFL TAQTLL
     MDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFI QIRSVA
     KKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQH ESGILG
     PLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVED GPTKSD
     PRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRF LPNPAG
     VQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLT LFPFSG
     ETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQ NSRHPS
     TRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDD PSPGAI
     DSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNL AAGTDN
     TSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTES GRLFKG
     KRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTP LIHDRM
     LMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLN SGQGPS
     PKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKI QEEIEK
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     KKGEEE
     NLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNM TLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAA SGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVEL YQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDN PKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLK TRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLR SVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEE EPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGR FALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYL ENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSN GMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFS FIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGC MPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVT LLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALKHLTPS
     SYRKKD
     LPKVHI
     HYGTQI
     RHQREI
     NRAQSG
     DQRQGA
     QVTVQE
     LSMGSN
     KCQTPL
     SLYISQ
     DLNSCS
     TQGVKS
     RMEVLG CEAQDLY
     以下序列相应于 SEQ ID No ： 3 所示的核酸序列， 即相应于编码人 BDD- 因子 VIII 的核酸序列 ：
     GCCACCAGAAGATACTACCTGGGTGCAGTGGAACTGTCATGGGACTATATGCAAAGTGATCTCGGTGAG CTGCCTGTGGACGC
     AAGATTTCCTCCTAGAGTGCCAAAATCTTTTCCATTCAACACCTCAGTCGTGTACAAAAAGACTCTGTT TGTAGAATTCACGG
     TTCACCTTTTCAACATCGCTAAGCCAAGGCCACCCTGGATGGGTCTGCTAGGTCCTACCATCCAGGCTG AGGTTTATGATACA
     GTGGTCATTACACTTAAGAACATGGCTTCCCATCCTGTCAGTCTTCATGCTGTTGGTGTATCCTACTGG
     AAAGCTTCTGAGGG
     AGCTGAATATGATGATCAGACCAGTCAAAGGGAGAAAGAAGATGATAAAGTCTTCCCTGGTGGAAGCCA TACATATGTCTGGC
     AGGTCCTGAAAGAGAATGGTCCAATGGCCTCTGACCCACTGTGCCTTACCTACTCATATCTTTCTCATG TGGACCTGGTAAAA
     GACTTGAATTCAGGCCTCATTGGAGCCCTACTAGTATGTAGAGAAGGGAGTCTGGCCAAGGAAAAGACA CAGACCTTGCACAA
     ATTTATACTACTTTTTGCTGTATTTGATGAAGGGAAAAGTTGGCACTCAGAAACAAAGAACTCCTTGAT GCAGGATAGGGATG
     CTGCATCTGCTCGGGCCTGGCCTAAAATGCACACAGTCAATGGTTATGTAAACAGGTCTCTGCCAGGTC TGATTGGATGCCAC
     AGGAAATCAGTCTATTGGCATGTGATTGGAATGGGCACCACTCCTGAAGTGCACTCAATATTCCTCGAA GGTCACACATTTCT
     TGTGAGGAACCATCGCCAGGCGTCCTTGGAAATCTCGCCAATAACTTTCCTTACTGCTCAAACACTCTT GATGGACCTTGGAC
     AGTTTCTACTGTTTTGTCATATCTCTTCCCACCAACATGATGGCATGGAAGCTTATGTCAAAGTAGACA GCTGTCCAGAGGAA
     CCCCAACTACGAATGAAAAATAATGAAGAAGCGGAAGACTATGATGATGATCTTACTGATTCTGAAATG GATGTGGTCAGGTT
     TGATGATGACAACTCTCCTTCCTTTATCCAAATTCGCTCAGTTGCCAAGAAGCATCCTAAAACTTGGGT ACATTACATTGCTG
     CTGAAGAGGAGGACTGGGACTATGCTCCCTTAGTCCTCGCCCCCGATGACAGAAGTTATAAAAGTCAAT ATTTGAACAATGGC
     CCTCAGCGGATTGGTAGGAAGTACAAAAAAGTCCGATTTATGGCATACACAGATGAAACCTTTAAGACT CGTGAAGCTATTCA
     GCATGAATCAGGAATCTTGGGACCTTTACTTTATGGGGAAGTTGGAGACACACTGTTGATTATATTTAA GAATCAAGCAAGCA
     GACCATATAACATCTACCCTCACGGAATCACTGATGTCCGTCCTTTGTATTCAAGGAGATTACCAAAAG GTGTAAAACATTTG
     AAGGATTTTCCAATTCTGCCAGGAGAAATATTCAAATATAAATGGACAGTGACTGTAGAAGATGGGCCA ACTAAATCAGATCC
     TCGGTGCCTGACCCGCTATTACTCTAGTTTCGTTAATATGGAGAGAGATCTAGCTTCAGGACTCATTGG CCCTCTCCTCATCT
     GCTACAAAGAATCTGTAGATCAAAGAGGAAACCAGATAATGTCAGACAAGAGGAATGTCATCCTGTTTT CTGTATTTGATGAG
     AACCGAAGCTGGTACCTCACAGAGAATATACAACGCTTTCTCCCCAATCCAGCTGGAGTGCAGCTTGAG GATCCAGAGTTCCA
     AGCCTCCAACATCATGCACAGCATCAATGGCTATGTTTTTGATAGTTTGCAGTTGTCAGTTTGTTTGCA TGAGGTGGCATACTGGTACATTCTAAGCATTGGAGCACAGACTGACTTCCTTTCTGTCTTCTTCTCTGGATATACCTTCAAAC ACAAAATGGTCTAT
     GAAGACACACTCACCCTATTCCCATTCTCAGGAGAAACTGTCTTCATGTCGATGGAAAACCCAGGTCTA TGGATTCTGGGGTG
     CCACAACTCAGACTTTCGGAACAGAGGCATGACCGCCTTACTGAAGGTTTCTAGTTGTGACAAGAACAC TGGTGATTATTACG
     AGGACAGTTATGAAGATATTTCAGCATACTTGCTGAGTAAAAACAATGCCATTGAACCAAGAGAAATAA CTCGTACTACTCTT
     CAGTCAGATCAAGAGGAAATTGACTATGATGATACCATATCAGTTGAAATGAAGAAGGAAGATTTTGAC ATTTATGATGAGGA
     TGAAAATCAGAGCCCCCGCAGCTTTCAAAAGAAAACACGACACTATTTTATTGCTGCAGTGGAGAGGCT CTGGGATTATGGGA
     TGAGTAGCTCCCCACATGTTCTAAGAAACAGGGCTCAGAGTGGCAGTGTCCCTCAGTTCAAGAAAGTTG TTTTCCAGGAATTT
     ACTGATGGCTCCTTTACTCAGCCCTTATACCGTGGAGAACTAAATGAACATTTGGGACTCCTGGGGCCA TATATAAGAGCAGA
     AGTTGAAGATAATATCATGGTAACTTTCAGAAATCAGGCCTCTCGTCCCTATTCCTTCTATTCTAGCCT TATTTCTTATGAGG
     AAGATCAGAGGCAAGGAGCAGAACCTAGAAAAAACTTTGTCAAGCCTAATGAAACCAAAACTTACTTTT GGAAAGTGCAACAT
     CATATGGCACCCACTAAAGATGAGTTTGACTGCAAAGCCTGGGCTTATTTCTCTGATGTTGACCTGGAA AAAGATGTGCACTC
     AGGCCTGATTGGACCCCTTCTGGTCTGCCACACTAACACACTGAACCCTGCTCATGGGAGACAAGTGAC AGTACAGGAATTTG
     CTCTGTTTTTCACCATCTTTGATGAGACCAAAAGCTGGTACTTCACTGAAAATATGGAAAGAAACTGCA GGGCTCCCTGCAAT
     ATCCAGATGGAAGATCCCACTTTTAAAGAGAATTATCGCTTCCATGCAATCAATGGCTACATAATGGAT ACACTACCTGGCTT
     AGTAATGGCTCAGGATCAAAGGATTCGATGGTATCTGCTCAGCATGGGCAGCAATGAAAACATCCATTC TATTCATTTCAGTG
     GACATGTGTTCACTGTACGAAAAAAAGAGGAGTATAAAATGGCACTGTACAATCTCTATCCAGGTGTTT TTGAGACAGTGGAA
     ATGTTACCATCCAAAGCTGGAATTTGGCGGGTGGAATGCCTTATTGGCGAGCATCTACATGCTGGGATG AGCACACTTTTTCT
     GGTGTACAGCAATAAGTGTCAGACTCCCCTGGGAATGGCTTCTGGACACATTAGAGATTTTCAGATTAC AGCTTCAGGACAAT
     ATGGACAGTGGGCCCCAAAGCTGGCCAGACTTCATTATTCCGGATCAATCAATGCCTGGAGCACCAAGG AGCCCTTTTCTTGG
     ATCAAGGTGGATCTGTTGGCACCAATGATTATTCACGGCATCAAGACCCAGGGTGCCCGTCAGAAGTTCTCCAGCCTCTACAT
     CTCTCAGTTTATCATCATGTATAGTCTTGATGGGAAGAAGTGGCAGACTTATCGAGGAAATTCCACTGG AACCTTAATGGTCT
     TCTTTGGCAATGTGGATTCATCTGGGATAAAACACAATATTTTTAACCCTCCAATTATTGCTCGATACA TCCGTTTGCACCCA
     ACTCATTATAGCATTCGCAGCACTCTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGTGATTTAAATAGTTGCAGCATG CCATTGGGAATGGA
     GAGTAAAGCAATATCAGATGCACAGATTACTGCTTCATCCTACTTTACCAATATGTTTGCCACCTGGTC TCCTTCAAAAGCTC
     GACTTCACCTCCAAGGGAGGAGTAATGCCTGGAGACCTCAGGTGAATAATCCAAAAGAGTGGCTGCAAG TGGACTTCCAGAAG
     ACAATGAAAGTCACAGGAGTAACTACTCAGGGAGTAAAATCTCTGCTTACCAGCATGTATGTGAAGGAG TTCCTCATCTCCAG
     CAGTCAAGATGGCCATCAGTGGACTCTCTTTTTTCAGAATGGCAAAGTAAAGGTTTTTCAGGGAAATCA AGACTCCTTCACAC
     CTGTGGTGAACTCTCTAGACCCACCGTTACTGACTCGCTACCTTCGAATTCACCCCCAGAGTTGGGTGC ACCAGATTGCCCTG
     AGGATGGAGGTTCTGGGCTGCGAGGCACAGGACCTCTACTGA
     以下序列相应于 SEQ ID No ： 4 所示的氨基酸序列， 即相应于人 BDD- 因子 VIII 的 氨基酸序列 ：
     ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTVHLFNIAKPRPPWM GLLGPTIQAEVYDT
     VVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPL CLTYSYLSHVDLVK
     DLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVN GYVNRSLPGLIGCH
     RKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHD GMEAYVKVDSCPEE
     PQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLA PDDRSYKSQYLNNG
     FQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVR PLYSRRLPKGVKHL
     KDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIM SDKRNVILFSVFDE
     NRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLS VFFSGYTFKHKMVY
     EDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSK NNAIEPREITRTTL
     QSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEF
     TDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFV KPNETKTYFWKVQH
     HMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWY FTENMERNCRAPCN
     IQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKM ALYNLYPGVFETVE
     MLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYS GSINAWSTKEPFSW
     IKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNI FNPPIIARYIRLHP
     THYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQ VNNPKEWLQVDFQK
     TMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRY LRIHPQSWVHQIAL
     RMEVLGCEAQDLY
     以 下 序 列 相 应 于 SEQ ID No ： 5 所 示 的 核 酸 序 列， 即相应于编码含有突变 Asn239Ala 的人因子 VIII 的重链的核酸序列 ：
     GCCACCAGAAGATACTACCTGGGTGCAGTGGAACTGTCATGGGACTATATGCAAAGTGATCTCGGTGAG CTGCCTGTGGACGC
     AAGATTTCCTCCTAGAGTGCCAAAATCTTTTCCATTCAACACCTCAGTCGTGTACAAAAAGACTCTGTT TGTAGAATTCACGG
     TTCACCTTTTCAACATCGCTAAGCCAAGGCCACCCTGGATGGGTCTGCTAGGTCCTACCATCCAGGCTG AGGTTTATGATACA
     GTGGTCATTACACTTAAGAACATGGCTTCCCATCCTGTCAGTCTTCATGCTGTTGGTGTATCCTACTGG AAAGCTTCTGAGGG
     AGCTGAATATGATGATCAGACCAGTCAAAGGGAGAAAGAAGATGATAAAGTCTTCCCTGGTGGAAGCCA TACATATGTCTGGC
     AGGTCCTGAAAGAGAATGGTCCAATGGCCTCTGACCCACTGTGCCTTACCTACTCATATCTTTCTCATG TGGACCTGGTAAAA
     GACTTGAATTCAGGCCTCATTGGAGCCCTACTAGTATGTAGAGAAGGGAGTCTGGCCAAGGAAAAGACA CAGACCTTGCACAA
     ATTTATACTACTTTTTGCTGTATTTGATGAAGGGAAAAGTTGGCACTCAGAAACAAAGAACTCCTTGAT GCAGGATAGGGATG
     CTGCATCTGCTCGGGCCTGGCCTAAAATGCACACAGTCAATGGTTATGTAGCCAGGTCTCTGCCAGGTC TGATTGGATGCCAC
     AGGAAATCAGTCTATTGGCATGTGATTGGAATGGGCACCACTCCTGAAGTGCACTCAATATTCCTCGAA GGTCACACATTTCT
     TGTGAGGAACCATCGCCAGGCGTCCTTGGAAATCTCGCCAATAACTTTCCTTACTGCTCAAACACTCTTGATGGACCTTGGAC
     AGTTTCTACTGTTTTGTCATATCTCTTCCCACCAACATGATGGCATGGAAGCTTATGTCAAAGTAGACA GCTGTCCAGAGGAA
     CCCCAACTACGAATGAAAAATAATGAAGAAGCGGAAGACTATGATGATGATCTTACTGATTCTGAAATG GATGTGGTCAGGTT
     TGATGATGACAACTCTCCTTCCTTTATCCAAATTCGCTCAGTTGCCAAGAAGCATCCTAAAACTTGGGT ACATTACATTGCTG
     CTGAAGAGGAGGACTGGGACTATGCTCCCTTAGTCCTCGCCCCCGATGACAGAAGTTATAAAAGTCAAT ATTTGAACAATGGC
     CCTCAGCGGATTGGTAGGAAGTACAAAAAAGTCCGATTTATGGCATACACAGATGAAACCTTTAAGACT CGTGAAGCTATTCA
     GCATGAATCAGGAATCTTGGGACCTTTACTTTATGGGGAAGTTGGAGACACACTGTTGATTATATTTAA GAATCAAGCAAGCA
     GACCATATAACATCTACCCTCACGGAATCACTGATGTCCGTCCTTTGTATTCAAGGAGATTACCAAAAG GTGTAAAACATTTG AAGGATTTTCCAATTCTGCCAGGAGAAATATTCAAATATAAATGGACAGTGACTGTAGAAGATGGGCCA ACTAAATCAGATCC
     TCGGTGCCTGACCCGCTATTACTCTAGTTTCGTTAATATGGAGAGAGATCTAGCTTCAGGACTCATTGG CCCTCTCCTCATCT
     GCTACAAAGAATCTGTAGATCAAAGAGGAAACCAGATAATGTCAGACAAGAGGAATGTCATCCTGTTTT CTGTATTTGATGAG
     AACCGAAGCTGGTACCTCACAGAGAATATACAACGCTTTCTCCCCAATCCAGCTGGAGTGCAGCTTGAG GATCCAGAGTTCCA
     AGCCTCCAACATCATGCACAGCATCAATGGCTATGTTTTTGATAGTTTGCAGTTGTCAGTTTGTTTGCA TGAGGTGGCATACT
     GGTACATTCTAAGCATTGGAGCACAGACTGACTTCCTTTCTGTCTTCTTCTCTGGATATACCTTCAAAC ACAAAATGGTCTAT
     GAAGACACACTCACCCTATTCCCATTCTCAGGAGAAACTGTCTTCATGTCGATGGAAAACCCAGGTCTA TGGATTCTGGGGTG
     CCACAACTCAGACTTTCGGAACAGAGGCATGACCGCCTTACTGAAGGTTTCTAGTTGTGACAAGAACAC TGGTGATTATTACG
     AGGACAGTTATGAAGATATTTCAGCATACTTGCTGAGTAAAAACAATGCCATTGAACCAAGA
     以下序列相应于 SEQ ID No ： 6 所示的氨基酸序列， 即相应于含有突变 Asn239Ala 的人因子 VIII 的重链的氨基酸序列 ：
     ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTVHLFNIAKPRPPWM GLLGPTIQAEVYDT
     VVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPL CLTYSYLSHVDLVK
     DLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVN
     GYVARSLPGLIGCH
     RKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHD GMEAYVKVDSCPEE
     PQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLA PDDRSYKSQYLNNG
     PQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVR PLYSRRLPKGVKHL
     KDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIM SDKRNVILFSVFDE
     NRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLS VFFSGYTFKHKMVY
     EDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSK NNAIEPR
     以 下 序 列 相 应 于 SEQ ID No ： 7 所 示 的 核 酸 序 列， 即相应于编码含有突变 Asn2118Ala 的人因子 VIII 的轻链的核酸序列 ：
     AGCTTTCAAAAGAAAACACGACACTATTTTATTGCTGCAGTGGAGAGGCTCTGGGATTATGGGATGAGT AGCTCCCCACATGT
     TCTAAGAAACAGGGCTCAGAGTGGCAGTGTCCCTCAGTTCAAGAAAGTTGTTTTCCAGGAATTTACTGA TGGCTCCTTTACTC
     AGCCCTTATACCGTGGAGAACTAAATGAACATTTGGGACTCCTGGGGCCATATATAAGAGCAGAAGTTG AAGATAATATCATG
     GTAACTTTCAGAAATCAGGCCTCTCGTCCCTATTCCTTCTATTCTAGCCTTATTTCTTATGAGGAAGAT CAGAGGCAAGGAGC
     AGAACCTAGAAAAAACTTTGTCAAGCCTAATGAAACCAAAACTTACTTTTGGAAAGTGCAACATCATAT GGCACCCACTAAAG
     ATGAGTTTGACTGCAAAGCCTGGGCTTATTTCTCTGATGTTGACCTGGAAAAAGATGTGCACTCAGGCC TGATTGGACCCCTT
     CTGGTCTGCCACACTAACACACTGAACCCTGCTCATGGGAGACAAGTGACAGTACAGGAATTTGCTCTG TTTTTCACCATCTT
     TGATGAGACCAAAAGCTGGTACTTCACTGAAAATATGGAAAGAAACTGCAGGGCTCCCTGCAATATCCA GATGGAAGATCCCA
     CTTTTAAAGAGAATTATCGCTTCCATGCAATCAATGGCTACATAATGGATACACTACCTGGCTTAGTAA TGGCTCAGGATCAA
     AGGATTCGATGGTATCTGCTCAGCATGGGCAGCAATGAAAACATCCATTCTATTCATTTCAGTGGACAT GTGTTCACTGTACG
     AAAAAAAGAGGAGTATAAAATGGCACTGTACAATCTCTATCCAGGTGTTTTTGAGACAGTGGAAATGTT ACCATCCAAAGCTG
     GAATTTGGCGGGTGGAATGCCTTATTGGCGAGCATCTACATGCTGGGATGAGCACACTTTTTCTGGTGT ACAGCAATAAGTGTCAGACTCCCCTGGGAATGGCTTCTGGACACATTAGAGATTTTCAGATTACAGCTTCAGGACAATATGGA CAGTGGGCCCCAAA
     GCTGGCCAGACTTCATTATTCCGGATCAATCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTTTCTTGGATCAA GGTGGATCTGTTGG
     CACCAATGATTATTCACGGCATCAAGACCCAGGGTGCCCGTCAGAAGTTCTCCAGCCTCTACATCTCTC AGTTTATCATCATG
     TATAGTCTTGATGGGAAGAAGTGGCAGACTTATCGAGGAGCCTCCACTGGAACCTTAATGGTCTTCTTT GGCAATGTGGATTC
     ATCTGGGATAAAACACAATATTTTTAACCCTCCAATTATTGCTCGATACATCCGTTTGCACCCAACTCA TTATAGCATTCGCA
     GCACTCTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGTGATTTAAATAGTTGCAGCATGCCATTGGGAATGGAGAGTA AAGCAATATCAGAT
     GCACAGATTACTGCTTCATCCTACTTTACCAATATGTTTGCCACCTGGTCTCCTTCAAAAGCTCGACTT CACCTCCAAGGGAG
     GAGTAATGCCTGGAGACCTCAGGTGAATAATCCAAAAGAGTGGCTGCAAGTGGACTTCCAGAAGACAAT GAAAGTCACAGGAG
     TAACTACTCAGGGAGTAAAATCTCTGCTTACCAGCATGTATGTGAAGGAGTTCCTCATCTCCAGCAGTC AAGATGGCCATCAG
     TGGACTCTCTTTTTTCAGAATGGCAAAGTAAAGGTTTTTCAGGGAAATCAAGACTCCTTCACACCTGTG GTGAACTCTCTAGA
     CCCACCGTTACTGACTCGCTACCTTCGAATTCACCCCCAGAGTTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGGAT GGAGGTTCTGGGCT
     GCGAGGCACAGGACCTCTACTGA
     以下序列相应于 SEQ ID No ： 8 所示的氨基酸序列， 即相应于含有突变 Asn2118Ala 的人因子 VIII 的轻链的氨基酸序列 ：
     SFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGL LGPYIRAEVEDNIM
     VTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDV DLEKDVHSGLIGPL
     LVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGY IMDTLPGLVMAQDQ
     RIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLH AGMSTLFLVYSNKC
     QTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGAR QKFSSLYISQFIIM
     YSLDGKKWQTYRGASTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNS CSMPLGMESKAISD
     AQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMY VKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
     以下序列相应于 SEQ ID No ： 9 所示的氨基酸序列， 即相应于 I2144-T2161 多肽的氨基 酸序列 ：
     HARYIRLHPTHYSIRST
     以下序列相应于 SEQ ID No ： 10 所示的氨基酸序列， 即相应于全长人因子 VIII 的 B 结构域的氨基酸序列 ：
     SFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQ EAKYET
     FSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNN LISTIP
     SDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESS WGKNVS
     STESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILE SDTEFK
     KVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWI QRTHGK
     NSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHE NNTHNQ
     EKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTN RTKKHT
     AHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKR
     以 下 序 列 相 应 于 SEQ ID No ： 11 所 示 的 核 酸 序 列， 即相应于编码含有突变 Asn239Gln 的人因子 VIII 的重链的核酸序列 ：
     GCCACCAGAAGATACTACCTGGGTGCAGTGGAACTGTCATGGGACTATATGCAAAGTGATCTCGGTGAG CTGCCTGTGGACGC
     AAGATTTCCTCCTAGAGTGCCAAAATCTTTTCCATTCAACACCTCAGTCGTGTACAAAAAGACTCTGTT TGTAGAATTCACGG
     TTCACCTTTTCAACATCGCTAAGCCAAGGCCACCCTGGATGGGTCTGCTAGGTCCTACCATCCAGGCTG AGGTTTATGATACA
     GTGGTCATTACACTTAAGAACATGGCTTCCCATCCTGTCAGTCTTCATGCTGTTGGTGTATCCTACTGG AAAGCTTCTGAGGG
     AGCTGAATATGATGATCAGACCAGTCAAAGGGAGAAAGAAGATGATAAAGTCTTCCCTGGTGGAAGCCA TACATATGTCTGGC
     AGGTCCTGAAAGAGAATGGTCCAATGGCCTCTGACCCACTGTGCCTTACCTACTCATATCTTTCTCATG TGGACCTGGTAAAA
     GACTTGAATTCAGGCCTCATTGGAGCCCTACTAGTATGTAGAGAAGGGAGTCTGGCCAAGGAAAAGACA CAGACCTTGCACAA
     ATTTATACTACTTTTTGCTGTATTTGATGAAGGGAAAAGTTGGCACTCAGAAACAAAGAACTCCTTGAT GCAGGATAGGGATGCTGCATCTGCTCGGGCCTGGCCTAAAATGCACACAGTCAATGGTTATGTACAGAGGTCTCTGCCAGGTC TGATTGGATGCCAC
     AGGAAATCAGTCTATTGGCATGTGATTGGAATGGGCACCACTCCTGAAGTGCACTCAATATTCCTCGAA GGTCACACATTTCT
     TGTGAGGAACCATCGCCAGGCGTCCTTGGAAATCTCGCCAATAACTTTCCTTACTGCTCAAACACTCTT GATGGACCTTGGAC
     AGTTTCTACTGTTTTGTCATATCTCTTCCCACCAACATGATGGCATGGAAGCTTATGTCAAAGTAGACA GCTGTCCAGAGGAA
     CCCCAACTACGAATGAAAAATAATGAAGAAGCGGAAGACTATGATGATGATCTTACTGATTCTGAAATG GATGTGGTCAGGTT
     TGATGATGACAACTCTCCTTCCTTTATCCAAATTCGCTCAGTTGCCAAGAAGCATCCTAAAACTTGGGT ACATTACATTGCTG
     CTGAAGAGGAGGACTGGGACTATGCTCCCTTAGTCCTCGCCCCCGATGACAGAAGTTATAAAAGTCAAT ATTTGAACAATGGC
     CCTCAGCGGATTGGTAGGAAGTACAAAAAAGTCCGATTTATGGCATACACAGATGAAACCTTTAAGACT CCTGAAGCTATTCA
     GCATGAATCAGGAATCTTGGGACCTTTACTTTATGGGGAAGTTGGAGACACACTGTTGATTATATTTAA GAATCAAGCAAGCA
     GACCATATAACATCTACCCTCACGGAATCACTGATGTCCGTCCTTTGTATTCAAGGAGATTACCAAAAG GTGTAAAACATTTG
     AAGGATTTTCCAATTCTGCCAGGAGAAATATTCAAATATAAATGGACAGTGACTGTAGAAGATGGGCCA ACTAAATCAGATCC
     TCGGTGCCTGACCCGCTATTACTCTAGTTTCGTTAATATGGAGAGAGATCTAGCTTCAGGACTCATTGG CCCTCTCCTCATCT
     GCTACAAAGAATCTGTAGATCAAAGAGGAAACCAGATAATGTCAGACAAGAGGAATGTCATCCTGTTTT CTGTATTTGATGAG
     AACCGAAGCTGGTACCTCACAGAGAATATACAACGCTTTCTCCCCAATCCAGCTGGAGTGCAGCTTGAG GATCCAGAGTTCCA
     AGCCTCCAACATCATGCACAGCATCAATGGCTATGTTTTTGATAGTTTGCAGTTGTCAGTTTGTTTGCA TGAGGTGGCATACT
     GGTACATTCTAAGCATTGGAGCACAGACTGACTTCCTTTCTGTCTTCTTCTCTGGATATACCTTCAAAC ACAAAATGGTCTAT
     GAAGACACACTCACCCTATTCCCATTCTCAGGAGAAACTGTCTTCATGTCGATGGAAAACCCAGGTCTA TGGATTCTGGGGTG
     CCACAACTCAGACTTTCGGAACAGAGGCATGACCGCCTTACTGAAGGTTTCTAGTTGTGACAAGAACAC TGGTGATTATTACG
     AGGACAGTTATGAAGATATTTCAGCATACTTGCTGAGTAAAAACAATGCCATTGAACCAAGA
     以下序列相应于 SEQ ID No ： 12 所示的氨基酸序列， 即相应于含有突变 Asn239Gln 的人因子 VIII 的重链的氨基酸序列 ：ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTVHLFNIAKPRPPWM GLLGPTIQAEVYDT
     VVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPL CLTYSYLSHVDLVK
     DLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVN GYVQRSLPGLIGCH
     RKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHD GMEAYVKVDSCPEE
     PQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLA PDDRSYKSQYLNNG
     PQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVR PLYSRRLPKGVKHL
     KDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIM SDKRNVILFSVFDE
     NRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGTVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLS VFFSGYTFKHKMVY
     EDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPR 以 下 序 列 相 应 于 SEQ ID No ： 13 所 示 的 核 酸 序 列， 即相应于编码含有突变 Asn2118Gln 的人因子 VIII 的轻链的核酸序列 ：
     AGCTTTCAAAAGAAAACACGACACTATTTTATTGCTGCAGTGGAGAGGCTCTGGGATTATGGGATGAGT AGCTCCCCACATGT
     TCTAAGAAACAGGGCTCAGAGTGGCAGTGTCCCTCAGTTCAAGAAAGTTGTTTTCCAGGAATTTACTGA TGGCTCCTTTACTC
     AGCCCTTATACCGTGGAGAACTAAATGAACATTTGGGACTCCTGGGGCCATATATAAGAGCAGAAGTTG AAGATAATATCATG
     GTAACTTTCAGAAATCAGGCCTCTCGTCCCTATTCCTTCTATTCTAGCCTTATTTCTTATGAGGAAGAT CAGAGGCAAGGAGC
     AGAACCTAGAAAAAACTTTGTCAAGCCTAATGAAACCAAAACTTACTTTTGGAAAGTGCAACATCATAT GGCACCCACTAAAG
     ATGAGTTTGACTGCAAAGCCTGGGCTTATTTCTCTGATGTTGACCTGGAAAAAGATGTGCACTCAGGCC TGATTGGACCCCTT
     CTGGTCTGCCACACTAACACACTGAACCCTGCTCATGGGAGACAAGTGACAGTACAGGAATTTGCTCTG TTTTTCACCATCTT
     TGATGAGACCAAAAGCTGGTACTTCACTGAAAATATGGAAAGAAACTGCAGGGCTCCCTGCAATATCCA GATGGAAGATCCCA
     CTTTTAAAGAGAATTATCGCTTCCATGCAATCAATGGCTACATAATGGATACACTACCTGGCTTAGTAA TGGCTCAGGATCAA
     AGGATTCGATGGTATCTGCTCAGCATGGGCAGCAATGAAAACATCCATTCTATTCATTTCAGTGGACAT
     GTGTTCACTGTACG
     AAAAAAAGAGGAGTATAAAATGGCACTGTACAATCTCTATCCAGGTGTTTTTGAGACAGTGGAAATGTT ACCATCCAAAGCTG
     GAATTTGGCGGGTGGAATGCCTTATTGGCGAGCATCTACATGCTGGGATGAGCACACTTTTTCTGGTGT ACAGCAATAAGTGT
     CAGACTCCCCTGGGAATGGCTTCTGGACACATTAGAGATTTTCAGATTACAGCTTCAGGACAATATGGA CAGTGGGCCCCAAA
     GCTGGCCAGACTTCATTATTCCGGATCAATCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTTTCTTGGATCAA GGTGGATCTGTTGG
     CACCAATGATTATTCACGGCATCAAGACCCAGGGTGCCCGTCAGAAGTTCTCCAGCCTCTACATCTCTC AGTTTATCATCATG
     TATAGTCTTGATGGGAAGAAGTGGCAGACTTATCGAGGACAGTCCACTGGAACCTTAATGGTCTTCTTT GGCAATGTGGATTC
     ATCTGGGATAAAACACAATATTTTTAACCCTCCAATTATTGCTCGATACATCCGTTTGCACCCAACTCA TTATAGCATTCGCA GCACTCTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGTGATTTAAATAGTTGCAGCATGCCATTGGGAATGGAGAGTA AAGCAATATCAGAT
     GCACAGATTACTGCTTCATCCTACTTTACCAATATGTTTGCCACCTGGTCTCCTTCAAAAGCTCGACTT CACCTCCAAGGGAG
     GAGTAATGCCTGGAGACCTCAGGTGAATAATCCAAAAGAGTGGCTGCAAGTGGACTTCCAGAAGACAAT GAAAGTCACAGGAG
     TAACTACTCAGGGAGTAAAATCTCTGCTTACCAGCATGTATGTGAAGGAGTTCCTCATCTCCAGCAGTC AAGATGGCCATCAG
     TGGACTCTCTTTTTTCAGAATGGCAAAGTAAAGGTTTTTCAGGGAAATCAAGACTCCTTCACACCTGTG GTGAACTCTCTAGA
     CCCACCGTTACTGACTCGCTACCTTCGAATTCACCCCCAGAGTTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGGAT GGAGGTTCTGGGCT
     GCGAGGCACAGGACCTCTACTGA
     以下序列相应于 SEQ ID No ： 14 所示的氨基酸序列， 即相应于含有突变 Asn2118Gln 的人因子 VIII 的轻链的氨基酸序列 ：
     SFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGL LGPYIRAEVEDNIM
     VTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDV DLEKDVHSGLIGPL
     LVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGY IMDTLPGLVMAQDQ
     RIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLH AGMSTLFLVYSNKC
     QTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGAR
     QKFSSLYISQFIIM
     YSLDGKKWQTYRGQSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNS CSMPLGMESKAISD
     AQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMY VKEFLISSSQDGHQ
     WTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
     本发明的范围不预期由此处描述的特定实施方式所限制。事实上， 通过前述说明 书和附图， 除此处描述之外的本发明的多种修饰对于本领域技术人员是显而易见的。此类 修饰包括在所附权利要求的范围内。下述实施例用于解释本发明， 而不是限制本发明。
     实施例
     实施例 1 ： 衍生自单核细胞的人 DCs
     通过在补充 10％人 AB 血清、 谷氨酰胺和抗生素的 RPMI1640 培养基中粘附塑料细 胞培养皿 60 分钟， 而从健康成年供体的肝素化的血沉棕黄层 (buffy coats) 中分离外周血 单核细胞。用培养基温和清洗 3 次以除去未粘附上的细胞。粘附上的单核细胞在补充 1％ 人 AB 血清、 抗生素和存在 500IU/ml 重组人白细胞介素 4(rhIL-4)(R&D Systems(Lille， France)) 和 1000IU/ml 重 组 人 粒 细 胞 - 巨 噬 细 胞 集 落 刺 激 因 子 (rhGM-CSF)(Immuno Tools(Friesoythe， Germany)) 的培养基中培养。每 2 天更换一半的培养基， 包括所有补充 物。培养 5 天以后， 收集未粘附的细胞和松散粘附的细胞 ( 相应于富含 DC 的部分 )， 洗涤并 用于随后的实验。
     实施例 2 ： 人重组全长 FVIII、 B 结构域缺失的人重组 FVIII 与荧光素的结合
     将 人 重 组 全 长 FVIII(1000IU， Kogenate， Bayer)、 B 结构域缺失的重组 人 FVIII(BDD-FVIII， 1000IU， Refacto Wyeth) 溶于水， 并以含有 5mM CaCl2 的碳酸氢钠缓 冲液 (pH9.2) 在 4℃进行透析， 然后与荧光素 -5- 异硫氰酸盐 ( 异构体 I， Sigma-Aldrich， Saint Quentin Fallavier， France) 在 4℃耦联 7-8 小时。 标记的 FVIII 进一步用 RPMI1640 培养基透析， 以除去未偶联的 FITC。 通过布拉德福 (Bradford) 测定法用牛血清白蛋白作为 标准来对 FVIII-FITC 进行定量。
     实施例 3 ： FVIII 内吞方式涉及的受体的性质
     将 DCs 以 5mM EDTA、 甘露聚糖 (1mg/ml) 或半乳糖 (1mg/ml) 在 37℃培养 30 分钟， 然后加入 FVIII-FITC(40μg/ml) 培养 2 小时。在 4℃的内吞作为对照 ( 未显示 )。 结果
     图 1A ： 在 存 在 EDTA 的 情 况 下， FVIII-FITC 的 内 吞 被 抑 制 了 92±16.5 ％ (P ＜ 0.01)。该数据表明在 FVIII 被 DCs 内吞的过程中二价离子依赖的受体的作用。多糖 甘露聚糖 ( 甘露糖敏感性摄入的竞争性配体 ) 使 FVIII-FITC 的摄入减少了 60±19 ％ (P ＜ 0.01)， 而半乳糖 ( 半乳糖敏感性摄入的竞争性配体 ) 没有显著性作用。
     图 1B ： 在我们的实验中， 甘露聚糖对甘露糖敏感性 CLRs 的特异性的确定是通过使 用 FITC 标记的葡聚糖 ( 典型的甘露糖敏感性 CLRs( 尤其是 CD206) 的配体 ) 和萤光黄 (LY)， 萤光黄的内部化仅仅由不依赖于受体的内吞来实现。在存在甘露聚糖时， 葡聚糖的内部化 被阻断了 89±9.3％， 而 IY 则没有影响。
     结论
     结果表明， 甘露糖敏感性受体介导了 FVIII 被 DCs 内吞的有效部分。
     实施例 4 ： DCs 对 FVIII 的甘露糖敏感性摄入导致了向 FVIII 特异性 CD4+T 细胞呈 递 FVIII 衍生的肽
     方法
     图 2A ： 来自 MHC II 匹配的供体的 DCs 在培养基中培养或在存在甘露聚糖 (1mg/ ml) 或 抗 CD206 IgG(10μg/ml) 的 培 养 基 中 培 养， 然 后 在 存 在 多 种 剂 量 的 全 长 FVIII( )(5.56、 2.78 或 1.39μg/ml) 和 20U/ml rhIL-2 的条件下与 FVIII 特异性 T 细 胞克隆 D9E9 在 37℃共同培养 20 小时。通过在培养上清中释放的 IFN-γ 来评估 T 细胞的 激活。
     图 2B ： 来自 MHC II 匹配的供体的 DCs 以甘露聚糖 (1mg/ml) 或抗 CD206IgG(10μg/ ml) 预培养， 然后添加 FVIII(5.56μg/ml) 或 I2144-T2161 肽 (2μg/ml) 和 D9E9。对于各处 理， 以相对于各独立的实验中所获得的最大值来描述 IFN-γ 的产生 (* ： P ＜ 0.0001， 用曼 恩 - 惠特尼检验来评估 )。
     图 1C ： 人 FVIII 特异性 HLA 匹配的 B 细胞系 LE2E9、 BO2C11 或 DCs 单独培养或在 甘露聚糖 (1mg/ml) 存在下培养， 然后与全长 FVIII( 同培养。 结果
     数据共同证实了甘露聚糖对 D9E9 激活的抑制作用， 该抑制作用由 DCs 对 FVIII 的 甘露糖敏感性内吞的阻断所导致。
     实施例 5 ： 位于 B 结构域外部的暴露的甘露糖残基在 DCs 对 FVIII 的内吞以激活 T 细胞的过程中发挥重要作用
     方法
     图 3A ： DCs 以 甘 露 聚 糖 (1、 5、 10、 100 和 1000μg/ml) 预 培 养， 然后添加全长
     )(10μg/ml) 和 D9E9 共FVIII-FITC()(40μg/ml， 143nM， 实心圆圈 ) 和 BDD-FVIII-FITC(24.31μg/ml， 143nM， 空心圆圈 )、 或葡聚糖 -FITC(50μg/ml)。通过流式细胞仪分析抗原的摄入。相 对于无甘露聚糖的条件计算各条件的抑 制百分比。
     图 3B ： 用 7.5％ SDS-PAGE 分离天然的或 EndoF 1 处理的 BDD-FVIII(3.7μg)， 并转 移到硝酸纤维素膜上。转移的蛋白用 Protogold 显示， 或者以 10μg/ml CTLD4-7-Fc 培育并使用碱性磷酸酶偶联的抗人 IgG。 使用轻链 (LCh) 和重链 (HCh) 特异性单克隆抗 FVIII IgGs 进行印迹来鉴定轻链和重链 ( 未显示 )。
     图 3C ： 经 EndoF1 处理的 BDD-FVIII 减少 T 细胞的激活。结果以 3 个独立实验中 的一个具有代表性的实验来表示。
     结果
     数据共同证实了位于 B 结构域外部的末端为甘露糖的多糖涉及 FVIII 的摄入。
     图 3B ： BDD-FVIII 的迁移谱的移动以及不能被 CTLD4-7-FC 识别显示用 EndoF1 处 理除去了寡甘露糖结构。
     图 3C ： 与以天然 BDD-FVIII 培养的 DCs 相比， 以 EndoF1 处理的 BDD-FVIII 培养的 DCs 激活 D9E9 的程度更低 (DC 的情况 P ＜ 0.0001)。BDD-FVIII 的去甘露糖基化不能有效 减少 T 细胞激活， 因为使用甘露聚糖使 DCs 上的甘露糖受体饱和。 EndoF1 处理的 BDD-FVIII残余的激活 D9E9 的能力可以归因于在 FVIII 上剩余的 N- 乙酰基葡糖胺残基， 该残基与甘 露糖敏感性受体具有中等亲和力。
     实施例 6 ： 修饰的 FVIII 轻链 Asn2118Ala 的 T 细胞激活
     方法
     获自 E Saenko(University of Maryland， Baltimore， MD， USA) 的纯化的血浆 衍 生 的 FVIII 轻 链 (wtLCh) 用 Endo-F1 处 理 或 不 处 理。 将 所 述 wtLCh、 甘 露 聚 糖 (1mg/ ml) 存在下的 wtLCh 以及 Endo-F1 处理的 wtLCh 加入到 DCs ( 图 4A) 或 BO2C11( 图 4B) 中， 与 D9E9 共 培 养 20 小 时。 通 过 ELISA 测 量 培 养 上 清 中 的 IFN-γ 来 评 估 D9E9 的 激 活。 图 C 和 D 显 示 LCh-FVIII 的 定 点 诱 变 (Asn2118Ala-LCh-FVIII) 使 D9E9 的 激 活 丧 失。所述 BO2C11 B 细胞克隆和单核细胞衍生的 DCs 在存在野生型 LCh( 图 4C) 或存在突变 Asn2118Ala-LCh-FVIII( 图 4D) 的条件下与 D9E9 一起培养。Asn2118 被 Ala 残基取代除去 了 N 甘露糖基化位点。20 小时后测量培养上清中的 IFN-γ 来评估 D9E9 的激活。
     结果
     图 4A 和 4B ： 首先， 确认 wtLCh 以甘露糖敏感性方式进入单核细胞衍生的 DCs 中 并激活 FVIII 特异性 D9E9T 细胞克隆。在以甘露聚糖培育 wtLCh 的情况和 Endo-F1 处理 wtLCh 的情况下， 由 DCs 引起的 D9E9 激活显著降低 ( 图 4A)。相反， 在甘露聚糖存在下培育 的 wtLCh 或 Endo-F1 处理的 wtLCh 的情况下， 由 BO2C11B 细胞系 ( 通过 FVIII 特异性 B 细 胞受体进行 FVIII 的内吞 ) 引起的 D9E9 激活未改变 ( 图 4B)。这些数据与在完整 FVIII 观 察到的一致， 并证明 FVIII 轻链进入单核细胞衍生的 DCs 主要依赖于甘露糖基化的多糖。
     图 4C 和 4D ： 在 ELISA 中使用特异性针对 FVIII 的 C2 结构域的构象表位的单克隆 人 IgG( 即由 BO2C11 B 细胞克隆产生的 IgG) 来确认正确折叠的 Asn2118Ala-LCh-FVIII。 由 BO2C11 和 DCs 呈递的 wtLCh 激活 D9E9( 图 4C)。相反， 当 Asn2118Ala-LCh-FVIII 激活 D9E9 时， 是被 BO2C11 呈递的， 而不使用 DCs 作为抗原呈递细胞 (APCs)( 图 4D)。
     实施例 7 ： 重组 FVIII 变体的克隆和产生
     步骤 1、 不同 FVIII 变体的克隆
     在本实施例中， 使用编码 BDD-FVIII 的 cDNA( 来自 ATCC， 克隆 pSP64-FVIII)、 重组 的全长 FVIII(Kogenate， Bayer) 或任意修饰的 FVIII 作为 “FVIII” 。
     使 用 Zero PCR 将 所 述 FVIII 亚 克 隆 到 亚 克 隆 载 体 ( 载 体 -Blunt II) 中。用合适的引物进行定位诱变以产生 4 个不同的 FVIII 变体 cDNA ：
     - 野生型序列
     - 单链重链变体 ： 密码子 AAC(Asn239)- ＞密码子 GCC(Ala239)
     - 单链轻链变体 ： 密码子 AAT(Asn2118)- ＞密码子 GCT(Ala2118)
     - 双链变体 ： Asn239Asn2118- ＞ Ala239Ala2118
     插入部分用合适的限制性内切酶消化， 纯化并与 pCDNA3.1(+) 载体 (Invitrogen， Carlsbad， CA， USA) 进行粘末端连接， 以在真核细胞系表达蛋白， 或与 pLIVE 载体 (Minis， Madison， WI， USA) 连接以用于体内的水动力注射 (hydrodynamic injection)。
     步骤 2、 哺乳动物细胞系的瞬时转染
     使用 技术 (Amaxa Biosystems) 将不同的 pCDNA3.1(+)-FVIII变体转染到不同真核细胞系中 ： 中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞、 幼年仓鼠肾 (BHK) 细胞核 HKB11( 肾细胞和 B 细胞的混合细胞 ； ATCC#CRL-12568) 细胞。通常， 所述 技术可以使 70-100％的细胞稳定转染。特别开发了 HKB11 细胞用以产生重组 FVIII。在上 清中的 FVIII 用三明治 ELISA、 表面等离子共振技术 (surface plasmon resonance(SPR， )) 和 Western 印迹进行检测。FVIII 水平与商购的重组 FVIII 标准品 (rFVIII， Bayer 或 BDD BrFVIII Wyeth) 相当。瞬时转染显示所述细胞是否 产生所述 FVIII 变体。
     步骤 3、 不同 FVIII 构建体的体内传染
     克隆到 pLIVE 载体中的不同的 FVIII 构建体被注射到 FVIII 缺失的小鼠 中。在 ≤ 5 秒的时间内静脉注射 2ml 各质粒 (100μg)。此方法称为 “水动力注射” ， 过去已成功地 应用于在冯维勒布兰德因子 (VWF) 缺失的小鼠中表达高水平的 VWF(25)。在这些实验中， VWF 表达维持到 3 周， 表达水平高于在野生型小鼠的血浆中发现的水平。 此处， 用 ELISA、 SPR 和 Western 印迹对 FVIII 表达的动力学跟踪监测 3 周。
     步骤 4、 哺乳动物细胞系的稳定转染和小规模生产
     如步骤 2 中描述的进行稳定转染。使用 技术转染候选细胞系以 后， 通过限制性稀释法克隆细胞。扩增产生 FVIII 的细胞， 并于 -80℃冷冻储备。 所述蛋白的小规模生产根据经典方法在 DMEM1 ： 1-F12 中进行。简言之， 细胞生 长 3-4 天到接近汇合， 之后收集上清。通过 ELISA、 表面等离子共振技术 ( )和 Western 印迹使用鼠和人单克隆抗 FVIII IgG 对上清中存在的 FVIII 变体进行检测。 FVIII 的量用商购的 rFVIII(Kogenate， Bayer 或 Refacto Wyeth) 作为标准物来定量， 以评估每个 细胞每天产生的 FVIII 的量。
     步骤 5、 增加分泌 / 产生的 rFVIII 变体的产量的建议的溶液
     由哺乳动物细胞产生的 rFVIII 的水平受限于不同因素 ： 1)FVIII 的 A1 结构域与 内质网 (ER) 伴侣 ( 例如免疫球蛋白结合蛋白 (BiP))， 抑制 FVIII 的分泌 ； 2) 在 FVIII 分子 上甘露糖基化的糖类与 LMANl(ERGIC53) 的结合， 对于 FVIII 从 ER 到高尔基体的正确输出 是必需的。相反， 通过分子的生物工程可以增加产生 / 分泌的 FVIII 的产量 ： 1) 添加表达 6 个 N- 糖基化位点的截短的 B 结构域部分， 与缺失野生型结构域的 rFVIII 相比 rFVIII 的 产生增加几倍 ； 2)Phe309 突变为 Ser 残基降低与 BiP 的结合并增加 FVIII 的分泌。在此方 面， 通过定位诱变除去 N 连接的糖基化位点可以导致 FVIII 的产生减少。事实上， 野生型 B 结构域缺失的 FVIII cDNA 具有 3 个糖基化位点。定位诱变以后， 仅预期保留一个位点 ： 位 于 A3 结构域的 Asn1810， 这 可能不足以使所述分子正确分泌。
     如果以突变的 rFVIII 变体获得的 FVIII 产量低， 可以向所述构建体中引入编码 FVIII 的 B 结构域的起始 226 个氨基酸的 cDNA 序列。该序列具有 6 个 N 连接的糖基化位 点。为此目的， 从人肝提取物提取了 mRNA， 并制备了人 cDNA(Dr Cavard， Institut Cochin， Paris 赠予 )。用合适的引物扩增编码 B 结构域的 DNA， 并将该 DNA 插入到 4 个 FVIII 构建 体的重链和轻链之间。然后将该含 B 结构域的构建体克隆到 pCDNA3 和 pLIVE 载体中。转 染细胞并如上所述对表达进行研究。
     实施例 8 ： 修饰的 FVIII 的中等规模生产
     用 滚 动 细 胞 培 养 瓶 在 补 充 血 清 的 基 本 培 养 基 中 产 生 实 施 例 7 的 FVIII( 野
     生 型 /239 突 变 /2118 突 变 /239 突 变 2118 突 变 )。 在 滚 动 细 胞 培 养 瓶 中 产 生 足 够 量 的 不 同 的 FVIII， 然后用亲和色谱法纯化。下述所有研究所需要的预计量估计为每种 FVIII 变体约 2mg(10000UI)。纯化过程的产量约为 25％， 因此每种 FVIII 变体需要产生 8mg(40000UI)。 各克隆产生的 FVIII 取决于该克隆的生产力。对于高生产力者 ( ＞ 5UI/106 细胞 / 天 )， 在 6 滚动细胞培养瓶中以批量系统生产。对于低生产力者 ( ＜ 5UI/10 细胞 / 天 )， 使用滚动细 胞培养瓶进行重复分批生产。
     实施例 9 ： 修饰的 FVIII 的结构 / 功能的完整性
     步骤 1、 重组 FVIII 变体的体内转染
     将来自实施例 7 或 8 的不同的 FVIII 构建体克隆到 pLIVE 载体中， 并在水动力注 射后在 FVIII 缺失的小鼠中表达。用三明治 ELISA 和功能性凝血测定法来测量小鼠血浆中 的 FVIII 水平。剪断尾部并测量出血时间和血液流失的量来研究小鼠凝血的纠正。
     步骤 2、 体外促凝血活性
     在 体 外 和 体 内 研 究 了 4 个 重 组 FVIII 变 体 ( 实 施 例 7) 的 促 凝 血 活 性。 将 稀 释的 FVIII 与人无 FVIII 血浆共同培育， 并用功能性凝血测定法 (FibrinTimer CA540， Dade-Behring) 来测量 FVIII 的活性。或者， 用显色法评估 FVIII 的活性， 其中 FVIII 与活 性的因子 IX 以及因子 X 和磷脂混合。然后用激活的因子 X 的显色合成底物测量激活的因 子 X 的生成。 计算不同 FVIII 构建体的特异活性。 优选 B 结构域缺失的 FVIII( Wyeth) 并用于该方法中。FXa 生成的结果表示为标准值除以测试样品的 t1/2( 最大响应的 一半 ) 值的比值。
     步骤 3、 FVIII 与单克隆抗体、 冯维勒布兰德因子以及磷脂的相互作用
     研究了不同的 FVIII 变体与单克隆抗体、 冯维勒布兰德因子以及磷脂的相互作 用。
     步骤 4、 分析翻译后修饰的方法
     a)FVIII 的脱盐、 浓缩和激活
     FVIII 样品必须进行浓缩和脱盐以除去可能干扰许多进一步分析的盐、 单糖和 小分子。在 AKTA 纯化系统 (Amersham-Biosciences) 上进行脱盐， 该系统装配有以 5 ％ MeCN+TFA 0.1％平衡的反相 (RP)Uptisphere10WC4-25QS 柱 (Interchim)。用 5-90％梯度 的 MeCN+TFA 0.1％在 5CV 内进行洗脱。收集脱盐的产物并在 Speed-Vac 真空蒸发器中干 燥。
     纯化的 FVIII 样品也可以通过凝血酶处理而激活。然后， 得到的 FVIII 链可以用 RP-HPLCF(Uptisphere UP5WOD$25QK) 用常规 MeCN+TFA 梯度进行分离。
     b)FVIII 的酶法去糖基化
     i)PNGase F 去糖基化
     PNGase F 是 对 N- 多 糖 结 构 的 特 异 性 酶。 脱 盐 和 干 燥 以 后， 将 FVIII 重 悬 于 含有或不含有还原剂的酶缓冲液中， 并在室温下培育 15 分钟。然后加入所述酶 (E/S 5mIU/200μg)， 于 37℃培育 18 小时以进行去糖基化。 ii)Endo-H 去糖基化
     Endo H 是对寡甘露糖和混合形式的 N- 多糖结构有特异性的酶。 脱盐和干燥以后， 将 FVIII 重悬于含有或不含有还原剂的酶缓冲液中， 并在 95℃下加热 5 分钟。 在冰上冷却，
     然后添加所述酶 (E/S 0.2mIU/μg 蛋白 )。在 37℃进行去糖基化反应 2 小时。
     iii)SDS-PAGE 分析
     用 SDS-PAGE 分 析 以 PNGase F 或 Endo H 进 行 酶 法 去 糖 基 化 之 前 和 之 后 获 得 的 产 物， 可 以 部 分 地 表 征 FVIII 的 糖 基 化。SDS-PAGE 在 NOVEX 系 统 (Invitrogen， Life Technologies) 进行。 在非还原和还原条件下在 4-12％凝胶 (Novex) 上点样 (0.5 和 1μg)。 在 200V 迁移 50 分钟以后， 蛋白质进行银染。对所述凝胶进行数字扫描和整合 (Quantity One software， Biorad) 之后， 通过与蛋白标准相比较来确定不同蛋白条带的表观分子量。
     iv) 凝集素印迹分析
     糖基化的 ( 复合型、 高甘露糖型等 ) 肽和多肽 ( 包括 FVIII) 用凝集素印迹分析 (Fukuda et Kobata， Glycobiology a Pratical Approach) 进行特异性检测。如上所述， 10μg FVIII 以 SDS-PAGE 分离， 并根据操作说明书 (Novex) 转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜 上。简言之， 印迹的膜用 BSA 封闭， 以 PBST( 含 0.05％ Tween20 的 PBS) 洗涤， 并与合适的过 氧化物酶 (Ey labs) 标记的凝集素 ( 即 GAN、 ConA、 DGA、 LcH、 MNA-M、 VFA、 PEA、 PMA、 AMA 等 等 ) 在 4℃培育 2 小时。经 PBST 洗涤后， 用比色法或化学发光法显示过氧化物酶， 用扫描仪 或 CCD 相机捕获所获得的印迹图像。用 QuantityOne software(Biorad) 进行图像分析和 定量。
     步骤 5、 FVIII 一级结构分析的方法
     a)FVIII 绘图
     FVIII 绘图使能够进行一级结构分析。蛋白质序列是独特的， 因此用特定酶 ( 胰 酶或内切蛋白酶 Asp-N) 消化后产生的肽是目的蛋白质的特征。在脱盐和干燥后， 将 FVIII 变性 (8M 尿素 )、 还原 (20 摩尔 DTT/ 摩尔 SH) 和烷基化 (40 摩尔碘乙酰胺 / 摩尔 SH)。然 后用胰酶 (E/S ： 1/25m/m) 消化 FVIII， 该酶在 Arg(R) 和 Lys(K) 残基之后切割蛋白质。也 使用在 Asp(D) 之前切割蛋白质的 Asp-N(E/S ： 1/100m/m)。在蛋白质消化后， 产生的肽直接 进样到 LC-MS/MS 系统以用于分析， 或者以反相 HPLC 色谱用增加的乙腈梯度在 C18 300 柱上进行分离。最后收集级分并用 Speed-Vac 干燥以用于通过 Edman 测序仪和 MALDI-TOF MS 进行额外分析。
     b)Edman 测序
     FVIII 的 N 末端 Edman 测序在微量测序仪 (Precise 491HT， AppliedBiosystems) 上进行， 包括 3 个步骤 ： 偶联 - 切割和转换。 然后通过反响色谱分离氨基酸。 用来自 Sequence Pro(Applied Biosystems) 的标准氨基酸以及与 FVIII 的理论序列相比较来实现 N- 末端残 基的分析和确定， 由此例如确认氨基酸取代。
     c) 质谱分析
     MALDI TOF(/TOF)
     基质辅助激光解吸 / 电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF MS) 是能够测量分子量的具 有很大精确度的技术。MALDI-TOF MS 是能够分析肽、 蛋白质和多糖的电离方法。
     所述的目的肽、 蛋白质或多糖 (FVIII、 其片段或多糖 ) 与在激光的所述波长吸收 的基质混合。最常用的基质为用于分析肽的 α- 氰基 -4- 羟基肉桂酸 (HCCA)、 用于蛋白质 的芥子酸 (SA) 以及用于寡糖的 2， 5- 二羟基苯甲酸 (DHB)。通过质谱测量质量并与从理论 蛋白序列推断的理论质量相比较来确定各个肽。用 MS/MS 实验 ( 串联质谱， TOF/TOF) 对于给定肽基于在这些条件下获得的片段离子进行肽的测序。对于寡糖的确定 / 表征也使用类 似的策略。可以使用 Bruker Autoflex 2 设备。
     液相色谱 - 电喷雾电离质谱 (LC-ESIMS)
     与 MALDI 相反， 电喷雾电离 (ESI) 不需要使用基质。在 ESI 中， 样品溶液被引入到 在高电压下的毛细管中。在管出口应用强电场以形成带电小滴的喷雾， 同时穿过电场和在 质谱分析仪的通道中的压力梯度。在被研究的肽经色谱分离以后进行 ESIMS 分析， 也可以 获得肽的图谱。对于 FVIII 的情况， 可以在 Uptisphere UP5WOD25QK 柱 (Interchim) 上以 乙腈梯度进行肽的分离。
     通过 Qq-TOF 混合质谱仪 ( 四极飞行时间， Qstar-xl， Applied Biosystems) 进行 质谱检测， 该质谱仪能够收集 MS 和 MS/MS 数据。因此， 可以覆盖氨基酸序列。
     d)HPCE-LIF 寡糖绘图
     通过 HPCE-LIF 进行不同的天冬酰胺连接的寡糖结构或 “N 连接的结构” 的表征 和定量。通过 PNGase F 处理从 FVIII 释放糖， 并以冰冷的乙醇进行蛋白沉淀来分离该糖。 为了保证每个分离的结构被定量和表征， 用外切糖苷酶 ( 唾液酸酶、 半乳糖苷酶、 甘露糖苷 酶、 己糖苷酶 ) 处理样品。所有使用的外切糖苷酶获自 Prozyme。在此阶段， 进行第二次乙 醇沉淀。获得的多糖用荧光团 (APTS) 标记， 并基于它们的质量和电荷而分离。两个标准 ( 葡萄糖均聚物、 寡糖 ) 使结构可以确定。
     Beckman Coulter N-CHO 包被的毛细管 ( 尺寸为 50cm x 50μmID) 安装到毛细 管电泳中 (ProteomeLab PA800， Beckman Coulter)。实验条件为 ： 分离缓冲液 《凝胶缓冲 液 -N-Beckman coulter》 ， 在 20℃、 25KV 下迁移 20 分钟， 用 λex 488nm 和 λem 520nm 进行 激光检测。
     e)NP-HPLC 寡糖绘图
     也可以通过正相高效液相色谱 (NP-HPLC) 进行多种天冬酰胺连接的寡糖结构 ( 已 知为 N 连接的结构 ) 的确定和定量。用特异性酶 (PNGase) 释放 N- 多糖， 并通过乙醇沉淀 而分离该多糖。获得的多糖用 2- 苯甲酰胺 (2-AB) 荧光团标记。标记的多糖通过 NP-HPLC 用连接于 《金》 系统 (Beckman) 的 Amide-80 柱 (Tosohaas) 分离。
     在样品进样之前， 所述柱用 80％乙腈缓冲液平衡。 所述寡糖在增加梯度的 50mM 甲 酸铵 (pH4.45) 中洗脱。用 λex 330nm 和 λem 420nm 的荧光进行检测。
     实施例 10 ： Asn2118Ala LCh 在 FVIII 缺失的小鼠中的免疫原性
     方法
     纯 化 的 血 浆 衍 生 的 人 FVIII 轻 链 (wtLCh) 由 Dr E Saenko(University ofMaryland， Baltimore， MD， USA) 提供。生成和产生了突变的 FVIII 的 LCh(Asn2118Ala LCh)。将 wtLCh 和突变的 LCh(0.2μg 蛋白质在 200μL PBS 中 ) 静脉注射到 FVIII 缺失的 小鼠 ( 获自 ProfKazazian， Pennsylvania University， LISA) 体内， 注射 4 次， 每次间隔一 周。第 4 次注射后一周， 取小鼠的血病用 FVIII 特异性 ELISA 研究抗 FVIII IgG 的水平。
     ELISA ： 小鼠血清按 1 ∶ 90 稀释， 并在以人 FVIII( 重组的， Baxter) 包被的 ELISA 平板中培育。用 PBS-1％ BSA 封闭平板。用偶联过氧化物酶的多克隆抗鼠 IgG 和过氧化物 酶底物 (OPD) 显示结合的 IgG。以分光光度计 (Tecan Genyos) 检测 492nm 的光密度来测量 结合强度， 由此确定抗 FVIIIIgG 的水平。结果
     向 FVIII 缺失的小鼠静脉内施用纯化的血浆衍生的人 FVIII 轻链 (wtLCh)， 诱导 可检测的抗 FVIII IgG 水平。引人注意的是小鼠对 wtLCh 的免疫应答在实验中所包括的 6 只小鼠中是多样的。相反， 用突变的 Asn2118Ala LCh 处理的小鼠不能诱导显著水平的抗 FVIII IgG。
     结论
     这些数据显示 Asn2118Ala LCh 诱导特异性免疫应答的能力与 wtLCh 相比显著地 减少了。
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101970481 A序列表Leu Cys Leu Thr Tyr 175 Leu Asn Ser Gly Leu 190 Leu Ala Lys Glu Lys 205 Ala Val Phe Asp Glu 220 Leu Met Gln Asp Arg 235 His Thr Val Asn Gly 255 Cys His Arg Lys Ser 270 Pro Glu Val His Ser 285 Asn His Arg Gln Ala 300 Ala Gln Thr Leu Leu 315 Ile Ser Ser His Gln 335 Ser Cys Pro Glu Glu 350 Glu Asp Tyr Asp Asp 365 Phe Asp Asp Asp Asn 380 Lys Lys His Pro Lys 395 Asp Trp Asp Tyr Ala 415 Lys Ser Gln Tyr Leu 430 Lys Lys Val Arg Phe 445 Glu Ala Ile Gln His 460 Glu Val Gly Asp Thr Ser Ile Thr Gly Asp 240 Tyr Val Ile Ser Met 320 His Pro Asp Ser Thr 400 Pro Asn Met Glu Leu2/40 页Lys Glu Asn Gly Pro 165 Tyr Leu Ser His Val 180 Gly Ala Leu Leu Val 195 Gln Thr Leu His Lys 210 Lys Ser Trp His Ser 225 Ala Ala Ser Ala Arg 245 Val Asn Arg Ser Leu 260 Tyr Trp His Val Ile 275 Phe Leu Glu Gly His 290 Leu Glu Ile Ser Pro 305 Asp Leu Gly Gln Phe 325 Asp Gly Met Glu Ala 340 Gln Leu Arg Met Lys 355 Leu Thr Asp Ser Glu 370 Pro Ser Phe Ile Gln 385 Trp Val His Tyr Ile 405 Leu Val Leu Ala Pro 420 Asn Gly Pro Gln Arg 435 Ala Tyr Thr Asp Glu 450 Ser Gly Ile Leu GlyMet Ala Ser Asp Pro 170 Asp Leu Val Lys Asp 185 Cys Arg Glu Gly Ser 200 Phe Ile Leu Leu Phe 215 Glu Thr Lys Asn Ser 230 Ala Trp Pro Lys Met 250 Pro Gly Leu Ile Gly 265 Gly Met Gly Thr Thr 280 Thr Phe Leu Val Arg 295 Ile Thr Phe Leu Thr 310 Leu Leu Phe Cys His 330 Tyr Val Lys Val Asp 345 Asn Asn Glu Glu Ala 360 Met Asp Val Val Arg 375 Ile Arg Ser Val Ala 390 Ala Ala Glu Glu Glu 410 Asp Asp Arg Ser Tyr 425 Ile Gly Arg Lys Tyr 440 Thr Phe Lys Thr Arg 455 Pro Leu Leu Tyr Gly43CN 101970481 A序列表475 Pro Tyr Asn Ile Tyr 495 Ser Arg Arg Leu Pro 510 Leu Pro Gly Glu Ile 525 Gly Pro Thr Lys Ser 540 Phe Val Asn Met Glu 555 Leu Ile Cys Tyr Lys 575 Ser Asp Lys Arg Asn 590 Ser Trp Tyr Leu Thr 605 Gly Val Gln Leu Glu 620 Ser Ile Asn Gly Tyr 635 His Glu Val Ala Tyr 655 Phe Leu Ser Val Phe 670 Tyr Glu Asp Thr Leu 685 Met Ser Met Glu Asn 700 Asp Phe Arg Asn Arg 715 Asp Lys Asn Thr Gly 735 Ala Tyr Leu Leu Ser 750 Gln Asn Ser Arg His 765 Thr Ile 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cagtgactgt ctagtttcgt gctacaaaga tcctgttttc ttctccccaa tgcacagcat tggcatactg ctggatatac caggagaaac actcagactt acactggtga acaatgccat ttgactatga aggatgaaaa cagtggagag ctcagagtgg cctttactca atataagagc cctattcctt ctagaaaaaa atatggcacc acctggaaaa cactgaaccc tctttgatga cctgcaatat atggctacat ggtatctgct tgttcactgt tttttgagac ttggcgagca agactcccct aatatggaca ggagcaccaa acggcatcaa gcggattggt gactcgtgaa tggagacaca tcacggaatc tttgaaggat agaagatggg taatatggag atctgtagat tgtatttgat tccagctgga caatggctat gtacattcta cttcaaacac tgtcttcatg tcggaacaga ttattacgag tgaaccaaga tgataccata tcagagcccc gctctgggat cagtgtccct gcccttatac agaagttgaa ctattctagc ctttgtcaag cactaaagat agatgtgcac tgctcatggg gaccaaaagc ccagatggaa aatggataca cagcatgggc acgaaaaaaa agtggaaatg tctacatgct gggaatggct gtgggcccca ggagcccttt gacccagggt18/40 页gcccccgatg aggaagtaca gctattcagc ctgttgatta actgatgtcc tttccaattc ccaactaaat agagatctag caaagaggaa gagaaccgaa gtgcagcttg gtttttgata agcattggag aaaatggtct tcgatggaaa ggcatgaccg gacagttatg 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ggtctgccac tgctctgttt aagaaactgc tcgcttccat ggatcaaagg tcatttcagt caatctctat gcgggtggaa gtacagcaat gattacagct cggatcaatc ggcaccaatg ctacatctct aggagcctcc acacaatatt tagcattcgc gccattggga taccaatatg taatgcctgg gacaatgaaa tgtgaaggag gaatggcaaa tctagaccca gattgccctgattgctgcag aacagggctc gatggctcct gggccatata tctcgtccct gcagaaccta caacatcata gatgttgacc actaacacac ttcaccatct agggctccct gcaatcaatg attcgatggt ggacatgtgt ccaggtgttt tgccttattg aagtgtcaga tcaggacaat aatgcctgga attattcacg cagtttatca actggaacct tttaaccctc agcactcttc atggagagta tttgccacct agacctcagg gtcacaggag ttcctcatct gtaaaggttt ccgttactga aggatggaggtggagaggct agagtggcag ttactcagcc taagagcaga attccttcta gaaaaaactt tggcacccac tggaaaaaga tgaaccctgc ttgatgagac gcaatatcca gctacataat atctgctcag tcactgtacg ttgagacagt gcgagcatct ctcccctggg atggacagtg gcaccaagga gcatcaagac tcatgtatag taatggtctt caattattgc gcatggagtt aagcaatatc ggtctccttc tgaataatcc taactactca ccagcagtca ttcagggaaa ctcgctacct ttctgggctgctgggattat tgtccctcag cttataccgt 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