本发明阐述了一个制备有生物活性的立体专一形式的通式为 的化合物或其盐或酯的方法，如它的碱金属盐，碱土金属盐，其中R代表一个任意取代的芳基如苯基或萘基，它们被包括在任意的杂环系统;R1还表示一个任意取代的芳杂环系统，环中除碳原子外还可选择一个或更多个杂原子如氮、硫和氧。
大家知道很多有生物活性的化合物是以立体异构体混合物形式存在的，这些混合物至今还常被用于农业或药物上，通常对映异构体中只有一个异构体有生物活性，所以它的消旋体的活性强度就会减半，应用消旋体的一个主要的原因是分离消旋体的代价大于活性增强可能提供的好处，然而很明显的一点就是现代药理学家越来越意识到以混旋体给药，其中某种立体异构体必须看作是杂质，它可能没有所需的治疗作用，甚至会有一些不需要地生理作用包括对机体的毒性。
更具体些，发现萘普生和布洛芬的体内抗炎活性的主要活性形式是S-型异构体（光学活性的异构体），它的活性是其对映体的150倍，由S.Adams et al，J.pharm.Pharmae.28（1976）.256以及
A.
J.Hutt和J.Caldwell，Cliaical Pharmacokinetecs 9（1984）.371等报道。
S.Iriuchiuima和A.Keiyu[Agrie.Biol.Chem。，45
（1981）1389]报道：选择一些微生物可水解萘普生和酮基布洛芬的甲酯，但很少改变它的构型。酱油曲霉菌（Aspergillus soje）主要水解R-构型的萘普生的甲酯，产生95%（重量比）的R-构型萘普生，而包皮垢分枝杆菌（Mycobacterium Smegmatis）主要水解S-酮基布洛芬的甲酯产生69%（重量比）的S-构型酮基布洛芬。
德国专利申请DE3345660描述了从消旋的萘普生的酯制备S-萘普生的方法，然而这个申请中的S-萘普生也不是直接由消旋的萘普生酯生成的，而是通过皂化或用酶水解S-萘普生的酯而得到的，这个S-萘普生的酯原来留在用酶水解R-萘普生酯且产生的R-萘普生被S-萘普生酯分离后的反应混合物中。
近期的文献（QU-Ming et al.，Tetrahedron Letters，Vol.27，no.16（1986）P.17-63）报道了一个用一种酵母菌（Candida cylindracea）的酶制备法，它能立体选择地水解S-萘普生酯，作者说明它们制备的念珠脂酶可以水解萘普生酯，然而，纯净的脂酶的活性是非常低的（在它们实验的具体条件下每毫克脂酶在每分钟内水解3×10摩尔酯）。
所以目前仍非常需要一个适合工业规模的，产率高的直接制备S-立体异构体的方法，本发明的目的就是提供一个这样的方法。基于广泛的研究和实验，发现了一种改进的选择合成法，用于制备化合物（Ⅰ）的S-立体异构体，它是通过微生物或从它来的化合物的作用，使通式为的化合物进行立体选择地水解为化合物（Ⅰ），通式（Ⅱ）中R1如前所定，R2为酯的一部分，宜为任意的烷基。产物中S-异构体至少占80%（重量比），根据制剂需要，可将化合物（Ⅰ）制成它的盐或酯。
更具体地说，本专利是有关一个生产有生物活性的立体专一的S-构型的化合物（Ⅰ）或它的适合制剂的盐或酯的方法，最好是碱金属盐和碱土金属盐。（Ⅰ）式中R1是一个任意取代的芳基如苯基或萘基，取代基可包括一个任意取代的杂环系统，或者R1可代表一个任意取代的芳杂环，除了碳原子以外还可选择一个或更多的杂原子如氮，硫和氧。通式（Ⅱ）中R2为任意取代的烷基，化合物（Ⅱ）受到微生物的作用，进行立体选择性的水解，生成立体专一性的化合物（Ⅰ）。
R2最好为1到8个碳的直链烷基，尤其是R2为甲基或乙基。
化合物（Ⅰ）最好为萘普生，布洛芬，噻丙吩、苯氧苯丙酸、酮布洛芬、苯恶丙酚、卡巴唑丙酸（Carprofen）、丙酸、吡丙芬，里西丙芬（isiprofenum）、氟联苯丙酸、氟苯丙酸（fluprofen）、克利得纳（Clidanac）叔丙吩（tertiprofen）己基苯丙酸（hexaprofen）、茚酮苯丙酸、甲氧基苯丙酸（mexoprofen）、吡喃苯丙酸（pranoprofen）、R803、吩噻嗪丙酸、酮基噻丙酸（fiaprofenic acid）或布鲁潘齐（brofezil）
按照本专利提供的方法，最好的情况是S-构型占优势的萘普生制备。
根据上述这些有利的情况，通过选择合适的微生物或从它们得到的物质完成了这一方法，生成的化合物（Ⅰ）至少90%（重量比）是S-构型的。
本发明的另一个目的提供一个酶;活性至少比上述提到的那种酵母菌脂酶高10倍，较好的情况下可高100倍。
本发明的再一个目的就是提供一个制备至少有80%R-构型的化合物（Ⅰ）的方法，按照发明中的方法，将S-型化合物（Ⅰ）分离后，水解余下的部分即得。
“合适的微生物”是指一些属于杆菌属（Bacillus）假单胞菌属（Pseudomonas），关节芽胞杆菌属（Arehrobactev，毛霉菌属（mucor）或链霉菌属（Streptomyces）的一些微生物。
通过引入新的遗传物质而具有立体选择性地水解化合物（Ⅱ）到化合物（Ⅰ）能力的微生物也包括在“合适的微生物”之内。
上述说的方法就是具有立体选择水解之类的某些经过筛选的微生物的酯酶的克隆基因，转移到另一个微生物内，通常是转移到大肠杆菌（Escherichia Coli）内，其它微生物可属于酵母菌属（Saccharomyces），克鲁维酵母属（Kluyvenomyces），曲霉菌属（Aspergillus），艾歇利烯菌属（Escherichia），假单胞菌属（Pseudomonas）和链霉菌属（Streptomyces）。克隆基因的选择是根据它们能表达一个水解β-萘乙酸酯和萘普生酯的酶。或选择与业经选择的表达酯酶的基因进行交叉杂化的基因。后一个设想基于下列实验现象：在有关的微生物中，表达相应的酶的DNA序列显示一致性（Ihara et al.，1985，J.Beochem.98，P.95）以及我们实验中发现细胞质体pNAPT-7（见例11）和从其它的杆菌得到的染色体DNA有交叉杂化作用。除此之外，本发明还提供了一个往微生物内植入表达酯酶的多重的和/或经修饰的基因片段的方法，它可以使微生物或从它得到的物质在转化化合物（Ⅱ）的化合物（Ⅰ）的过程中活性提高。这个微生物可以是例如枯草杆菌（Bacillus subtilis）。
这些微生物可用聚合物的凝胶等物质来固定，这时可以以活的细胞和/或杀死的细胞的形式进行固定，而用微生物的酯酶时，可根据对活性的需要进行某种程度的纯化。
所以，“微生物或从它们得到的物质”是指活的或杀死的微生物，从它们得到的提取物，可以是浓缩的或纯化的。
更具体地说，适用于水解萘普生的甲酯和乙酯[分别为2-（6-甲氧基-2-萘基）丙酸甲酯和2-（6-甲氧基-2-萘基）丙酸乙酯]为S-型萘基普生[2-（6-甲氧基-2-萘基）丙酸]及水解布洛芬的甲酯和乙酯[分别为2-（4-异丁基-1-苯基）丙酸甲酯和2-（4-异丁基-1-萘基）丙酸乙酯]为S-型布洛芬[2-（4-异丁基-1-苯基）丙酸]微生物有：枯草杆菌（Bacillus subtili）），苔状杆菌（Bacillus ticheniformis）样品储存在ATCC，登记号11945）;荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens），恶臭假单胞菌（Pseudomonas Putida），（样品储存在IFO.登记号12996）;核黄素假单胞菌（Pseudomonas riboflavina）（样品储存在IFO，登记号13584）;卵状假单胞菌（Pseudomones ovalis）（样品储存在IAM.登记号1049）;铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）（Pseudomonas aeruginosa）（样品储存在IFO，登记号13130）;多棱大孢子毛霉菌Mulor augulimaero sporus（样品储存在IAM，登记号6149）;石蜡关节芽胞杆菌（Arthoobacter Paraffmeus）（样品储存在ATCC.登记号21218）;菌株为Ⅲ-25（样品储存在CBS.登记号666.86）;菌株LK3-4（样品储存在CBS.登记号667.86）;菌株SP4（样品储存在CBS，登记号668.86）;菌株Thai Ⅲ18-1（样品储存在CBS，登记号669.86）和菌株Thai Ⅵ 12（样品储存在CBS，登记号670.86）。在枯草杆菌中，较好的菌种是杆菌Thai 1-8（样品储存在CBS.登记号679.85），杆菌ⅠnⅠv-8（样品储存在CBS，登记号680.85），杆菌Nap 10-M（样品储存在CBS.登记号805.85），杆菌spⅢ-4（样品储存在CBS，登记号806.85），枯草杆菌1-85（Yuki，S.，1967，Jpn.J.Genet.42.P251），枯草杆菌1-85/pNAPT-7（样品储存在CBS，登记号673.86），枯草杆菌1A-40/pNAPT-8（样品储存在CBS，登记号674.86）和枯草杆菌1A-40/pNAPT-7（样品储存在CBS，登记号675.86）。荧光假单胞菌中较好的是假单胞KorⅠ-6（样品储存在CBS登记号807.85）和荧光假单胞菌（样品储存在IFO，登记号3081）。
[注]：ATCC美国标准菌库
CBS：荷兰真菌菌种收藏中心
IFO：日本发酵研究所（大阪）
IAM：东京大学应用微生物研究所。在本发明较佳的制备实施方法中，微生物能够将化合物（Ⅱ）转变为化合物（Ⅰ），其中S构型至少占80%（重量比），微生物必须经过大约0.5到10天的培养。然后，悬浮于液体营养培养基上的细胞作用于化合物（Ⅱ）;或者将细胞杀死，如将其悬浮于使细胞溶解的介质上，让从这些细胞中抽提出的物质作用于化合物（Ⅱ）。
上述提到的微生物培养0.5到10天后，在将它们悬浮于液体营养培养基或细胞溶解培养基之前，可首先从培养它的培养基中分离出来。
在培养用于选择性水解化合物（Ⅱ）的微生物时，采用一般的培养基，其中含有可被同化的碳源（如葡萄糖，乳酸盐，蔗糖等），氮源（如硫酸铵，硝酸铵，氯化铵等），一个能提供有机营养源的物质（如酵母抽提物，麦芽提取物，陈，肉类抽提物等）和一个无机营养源（如痕迹量的磷酸盐，镁、钾、锌，铁及其它金属）。
Jap培养基是一个较好的培养基，它可任意地加入一种或几种成分作为营养。可采用含有下列成分的Jap培养基：大豆粉（30克/升），硝酸钠（7.5克/升），七水硫酸亚铁（0.28克/升），枸椽酸钠（6克/升）和果糖12.5克/升），PH值调至7.2。培养基在使用前在120℃消毒20分钟。
另一个较好的培养基是TSB-medium 2X，可任意加入一种或几种物质作为营养，可以选用含60克/升胰蛋酶大豆肉汤（OXoid）培养基，使用前于120℃消毒20分钟。另一个较好的培养基是2XTY，可任意地加入一种或几种物质作为营养，如可选用含下列成分的培养基;胰（蛋白）胨（Difco）30克/升，酵母抽提物（Difco）20克/升，氯化钠3克/升，（NH4）2HPO41克/升和（NH4）2SO41克/升，PH为6.8，培养基在使用前于110℃消毒30分钟。更好的培养基是脱酯乳培养基，它可加入一种或几种物质作为营养。实验中采用的脱酯乳含下列成份：由脱酯奶粉制成的10%的脱酯乳，它在使用前于110℃消毒30分钟。
作为脱酯乳培养基的营养物质可加入0.5%的乳酸盐或PSⅠⅠⅠ盐或同时合并加入。实验中曾用了含下列成分的PSⅠⅠⅠ盐培养基：磷酸二氢钾（2.1克/升），磷酸氢二铵（1.0克/升），硫酸铵（0.9克/升），氯化钾（0.2克/升），枸椽酸钠（0.29克/升），二水硫酸钙（0.005克/升），七水硫酸镁（0.2克/升），六水硫酸亚铁铵（2.5毫克/升），七水硫酸锌（0.5毫克/升），四水氯化锰（0.3毫克/升），五水硫酸铜（0.15毫克/升），六水氯化钴（0.15毫克/升），原硼酸（0.05毫克/升），二水钼酸钠（0.055毫克/升）和碘化钾（0.1毫克/升），PH调至6.8，使用前PSⅠⅠⅠ培养基在120℃灭菌20分钟。
在微生物生长的过程中温度保持在0到45℃之间，PH保持在3.5到9之间，较适宜微生物生长的温度是20到37℃，PH为5到9。
微生物生长过程中按照一些现成的方法提供一个较好的通气条件，这样可提供充足的氧以满足微生物代谢的需要。最简单的方法是供给氧气，一般以空气的形式，也可以同时振摇或搅拌反应液。在转变化合物（Ⅱ）到化合物（Ⅰ）的过程中，微生物可以处在生长阶段（用上述提到的普通培养基），也可以保存在能防止酶的降解的体系（培养基或缓冲液）中。
在将化合物（Ⅱ）转变为化合物（Ⅰ）的过程中，可采用普通的培养基，当需要时加入可同化的碳源（如葡萄糖，乳酸盐，蔗糖等），氮源（如硫酸铵，硝酸铵，氯化铵等），有机营养源（如酵母抽提物，麦芽抽提物，胨，肉类抽提物等），无机营养源（如痕迹量的磷酸盐，镁，钾，锌，铁和其它金属）。
在转变化合物（Ⅱ）到化合物（Ⅰ）的过程中，较好的培养基为Jap培养基（如上所述），可以加入一种或几种营养物质。更好的培养基是脱酯乳培养基（如上所述），可以加入一种或几种营养物质。
微生物可以保持在一个非生长状态，例如通过除去可同化的碳源或氮源。在这一阶段温度保持在0到45℃，PH保持在3.5到9之间。
较好的情况是将微生物保存在温度20到37℃，PH在5到8之间。这一阶段所需的通气条件可通过一个现成的方法达到，它可提供氧以满足微生物代谢的需要，最简便的方法是供给氧气，通常以空气的形式，也可以同时振摇或搅拌反应液，由这些微生物或由它们而来的物质产生出来的化合物（Ⅰ）可按这类产品已知的方法得到和精制。
这些微生物可保存在琼脂上，在50%的甘油中冷冻或真空冷冻。若需要的话，这些微生物可按一些现成的方法进行预先培养，如在一个旋转振荡器上将微生物在肉汤或BHI中在30℃培养24小时。可采用含有下列成分的肉汤培养基：Lab Lemco L29（肉的抽提物，Oxoid）（9克/升），Bactopepton（10克/升）和氯化钠（5克/升），PH调到7.6。使用前培养基在120℃灭菌20分钟。
BHI（脑心浸液）培养基含有0.037克/升BHI（Oxoid），PH值调到7.0。培养基在使用前在120℃灭菌20分钟。
对杆菌Thai 1-8的水解s-萘普生甲酯的酶进行了研究，发现酯酶的活性与微生物体内脂酶的活性无关。实际上，少量的构型错误的萘普生的水解似乎主要是由于杆菌菌株持有脂酶活性。被纯化的杆菌Thai 1-8的萘普生酯酶具有比杆菌的细胞溶解液高得多的对映体选择性。
大肠杆菌/PNAPT-7（E.coli/PNAPT-7）和杆菌/PNAPT-7（Bacillus/PNAPT-7），这两个菌株都有一个含有杆菌ThaiⅠ-8酯酶质体，都能产生可观量的S-型萘普生酯酶。令人奇怪的是，经过SDS-PAGE，HPLC-SEC和等电点聚焦法证实，具有酯酶活性的蛋白质远不是微生物细胞溶解液中浓度最高的蛋白质。虽然已经知道植入新的基因可改善酶的表达水平，但该酯酶增加的程度是令人吃惊的。在植入表达酶的基因时经常遇到很多问题，如不正确的折叠，蛋白质降解和细胞内沉淀等（Harris，T，J.R.，1983Genetic Engineering 4.Academic Press）。出乎意料的是在植入酯酶基因时似乎未发生这类问题。
在本专利说明书中s-立体专一性定义为
（生成的）S
（生成的）R+（生成的）S
本专利的通过下列一些例子作一些进一步的说明，但本专利的范围不局限于这些例子。
例1
微生物法使消旋的萘普生乙酯转变为S-型萘普生[用杆菌ThaiⅠ-8、杆菌Ⅰn.Ⅰv-8、杆菌Nap 10M、杆菌spⅢ-4、苔状杆菌（ATCC11945）和假单胞菌KorⅠ-6]
杆菌ThaiⅠ-8、杆菌ⅠnⅠv-8、杆菌Nap 10M、杆菌spⅢ-4、苔状杆菌（ATCC 11945）和假单胞菌KorⅠ-6分别置于500毫升的有挡板的烧瓶加25毫升10%的脱酯乳，在旋转振荡器上30℃培养48小时，在该生长期后，将100毫克萘普生乙酯溶于500毫克的豆油中，在110℃灭菌一小时后加到培养物中去。取决于微生物，需要2到5个培养物。培养物在旋转振荡器上于30℃再培养24小时，然后，用磷酸酸化培养基到PH值2至3，加入少量的硫酸铵，每25毫升培养基加入20毫升氯仿或者乙酸乙酯进行提取。提取液用薄层层析（TLC）分析，TLC硅胶板（硅胶60，F254荧光指示）用氯仿加1%的冰乙酸展开，使萘普生乙酯和萘普生能够分开。萘普生乙酯的Rf值为0.7，萘普生的Rf值为0.2。之后蒸发有机相，所得油状物上硅胶柱、用醚洗脱得纯的萘普生。结果列于表1中。
旋光用Perkin-Elmer141旋光仪在1或10厘米长（体积0.5或5毫升）的腔内于室温下测定，旋光值是在589nm（钠D线）下测得的。
测定旋光值时将产物（最多50毫克）溶于5毫升甲醇。商品s-萘普生（商品名secifarma）的旋光值｜α｜rtD为+60°。
表1
微生物水解2-（6-甲氧基-2-萘基）
丙酸乙酯成为2-（6-甲氧基-2-萘基）
丙酸，将底物转变为光学活性产物。
微生物 所加酯的总量 培养后回收 得到的 ｜α｜rtD
（mg） 的酯量（mg） 萘普生
（mg）
杆菌 ThaiⅠ-8 400 n.d.＊ 23＊＊ +57°
杆菌 Ⅰn Ⅳ-8 500 210 75 +60°
苔状杆菌 200 53 32 +52°
（ATCC 11845）
杆菌 SpⅢ-4 400 n.d.＊ 33＊＊ +37°
杆菌Nap 10M 200 110 30 +44°
假单胞菌KorⅠ-6 200 93 25 +43°
＊ n.d.-未测定
＊＊分离后所剩的量
例2
由微生物水解得到的萘普生中R.S.对映体的分布
如例1中所述，所有试验是在100ml有档板的烧瓶中25ml的培养基上进行的。所有的培养基都是用在BHI培养基上预生长24小时后的培养物接种的。
投入溶于豆油的大约20mg的消旋的萘普生乙酯，在1小时和24小时进行分析。
提取物用HPLC分析，酯和酸用硅胶柱（CP-Sper-si，Chrompack）分开。流动相：异辛烷/乙酸乙酯/甲酸（875ml/125ml/3.5ml）。流速：1.7ml/min。保留时间：萘普生乙酯Rt＝3.8分钟。萘普生Rt＝9.0分钟。
为测定它的对映体的纯度，对萘普生样品经衍生化，成为萘甲酰胺衍生物，它们可通过DNBPG手性柱得到分离，洗脱剂：异辛烷/氯仿/甲醇（900ml/70ml/30ml）;流速：2ml/min。
衍生化的S-萘普生和R-萘普生的保留时间分别为28.1分钟和30.7分钟。
衍生化的步骤：
将2ml提取液在氮气流下干燥，干燥后的样品和200μl苯及10μl二氯亚砜在60℃反应10分钟，反应混合物在氮气流下干燥，加入200μl5%的萘甲基胺的干燥二氯甲烷溶液，反应在室温下进行1小时。反应混合物再次在氮气流下干燥，然后用2ml的异辛烷/氯仿（2∶1体积比）和2ml 1N的盐酸进行提取，有机相用HPLC分析，结果列于表2。
表2
微生物水解得到的萘普生的
R.S.对映体的分布
微生物 培养周期 生成的 生成的 S-萘普 R-萘
（小时） S-萘 R-萘 生 普生
普生 普生 % %
（mg/培 （mg/培
养基） 养基）
杆菌ThaiⅠ-8 1 1.26 0.014 99 1
24 7.14 0.59 92 8
杆菌 ⅠnⅣ-8 1 0.48 0.008 98 2
24 4.18 0.40 91 9
苔状杆菌 1 0.28 0.014 95 5
（ATCC 11945） 24 4.76 0.086 98 2
假单胞菌KorⅠ-6 24 2.8 0.07 98 2
杆菌 Nap 10M 24 1.3 0.01 99 1
杆菌 SpⅢ-4 24 2.5 0.3 89 11
例3.
用不同的微生物转变消旋的萘普生甲酯为S-萘普生。
象例1和例2描述的那样，所有的测定在100ml档板烧瓶中的25ml培养基上进行，但往培养基内加入的不是消旋的萘普生乙酯，而是消旋的萘普生甲酯。培养基是从已在BHI培养基上生长24小时的培养物接种的。
结果列在表3
表3
微生物 生成的萘普生 S% R%
（mg/培养基）
杆菌ThaiⅠ-8 6.9 96 4
杆菌 ⅠnⅣ-8 2.0 90 10
苔状杆菌 8.6 98 2
（ATCC 11845）
杆菌Nap 10M 3.2 99 1
杆菌 SpⅢ-4 5.8 82 18
例4
用杆菌ThaiⅠ-8，杆菌ⅠnⅣ-8和苔状杆菌（ATCC11945）转变S-萘普生乙酯为S-萘普生。
所有的测定象例1中一样都是在100ml档板的烧瓶中25ml的培养基上进行的，所有的培养基都是从已在BHI培养基上生长了24小时的培养物接种的。
被水解的S-萘普生乙酯的量列在表4
表4
在加入PSⅢ和乳酸盐的脱脂乳培养基上
24小时内被水解的S-萘普生的量。
微生物 24小时后剩余的酯 生成的萘普生
（mg）＊（mg）
杆菌ThaiⅠ-8 7.9 18.6
杆菌 ⅠnⅣ-8 15.0 10.5
苔状杆菌 11.6 10.2
（ATCC 11945）
＊每25ml培养基加入大约30mg的酯
例5
在发酵器中生长的杆菌ThaiⅠ-8转化消旋的萘普生乙酯为S-萘普生。
杆菌ThaiⅠ-8预先在BHI培养基上培养生长24小时，之后移植50ml培养液到10升的Eschweilen发酵器中，其中含有10%的脱脂乳培养基或加入PSⅢ盐和5克/升乳酸盐的10%的脱脂乳培养基。
所用的发酵条件是：
体积：5升培养基
温度：30℃
搅拌速度：500转/分
空气流速：50升/小时
消沫剂：自动滴加消沫剂Pluronic L81.
PH：不调节（PH值在6到9之间自由变动）。
微生物在发酵器内生长70小时，在此期间取几次样品，检测它们对萘普生乙酯的反应活性。检测的方法是取25ml样品在档板烧瓶中于30℃培养1小时，加入溶于豆油的20mg消旋萘普生乙酯，培养完成后进行提取，衍生化，用HPLC分析结果。
24小时以后，微生物的干重和它的单位体积的活性不再发生变化。培养液为脱脂乳时PH值从6.0上升到7.8，当培养液为加营养的脱脂乳时PH值从6.0上升到8.4。
结果总结在表5。
表5
杆菌ThaiⅠ-8分别用
脱脂乳和加营养的脱脂乳培
养时发酵的结果：
脱脂乳作为培养液 加入PSⅢ和乳酸
盐的脱脂乳作为培养液
干重 1.2～1.3克/升 2.5～2.6克/升
单位体积的活性 形成30mg萘普生/升/小时 形成53mg萘普生/升/小时
对映体分布 96% S，4% R 91% S，9% R
例6
在发酵器中生长的杆菌ⅠnⅣ-8转化消旋的萘普生乙酯为S-萘普生。
杆菌 ⅠnⅣ-8以例5中相同的步骤处理，在70小时的培养过程中取样，分析，办法同前，发现干重和单位体积的活性在此过程中丝毫不发生变化。用脱脂乳作培养基时，其PH值从6.4升到7.9，当用加营养的脱脂乳作培养基时，其PH值从6.2上升到8.4。
结果总结在表6中。
表6
杆菌 ⅠnⅣ-8分别用
脱脂乳和加营养的脱脂乳培
养基时的发酵结果：
脱脂乳作为培养液 加入PSⅢ和乳酸
盐的脱脂乳作为培养基
干重 0.7克/升 2.5克/升
单位体积的活性 形成10mg萘普生/升/小时 形成25mg萘普生/升/小时
对映体分布 94% S，6% R 未测
例7：
用不同的微生物将消旋的布洛芬乙酯转化为S-布洛芬
象例1和例2中那样，所有的实验是在100～500ml的档板烧瓶的25～100ml的培养基中进行的。培养基是从预先已在营养丰富的复合培养基（如BHI.）生长24小时的培养基中接种，再生长48小时。根据培养基的体积，加入20或80μl的消旋布洛芬乙酯，培养24小时。
往培养基中加入少量的硫酸铵，用H3PO4酸化到PH2.5，加CH2Cl2提取，提取液中的布洛芬转变为萘甲基胺的酰胺衍生物，以便测定它的光学纯度。
往3ml提取液中加入200μl碘化2-溴-1-甲基吡啶的二甲基甲酰胺溶液（50mg/ml）和200μl 1-萘甲基胺的CH2Cl2溶液（100mg/ml），在22℃反应5分钟，反应混合物在氮气流下于60℃干燥，将残余物溶于异辛烷/CH2Cl2（2∶1体积比）中，加入2ml 1N的硫酸后进行提取。
有机相用HPLC分析，选用DNBPG手性柱，洗脱剂用异辛烷/异丙醇/甲醇（97/2/1，体积比）或当有杂质干扰时可选用异辛烷/异丙醇/甲醇（98/1/1，体积比）。
结果列于表7。
表7
微生物 形成的布洛芬 % S % R 培养基体
（mg/培养基） 积（ml）
Arthrobacter Paraffineus。 9.8 85 15 25
ATCC21218
苔状杆菌＊ 0.8 99 1 25
ATCC11945
枯草杆菌ⅠnⅣ-8＊ 0.4 89 11 25
CBS 680.85
枯草杆菌Nap 10M 1.4 92 8 25
CBS 805.85
枯草杆菌SpⅢ-4 4.2 88 12 25
CBS 806.86
枯草杆菌ThaiⅠ-8 4.3 96 4 25
CBS 679.85
Mucor angwlimacrosporus 4.3 96 4 25
IAM 6149
绿脓杆菌 5.5 81 9 25
IFO 13130
荧光假单胞菌 3.4 ≥95 ≤5 25
IFO 3081
荧光假单胞菌KorⅠ-6 3.9 94 6 100
CBS 807.85
卵状假单胞菌 1.6 98 2 100
IAM 1049
恶臭假单胞菌 1.6 ≥95 ≤5 25
IFO 12996
核黄素假单胞菌 0.7 98 2 100
IFO 13584
黄微绿链霉菌 0.6 ≥95 ≤5 25
IFO 3412
菌株 isⅢ-25 1.0 82 18 100
CBS 666.86
菌株 LK3-4 0.4 ≥95 ≤5 25
CBS 667.86
菌株 Sp4 0.9 95 5 25
CBS 668.86
菌株 ThaiⅢ 18-1 7.0 87 13 25
CBS 669.86
菌株 ThaiⅥ 12 8.6 97 3 25
CBS 670.86
[注]：表中给出的值都是同时做两份实验得出的平均值，微生物后标有“＊”号的只是一份实验的结果。这种情况只向培养基中加入10μl布洛芬的50μl正十四烷溶液。
例8：
用不同的微生物将消旋的布洛芬甲酯转化为S-布洛芬
所有的步骤与例7相同，只是用消旋的布洛芬甲酯代替例7中消旋的布洛芬乙酯加到培养基中去。
结果列于表8。
表8
微生物 生成的布洛芬 S% R% 培养基体
（mg/培养基） 积（ml）
Arthrobacter Paraffineus 9.1 87 13 25
ATCC21218
苔状杆菌＊ 1.5 99 1 25
ATCC11945
枯草杆菌ⅠnⅣ-8＊ 0.5 90 10 25
CBS 680.85
枯草杆菌Nap 10-M 2.2 93 7 25
CBS 805.85
枯草杆菌SpⅢ-4 5.5 89 11 25
CBS 806.86
枯草杆菌 ThaiⅠ-8 5.7 97 3 25
CBS 679.85
Mucor angwlimacrosporus 6.1 93 7 25
IAM 6149
荧光假单胞菌 3.1 93 7 25
IFO 3081
恶臭假单胞菌 0.7 ≥95 ≤5 25
IFO 12996
核黄素假单胞菌 1.3 88 12 25
IFO 13584
黄微绿链霉菌 0.2 ≥95 ≤5 25
IFO 3412
菌株 LK3-4 0.2 ≥95 ≤5 25
CBS 667.86
菌株 ThaiⅢ 18-1 3.1 88 12 25
CBS 669.86
菌株 ThaiⅥ 12 4.0 ≥93 ≤7 25
CBS 670.86
[注]：表中给出的值都是同时做两份实验得出的平均值，微生物后标有“＊”号的只是一份实验的结果，这种情况只向培养基中加入10μl布洛芬的50μl正十四烷溶液。
例9
枯草杆菌ThaiⅠ-8（CBS679.85）的萘普生甲酯酶的研究
杆菌ThaiⅠ-8在含10%的脱脂乳的Eschweiler发酵器中发酵生长。
生长28小时后，离心收集细胞、将细胞溶解在PH为8.0的0.1M Tris-HCl溶液中，用溶菌酶（0.5mg/ml溶菌酶，4mg/ml EDTA）处理，室温放置18小时后，用DN′ase（0.01mg/ml DN′ase，3.5mg/ml MgCl2）在同样温度下处理一小时。
离心后，上清液的旦白质部分用70%的饱和硫酸铵沉淀，离心后将沉淀溶于0.01M MOPS（3-（N-吗啉啉）丙磺酸）PH为7.5的缓冲液，它与含有0.02% Na N3（作为防腐剂）的同样的缓冲液进行透析18小时。
最后的溶液用HPLC-SEC（排阻色谱）的制备柱（TSK2000SW，600×21.5mm）来分析。洗脱剂用PH为5.5的0.1M醋酸钠溶液，流速6ml/分钟每隔10分钟收集2ml柱子的组分用来检测脂酶和S-萘普生甲酯酶的活性。
脂酶的活性是在PH为7.5的0.1M MOPS溶液中以1mg/ml的月桂酸对硝基苯酯为底物测得的。和对硝基苯酚的形成相应，脂酶的活性可在405纳米处测得。
S-萘普生甲酯酶的活性是在PH为8.0的0.1M MOPS溶液中，以20mg/ml的S-萘普生甲酯作底物测得的，培养18小时后，用例2中的方法用HPLC测定形成的S-萘普生的量。
图1画出了杆菌ThaiⅠ-8的细胞溶解液中HPLC-SEC中出现的峰。这一微生物中S-萘普生甲酯酶（组分37）可以和脂酶（组分31）很好地分开。
表9比较了细胞溶解液、组分31和38的对映体选择性。
作用于R和S-萘普生甲酯的酯酶活性用上述的方法测定。
有S-萘普生酯酶活性的旦白质的表观分子量用分子量已知的旦白质为标准估计为27000。
在测定条件下S-萘普生甲酯水解对PH的依赖性见图2，使用的缓冲液为0.1M磷酸溶液（PH：5.5～7.5），0.1M Tris-HCl（PH：7.5～9.0）和0.1M甘氨酸（PH：9.0～10.0）。
温度对酯酶反应的影响见图3。
温度在45℃以上，几乎没有酶水解反应发生。37℃时的水解速度大约比25℃时高两倍。
表9
酶活性 从S-酯生成 从R-酯生成 S-专一性
的S-萘普生 的R-萘普生 （%）
（mM） （mM）
细胞溶解液 2.891 0.087 97.1
组分31 “脂酶” 0.090 0.119 43.1
组分38 “脂酶” 5.264 0.064 98.8
例10
有关立体选择地转化R-S萘普生酯的基因的分子克隆繁殖
一个含有枯草杆菌ThaiⅠ-8（CBS 679.85）染色体DNA片段的质体PNAPT-2按下述方法制得。
采用基因移植的通用的方法（见T.Maniatis等人的手册，Molecular Cloning，1982，Could Spring Harbour Laboratory.），所有的DNA修饰酶都是从市场上买到的商品，使用时参考生产商的说明。用于DNA分离和纯制的试剂和仪器在使用时都参考生产商的说明。
实验中采用了正性选择载体 PUN 121（Nilsson等人，1983，Nucleic Acids Res.11.P8019）。这一载体载有氨苄青霉素抗性基因，四环素抗性基因和C1-阻遏基因。C1-阻遏基因的基因产物可防止四环素基因的转录，往C1-阻遏基因的BCL1部位插入外界的DNA可导致四环素基因的活化。这就使氨苄青霉素/四环素琼脂上重组物的阳性选择成为可能。
将部分Sau3 A水解的枯草杆菌ThaiⅠ-8 DNA与BCl 1水解的PUN 121 DNA混合。使用多聚核苷酸连接酶使其重新环化，之后用CaCl2转移步骤（见T.Maniatis等人的手册，1980）将DNA混合物引入到大肠杆菌DH1（ATCC33849）中。
得到了1000个耐氨苄青霉素和耐四环素的菌落，所有的转化细胞被储存起来，菌落按J.P.Gergen等人的方法（Nucleic Acids Res.7.P.2115.1979）进行平板影印培养，平板影印培养出的菌落基于上述测定酯酶活性的步骤，用软琼脂重叠技术进行筛选。（T.B.Higerd和J.Spizizen.1973，J.Bacteriol.114，P.1184）。将0.5%低熔点琼脂糖，0.5M磷酸钾（PH7.5），0.5mg/l β-萘乙酸和0.5mg/ml速兰（fast-blue）的混合物铺展在转化细胞上，几分钟后，有酯酶或脂酶活性的菌落变为紫色。这些菌落在ZXYT培养基（16g/升细菌用胰化胨。10g/升酵母抽提物，5g/升氯化钠）中培养过夜。随后测定它们转化S-萘普生酯到S-萘普生的活性（例1中的方法）。一种大肠杆菌的转化细胞可转化S-萘普生酯，从中分离出的质体称为pNAPT-2，图4绘出了它的结构，其大小为9.4kb。
表10列出了在zxYT培养基中生长一夜后大肠杆菌/pNAPT-2和大肠杆菌/pNAPT-7（按例12的方法测定）。只有质体PUN 121的大肠杆菌不能水解S或R-萘普生酯，这证明水解S-萘普生酯需要的信息在插入的5kb枯草杆菌ThaiⅠ-8 DNA片段上。
带有质体pNAPT-2的大肠杆菌DH1的样品储存在CBS，登记号671.86。
表10
活性 S-专-性
（单位/升） （%）
大肠杆菌/PUN 121 0 -
大肠杆菌/pNAPT-2 45 ＞95
大肠杆菌/pNAPT-7 761 99.4
例11
引入枯草杆菌的多重基因提高酯酶的活性
表达酯酶密码的质体pNAPT-2带有一个插入的5kb的枯草杆菌ThaiⅠ-8（CBS 679.85）DNA片段。它比表达一个大约30kb的旦白质所需的基因的最小片段大得多，所以可以设想这个插入的DNA片段在不丧失酯酶活性的前提下可被缩短，为验证这一可能性，把pNAPT-2的HindⅢ限制酶片段连接到pPNeo/ori中去，方法如下：pPNeo/ori是通过连接2.7kb的PUC19 Eco R1-smal限制片段（C.Yanisch-Perron.et al.，Gene33，P.103.1985）和2.5kb的PUB110 EcoR1-SnaB1限制片段（T.C.Gryczan et al.，J.Bacteriol.，134，P.318.1978）而成的。由于PUC19起源和PUB110起源的存在，得到的质体pPNeo/ort（5.2kb）在大肠杆菌和杆菌属的细菌中均可复制，此外p PNeo/ori还带有一个表达耐氨苄青霉素密码的基因和一个表达耐新霉素密码的基因（C.Yanisch-Perron et al.，1985;M.Matsumura et al.，J.Biobateridol.，160，P.413，1984）。
为了继代克隆繁殖，将HindⅢ消化的质体pNAPT-2和HindⅢ消化的质体pPNeo/ori混合并连接。混合物转化到大肠杆菌JM 101 hsds（Maniatis等人于1982年报道）中去。大肠杆菌JM 101 hsds是由Phabagen收集物制得的（登记号PC2493，马得勒支，荷兰）。用例10中所述的方法筛选能水解β-萘乙酸酯的菌落，从几个阳性的菌落分离出质体DNA，通过鉴定限制酶的识别位置进行详细的研究。这两个质体pNAPT-7和pNAPT-8的结构图见图5和图6。测定了大肠杆菌/pNAPT-7和大肠杆菌/pNAPT-8水解S-萘普生甲酯的活性（表11）。
发现这两个质体都带有2.2kb的pNAPT-2的HindⅢ-HindⅢ片段作为它们的插入片段，只是它们的取向是相反的。枯草杆菌ThaiⅠ-8DNA中表达酯酶的基因好象也在2.0kb的部分。
从大肠杆菌JM 101 hsds提取出质体pNAPT-7和pNAPT-8后，将这两个质体转移到枯草杆菌1-85和枯草杆菌1A-40的原生质体中。（S.Chang和S.N.Cohen，Mol.Gene Genet.168，P.111，1979）。枯草杆菌1-85（Ycki，S.，1967，Jpn.J.Genet.42.P.251）和枯草杆菌1A-40（Bacillus Stock Center B.G.S.C1A-40）已被报道过。
耐新霉素菌落在zxYT肉汤培养基中发酵培养后，测定其水解S-萘普生甲酯的活性（方法见例12）。结果在表11中列出，发现引入多重基因片段使活性提高大约300倍，所以使微生物或由微生物得到的物质更加适合于水解S-萘普生酯。
虽然已经知道，基因的克隆繁殖可以提高酶的表达水平，但对于酯酶提高的程度是令人惊奇的。在克隆繁殖酶的基因时经常遇到一些问题如不正确的折叠、旦白质降解和细胞内沉淀（Harris，T.J.R.，1983，Genetic Engineering 4，Academic Press）。出乎意料的是移植酯酶基因时不发生这些问题。
表11
活性（单位/升）
大肠杆菌JM 101 hsds/pNAPT-7 1064
（CBS…712.86）
大肠杆菌 JM 101 hsds/pNAPT-8 1160
（CBS672.86）
枯草杆菌1-85/pNAPT-7 1011
（CBS673.86）
枯草杆菌1A40/pNAPT-7 965
（CBS675.86）
枯草杆菌1A40/pNAPT-8 1228
（CBS674.86）
大肠杆菌JM 101 hsds/PUN 121 0.0
枯草杆菌1-85 8.0
枯草杆菌1A40 0.0
（BGSC1A40） \\枯草杆菌Thai Ⅰ-8
3.5
（CBS679.85）
例12
大肠杆菌JM 101 hsds/pNAPT-7的萘普生甲酯酶的研究。
将例11中-升大肠杆菌JM 101 hsds/pNAPT-7的发酵液离心，将沉淀物悬浮于PH为8.0的0.1M Tris-HCl缓冲液中，在1mg/ml溶菌酶，4mg/ml EDTA和1%正辛醇的存在下，于30℃培养60分钟。DNA在15毫克分子的Mg存在下被DNA酶（DN′ase）水解（22℃，30分钟）。
离心后，上清液中的旦白质部分在60%的饱和硫酸铵中沉淀。离心后将沉淀物溶于PH为7.5的10毫克分子的MOPS中，通过超过滤（Amicon YM10）使之浓缩10倍。发现大肠杆菌pNAPT-7残余物专一地水解S-萘普生甲酯的活性为每毫克蛋白质1.6单位（u）。[测定时的条件为：温度25℃，PH为7.5的0.1M的MOPS溶液，20mg/ml S-萘普生甲酯，2%吐温，1mg/ml BSA（牛血清蛋白）]。整个过程中，一个专一性单位（u）定义为在特定条件下每分钟水解1.6×10克分子S-萘普生甲酯所需的酶的量。加入吐温是为了提高强巯水性的酯和BSA的溶解性，避免由于某些吸附作用引起酶的去活化。蛋白质浓度用Bradford的方法，以BSA为标准而测得。
超离心以后的大肠杆菌pNAPT-7残留物用例9所述的HPLC-SEC系统分析。
每隔15分钟收集2ml柱组分，测定其S-萘普生酯酶活性（见例9）。
图7表示的是280纳米时的吸收光密度和HPLC-SEC组分的酯酶活性。S-萘普生酯酶的活性（组分26）同洗脱吸收谱的一个峰相一致。枯草杆菌ThaiⅠ-8酯酶在同样的条件下分析得到相同的保留时间（结果未给出）。
图8是按Laemmli的方法得到的大肠杆菌pNAPT-7残留物和HPLC-SEC中组分的26的12.6% SDS-PAGE的结果。
样品4含大肠杆菌JM 101 hsds/PUN121。PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）结果清楚地表明：大肠杆菌pNAPT-7残留物中最明显的蛋白质就是HPLC-SEC中组分26中可测的蛋白质带，这一蛋白质带在大肠杆菌中没有。
图9为大肠杆菌pNAPT-7残留物的等电点聚集的结果（LKB两性聚丙烯酰胺板，PH3.5～9.5）。A中蛋白质用Serva Blue R.染色，B中样品6酯酶活性用β-萘乙酸酯/FB（Fast Blue RR盐）方法来显示（见例10）。可见A中最明显的蛋白质带具有最高的酯酶活性。
例13
大肠杆菌JM 101 hsds/pNAPT-7转化布洛芬乙酯为布洛芬
在硫酸铵沉淀和超过滤后，测定大肠杆菌pNAPT-7细胞溶解液对R和S-布落芬乙酯的水解作用。
酶活性的测定是在25℃PH7.5的0.1M MOPS溶液中，加入0.3mg/ml R或S-布洛芬乙酯，2%吐温和1mg/ml BSA。培养2小时后，加入乙腈终止反应。
反应混合物用HPLC-反相柱（Chrompack Polygosil 60D-10CN，250×4.6mm）分析，洗脱液中34%乙腈，0.05M磷酸（PH为3.0），流速1.5毫升/分。R、S-布洛芬和R、S-布洛芬乙酯的保留时间分别为5.98分钟和11.08分钟。结果列于表12中。
水解S-布洛芬乙酯的活性是同样条件下测得的水解S-萘普生甲酯的活性的60%。
表12
底物 酯基 单位/升 S-立体专-性
（%）
S-布洛芬 乙基 39600 95.3
R-布洛芬 乙基 1860
S-萘普生 甲基 65000
例14
杆菌1-85/pNAPT-7的S-萘普生酯酶的研究
杆菌1-85/pNAPT-7在5升的Eschweiler发酵器中发酵生长，培养基为zxYT。
离心分离出细胞，将其溶于PH8.0的0.1克分子Tris-HCl溶液中，按例9中所述的方法使细胞溶解。
离心后将上清液加到60%的饱和硫酸铵中再次离心，沉淀溶于PH为7.5的0.02克分子MOPS中，用Amicon YM10过滤器进行超过滤。细胞溶解液用HPLC-SEC分析柱[Tsk 2000 sw，（2x）300×7.5mm]分析，洗脱剂用PH为5.6的0.01克分子MES（2-（N-吗啡啉）乙磺酸）和0.1M氯化钠溶液。流速为1毫升/分按例12所述的方法，每隔10分钟收集1毫升柱组分测定其S-萘普生甲酯酶的活性。
图10表示组分在280纳米处光密度吸收率和它们的酯酶活性。S-萘普生酯酶的保留时间对应的表现分子量为27000。不同蛋白质样品的具体的活性总结在表13。酯酶活性的测定如例12所述。
杆菌pNAPT-7残留物的对映体选择性列于表14。活性的测定如例12所述。
杆菌pNAPT-7、分别代表脂酶和S-萘普生酯酶活性的HPLC-SEC中的组分5和组分7的12.6% SDS-PAGE结果见图8（Laemmli的方法）。杆菌残留物中主要的蛋白质带是组分7中唯一的蛋白质，这一蛋白质在组分5（脂酶活性）中没有。样品8中的蛋白质带对应的表现分子量为31000。
图9显示了杆菌pNAPT-7和组分7等电聚焦的结果（操作见例12）。在杆菌pNAPT-7残留物中，等电点为4.5的酯酶活性在底物为萘乙酸酯时为主要的活性。HPLC-SEC的组分7中主要蛋白质带的等电点为5.4，它与B部分中显示的水解萘乙酸酯的活性相一致。必须注意到β-萘基速兰（fast-blue）法对脂酶来讲比酯酶灵敏得多。
HPLC-SEC的280纳米光密度峰（组分7）好象包括萘普生酯酶，同时是SDS-PAGE中主要的蛋白质带。等电点聚焦的结果证实组分7中主要蛋白质带有酯酶活性。这说明在大肠杆菌或杆菌属细菌中无性繁殖枯草杆菌的酯酶活性，导致酯酶的形成大大加强。实际上在大肠杆菌pNAPT-7和杆菌pNAPT-7中，萘普生酯酶都是细胞溶解液中浓度最大的蛋白质。
表13
样品 单位/毫升 蛋白质浓度 单位/毫克
毫克/毫升 蛋白质
杆菌1-85/pNAPT-7＊ 196 120 1.2
组分6（HPLC-SEC） 6.7 1.1 6.1
组分7（HPLC-SEC） 6 0.95 6.3
杆菌ThaiⅠ-8＊ 0.221 107 0.002
＊胞解、硫酸铵沉淀、超离心以后的细胞溶解液。
表14
加入的甲酯 单位/毫升 S-立体专一性
（%）
杆菌1-85/pNAPT-7 S-萘普生 105000 99.4
R-萘普生 577
图的注解：
图1：杆菌ThaiⅠ-8细胞溶解液的HPLC-SEC曲线。
-：280纳米的光密度
：脂酶活性
：萘普生甲酯酶活性
图2：例9中分析条件下PH对水解S-萘普生甲酯的影响
图3：温度对酯酶反应的影响
□＝25℃ +＝30℃ ◇＝37℃
△＝45℃ x＝60℃
图4：PNAPT-2的限制结构图。
测定了在大小为9.4kb的质体pNAPT-2中的一些限制酶的识别部分。
：PUN 121 DNA
：ThaiⅠ-8 DNA插入片段
部分被Sau3a消化的ThaiⅠ-8 DNA的位置与PUN 121的连接用Bcl 1/Sau3a标出。
图5和图6分别为pNAPT-7和pNAPT-8的限制结构图。
2.2kb的pNAPT-7的HindⅢ片段引入到pPNeo/ori中。产生的质体pNAPT-7和pNAPT-8用几个限制性酶进行详细研究。两个质体的大小均为7.3kb。可以发现pNAPT-8带有一个2.2kb和pNAPT-7中取向相反的HindⅢ片段。
：PUC 19 DNA
：PUB 110 DNA
：PUN 121 DNA
：ThaiⅠ-8 DNA
图7：HPLC-SEC组分的280纳米吸收光密度和酯酶活性。
：S-萘普生甲酯酶活性
-：280纳米光密度
图8：大肠杆菌pNAPT-7残留物和HPLC-SEC的组分26按Laemmli法得到的12.6% SDS-PAGE的结果。
样品1，5和9：分子量标记物
样品2：大肠杆菌pNAPT-7残留物
样品3：大肠杆菌pNAPT-7残留物在经过HPLC凝胶
过滤后得到的活性组分26
样品4：大肠杆菌/PUN121宿主菌柱
样品6：带有pNAPT-7的枯草杆菌1-85
样品7和8：带有pNAPT-7的枯草杆菌1-85经过HPLC
凝胶过滤后得到的组分5和组分7
样品10：杆菌ThaiⅠ-8残留物
图9：大肠杆菌pNAPT-7残留物在等电点聚焦的结果（LKB两性聚丙烯酰胺板，PH3.5～9.5）。
A：用Sweva blue染色后的情况
B：用β-萘乙酸酯/FBB染色后的情况
样品1：已知等电点的标记蛋白质
样品4：大肠杆菌pNAPT-7残留物
样品3：带有pNAPT-7的枯草杆菌残留物
样品2：样品3经过HPLC凝胶过滤后的活性组分
图10：HPLC-SEC组分的280纳米吸收光密度曲线和酯酶活性
：S-萘普生甲酯酶活性
-：280纳米光密度