人体胰岛素前体转化为人体胰岛素的方法.pdf

因此，本发明目的在于提供使人体胰岛素前体转化为人体胰岛素的方法。这种前体具有下面的化学式：

式中R是氢、用化学或酶促法可切割的氨基酸残基，或者用化学或酶促法可切割的至少带有两个氨基酸残基的肽部分;

R₁是OH、Arg-Y，或Lys-Y，其中Y是OH、氨基酸残基，或者至少含有两个氨基酸残基的肽部分;从A-1至A-21部分是人体胰岛素A链;从B-1至B-30部分是人体胰岛素B链;以及X是胰岛素A-链上A-1的氨基与胰岛素B链上B-30的羧基之间相互连接的部分，这部分可被酶促地从A-链和B-链上裂下而不破坏A链和B链，它包括在水介质中用胰蛋白酶和羧肽酶B处理这种人体胰岛素前体，在该水介质中每摩尔人体胰岛素前体约有0.1至10摩尔的一种或多种金属离子，这些金属具有原子序数21至34、39至52、57至84和89至92。

正如所指出的，本发明的方法显示出增强了公认的用胰蛋白酶和羧肽酶B将胰岛素原转化为胰岛素的作用。该方法用于上述化学式的人体胰岛素前体。尤以人体胰岛素原本身为最佳。

本文所用的“人体胰岛素前体”一词是指下述分子：（1）含人体胰岛素A链和人体胰岛素B链，（2）至少具有通过分别在A-链和B-链上的
（a）A-6和A-11，（b）A-7和B-7（c）A-20和B-19上的每个Cys部分的硫相连接的三个二硫键，以及（3）具有与胰岛素A链的A-1氨基与胰岛素B链的B-30羧基连接的可除去连接部分。

R是氢、氨基酸残基，或至少具有两个氨基酸残基的肽部分。其中在R是氨基酸残基或肽部分的情况下，R是可从没有损失残余胰岛素完整结构的胰岛素前体产物切割的基。众多氨基酸残基或肽部分之任一种都限制在基团R的定义范围内。可切割的氨基酸残基的实例是碱性氨基酸，如精氨酸（Arg）或赖氨酸（Lys）及由这些氨基酸残基的羧基终止的肽部分。这些氨基酸残基被公认为在用蛋白水解酶胰蛋白酶处理时易于被切下。可切割的氨基酸残基的又一实例是蛋酸（Met），还有在其羧基末端具有Met的肽部分。通过用溴化氰处理可去除这些残基。再一实例是色氨酸（Trp）或在其羧基末端含Trp的肽部分。用N-溴丁二酰亚胺处理，可去除这种残基。

基团R₁是羟基、精氨酸、赖氨酸或在氨基末端具有精氨酸或赖氨酸的肽。当R₁是精氨酸、赖氨酸、或在氨基末端具有的任何一个这些残基的肽时，在本发明方法的条件下，氨基酸或肽。会被切下同时形成R₁是羟基的产物。

胰岛素前体的连接部分X可以是各种结构之任一种，以X部分是多肽为最佳。多肽一般至少有2个氨基酸残基，更好为约2至35个氨基酸残基，以约6至35个氨基酸残基为最佳。X部分与A链上A-1的氨基和与B链上B-30的羧基相连接。最佳情况是当连接部分X是肽时，是人体胰岛素原的天然连接肽，这种连接肽具有下述化学式：

-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-.

尽管最好使用如以上所示的天然连接序列，但短得多的肽序列可用于连接肽，只是要求（1）他们的长度足以使A链和B链间形成合适的二硫键，（2）随着胰岛素的形成它们可以从胰岛素前体上裂下。可使用的典型二肽是-Arg-Arg-。此外，可方便地采用具有式-Arg-X-Arg-的改进的上述二肽，（其中X至少表示1个氨基酸残基）。最佳连接的肽是-Arg-Arg-Lys-Arg-及具有结构-Arg-Arg-X²-Lys-Arg-的较长链的肽，其中X²至少是1个氨基酸残基，最佳为至少2个氨基酸残基。当然，后者包括天然的连接肽。

本发明的方法是在水介质中进行的。水介质一词“要求有水存在，然而不排除有与水易混溶的有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙酮、N，N-二甲基甲酰胺等存在。人体胰岛素前体存在于介质中的浓度不超过约20毫克分子。最佳的是人体胰岛素前体的浓度基本上较低，一般约0.1毫克分子至10毫克分子，较好为约0.5至5毫克分子，最佳为约1至3毫克分子。

可在任意温度范围下进行转化，一般在约0℃至40℃，进行反应的
较好温度约4℃至25℃，最佳为约10℃至15℃。

反应混合物的pH可在4至12的任意值。然而，通过严格控制pH为6至9，最好在约7至8下进行，当精确控制时，在约7.2至7.6时可得到最好结果。

一般通过使用缓冲剂来帮助控制pH值，可采用任意一种pH范围广的典型的缓冲剂。适宜的缓冲剂的例是TRIS（三羟甲基氨基甲烷）、乙二胺、三乙醇胺、甘氨酸、HEPES（N-2-羟基-乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸）等。

所用胰蛋白酶和羧肽酶B的量一般与这两种酶和人体胰岛素前体的量都有关。这些酶或可加到反应混合物的溶液中，或用已知的技术，可固定在适宜的载体上，从而可在反应介质中起作用。

根据重量∶重量计，通常所存在的羧肽酶B相对于人体胰岛素前体的量约1∶10至约1∶5000，较好为约1∶500至约1∶3500，最佳为约1∶1000至约1∶3000。

根据重量∶重量计，通常所存在的胰蛋白酶相对于人体胰岛素前体的量约1∶20至约1∶250000，较好为约1∶300至1∶20000，最佳为约1∶5000至1∶15000。

在反应混合物中羧肽酶B对胰蛋白酶的比率也是一个重量参数。一般以重量计，羧肽酶B对胰蛋白酶的比率约为1∶1至约10∶1，最好为约2∶1至约5∶1。

构成本发明基础的关键发现在于找到了在一种或多种广泛的一定量的金属离子，显著地减低了在反应中形成Des-Thr（B30）-hI的量。

虽然某些金属离子是非常好的，但业已发现这些金属离子在一个广范围内都是可以应用的。可以采用的是以下金属的离子：钪（Sc）、钛（Ti）、钒（V）、铬（Cr）、锰（Mn）、铁（Fe）、钴（Co）、镍（Ni）、铜（Cu）、锌（Zn）、镓（Ga）、锗（Ge）、砷（As）、硒（Se）、钇（Y）、锆（Zr）、铌（Nb）、钼（Mo）、锝（Tc）、钌（Ru）、铑（Rh）、钯（Pd）、银（Ag）、镉（Cd）、铟
（In）、锡（Sn）、锑（Sb）、碲（Te）、镧（La）、铈（Ce）、镨（Pr）、钕（Nd）、钷（Pm）、钐（Sm）、铕（Eu）、钆（Gd）、铽（Tb）、镝（Dy）、钬（Ho）、铒（Er）、铥（Tm）、镱（Yd）、镥（Lu）、铪（Hf）、钽（Ta）、钨（W）、铼（Re）、锇（Os）、铱（Ir）、铂（Pt）、金（Au）、汞（Hg）、铊（Tl）、铅（pb）、铋（Bi）、钋（Po）、锕（Ac）、钍（Th）、镤（Pa）和铀（U）。

虽然在本发明方法中可使用上述金属的任何离子，但在缩小的范围内最好的小类并因此而增加的选择机会如下：

（1）铬、钼、钨、汞、锑、铋、镍、铁、钴、锌、镉、铜、锡、铅、铕、铀、铂和锰。

（2）镍、铁、钴、锌、镉、铜、锡、铅、铕、铀、铂或锰。

（3）镍、锌、钴和镉。

（4）镍和锌。

（5）镍。

根据本发明方法，将上述金属中的一种或多种离子加到人体胰岛素前体反应混合物中，上述金属的离子聚集于反应混合物中的量为每摩尔人体胰岛素前体约0.1至约10摩尔。所用的实际量最好是上述范围的较低值，一般为每摩尔人体胰岛素前体约0.1至2摩尔，最好为每摩尔人体胰岛素前体0.3至1摩尔，理想量为每摩尔人体胰岛素前体约0.33至0.6摩尔。

转化反应一般进行约2至48小时，通常约为8至16小时。可用高效液相色谱法监测该反应，注意使反应时间与人体胰岛素的产生相协调。

本发明另一方面完全意想不到的发现，是将另一类金属之一种或多种金属离子加入反应混合物中，可进一步减少产生Des-Thr（B30）-hI的量。当第一类金属离子的量为每摩尔人体胰岛素前体约0.1至0.6摩尔时，这种进一步的改进特别明显。加入选自铍、镁、钙、锶、钡和镭等金属的一定量的离子是非常有利的。以钙、钡、锶或镁离子为好，尤以
钙为最佳。

第二类金属离子的量为每摩尔人体胰岛素前体约0.5至5摩尔，而以每摩尔人体胰岛素前体约1至3摩尔为最佳。

以上所述的第二类金属离子的用途最意想不到的是已知第二类的离子特别是钙使胰蛋白酶稳定，但当它在无第一类金属离子的情况下使用时，值得注意的是确实增加了Des-Thr（B30）的产量。

典型的是在水介质中溶解人体胰岛素前体来实施本发明方法。最终混合物浓度一般约1毫克分子至3毫克分子，约pH8。然后加入第二类金属离子（如果采用的话）。当采用上述人体胰岛素前体的浓度时，典型的是将氯化钙加至约5毫克分子浓度。然后将第一类金属的离子〔典型的是Ni（Ⅱ）的离子〕加至浓度为每摩尔人体胰岛素前体约0.5摩尔，调节混合物pH至7.3～7.5，加入羧肽酶B（约1∶2500重量/重量人体胰岛素前体），再加上胰蛋白酶（约1∶12500重量/重量人体胰岛素前体）。该混合物维持在约12℃条件下，可进行反应，通过高效液相色谱法严格监测该反应的进程。