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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610183051.1 (22)申请日 2016.03.28 (71)申请人 济南新时代医药科技有限公司 地址 250200 山东省济南市章丘市唐人中 心A5-125号 (72)发明人 不公告发明人 (51)Int.Cl. A61K 36/71(2006.01) A61K 9/20(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 天胡荽愈肝片在制备抑制喉表皮样癌细胞 HEp-2细胞增殖药物中的应用 (57)摘要 本发明属于中药技术领域， 具体涉及。
2、一种天 胡荽愈肝片在制备抑制喉表皮样癌细胞HEp-2细 胞增殖药物中的应用及天胡荽愈肝片的制备方 法。 所述天胡荽愈肝片由天胡荽699g、 杏叶防风 1398g、 酢浆草699g、 虎掌草209g作为原料药制 成， 采用超临界萃取制备而成， 使得齐墩果酸含 量有很大提高。 权利要求书1页 说明书4页 CN 105770030 A 2016.07.20 CN 105770030 A 1.天胡荽愈肝片在制备抑制喉表皮样癌细胞HEp-2细胞增殖药物中的应用， 所述天胡 荽愈肝片由天胡荽699g、 杏叶防风1398g、 酢浆草699g、 虎掌草209g作为原料药制成， 其特征 在于， 所述天胡荽愈肝片。
3、的制备方法包括如下步骤： 取天胡荽699g、 杏叶防风1398g、 酢浆草 699g、 虎掌草209g， 加入到CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体 积百分比为4-6%， 萃取压力15-30MPa， 温度30-50， CO2流量l-3ml/g生药min， 萃取时间 800-1000min， 得超临界萃取物， 将超临界萃取物加入淀粉， 70%乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制 成500片， 每片重0.30g。 2.根据权利要求l所述的天胡荽愈肝片在制备抑制喉表皮样癌细胞HEp-2细胞增殖药 物中的应用， 其特征在于， 所述天胡荽愈肝片的制备方法包括如下步骤： 取天胡荽6。
4、99g、 杏 叶防风1398g、 酢浆草699g、 虎掌草209g， 加入到CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带 剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%， 萃取压力25MPa， 温度40， CO2流量2ml/g生药min， 萃取时间900min， 得超临界萃取物， 将超临界萃取物加入淀粉， 70%乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成500片， 每片重0.30g。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105770030 A 2 天胡荽愈肝片在制备抑制喉表皮样癌细胞HEp-2细胞增殖药 物中的应用 技术领域 0001 本发明属于中药技术领域， 具体涉及一种天胡荽愈肝片在制备抑制喉表皮样癌细。
5、 胞HEp-2细胞增殖药物中的应用及天胡荽愈肝片的制备方法。 背景技术 0002 天胡荽愈肝片标准号WS-10213 （ZD-0213） -2002， 记载于国家中成药标准汇编内科 肝胆分册。 由天胡荽699g、 杏叶防风1398g、 酢浆草699g、 虎掌草209g作为原料药制成， 具有 清热解毒， 疏肝利胆的功效， 用于肝胆湿热所致的急、 慢性肝炎。 0003 现有技术中， 尚未有天胡荽愈肝片在在制备抑制人喉表皮样癌细胞HEp-2细胞增 殖药物中的应用的报道， 也未见有天胡荽愈肝片提取制备方面采用超临界萃取的报道， 而 传统水煎煮的方法， 工艺粗糙、 落后， 杂质多， 导致患者用量过大， 。
6、不方便服用， 严重影响了 本品在临床上应用。 发明内容 0004 发明目的： 本发明的目的在于提供一种天胡荽愈肝片在制备抑制喉表皮样癌细胞 HEp-2细胞增殖药物中的应用。 0005 本发明的另一个目的在于提供一种天胡荽愈肝片的制备方法。 0006 本发明的目的是通过如下的方案实现的： 天胡荽愈肝片在制备抑制喉表皮样癌细胞HEp-2细胞增殖药物中的应用， 所述天胡荽 愈肝片由天胡荽699g、 杏叶防风1398g、 酢浆草699g、 虎掌草209g作为原料药制成， 所述天胡 荽愈肝片的制备方法包括如下步骤： 取天胡荽699g、 杏叶防风1398g、 酢浆草699g、 虎掌草 209g， 加入到C。
7、O2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为 4-6%， 萃取压力15-30MPa， 温度30-50， CO2流量l-3ml/g生药min， 萃取时间800- 1000min， 得超临界萃取物， 将超临界萃取物加入淀粉， 70%乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成500 片， 每片重0.30g。 0007 优选的， 上述的天胡荽愈肝片在制备抑制喉表皮样癌细胞HEp-2细胞增殖药物中 的应用， 所述天胡荽愈肝片的制备方法包括如下步骤： 取天胡荽699g、 杏叶防风1398g、 酢浆 草699g、 虎掌草209g， 加入到CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占。
8、总萃取溶剂的 体积百分比为5%， 萃取压力25MPa， 温度40， CO2流量2ml/g生药min， 萃取时间900min， 得 超临界萃取物， 将超临界萃取物加入淀粉， 70%乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成500片， 每片重 0.30g。 0008 现有技术中， 天胡荽愈肝片口服， 一次6片， 一日3次。 天胡荽愈肝片服药量大。 采用 本发明方法制备成的天胡荽愈肝片每片重0.30g， 每次仅需3片， 一日服用3次。 在具有更多 活性成分的条件下大大减少了服用量。 此结论可以通过下述试验证明。 0009 试验一、 不同方法制备的天胡荽愈肝片中齐墩果酸含量的比较 说 明 书 1/4 页 3 。
9、CN 105770030 A 3 l、 仪器及试药本发明天胡荽愈肝片： 按实施例1方法制备， 使用3005g原料药， 经提取制 成500片， 每片重0.30g。 原天胡荽愈肝片， 按照WS-10213 （ZD-0213） -2002标准方法制备。 Agilent1200高效液相色谱仪； METTLER AE240电子分析天平； 齐墩果酸对照品 （中国药品生 物制品检定所） 。 0010 2、 方法 照高效液相色谱法 （中国药典2015年版第四部凡例十五） 测定。 0011 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂； 乙腈-0.1磷 酸 （80:20） 为流动相； 检测波长为21。
10、0nm。 理论板数按齐墩果酸峰计算应不低于3000。 0012 对照品溶液的制备 精密称取齐墩果酸对照品适量， 加甲醇制成每1ml含0.2mg的 溶液， 即得。 0013 本发明的天胡荽愈肝片供试品溶液的制备 取本发明的天胡荽愈肝片， 研细， 取 0.75g （2.5片的量） ， 精密称定， 置具塞锥形瓶中， 精密加入乙醇25ml， 密塞， 称定重量， 加热 回流1小时， 放冷， 再称定重量， 用乙醇补足减失的重量， 摇匀， 滤过， 精密量取续滤液10ml， 加20盐酸溶液5ml， 加热回流2.5小时， 加水30ml， 水浴上浓缩至无醇味， 放冷， 用二氯甲烷 振摇提取3次 （40ml、 30。
11、ml、 30ml） ， 合并二氯甲烷提取液， 蒸干， 残渣加甲醇适量使溶解， 转移 至10ml量瓶中， 加甲醇稀释至刻度， 摇匀， 即得。 0014 对照产品供试品溶液的制备 取对照的天胡荽愈肝片20g， 研细， 取1.5g （5片的 量） ， 精密称定， 置具塞锥形瓶中， 精密加入乙醇25ml， 密塞， 称定重量， 加热回流1小时， 放 冷， 再称定重量， 用乙醇补足减失的重量， 摇匀， 滤过， 精密量取续滤液10ml， 加20盐酸溶 液5ml， 加热回流2.5小时， 加水30ml， 水浴上浓缩至无醇味， 放冷， 用二氯甲烷振摇提取3次 （40ml、 30ml、 30ml） ， 合并二氯甲烷。
12、提取液， 蒸干， 残渣加甲醇适量使溶解， 转移至10ml量瓶 中， 加甲醇稀释至刻度， 摇匀， 即得。 0015 测定法 分别精密吸取对照品溶液与本发明的天胡荽愈肝片供试品溶液、 对照产 品供试品溶液各10 l， 注入液相色谱仪， 测定， 即得。 0016 3、 结果 结果表明， 本发明天胡荽愈肝片中齐墩果酸的含量为3.22-6.45mg/片； 而原天胡荽愈 肝片中齐墩果酸的含量为0.81mg/片， 每次服用量3片的齐墩果酸含量为原片剂6片含量的 2-4倍， 在服用量减少的情况下， 齐墩果酸含量有很大提高。 0017 上述研究表明， 采用本发明制备方法制备的天胡荽愈肝片， 有效成分含量远远高 。
13、于WS-10213 （ZD-0213） -2002标准记载的方法制备的天胡荽愈肝片。 具体实施方式 0018 下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明， 以便本领域的技术人员更了解 本发明， 但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例， 凡基于本发明上述 内容所实现的技术均属于本发明的范围。 0019 实施例1 取天胡荽699g、 杏叶防风1398g、 酢浆草699g、 虎掌草209g， 加入到CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%， 萃取压力25MPa， 温度40， CO2 流量2ml/g生药min， 萃取时间900min， 得超临界萃取物。
14、， 将超临界萃取物加入淀粉， 70%乙 说 明 书 2/4 页 4 CN 105770030 A 4 醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成500片， 每片重0.30g。 0020 经检测， 成品中齐墩果酸的含量为6.45mg/片。 0021 实施例2 取天胡荽699g、 杏叶防风1398g、 酢浆草699g、 虎掌草209g， 加入到CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%， 萃取压力15MPa， 温度30， CO2 流量1ml/g生药min， 萃取时间1000min， 得超临界萃取物， 将超临界萃取物加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成50。
15、0片， 每片重0.30g。 0022 经检测， 成品中齐墩果酸的含量为4.98mg/片。 0023 实施例3 取天胡荽699g、 杏叶防风1398g、 酢浆草699g、 虎掌草209g， 加入到CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6%， 萃取压力30MPa， 温度60， CO2 流量3ml/g生药min， 萃取时间800min， 得超临界萃取物， 将超临界萃取物加入淀粉， 70%乙 醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成500片， 每片重0.30g。 0024 经检测， 成品中齐墩果酸的含量为3.22mg/片。 0025 实施例4： 天胡荽愈肝片抑制人喉表皮样癌。
16、细胞HEp-2细胞增殖的实验研究资料 1 实验材料 1.1实验用细胞株 人喉表皮样癌细胞HEp-2细胞， 山东大学实验室细胞库， DMEM+10%FBS常规培养。 0026 1.2实验药物 研究药物： 本发明天胡荽愈肝片： 按实施例1方法制备。 0027 药液储液： 称取100mg天胡荽愈肝片， 溶于5ml无水乙醇中， 0.2m滤器过滤， 500 ldoff管分装， -20存储， 同时0.2m滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。 0028 1.3实验试剂 DMEM( GIBCO公司Cat.No.12100-061 Lot.No.758137)； 胎牛血清 （浙江天杭生物科技 有限公司Lot.No 。
17、.100419） ； NaHC03(上海久亿化学试剂有限公司Cat.No .11810-033 Lot.No. 1088387)； Trypsin （AMRESCO公司） ； EDTA （AMRESCO公司） ； Penicillin G Sodium Salt （AMRESCO公司1） ； Streptomycin Sulfate(AMRESCO)； 无水乙醇 （淄博亚杜兰经贸有限 公司） ； MTT (Biosharp批号： 0793)： PBS （实验室自配） ； 1.4实验器材 莱卡倒置显微镜 （德国Leica型号： DMIL） ； 可见-紫外光微孔板检测仪 （美国MD公司型 号： S。
18、PECTRAMAX 190） ； C02培养箱 （FORMA型号： 3111） ； 超净台 （苏净集团安泰公司制造型号： SW-CJ-ZFD） ； 纯水仪 （美国Sprlng公司型号： S/N 020579） ； 精密移液器 （法国吉尔森公司型 号： P2） ； 电子天平 （德国赛多利斯有限公司型号： BT323S） ； 全自动高压灭菌锅 （日本SANYO公 司型号： MLS-3020） ； 台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号： DHG9123A)； 冰箱 (西门子公司型号： KG18V21TI)； 液氮罐 （CBS型号： 2001） ； 低速离心机 （上海安亭科学仪器厂 型号： K。
19、A-1000） ； 0.2m滤器 （MILLIPORE型号： SLGP033RB） ； 1cm培养皿(NEST公司)、 96孔培养 板 （NEST公司） ； 细胞计数板； 离心管、 移液管、 Tips若干。 0029 2 实验方法 1)HEp-2细胞用DMEM+10%FBS于37、 5%C02进行常规培养 （10cm培养皿） ， 当细胞生长至 说 明 书 3/4 页 5 CN 105770030 A 5 对数期时， 收集细胞， 弃去培养液， PBS轻洗3遍， 加入3ml 0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA， 37 消化2min后， 向其中加入5ml完全培养基中和反应， 吹打细胞后将其转入离。
20、心管中， 1000rpm 离心5min， 调整细胞悬液浓度3104个/ml。 0030 2)将细胞种入96孔培养板中， 每孔加入细胞悬液180l， 培养板放入细胞培养箱中 (37， 5%C02)常规培养。 0031 3)根据细胞生长情况， 一般长至50%-70%， 加入天胡荽愈肝片溶液， 继续培养24h。 0032 4)24h后加入20l MTT溶液 （5mg/ml， 即0.5%MTT） ， 继续培养4h。 0033 5)4h后扣板法倒去上清， 用吸水纸轻轻拍干， 每孔加入200l二甲基亚砜， 置摇床 上低速振荡10min， 使结晶物充分溶解。 在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。 。
21、0034 6)同时设置本底 （不加细胞， 只加培养液） ， 对照孔 （细胞、 相同浓度的药物溶解介 质、 培养液、 MTT、 二甲基亚砜） ， 每组设定6个复孔。 0035 7)结果以药物对细胞的抑制率表示： 细胞增值抑制率(%)= （对照孔OD值-给药孔OD 值） 、 对照孔OD值100%。 实验重复3次。 0036 3 统计处理 采用Microsoft Excel 2007软件中的相关分析和Student t检验， 数据以meanS D 表示。 0037 4 实验结果 MTT法实验后统计结果显示， 与对照组比较， 当剂量达到5mg/ml时， 对HEp-2细胞增殖抑 制有差异(P0.05)，。
22、 剂量在10mg/ml时该差异具有显著性(P0.01)， 当剂量达到15-20mg/ml 时有极显著性差异(P0.001)。 0038 表1天胡荽愈肝片对HEp-2细胞增殖抑制影响研究 (XSD) 组别药物浓度 （mg/ml）抑制率 （%） 对照组00 1515.233.98 21029.365.89* 31542.039.85* 42052.3912.01* 注： 与对照组比较， *P0.01； *P0.001。 0039 5 实验结论 本发明的天胡荽愈肝片可以抑制HEp-2细胞增殖， 减少HEp-2细胞的细胞生长数目， 该 作用呈剂量依赖性。 说 明 书 4/4 页 6 CN 105770030 A 6 。