一种提高奶牛受胎率的制剂及其应用.pdf

本发明提供了一种提高奶牛受胎率的制剂及其应用,所述制剂的有效成分含有褪黑素和前列腺素。其使用方法为在精液解冻后加入制剂混匀后输精。本发明通过奶牛实验发现，所述制剂能够提高奶牛冻精输精后的受胎率，可以在家畜养殖领域广泛推广应用，具有良好的市场前景和社会效应。

1.一种提高家畜受胎率的制剂，其特征在于，所述制剂为混合溶液，其有效成分为褪黑素和前列腺素。 2.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述褪黑素与前列腺素的重量比为：1:6250-625000。 3.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述褪黑素与前列腺素的重量比为：1:62500。 4.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述褪黑素的浓度为4.8-480ng/ml，优选为48ng/ml。 5.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述前列腺素的浓度为2-4mg/ml，优选为3mg/ml。 6.一种提高家畜受胎率的方法，其将有效量的褪黑素和前列腺素共同作用待孕家畜。 7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将有效量的褪黑素和前列腺素同精液混合制成混合液后进行人工受精。 8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述混合液中褪黑素的浓度为2.4-240ng/ml，优选为24ng/ml，所述前列腺素的浓度为1-2mg/ml，优选为1.5mg/ml。 9.褪黑素和前列腺素在提高家畜受胎率上的应用，权利要求1-5任一项所述的制剂在提高家畜受胎率上的应用。所述的家畜为奶牛。 10.权利要求1-9中所述的前列腺素为地诺前列腺素。

技术领域

本发明涉及家畜人工授精的改良技术领域，具体涉及一种提高奶牛受胎率的制剂及其制备方法与应用。

背景技术

人工授精技术是家畜繁殖中一项效果非常好、非常成熟的专门技术，在推进品种改良、提高和改善畜产品产量和品质方面意义非常重大。奶牛的人工授精技术从20世纪80年代开始在中国广泛使用,随后冷冻精液逐渐取代了鲜精授精。近年来随着规模化、集约化的普及，奶牛的产奶量在逐年增加，但是奶牛的繁殖效率却在下降。如何提高奶牛输精后的受胎率进而提高奶牛的繁殖效率,成为繁殖学家研究的热点。

前列腺素(prostaglandin)最早发现存在于人的精液中，主要来自精囊。此后发现从动物体多种组织，如睾丸、子宫、胎盘、及卵巢等均可提取。其主要具有溶解黄体的功能以及促使平滑肌收缩，这对发情、排卵、分娩时子宫的蠕动、产后胎衣排出、精子在生殖道内运行，均有一定的影响。目前，前列腺F2α(PGF2α)及其类似物已有效地用于奶牛的同期发情，持久黄体、黄体囊肿等卵巢疾病的治疗。Abdussamad等(2015，Comparison of various semen extenders and addition of prostaglandin F2αon pregnancy rate in cows)研究表明，冷冻精液中添加1.5mg/ml PGF 2α,受胎率可达到56％。发明专利(一种提高母牛受胎率的方法，申请号，201510265568.0)在人工授精前1至2小时，用输精管吸入0.2mg前列腺素2ml，注射到子宫颈分叉处，可以提高奶牛的受胎率。

褪黑素(melatonin)是一种主要由松果体分泌的神经内分泌激素，化学结构为N-乙酰-5-甲氧色胺(N-acetyl-5-methoxytryptamine)，其在生物钟、生殖、免疫、抗氧化等方面有重要作用。同时，也有研究表明，褪黑素可以直接参与卵泡的发育与排卵,提高牛卵母细胞成熟率以及胚胎的发育率。发明专利(一种提高奶牛受胎率的制剂及其制备方法与应用，申请号，201510085043.9)10-3～10-1mol/L的褪黑素和浓度为10-6～10-4mol/L的维生素E可以有效提高奶牛受胎率。

提高奶牛受胎率的方法和制剂还有很多，但是奶牛受胎率的提升幅度仍然有很大的空间。并且，很多技术操作复杂，需要经过专业训练，在一定程度上影响了技术的推广应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高奶牛受胎率的制剂及其应用。

本发明研究意外发现，在褪黑素与前列腺素的共同作用下胚胎的受胎率得到了进一步的提高，基于此，本发明的技术方案如下：

首先，本发明一种提高家畜受胎率的制剂，所述制剂为混合溶液，其有效成分为褪黑素和前列腺素。

优选地，所述褪黑素与前列腺素的重量比为：1:6250-625000，更优选，所述褪黑素与前列腺素的重量比为：1:62500。

在所述制剂溶液中，所述褪黑素的浓度为优选为4.8-480ng/ml，更优选为48ng/ml。所述前列腺素的浓度优选为2-4mg/ml，更优选为3mg/ml。

本领域技术人员应当理解，上述制剂的浓度可以根据商品的需要进行浓缩或稀释，在使用时制剂可以进行相应稀释后使用。另外，制剂溶液的溶剂可以是本领域所能接受的任何可用于稀释精子的溶剂，例如常规精子稀释液。为方便表述褪黑素和前列腺素的制剂下称为MP制剂(Melatonin-Prostaglandin agent)。

其次，本发明提供一种提高家畜受胎率的方法，其将有效量的褪黑素和前列腺素共同作用待孕家畜。所述的有效量针对不同的家畜剂量会有所差异，例如，对于羊其剂量可以在50-200μL，对于马剂量可以是100-500μL，对于牛剂量可以是100-500μL。对于作用的方式可以是直接注入，例如将所述的制剂注入到子宫内、子宫壁或其他接近子宫的部位。当然，对于不同物种和不同的方法，剂量可以根据测试的受胎率进行调整。本发明的一种实施方式是将效量的褪黑素和前列腺素同精液混合制成混合液后进行人工授精。优选地，所述混合液中褪黑素的浓度为2.4-240ng/ml，更优选为24ng/ml；优选地，所述前列腺素的浓度为1-2mg/ml，更优选为1.5mg/ml。

最后，本发明提供褪黑素和前列腺素在提高家畜受胎率上的应用，以及所述的MP制剂在提高家畜受胎率上的应用。

本发明提供的提高奶牛受胎率的MP制剂，是将褪黑素与前列腺素以一定的比例溶解在精液稀释液中，并与解冻后的冷冻精液混合进行输精后可以提高奶牛的受胎率。该方法简单易操作，通过受胎率的提高，进而提高了奶牛的繁殖效率，降低了成本，增加了经济效益，因此具有良好的应用前景。

具体实施方式：

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范围。地诺前列腺素购自辉瑞、精液稀释液都购自Minitueb，褪黑素购自Sigma。

实施例1提高奶牛受胎率的MP制剂及其制备方法

原料：地诺前列腺素、褪黑素、精液稀释液

制备方法：

1)称取8.16mg褪黑素，溶于1mL的无水乙醇中，用PBS稀释1000倍，成终浓度8.16ng/μL，备用。

2)在0.5mL EP管中，分别加入浓度为5mg/ml的地诺前列腺素102μL,精液稀释液67μL，褪黑素1μL，共计170μL MP制剂，混匀。

MP制剂中褪黑素的浓度为48ng/ml，地诺前列腺素的浓度为3mg/ml。

所有操作均在暗室中完成。

实施例2提高奶牛受胎率的MP制剂及其制备方法

原料：地诺前列腺素、褪黑素、精液稀释液

制备方法：

1)称取81.6mg褪黑素，溶于1mL的无水乙醇中，用PBS稀释1000倍，成终浓度81.6ng/μL，备用。

2)在0.5mL EP管中，分别加入浓度为5mg/ml的地诺前列腺素136μL,精液稀释液33μL，褪黑素1μL，共计170μL MP制剂，混匀。

MP制剂中褪黑素的浓度为480ng/ml，地诺前列腺素的浓度为4mg/ml。

所有操作均在暗室中完成。

实施例3提高奶牛受胎率的MP制剂及其制备方法

原料：地诺前列腺素、褪黑素、精液稀释液

制备方法：

1)称取8.16mg褪黑素，溶于1mL的无水乙醇中，用PBS稀释10000倍，成终浓度0.816ng/μL，备用。

2)在0.5mL EP管中，分别加入浓度为5mg/ml的地诺前列腺素68μL,精液稀释液101μL，褪黑素1μL，共计170μL MP制剂，混匀。

MP制剂中褪黑素的浓度为4.8ng/ml，地诺前列腺素的浓度为2mg/ml。

所有操作均在暗室中完成。

实施例4精液解冻，与MP制剂混合

1)从液氮中取出奶牛0.25mL细管冻精(购自北京奶牛中心的性控冻精)，置于38℃水浴锅中解冻30秒；

2)剪开细管封口，将冷冻精液加入38℃预热的加有170μL MP制剂的EP管中，混匀，制成混合溶液。混合液中，褪黑素的终浓度为24ng/ml，地诺前列腺素的浓度为1.5mg/ml。另设对照组、褪黑素实验组和地诺前列腺素实验组，对照组为精液稀释液，褪黑素实验组和地诺前列腺素实验组分别仅含褪黑素和地诺前列腺素。各组别操作同。具体分组如下：

表1各组别精液混合液中褪黑素组和地诺前列腺素的含量

组别 褪黑素(ng/ml) 前列腺素(mg/ml) 总体积(μL) 对照组 0 0 340 褪黑素组 24 0 340 地诺前列腺素组 0 1.5 340 褪黑素组+地诺前列腺素组 24 1.5 340

3)将混合液全部加入到0.5mL的精液细管中，装入输精枪，准备输精；

4)输精对象的选择

优选15-20月龄、体重达到350公斤以上、发情周期正常的育成母牛，因育成牛生殖机能旺盛、子宫环境好，有利于受胎。

5)输精时间的确定

严格控制在排卵前的3-5小时输精，即奶牛接受爬跨后12-14小时进行直肠检查，卵泡有一触即破时为最佳输精时间。并结合外观观察，奶牛表现安静，外阴肿胀开始消失，阴门流出半透明的牵缕性黏液。

6)输精方法

严格消毒母牛外阴。采用子宫体深部输精，输精部位要求在排卵侧子宫角深处2-5厘米处，这样保证有足够精子到达与卵子授精部位。并且输精时做到“轻插、慢推、缓出”，以免对母牛的子宫造成损伤。

7)早期妊娠诊断

配种后28天，采集血液5ml，分离血清，利用爱德士可视早孕检测试剂盒，检查奶牛的受胎情况，并统计结果。

表2各组别精液混合液输精后的受胎率

处理 处理奶牛头数 妊娠头数 受胎率(％) 对照组 87 42 48.28±2.07a 褪黑素组 65 34 52.31±1.12b 地诺前列腺素组 59 32 54.24±1.35b 褪黑素组+地诺前列腺素组 82 56 68.29±2.60c

统计结果显示：该制剂可显著提高奶牛配种后的受胎率。

结论：由以上结果可知褪黑素和地诺前列腺素联合使用可以提高奶牛输精后的受胎率。因此，该组合试剂可应用于奶牛的体外输精。