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1、(10)申请公布号 CN 102552306 A (43)申请公布日 2012.07.11 CN 102552306 A *CN102552306A* (21)申请号 201010583270.1 (22)申请日 2010.12.13 A61K 31/7088(2006.01) A61K 39/395(2006.01) C07H 21/04(2006.01) C07K 16/18(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (71)申请人 马鞍山中美德康生物科技有限公司 地址 243000 安徽省马鞍山市花山区康佳花 园 6-7 (72)发明人 张雪晴 刘辉宇 (74)专利代理机。
2、构 马鞍山市金桥专利代理有限 公司 34111 代理人 许瑞祥 (54) 发明名称 一种中性粒细胞抗菌肽阻断剂治疗败血症的 方法 (57) 摘要 本发明公开了一种中性粒细胞抗菌肽 (HNP) 阻断剂治疗败血症的方法， 包括制备小分子干扰 RNA(siRNA)和抗人HNP抗体等阻断剂， 阻断、 中和 及减少中性粒细胞 HNP 的产量、 功能和生物活性。 通过设计和化学合成法， 体外制备小分子 siRNA。 通过设计生产HNP-1多肽与KLH交联， 然后免疫试 验兔， 获得兔免疫球蛋白。用同一个 HNP-1 多肽， 免疫小鼠， 制备抗 HNP-1 抗体的可变区， 然后制成 人源化单克隆抗人 HNP。
3、-1 抗体。小分子 siRNA 和 抗人 HNP-1 抗体均能有效阻断、 中和及减少中性 粒细胞的 HNP 产量、 功能和生物活性， 可用于治疗 细菌感染引起的败血症和其他相关疾病。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 4 页 1/1 页 2 1. 一种中性粒细胞抗菌肽阻断剂治疗败血症的方法， 其特征在于 ： 包括制备小分子干 扰 RNA(siRNA) 和抗人 HNP 抗体等阻断剂， 阻断、 中和及减少中性粒细胞 HNP 的产量、 功能和 生物活性， 治疗。
4、细菌感染引起的败血症和其他相关疾病。 2. 根据权利要求 1 所述的一种中性粒细胞抗菌肽阻断剂治疗败血症的方法， 其特征在 于 ： 所述的小分子干扰 RNA(siRNA) 阻断剂是用以下方法来制备的， 经酶切的双链 RNA 会形 成为小片段抑制 (siRNA)， siRNA 与信使 RNA(mRNA) 的同源序列互补结合， 使 mRNA 降解成小 片段， 从而导致 mRNA 失去功能 ； 设计 siRNA， AGGCACUGCUCUCCAAGAU， 并应用化学合成法体外 制备 siRNA 小片段， 保存于含有 RNA 稳定剂的溶液中。 3. 根据权利要求 1 所述的一种中性粒细胞抗菌肽阻断剂治。
5、疗败血症的方法， 其 特征在于 ： 所述的抗人 HNP 抗体阻断剂是用以下方法来制备的， 设计生产 HNP-1 多 肽， CACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC， 与 KLH 交联， 免疫试验兔， 取得大量的抗体血 清 ； 再经免疫学亲和层析的方法纯化兔血清， 获得兔免疫球蛋白 ； 同一个 HNP-1 多肽， CACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC， 与 KLH 交联后， 免疫 Balb/c 小鼠， 制成人源化单克隆 抗人 HNP 抗体。 4. 根据权利要求 1 所述的一种中性粒细胞抗菌肽阻断剂治疗败血症的方法， 其特征 在于 ： 治疗细菌感染引。
6、起的败血症和其他相关疾病时， 是采用阻断、 中和及减少中性粒细胞 HNP 的产量、 功能和生物活性的方法。 权 利 要 求 书 CN 102552306 A 2 1/3 页 3 一种中性粒细胞抗菌肽阻断剂治疗败血症的方法 技术领域 0001 本发明涉及生物制药领域。具体来说， 本发明涉及一种中性粒细胞抗菌肽阻断剂 治疗败血症的方法， 包括制备小分子干扰RNA(siRNA)和抗人HNP抗体等阻断剂， 阻断、 中和 及减少中性粒细胞 HNP 的产量、 功能和生物活性， 治疗细菌感染引起的败血症和其他相关 疾病。 背景技术 0002 已知中性粒细胞在败血症及多器官功能衰竭的发生发展中起着关键性的作用。
7、 【参 阅文献Brown， 等， Lancet 368， 157-169(2006)】 。 中性粒细胞含有大量的多肽、 酶、 小分子等 物质。他们在杀死、 裂解和消灭被吞噬进入中性粒细胞内的细菌、 病毒和真菌有重要作用。 然而， 这一作用只有在中性粒细胞内可以完全发挥。 一旦中性粒细胞自身裂解， 这些物质可 以损伤周边细胞、 组织、 乃至器官。因此， 保护中性粒细胞完整是治疗败血症的重要手段。 0003 防御肽 (defensin) 在机体天然免疫中发挥重要作用 【参阅文献 Klotman 等， Nat Rev Immunol 6， 447-56(2006)和Selsted等， Nat Imm。
8、unol 6， 551-7(2005)】 。 他们直接或间 接地杀伤细菌、 病毒、 真菌及其他微生物。人体白细胞和上皮细胞产生和分泌多种防御肽。 人中性粒细胞分泌的有中性粒细胞防御肽 (HNP)， 包括 HNP-1、 -2、 -3 和 -4， 是主要的 - 防 御肽， 它们在中性粒细胞防御和控制感染中起到重要作用。肠道 Paneth 细胞也分泌 - 防 御肽。它们是 HD-5 和 HD-6 二种， 是肠道防御和控制感染的主要门户。许多表皮细胞， 如多 种上皮细胞及皮肤细胞等则分泌 - 防御肽， 如 hBD-1、 hBD-2、 hBD-3、 hBD-4 等等。 0004 中性粒细胞中多达 40的。
9、蛋白成分是 HNP 【参阅文献 Ganz 等， Curr OpinImmunol 6， 584-9(1994) 和 Selsted 等， J Clin Invest 76， 1436-1439(1985)】 。这些 HNP 在正常 情况下包囊在中性粒细胞的分泌颗粒内。因此， 正常情况下人血清中 HNP 的浓度非常低， 多数检测不到， 最高在 0.2 微克 / 毫升。然而， 在病理情况下， 特别是在细菌感染时， 大量 中性粒细胞被活化并破坏， 血液中 HNP 含量明显升高 【参阅文献 Brown， 等， Lancet 368， 157-169(2006)】 。已有报道称细菌感染性败血症时血液中 。
10、HNP 量可以达到 170 微克 / 毫升 【参阅文献 Ihi 等， Clin Infect Dis 25， 1134-1140(1997) 和 Panyutich 等， J Lab Clin Med122， 202-207(1993)】 。这提示 HNP 除了直接杀灭外侵的微生物之外， 还可能有病理性致 病作用。 文献尚未报道过HNP在败血症中有病理性致病作用。 只有一篇文献提到大剂量HNP 用于正常大鼠肺部时致使其肺功能低下和肺功能衰竭 【参阅文献 Zhang 等， Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 280， L947-L954(2001)】 。这只能间。
11、接表明 HNP 可能在败血症的发 生发展中有重要作用。 0005 到目前为止， 尚无医学和药学方法来阻断、 减少和中和中性粒细胞 HNP 的产量、 功 能和生物活性， 用于治疗细菌感染引起的败血症等疾病。 发明内容 0006 本发明的目的就是用医学和药学方法来阻断、 减少和中和中性粒细胞外 HNP 的产 说 明 书 CN 102552306 A 3 2/3 页 4 量、 功能和生物活性， 治疗细菌感染引起的败血症和其他相关疾病。 首创一种中性粒细胞抗 菌肽阻断剂治疗败血症和其他相关疾病的方法， 包括制备小分子干扰 RNA(siRNA) 和抗人 HNP 抗体阻断剂， 阻断、 减少和中和中性粒细胞。
12、 HNP 产量、 功能和生物活性， 治疗细菌感染引 起的败血症和其他相关疾病。 0007 为实现本发明之目的， 本发明中性粒细胞抗菌肽阻断剂通过以下技术方案来实 现。 0008 1、 制备 siRNA。经酶切的双链 RNA 会形成很多小片段， 称为小片段抑制 RNA(siRNA)。siRNA 与信使 RNA(mRNA) 的同源序列互补结合， 使 mRNA 降解成小片段 RNA， 从 而导致mRNA失去功能， 不能被翻译成蛋白质。 设计siRNA， 5-AGGCACUGCUCUCCAAGAU-3， 并应用化学合成法体外制备siRNA小片段， 保存于含有RNA稳定剂的溶液中。 理论上， siRNA。
13、 小片段可以用于减少中性粒细胞所有 HNP 亚型 (HNP-1-4) 的表达水平。该小分子 siRNA 可 以有效地减少中性粒细胞产生 HNP( 见图 1)。从而确保单一 siRNA 制剂可以有效降低同源 互补 HNP 蛋白。 0009 2、 制备抗人 HNP-1 抗体。为了生产特异的抗人 HNP-1 抗体， 设计生产了 HNP-1 多 肽， CACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC。把这一多肽与 KLH 交联， 然后免疫试验兔， 取得 大量抗体血清。再经免疫学亲和层析的方法纯化兔血清， 获得兔 免疫球蛋白 (IgG)。经动 物和细胞试验结果表明， 该抗人 HNP-1 抗。
14、体可以有效地中和中性粒细胞外 HNP( 见图 2 和图 3)。 为了达到治病这一目的， 需要生产特异的人源化单克隆抗人HNP抗体。 应用上述相同的 HNP-1 多肽， CACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC， 与 KLH 交联后， 免疫 Balb/c 小鼠， ELISA 方法证明产生了高效价的抗人 HNP-1 抗体。制备抗 HNP-1 抗体的可变区， 然后制成人源化 单克隆抗人 HNP-1 抗体。图 4 为人源化单克隆抗人 HNP 抗体的生产程序。 0010 HNP 阻断剂治疗细菌感染引起的败血症和其他各类疾病是本发明的核心部分。 siRNA 和抗人 HNP-1 抗体，。
15、 均能有效地抑制和阻断 HNP 产量、 功能和生物活性。抗人 HNP-1 抗体能够抑制 HNP 引起的细胞损伤， 也能抑制 HNP 导致的细胞凋亡。 0011 siRNA 和抗人 HNP-1 抗体是二种不同的制剂。siRNA 减少 HNP 在中性粒细胞内表 达， 然而抗人 HNP-1 抗体则是中和中性粒细胞外的 HNP-1， 所以这二种制剂同时应用可能有 加强作用。 0012 本发明具有减少、 抑制和消除 HNP 在细菌感染性疾病中的致病作用。与抗生素联 合用药， 可以加强抗生素的治疗效果。 0013 附图说明 0014 图1 ： siRNA降低HNP表达水平。 从人骨髓分离培养单个核细胞， 。
16、用每毫升116-8 慢病毒 pfu 感染骨髓细胞导入 siRNA48 小时后， 取 1.5 微克总 RNA 反转录成 cDNA， 50 倍稀 释后定量 PCR 检测 HNP 表达水平。 0015 图 2 ： 抗 HNP-1 抗体中和中性粒细胞外 HNP 激活 Akt。从人痰液中提取的 HNP 复合 物与抗人 HNP-1 抗体孵育 30 分钟后作用于肺癌 A549 细胞 30 分钟。裂解细胞后用免疫酶 标记法检测细胞内 Akt 活性。*， #p 0.001vs HNP 组。 0016 图 3 ： 抗 HNP-1 抗体中和中性粒细胞外 HNP 引起细胞凋亡。从人痰液中提取的 HNP 复合物与抗人H。
17、NP-1抗体孵育30分钟后共同作用于肺癌A549细胞8小时后检测细胞凋亡。 *， #p 0.001vs HNP 组。 说 明 书 CN 102552306 A 4 3/3 页 5 0017 图 4 人源化单克隆抗人 HNP 抗体的生产程序 具体实施方式 0018 为进一步描述本发明， 下面结合实施例对本发明一种中性粒细胞抗菌肽阻断剂治 疗败血症的方法作进一步的描述。 0019 实施例 1 0020 为高效表达 siRNA， 使用了慢病毒载体 (Lentiviral vector) 系统， 因为慢病毒载 体较逆转录病毒载体有更广的宿主范围。基因序列 AGGCACTGCTCTCCAAGAT 被组装。
18、入自行研 制的慢病毒载体中。慢病毒载体与其他载体成分共同导入人 293T 细胞中， 以便复制表达慢 病毒。48 小时后， 慢病毒滴度达到每毫升 11013空斑形成单位 (pfu)。 0021 为了检验上述 siRNA 能够有效抑制 HNP 表达， 从大鼠骨髓中制备骨髓细胞。颈椎 脱臼处死 2 只 Wistar 大鼠。75酒精消毒全身， 共取 4 根股骨。用 RPMI1640(pH7.2) 在无 菌环境中冲洗出全部骨髓细胞。用吸管吹打 5 次， 再通过 4 号针头 5 次， 制成单细胞悬液。 在 1000 转 / 分钟下离心 10 分钟， 弃上清。沉淀用 RPMI1640 液调细胞浓度至每毫升 。
19、1107 个。用 2台盼蓝染色检查骨髓细胞活性， 每次制备的细胞活性都在 95以上。于 6 孔板 中加入 1 毫升 1107个细胞培养。次日， 用每毫升 1108pfu 慢病毒感染骨髓细胞 48 小时 后提取总 RNA， 用 1.5 微克总 RNA 反转录成 cDNA， 50 倍稀释后定量 PCR 检测 HNP 表达水平。 如图1所示， 在每毫升1106pfu慢病毒感染后骨髓细胞的HNP表达水平即有明显下降。 用 每毫升 1108pfu 慢病毒感染后更大程度地降低了骨髓细胞表达 HNP。 0022 实施例 2 0023 为了阐明抗人HNP-1抗体能够有效中和中性粒细胞外HNP的活性， 作了二个。
20、试验。 第一个试验， 从 30 例慢性支气管肺炎病人的混合痰液中提取了复合 HNP(70为 HNP-1、 21是 HNP-2 和只有 5是 HNP-3， 没有可检测的 HNP-4) 【参阅 文献 Khine， 等， Blood 107， 2936-2942(2006)】 。100 微克 / 毫升 HNP 复合物与抗人 HNP-1 抗体 (1、 10 和 200 微克 / 毫 升 ) 室温下孵育 30 分钟后， 取其混合物 10 微克 / 毫升作用于肺癌 A549 细胞， 30 分钟后裂 解细胞用免疫酶标记法检测细胞内 Akt 酶活性。结果显示抗人 HNP-1 抗体可以阻断 HNP 激 活肺癌 。
21、A549 细胞内 Akt 酶活性 【见图 2】 。第二个试验， 用人痰液中提取的 100 微克 / 毫升 HNP 复合物与抗人 HNP-1 抗体 (1、 10 和 200 微克 / 毫升 ) 孵育 30 分钟后， 共同作用于肺癌 A549 细胞， 8 小时后用 Apoptosis Detection Kit 检测细胞凋亡 【见图 3】 。很明显， 单用 HNP 复合物 (100 微克 / 毫升 ) 后， 65细胞凋亡。抗人 HNP-1 抗体在 1 微克 / 毫升水平即 已明显阻止 HNP 的细胞毒性作用。剂量加大后， 抗人 HNP-1 抗体的这种阻断效应增强。 0024 最后， 用抗人 HNP。
22、 抗体治疗败血症动物模型。败血症动物模型是在 Wi star 大鼠 中建立的。总共 6 只 Wistar 大鼠被用于试验， 其中 3 只大鼠腹腔内注射抗人 HNP-1 抗体 (50 微克 / 公斤 )， 3 只大鼠腹腔内注射生理盐水作对照。生理盐水注射大鼠均成功诱导败 血症， 而抗人 HNP-1 抗体治疗者无一例败血症诱导成功。 说 明 书 CN 102552306 A 5 1/4 页 6 图 1 说 明 书 附 图 CN 102552306 A 6 2/4 页 7 图 2 说 明 书 附 图 CN 102552306 A 7 3/4 页 8 图 3 说 明 书 附 图 CN 102552306 A 8 4/4 页 9 图 4 说 明 书 附 图 CN 102552306 A 9 。