技术领域
本发明属生物技术领域，特别是涉及一种反义硫代核苷酸的抗肿瘤应用。
背景技术
癌症是威胁人类生命的第一大疾病，全球每年约有700万人死于癌症。随着世界人口 老龄化的加剧，人类生存环境的恶化，癌症发病率逐年上升，给患者带来巨大痛苦，也给 整个社会造成了沉重负担。
通常认为，肿瘤的发生是一个多因素促进的过程，其中包含遗传因素、感染因素、理 化因素和基因突变等等。用于癌症治疗的手段依然是外科手术，放疗和化疗。目前临床常 用抗肿瘤药物约80余种，依据药物作用的分子靶点大致可以分为：①作用于DNA结构的 药物如烷化剂、蒽环类和铂类化合物等；②影响核酸合成的药物，主要是指抗代谢物；③ 影响DNA转录，RNA合成的药物，如放线菌素、阿霉素等；④影响蛋白质合成的药物， 如鬼臼素、长春花碱、门冬酰胺酶等。
这些药物多属于细胞毒类药物，专一性差，在杀死肿瘤细胞的同时也会对正常细胞造 成较大影响，临床上表现为较为严重的副作用，这也是当前使用化疗药物治疗癌症的过程 中最令人头痛的问题。此外，长期使用此类药物可能诱发癌细胞的耐药性，使得化疗药物 对肿瘤的生长与恶化无能为力。因此，如果存在一种药物，既可以高特异性的杀伤肿瘤细 胞而不影响正常细胞，又可以有效的提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，那么，这一药物 无疑将具有更大的优势。而开发用于肿瘤治疗的反义核苷酸类药物很可能就拥有这些优越 性。
反义药物又称反义寡聚核苷酸药物(antisense oligonucleotide，ASO)，是人工合成的 脱氧核糖核苷酸类似物，通常具有15-20个碱基序列的长度，可以通过Watson-Crick碱 基配对的形式靶向性的与细胞内的特定mRNA结合，抑制该mRNA编码的蛋白质的翻译 过程。实现这类抑制具有几种可能的机制，如①反义药物的结合诱导mRNA被RNase H 降解；②空间位阻的形式影响mRNA的翻译③影响RNA的正常剪接。
反义药物同传统的小分子药物相比具有较大差异，具体表现在分子结构、作用靶点和 作用机理等方面。
首先，反义药物是遗传物质DNA的类似物，是一个有序的链状分子，只是在骨架或 核糖部位作了简单的化学修饰。传统化药的空间构型和关键的官能团决定其活性，而反义 药物活性则由一连串的碱基序列来决定，拥有更多的活性位点。
其次，反义药物的作用靶点是mRNA，而非蛋白质。在反义药物之前，从来没有人将 mRNA提到作为药物作用的靶点这一层次上来。传统意义上的小分子药物通常是通过影响 配体受体结合或者蛋白之间的相互作用来实现对蛋白质功能的调节。反义药物则作用于这 些生理活动的更上游—蛋白质的合成过程，在根本上影响到靶蛋白在细胞内的表达水平。
人类基因组测序工作的完成，为我们揭示了人体内多达35000个基因及其多样的RNA 剪接方式。这些海量的信息为我们提供了寻找治疗疾病的靶点的巨大便利。
但是，使用小分子化合物对靶蛋白的正常生理功能进行调节的机会并不是太多。而且， 寻找具有足够活性和特异性的小分子也十分困难。反义药物则在此体现出其优势。因为： ①理论上，所有基因的表达都可以被特定的反义药物调节；②同样在理论计算中，人类基 因组任何一个长度超过17个碱基的序列都只出现一次，保证了反义药物的特异性； ③watson-crick碱基配对形式的结合保证了反义药物具有足够强的结合活性；④反义药物 的序列信息就包含在基因组中，寻找活性反义药物序列要比寻找活性小分子化合物容易的 多。因此，在当今的科技时代背景下，直接作用于mRNA的反义药物技术无疑将成为靶向 治疗的理想技术。
目前，已有多种反义药物被应用于疾病的临床治疗。其中，美国ISIS公司开发的用于 治疗HIV病人并发症—CMV型视网膜炎的硫代寡核苷酸类反义药物Vitravene(ISIS2922) 已经被批准在美国、欧洲和拉丁美洲上市，成为第一个成功上市的反义药物。其它类型的 反义药物大多处于研究开发阶段，例如：人工合成互补于c-myc的mRNA寡核苷酸，可 以在体外抑制人白血病细胞的增殖(Holt等，1988，Mol.Cell Biol.8：963-973)，人工合成的 互补于人免疫缺陷病毒基因的寡核苷酸可以抑制人免疫缺陷病毒的感染复制(Zamecnik 等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：4143-4146)。
Bcl-2是Bcl-2蛋白家族的一员，它定位于细胞内的线粒体膜上，阻止线粒体内细胞色 素c的释放，而后者是细胞凋亡的发起者之一。Bcl-2蛋白被认为同肿瘤细胞抵抗细胞凋 亡以及肿瘤细胞耐药性的产生密切相关。
目前，已在多种人肿瘤细胞中发现了Bcl-2的过表达，其中包括急慢性白血病，多发 性骨髓瘤，非霍奇金淋巴瘤，恶性黑素瘤，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，乳腺癌胞，前列 腺癌，肝癌，肠癌，胃癌等等。通常认为，这种凋亡负调控因子过表达导致肿瘤细胞对多 种死亡刺激，例如化疗，放疗，缺氧，营养缺乏，胞质Ca2+浓度改变，氧自由基积累等等 不再敏感，协助细胞逃脱既定的凋亡进程。
此外，越来越多的证据表明Bcl-2过表达同许多肿瘤对化疗药物产生耐药性相关。在 非霍奇金淋巴瘤，急性髓细胞白血病，多发性骨髓瘤，前列腺癌中，都发现了Bcl-2表达 的上调同肿瘤对化疗和/或激素治疗的抵抗性的产生相关的证据。
Bcl-2蛋白对抗癌药物诱导的细胞死亡的阻断能力已经使它被划分为新型的多药耐药 性蛋白。同其它耐药性蛋白如MDR-1家族蛋白将药物排出细胞的机制不同，Bcl-2的过表 达并不影响药物的进入和累积。它所做的只是阻止了药物的细胞毒性向细胞死亡的高效转 化。因此，过表达Bcl-2的癌细胞可能经受了药物所致的DNA合成抑制或有丝分裂的干扰， 却仅仅出现细胞周期的延迟，而不会死亡。总之，Bcl-2的过表达使得许多抗癌药物的作 用由杀死细胞的胞毒作用降低为细胞生长抑制作用。
中国专利申请200610029202.4公开了一系列具有如下通式结构的反义核苷酸： 5’-CTC CCA GCG TGC GCC AT Z-3’，共包含12种反以核苷酸序列，见表1。该类核苷 酸均是通过反义作用特异性的抑制肿瘤细胞中Bcl-2蛋白的表达从而产生抗癌作用的。该 专利中的实施例揭示：专利涉及的反义核苷酸KS0601，KS0602，KS0604和KS0605等 可以较显著的抑制体外培养的人结肠癌细胞HT-29，人小细胞肺癌细胞NCI-H446和人宫 颈癌细胞Hela中癌基因Bcl-2的表达，并且抑制HT-29细胞的集落生成。但未与现有反 义药物相比较，体现该类反义核苷酸对体外培养的人肺癌细胞系中癌基因bcl-2的表达抑 制、发生细胞凋亡及在裸鼠动物模型中的抗肿瘤活性，也没有获得特定的药物用量等作为 抗肿瘤药物的关键技术特征。
表1中国专利申请200610029202.4涉及到的12种硫代反义寡核苷酸序列 名称 序列 KS0601 5’-TCT CCC AGC GTG CGC CAT C-3’ KS0602 5’-TCT CCC AGC GTG CGC CAT CC-3’ KS0603 5’-TCT CCC AGC GTG CGC CAT CCT-3’ KS0604 5’-CTC CCA GCG TGC GCC ATC-3’ KS0605 5’-CTC CCA GCG TGC GCC ATC C-3’ KS0606 5’-CTC CCA GCG TGC GCC ATC CT-3’ KS0607 5’-TTC TCC CAG CGT GCG CCA TC-3’ KS0608 5’-TTC TCC CAG CGT GCG CCA TCC-3’ KS0609 5’-TTC TCC CAG CGT GCG CCA TCC T-3’ KS0610 5’-GTT CTC CCA GCG TGC GCC ATC-3’ KS0611 5’-GTT CTC CCA GCG TGC GCC ATC C-3’ KS0612 5’-GTT CTC CCA GCG TGC GCC ATC CT-3’
发明内容
所要解决的技术问题
本发明所要解决的技术问题是提供一种反义硫代核苷酸的抗肺癌应用，以填补现有技 术中对该反义硫代核苷酸在人肺癌细胞凋亡中应用上和具体用药方案上的空白。
技术方案
本发明的技术方案之一是提供一种药物组合物，所述的药物组合物包含有临床使用剂 量为5mg/kg-20mg/kg的反义硫代核苷酸5’-CTC CCA GCG TGC GCC ATC-3’，及药学上 可接受的载体。
上述的药物组合物的优选方案之一为，所述的药物组合物抑制肿瘤细胞增殖的作用靶 点为Bcl-2蛋白的mRNA。
上述的药物组合物的优选方案之二为，所述的药物组合物对细胞Bcl-2蛋白含量的抑 制浓度为200-400nM，最优选为400nM。
上述的药物组合物的优选方案之三为，所述的药物组合物对肺癌细胞的早期抑制作用 时间在0-48小时。
上述的药物组合物的优选方案之四为，所述的药物组合物在48小时中对肺癌细胞的 抑制率＞10％。
本发明的技术方案之二是提供一种体外抑制肺癌细胞生长的方法，所述的方法包括： 将所述的肺癌细胞与反义硫代核苷酸5’-CTC CCA GCG TGC GCC ATC-3’接触，所述的反 义硫代核苷酸的作用浓度为200-400nM。
本发明的技术方案之三是提供一种对肺部肿瘤进行抑制的方法，所述的方法包括：将 反义硫代核苷酸5’-CTC CCA GCG TGC GCC ATC-3’与肺部肿瘤接触，所述的反义硫代核 苷酸的临床使用剂量为5mg/kg-20mg/kg。
上述的对肺部肿瘤进行抑制的方法的优选方案为，所述的反义硫代核苷酸的临床使用 剂量为20mg/kg时，对肿瘤的抑制率＞90％。
本发明的技术方案之四是提供一种反义硫代核苷酸在制备抗肺癌药物中的应用，所述 的反义硫代核苷酸为5’-CTC CCA GCG TGC GCC ATC-3’，所述的反义硫代核苷酸的临床 使用剂量为5mg/kg-20mg/kg。
有益效果
Bcl-2蛋白是细胞凋亡的抑制蛋白，被认为同肿瘤的发生和肿瘤耐药性的产生密切相 关。KS0604被设计与bcl-2基因的mRNA的特定序列互补，依靠反义作用机理抑制bcl-2 基因的表达，导致癌细胞内Bcl-2水平下降，促进癌细胞凋亡。与传统化疗药物相比，本 发明具有以下优点：
表2反义药物KS0604同化疗药物的比较 传统化疗药物 反义药物(KS0604) 分子结构 有机小分子，特定的构象， 有限个活性位点 DNA类似物，链状结构，每个碱基都是活性 位点 靶点和作用机 理 DNA复制，转录，细胞分 裂相关的蛋白、酶类 作用于蛋白质的合成过程，以mRNA为靶 点，作用于细胞生理活动的更上游 药物使用剂量 较大 作用于生理活动的更上游，所以理论上有效 剂量较传统药物小 毒副作用 特异性不高，对正常细胞影 响大，毒副作用明显 高特异性，临床只表现轻微毒副作用；药物 为DNA结构类似物，不易产生有害代谢物 对耐药性肿瘤 的作用 需加大药物剂量治疗，难以 在毒副作用和疗效间平衡 作用于肿瘤耐药性产生机制中关键的Bcl-2， 可能具有对化疗药物的增敏作用
具体而言，其优势表现在：
①作用靶点及药物的化学组成具有新颖性。传统药物的靶点通常为蛋白质，而本药物 的作用靶点是细胞凋亡抑制因子Bcl-2的mRNA。本发明涉及的药物是反义硫代寡核苷酸， 与传统的小分子药物差异明显。
②药物具有较高的抗肿瘤活性。由实施例可知，同化疗药物阿霉素(ADM)和同类型的 反义药物G3139相比，药物的抗肿瘤活性毫不逊色，甚至可以说是强于ADM。
③药物毒副作用小。本发明涉及的药物作用于基因水平，位于细胞生理活动的更上游， 因此药物用量更小。反义药物的母体是人体遗传物质DNA，不含较大毒性基团，毒负作用 小。目前处于临床阶段的反义药物多体现疲劳，发热等轻微副作用。
④具有化疗药物增敏作用。肿瘤耐药性的产生同Bcl-2蛋白密切相关，本发明涉及的 反义药物可以降低细胞内Bcl-2的水平，增强其对化疗药物的敏感性，从而减少化疗药物 的使用量，将化疗对患者造成的伤害大大降低，这是传统药物无法实现的。
除了上述与传统化疗药物相比所具备的优点，本发明与其他的Bcl-2蛋白抗肿瘤药物 或现有反义核苷酸抗肿瘤药物相比，还有如下优点：
1.本发明的抑制肿瘤细胞增殖的硫代反义核苷酸是以人Bcl-2蛋白的mRNA为靶点的， 故作用于更加上游的基因表达而不是蛋白质水平，其作用机理更加明确。
2.本发明以体外培养的人肺癌细胞系NCI-H446为例，证明了硫代反义核苷酸的抗肺癌 作用。
3.KS0604可以特异的高效的导致体外培养的人肺癌细胞系NCI-H446出现癌基因bcl-2 的表达抑制。300nM浓度的KS0604可以使细胞内Bcl-2蛋白的水平下降达80％。 且在NCI-H446细胞系中，KS0604与同类药物G3139相比，显示了其用药量少、 Bcl-2蛋白下降更显著效果。
4.KS0604可以诱导体外培养的人肺癌细胞NCI-H446发生细胞凋亡，其诱导效果好于 阳性药物G3139，特别是在早期凋亡的效果上，更加体现了其作为治疗药物快速作 用的优势。
5.在裸鼠肿瘤模型中，KS0604可以十分显著地抑制人肺癌细胞诱导的裸鼠肿瘤的生长， 20mg/kg的剂量下，抑制率达90％以上。
6.本发明还首次提供了的硫代反义核苷酸KS0604用于肺癌的治疗，临床使用剂量约为 5mg/kg-20mg/kg。
附图说明
图1显示KS0604的体内抗肿瘤活性。注：相对肿瘤体积＝Vt/V0，V0为分组给药时肿瘤体 积，Vt为每次测量时的肿瘤体积；NS为生理盐水对照组；ADM，阿霉素；RP，反 极性序列对照。
图2反义药物诱导的NCI-H446 bcl-2基因mRNA水平的下调。
图3为不同浓度的药物作用48hr后对NCI-H446细胞内Bcl-2蛋白表达水平的影响，柱状 图为三次实验结果使用Band Scan 5.0进行灰度扫描后的统计图。
图4为硫代反义寡核苷酸的结构简式。其中，碱基为A、G、C、T中的一种。KS0604分 子为由硫原子取代的磷酸键连接脱氧核糖核苷酸形成的链状结构，其核苷酸序列为 5’-CTC CCA GCG TGC GCC ATC-3’。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限 定的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如：分子克隆操作手 册，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中涉及的寡聚核苷酸药物序列如下：
表3实施例中合成的硫代反义核苷酸序列 名称 序列 KS0604 5’-CTC CCA GCG TGC GCC ATC-3’ G3139 5’-TCT CCC AGC GTG CGC CAT-3’ 反极性序列(RP) 5’-TAC CGC GTG CGA CCC TCC-3’ 错配序列(TM) 5’-CTC CCA GCA TGT GCC ATC-3’
G3139为美国Genta公司的同类型反义药物，用于实施例中作为治疗效果的参考。
RP序列为具有与KS0604相同核苷酸组成但不与人细胞内任何mRNA有特异性结合 的寡核苷酸，TM序列为关键碱基出现错配的KS0604序列(错配碱基为斜体)，两者都作 为实施例中的阴性对照，体现KS0604的特异性。
实施例中还涉及的癌症化疗药物阿霉素(ADM)，也作为KS0604药物效果的参考。
实施例1
KS0604抑制体外培养的人肺癌细胞系NCI-H446中Bcl-2基因的表达。
以Genta公司的同类型药物G3139作为阳性对照，错配序列(TM)作为阴性对照，采 用反转录PCR的方法检测KS0604作用。转染48h后人肿瘤细胞系NCI-H446内bcl-2 mRNA的水平，见图2。
同样使用G3139和TM作为对照，Western blot的方法检测药物诱导的NCI-H446 Bcl-2蛋白的下调。见图3。
由以上结果可知：
①RT-PCR实验中，各组别中Actin的mRNA水平无显著差异，而G3139和KS0604 加药组均出现bcl-2 mRNA水平的显著下调，错配序列则无此效果。尽管作为PCR扩增 反应结果，不能进行线性比较，但仍然可以确定药物引起了bcl-2 mRNA水平的十分显著 的的下调。
②Western blot实验中，KS0604和阳性药物G3139均可引起NCI-H446细胞Bcl-2 水平的下调，同时，转染试剂Lipofectamine和错配序列TM的对照组Bcl-2水平变化不明 显。最大剂量组400nM的KS0604作用48h可导致Bcl-2近80％的下调。100nM，200nM， 400nM剂量组比较，Bcl-2的下调同KS0604剂量相关。而且，KS0604的200nM、400nM 剂量组与阳性药物G3139的400nM相比，NCI-H446细胞Bcl-2水平的下调更加明显， 表明在NCI-H446细胞系中，KS0604优于G3139的效果。
结论：
①使用反转录PCR的方法证明了反义药物KS0604可以有效下调人小细胞肺癌细胞 系NCI-H446中bcl-2mRNA的水平。证明了KS0604的药物分子作用机理，即：KS0604 可以特异性的结合bcl-2mRNA，并促进其被RNase H降解。
②使用蛋白免疫印记实验在蛋白水平证明反义药物KS0604对bcl-2基因表达的下调 作用。即：KS0604通过反义药物作用促使bcl-2mRNA降解，导致NCI-H446细胞内Bcl-2 水平出现显著下调。两组实验在mRNA和蛋白两种水平均证明了KS0604的分子水平的 药理作用。
本实施例在mRNA水平和蛋白质水平都证实了：KS0604可以特异的高效的导致体 外培养的人肺癌细胞系NCI-H446出现癌基因bcl-2的表达抑制。300nM浓度的KS0604 可以使细胞内Bcl-2蛋白的水平下降达80％。且在NCI-H446细胞系中癌基因bcl-2的表 达抑制上，KS0604优于G3139。
实施例2
KS0604诱导体外培养的人肺癌细胞NCI-H446发生细胞凋亡。
400nM的KS0604作用于NCI-H446细胞48h，G3139作为阳性对照，TM序列作为 阴性对照。使用Annexin V/PI双染流式细胞仪检测的方法检测发生凋亡的细胞比率，结果 见表4。
表4 KS0604诱导NCI-H446细胞凋亡结果统计 48h早期凋亡(％) 48h晚期凋亡(％) 总凋亡率(％) 空白对照 4.67 0.21 4.87 TM 5.04 0.42 5.46 G3139 6.02 0.66 6.68 KS0604 10.38 1.20 11.58
由结果可知，400nM的KS0604作用48小时诱导部分NCI-H446细胞发生凋亡，处 于凋亡早期的细胞达到10.38％，凋亡晚期细胞为1.20％。考虑到凋亡晚期细胞贴壁能力下 降，易在操作中出现损失，实际发生凋亡的细胞数量应该更多。同时，阳性药物G3139 所能诱导的细胞凋亡比率也仅有6.68％，说明KS0604较G3139可能具有更强的诱导肿 瘤细胞凋亡的活性。
Bcl-2是细胞凋亡的抑制物，Bcl-2水平下调将促使细胞对凋亡刺激更加敏感，本实施 例中使用Annexin V/PI双染流式细胞染色的方法证明，KS0604下调NCI-H446细胞的 Bcl-2水平后，使得细胞更易于凋亡，具体表现在加入KS0604后，癌细胞NCI-H446发 生早期凋亡的比率显著上升。
结论：KS0604可以诱导体外培养的人肺癌细胞NCI-H446发生细胞凋亡，其诱导效 果好于阳性药物G3139。
实施例3
KS0604有效抑制肺癌动物模型中肿瘤的生长。
使用人肺癌细胞系NCI-H446建立人肺癌的裸鼠动物模型，对动物以腹腔注射的形 式给药。仍然以G3139作为阳性对照，RP序列作为阴性对照，各种核苷酸序列皆为每天 给药连续给药14天。此外，实验中同时设置化疗药物阿霉素(ADM)组，其给药方式为每 周给药一次(3mg/kg)，连续3次。实验结果见图1。
由结果可知，①同空白对照组相比，KS0604给药组动物的肿瘤体积增长速度明显减 缓，且具有剂量依赖型。在最高给药组20mg/kg时，KS0604达到最大抑制效果，抑制率 达到94％；②同阳性药物G3139相比，相同浓度的KS0604具有与之相当的抗肿瘤生长 活性；③同化疗药物ADM相比，KS0604同ADM的用药剂量和给药方式存在差异，但是 从结果亦可得出KS0604具有良好的抑制肿瘤生长的活性，其效果至少与阿霉素相当。
结论：在裸鼠肿瘤模型中，KS0604可以十分显著地抑制人肺癌细胞诱导的裸鼠肿瘤 的生长，20mg/kg的剂量下，抑制率达90％以上。
KS0604分子细胞水平的作用反映到整个哺乳动物水平上就是：KS0604导致动物体 内肿瘤细胞Bcl-2下调，从而使得肿瘤细胞对凋亡刺激更加敏感，从而提升了动物体自身 的免疫系统对肿瘤细胞的杀伤效果，抑制肿瘤的生长。本实施例的结果很明显的证明了这 一机制。
综上所述，在mRNA和蛋白水平上证明KS0604可以显著下调肿瘤细胞NCI-H446 的Bcl-2表达，导致细胞对凋亡刺激更加敏感。这一作用效果反映在哺乳动物身上就是 KS0604促进动物体自身的免疫作用对肿瘤的杀伤作用，抑制肿瘤生长。