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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810488984.0 (22)申请日 2018.05.21 (71)申请人 中国医学科学院生物医学工程研究 所 地址 300192 天津市南开区白堤路236号 (72)发明人 朱敦皖 张琳华 樊帆 秦玉 黄晨露 (74)专利代理机构 天津市杰盈专利代理有限公 司 12207 代理人 赵尊生 (51)Int.Cl. A61K 41/00(2006.01) A61K 9/127(2006.01) A61K 47/34(2017.01) A61P 35/00(2006.01) 。
2、A61K 31/136(2006.01) A61K 31/704(2006.01) (54)发明名称 具有气泡生成功能的双载蒽环类药物及光 敏剂的聚合物囊泡与制备 (57)摘要 本发明涉及一种具有气泡生成功能的双载 蒽环类药物及光敏剂的聚合物囊泡与制备。 以两 亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL为材料制备 具有气泡生成功能的亲水内腔载蒽环类药物、 疏 水性膜层载光敏剂的pH/温度双重敏感性多功能 聚合物囊泡。 采用碳酸氢铵梯度主动载药法将蒽 环类药物包载于亲水内腔中， 在较低pH值或加热 下碳酸氢铵能够分解产生二氧化碳气泡， 破坏囊 泡结构使包载的药物迅速释放。 通过EPR靶向递 。
3、送到肿瘤局部后， 在光照下能显著提高蒽环类化 疗药物对肿瘤的治疗作用。 本发明聚合物囊泡可 用作药物载体同时包载亲水和疏水性药物， 并且 结构稳定， 具有良好的生物相容性和可降解性， 在药物递送与可控释放、 化疗联合光热治疗肿瘤 方面具有广阔的应用前景。 权利要求书1页 说明书9页 附图4页 CN 108653733 A 2018.10.16 CN 108653733 A 1.一种具有气泡生成功能的双载蒽环类药物及光敏剂的聚合物囊泡得的制备方法， 包 括的步骤： 1） 将PCL8000-b-PEG8000-b-PCL8000两亲性三嵌段共聚物与疏水性药物共混溶于二氯甲烷 中， 在旋转蒸发仪中旋。
4、转蒸发除去二氯甲烷， 在反应器内壁形成一层均匀的薄膜， 抽真空16 小时， 除去残余有机溶剂； 其特征在于： 2） 向反应器中加入浓度为300 mM的碳酸氢铵水溶液， 所述PCL8000-b-PEG8000-b-PCL8000 两亲性三嵌段共聚物与碳酸氢铵水溶液的质量与体积比为： 4 mg:1 mL， 于65水化5 h， 放 置至室温， 冰浴下超声， 得到载有疏水性药物的聚合物囊泡分散液； 3） 将上述分散液移入MWCO8000-14000 Da的透析袋中， 放在pH7.4的浓度为300 mM的蔗 糖水溶液中透析14小时,得透析后的载有疏水性药物的聚合物囊泡分散液； 4） 将蒽环类药物溶于去离。
5、子水中， 浓度15 mg/mL， 加入到载光敏剂聚合物囊泡分散液 中， 在65搅拌1.5 h； 冷却至室温， 移入MWCO8000-14000 Da的透析袋中， 放在pH7.4的PBS 溶液中透析12小时， 除去游离的水溶性蒽环类药物， 即得具有气泡生成功能的亲水性内腔 载蒽环类药物、 膜层载光敏剂的聚合物囊泡。 2.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于所述的水溶性蒽环类药物为 柔红霉 素、 阿霉素、 阿柔比星、 表阿霉素、 伊达比星或米托蒽醌。 3.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于所述的膜层载光敏剂为光敏剂吲哚菁 绿 （ICG） 、 七甲川花菁类荧光小分子IR780、 二氢卟。
6、吩 （Ce6） 、 卟啉类。 4.权利要求1-3任一所述的制备方法得到的具有气泡生成功能的亲水性内腔载蒽环类 药物聚合物囊泡。 5.根据权利要求4所述的聚合物囊泡， 其特征在于该聚合物囊泡的粒径为200-300 nm。 6.权利要求4所述的聚合物囊泡在制备用于肿瘤治疗、 尤其是化疗协同光热治疗抑制 肿瘤提高疗效的药物的应用。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108653733 A 2 具有气泡生成功能的双载蒽环类药物及光敏剂的聚合物囊泡 与制备 技术领域 0001 本发明涉及一种具有气泡生成功能的双载蒽环类药物及光敏剂的聚合物囊泡与 制备， 特别是一种具有气泡生成功能的亲水内腔载蒽环。
7、类药物、 疏水性膜层载光敏剂的pH/ 温度双重敏感性多功能聚合物囊泡的制备及其应用。 背景技术 0002 近几十年来， 恶性肿瘤具有越来越高的发病率， 其发病年龄逐渐低龄化， 严重威胁 着人类的生命健康。 化学治疗是临床上最常用的肿瘤治疗方式之一， 随着近年来对化疗药 物作用机理的深入研究， 临床肿瘤治疗水平有很大提高。 尽管如此， 但化疗药物副作用较 大， 对肿瘤细胞造成损伤的同时也会对人体正常细胞造成不可逆损伤。 为了降低其毒副作 用， 改善治疗效果， 纳米药物载体已成为肿瘤化疗研究的热点领域， 其中代表性的给药系统 有脂质体、 纳米粒、 纳米乳、 聚合物胶束、 聚合物囊泡等。 0003 。
8、聚合物囊泡是一种新兴的自组装体， 具有亲水性内腔和疏水性双分子膜层， 能够 同时包载亲水性和疏水性药物。 其亲水性的内腔结构有利于包封水溶性治疗分子 （药物、 酶、 蛋白质、 多肽、 DNA和RNA片段） ； 疏水性双分子膜层较厚， 有利于包封脂溶性药物。 同时， 聚合物囊泡表面的亲水性外壳具有空间稳定作用及高通透性和滞留效应 （Enhanced Permeability and Retention， EPR） ， 可避免网状内皮系统的吞噬， 延长药物在体内循环时 间， 增强被动靶向能力。 随着近年来聚合物自组装技术的发展以及研究者们对纳米载体的 深入研究， 响应于肿瘤微环境的智能聚合物囊泡成。
9、为当前分子自组装新型药物载体研究的 热点。 利用智能聚合物囊泡对肿瘤微环境刺激的响应来控制药物释放， 大大增加了肿瘤局 部的药物浓度， 达到药物的最佳治疗效果。 0004 纳米药物载体对肿瘤微环境的响应性在药物递送体系中有非常重要的意义。 众所 周知， 正常组织的细胞外pH为7.4， 细胞内7.2， 血液循环过程中pH为7.4； 而肿瘤组织局部缺 氧， 通过异常的能量代谢和对特定蛋白的自身调节导致局部pH降低到pH 6.8以下， 形成一 个局部酸性微环境。 药物载体如果能特异性地在肿瘤局部酸性微环境中释放， 就能够提高 药物释放对肿瘤组织的特异性， 从而优化药物治疗效果。 这些来自于组织内部的。
10、刺激我们 称之为内在刺激， 相似的， 一些因外部诱导而促进负载药物的释放， 如超声、 加热或近红外 照射等这一类刺激称之为外在刺激。 这些内部与外部刺激均可作为刺激响应型药物载体的 靶点， 可被用于肿瘤的靶向治疗。 原来的单功能型纳米载体逐渐发展为双重或多重响应型 纳米载体， 目前多重响应型多功能纳米载体受到研究者们的广泛关注。 0005 中国专利CN101940792A公开了PCL-b-PEG-b-PCL载疏水性药物聚合物囊泡及制备 方法及用途。 CN104771382A公开了一种亲水性内腔载蒽环类药物的聚合物囊泡的制备方 法。 但具有气泡生成功能的亲水性内腔载蒽环类药物、 膜层载光敏剂的P。
11、CL-b-PEG-b-PCL聚 合物囊泡目前还未见报道。 说 明 书 1/9 页 3 CN 108653733 A 3 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种具有气泡生成功能的双载蒽环类药物及光敏剂的聚合 物囊泡与制备， 特别是一种具有气泡生成功能的亲水内腔载蒽环类药物、 疏水性膜层载光 敏剂的pH/温度双重敏感性多功能聚合物囊泡的制备及其应用。 本发明通过薄膜水化超声 法将光敏剂包载于囊泡的疏水膜层中， 然后采用碳酸氢铵梯度主动载药法将蒽环类药物包 载于囊泡的亲水内腔中， 在较低pH值或加热下囊泡内腔的碳酸氢铵能够分解产生二氧化碳 气泡， 破坏囊泡结构使包载的药物迅速释放。 其外壳的PE。
12、G层赋予聚合物囊泡长循环和空间 稳定性， 并且粒径较小 （200-300 nm） ， 能通过EPR效应实现肿瘤部位高效富集， 通过肿瘤微 环境pH和温度双重响应快速释放药物而发挥作用。 0007 本发明通过将广谱抗癌的蒽环类药物与疏水性药物 （如光敏剂ICG） 包载于具有气 泡生成功能的囊泡中， 利用肿瘤局部pH响应性及ICG吸收光热能量产生的温度变化来控制 药物释放， 实现化疗协同光热治疗的效果最大化。 本发明可实现化疗药物与疏水性药物的 共包载、 环境响应触发释药以及对肿瘤的光热-化疗联合治疗。 0008 本发明提供的具有气泡生成功能的双载蒽环类药物及光敏剂的聚合物囊泡的制 备方法包括的步。
13、骤： 1） 将PCL8000-b-PEG8000-b-PCL8000两亲性三嵌段共聚物与疏水性药物共混溶于二氯甲烷 中， 在旋转蒸发仪中旋转蒸发除去二氯甲烷， 在反应器内壁形成一层均匀的薄膜， 抽真空16 小时， 除去残余有机溶剂； 2） 向反应器中加入浓度为300 mM的碳酸氢铵水溶液， 所述PCL8000-b-PEG8000-b-PCL8000 两亲性三嵌段共聚物与碳酸氢铵水溶液的比为4 mg:1 mL， 于65水化5 h， 放置至室温， 冰 浴下超声， 得到载有疏水性药物的聚合物囊泡分散液； 3） 将上述分散液移入MWCO8000-14000 Da的透析袋中， 放在pH7.4的浓度为30。
14、0 mM的蔗 糖水溶液中透析14小时， 得透析后的载有疏水性药物的聚合物囊泡分散液； 4） 将蒽环类药物溶于去离子水中 （浓度15 mg/mL） ， 加入到载光敏剂聚合物囊泡分散液 中， 在65搅拌1.5 h； 冷却至室温， 移入MWCO8000-14000 Da的透析袋中， 放在pH7.4的PBS 溶液中透析12小时， 除去游离的水溶性蒽环类药物， 即得具有气泡生成功能的亲水性内腔 载蒽环类药物、 膜层载光敏剂的聚合物囊泡。 0009 PCL8000-b-PEG8000-b-PCL8000两亲性三嵌段共聚物采用已知的方法制备， PEG亲水链 段分子量35% 10%。 pH值用10 mM组氨酸。
15、水溶液进行调节。 0010 具有气泡生成功能的亲水性内腔载蒽环类药物、 膜层载光敏剂的聚合物囊泡的粒 径为200-300 nm。 0011 水溶性蒽环类药物优选为 柔红霉素、 阿霉素、 阿柔比星、 表阿霉素、 伊达比星或米 托蒽醌。 0012 光敏剂如吲哚菁绿 （ICG） 、 七甲川花菁类荧光小分子IR780、 二氢卟吩 （Ce6） 、 卟啉 类。 0013 上述方法制备的具有气泡生成功能的亲水性内腔载蒽环类药物、 膜层载光敏剂的 pH/温度双重敏感性多功能聚合物囊泡， 在制备用于包载亲水性或疏水性药物的药物载体 中的应用， 以及在制备用于肿瘤治疗、 尤其是化疗协同光热治疗抑制肿瘤提高疗效的药。
16、物 说 明 书 2/9 页 4 CN 108653733 A 4 的应用。 0014 本发明所制备的具有气泡生成功能的亲水性内腔载蒽环类药物、 疏水性膜层载光 敏剂的聚合物囊泡可通过pH与温度双重响应控释药物。 亲水性PEG外壳使得囊泡具有长循 环特性和空间稳定作用， 能通过EPR作用靶向富集到肿瘤局部， 光热作用促进肿瘤细胞内吞 聚合物囊泡， 肿瘤细胞内低pH及光热作用促进聚合物囊泡产生气泡从而破坏囊泡结构并触 发释放药物， 化疗协同光热治疗能够更好地杀伤肿瘤细胞， 并可通过光敏剂可视化药物载 体在体内的递送过程。 本发明以生物相容性好并且可生物降解的聚酯类两亲性嵌段共聚物 PCL8000-。
17、b-PEG8000-b-PCL8000制备的多功能聚合物囊泡， 其在体内是完全可生物降解的， 降解 后不产生对生物有害的物质。 所构建的可产生气泡、 共递释化疗药物与光敏剂的pH/温度敏 感聚合物囊泡作为一种多功能药物载体， 为肿瘤的靶向递送、 触发可控释药、 化疗协同光热 治疗提供了新技术和方法。 0015 总之， 本发明具有以下突出的实质性特点： 1） 本发明所制备的具有气泡生成功能的双载蒽环类药物及光敏剂的聚合物囊泡在生 理条件下稳定， 在酸性或加热环境下囊泡内部包载的碳酸氢铵能够分解产生二氧化碳气 泡， 破坏囊泡结构从而促进药物释放， 因此具有pH及温度敏感性， 能通过对肿瘤微环境pH。
18、及 温度敏感双重响应而快速释放药物， 提高药物治疗效果。 0016 2） 本发明的聚合物囊泡表面的PEG链具有亲水性、 柔性的特点， 赋予了聚合物囊泡 长循环特性， 可延长在血液中的循环时间而不被单核吞噬细胞系统 （MPS） 捕获； 粒径200- 300 nm， 分散度好， 适用于静脉全身给药， 能够通过EPR效应， 使载药囊泡有效聚集在肿瘤部 位， 达到靶向治疗的目的。 0017 3） 本发明所制备的具有气泡生成功能的pH/温度双重敏感性聚合物囊泡的疏水膜 层能够包载疏水性药物， 亲水性内腔可通过主动载药法包载亲水性蒽环类药物， 能够同时 包载两种药物， 增强治疗效果。 0018 4） 在本。
19、发明的制备过程中无需使用乳化剂或表面活性剂， 克服了传统制备药物缓 控释系统需要大量使用乳化剂或表面活性剂的不足， 避免了使用化学试剂而造成的对生物 体的毒、 副作用。 0019 5） 本发明使用的药物载体材料PCL8000-b-PEG8000-b-PCL8000具有良好的生物降解性 和生物相容性、 无免疫原性， 制备出的具有气泡生成功能的亲水性内腔载蒽环类药物、 膜层 载疏水性药物的聚合物囊泡在体内可完全生物降解， 降解后不产生对生物有害的物质。 0020 6） 该聚合物囊泡制备方法简单， 周期短， 成本低。 0021 7） 本发明所制备的聚合物囊泡能够明显减少游离药物的毒副作用。 附图说明。
20、 0022 图1为具有气泡生成功能的双载阿霉素与吲哚菁绿的聚合物囊泡 （BG-DIPS） 在不 同环境下的粒径分布图。 0023 图2为本发明的透射电镜图； A） BG-DIPS在PBS pH7.4的透射电镜图， 可以观测到囊 泡内腔的气泡、 气泡的融合及囊泡明显的膜层结构； B） BG-DIPS在不同条件下 （PBS pH7.4、 PBS pH5.5、 PBS pH7.4加激光、 PBS pH5.5加激光） 的透射电镜图， 可以观察到酸性和光热可 破坏囊泡的结构。 说 明 书 3/9 页 5 CN 108653733 A 5 0024 图3为不同pH环境下BG-DIPS的药物释放曲线， a）。
21、 为以每小时记， b） 为以每天记， 药 物释放表明酸性及光热条件均可增加药物的释放量， 在PBS pH5.5加激光时药物释放量最 高。 0025 图4为不同浓度游离药物以及BG-DIPS 对4T1-Luc细胞的细胞毒性。 a） 为不同给药 组与细胞共培养24 h后的细胞毒性； b） 为不同给药组与细胞共培养48 h后的细胞毒性； c ） 为不同给药组 （阿霉素药物浓度分别为2.5、 5 g/mL） 与细胞共孵育2 h后， 用1 W/cm2的 808 nm激光照射5 min后继续孵育22 h后的细胞毒性。 细胞毒性具有时间、 剂量依赖性， 激 光照射可明显增强细胞毒性。 0026 图5为BG-。
22、DIPS和游离药物在加或不加激光条件下， 与细胞共培养4 h后的细胞吞 噬图， 激光照射明显增强了细胞对纳米粒及游离药物的吞噬。 0027 图6为荧光成像； A） 尾静脉注射不同制剂后在4 h、 12 h、 24 h和48 h的动物体内 ICG荧光成像； B） 给药48 h后荷瘤小鼠离体脏器DOX荧光成像。 载药囊泡具有长循环特性， 可 以通过EPR效应有效将药物富集于肿瘤部位。 0028 图7为BG-DIPS用于荷瘤小鼠 （4T1-Luc） 的体内药效学评价结果； A） 为不同治疗方 案给药后小鼠在不同时间点的生物发光图片； B） 为荷瘤小鼠 （4T1-Luc） 的肿瘤增长趋势图； C） 为。
23、荷瘤小鼠 （4T1-Luc） 的体重变化图。 BG-DIPS具有较好的抑制肿瘤效果并可以降低药物 的毒性， 激光照射可进一步增强抗肿瘤效果。 具体实施方式 0029 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。 实施例中未注明具体条件的实验 方法， 通常按照常规条件以及手册中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件； 所用的通 用设备、 材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0030 实施例1 一种具有气泡生成功能的双载阿霉素和吲哚菁绿的pH/温度双重敏感性聚合物囊泡的 制备方法， 包括如下步骤： （1） 将PCL8000-b-PEG8000-b-PCL8000两亲性三嵌段共聚。
24、物与转疏水的吲哚菁绿溶于二氯 甲烷中， 在旋转蒸发仪中旋转蒸发除去二氯甲烷， 在反应器内壁形成一层均匀的薄膜， 抽真 空过夜除去残余有机溶剂； （2） 向反应器中加入5 mL浓度为300 mM的碳酸氢铵水溶液， 所述PCL8000-b-PEG8000-b- PCL8000两亲性三嵌段共聚物与碳酸氢铵水溶液的比为4 mg:1 mL， 于65水化5 h， 震荡混 匀， 放置至室温， 冰浴下超声30 min， 得到稳定的单载吲哚菁绿的聚合物囊泡分散液； （3） 将单载吲哚菁绿的聚合物囊泡分散液移入MWCO8000-14000 Da的透析袋中， 放在 pH7.4的浓度为300 mM的蔗糖水溶液中透析1。
25、4小时,得透析后的单载吲哚菁绿的聚合物囊 泡分散液； 蔗糖水溶液的pH值用10 mM组氨酸水溶液进行调节； （4） 将阿霉素溶于去离子水中得浓度为15 mg/mL的溶液1， 将溶液1加入到预热至65 的单载吲哚菁绿的聚合物囊泡分散液中， 在65搅拌1.5 h； 所述溶液1与步骤 （3） 获得的透 析后的单载吲哚菁绿的聚合物囊泡分散液的体积比为1:10； 冷却至室温， 移入MWCO8000- 14000 Da的透析袋中， 放在pH7.4的PBS溶液中透析12小时， 在透析过程中换新鲜的同浓度 的PBS水溶液， 除去游离的阿霉素， 得具有气泡生成功能的双载阿霉素和吲哚菁绿的pH/温 说 明 书 4。
26、/9 页 6 CN 108653733 A 6 度双重敏感性聚合物囊泡 （BG-DIPS） 。 0031 （5） BG-DIPS对pH/温度敏感性的考察 将制得的BG-DIPS分散于不同pH以及是否有激光照射条件的溶液中， 包括PBS (pH 7.4)、 PBS + laser (pH 7.4)、 PBS (pH5.5)和PBS + laser (pH5.5)， 检测其粒径变化。 如 图1 所示， 在pH 7.4的PBS溶液中， BG-DIPS显示一个窄峰， 表明其在生理条件下具有良好的 单分散性； 在此条件下进行激光照射后显示一个宽峰， 表明在加热过后其平均尺寸和多分 散性增加。 在酸性pH。
27、 5.5的PBS溶液中， 不论有无激光照射， 产生两个或三个宽峰， 表明在酸 性环境下该囊泡结构被破坏。 综上结果， 说明本发明所制备的聚合物囊泡有pH以及温度响 应性。 0032 实施例2 具有气泡生成功能的BG-DIPS的表征。 0033 将实施例1制备的BG-DIPS溶液用PBS pH7.4稀释后滴到碳膜铜网上， 待干燥后置 于透射电镜下观察具有气泡生成功能的聚合物囊泡的形貌。 透射电子显微镜 （TEM） 照片如 图2， A） 所示， 可以明显观测到囊泡内有气泡生成， 随着观测时间的延长， 气泡吸收电子束的 能量而融合成大气泡， 但所形成的大气泡不会破坏囊泡的结构， 同时可清晰观察到囊泡。
28、具 有明显的膜层结构。 0034 将实施例1制备的BG-DIPS溶液分别用PBS pH7.4和PBS pH5.5稀释后滴到碳膜铜 网上， 同时设置激光照射组， 将PBS pH7.4和PBS pH5.5稀释后的BG-DIPS用1 W/cm2的808 nm激光照射5min， 然后滴加到碳膜铜网上， 用TEM观察BG-DIPS在4种不同条件下 （PBS pH7.4、 PBS pH5.5、 PBS pH7.4加激光、 PBS pH5.5加激光） 的形态变化。 如图2， B） 所示， 可以 观察到BG-DIPS在PBS pH7.4时结构稳定并具有明显的膜层结构； BG-DIPS在PBS pH7.4加激 。
29、光的条件下， 有部分囊泡结构被破坏； BG-DIPS在PBS pH5.5时， 也有部分囊泡结构被破坏； BG-DIPS在PBS pH5.5加激光时， 囊泡结构被严重破坏。 结果进一步表明本申请发明所制备 的囊泡具有pH和温度响应性， 在酸性条件及光热条件下囊泡结构均可被破坏。 0035 实施例3 具有气泡生成功能的BG-DIPS体外释放行为的测定。 0036 取实施例1制备好的BG-DIPS溶液置于透析袋内密封， 然后将透析袋放置于15 mL pH7.4 PBS溶液或pH5.5 PBS溶液中， 同时设置激光照射组， 各平行3组进行， 于37恒温、 震 荡频率120次/分钟的条件下进行体外释放实。
30、验。 定时取出全部释放液通过紫外可见分光光 度计测定阿霉素吸光度并补充相同体积的PBS缓冲溶液。 结果如图3所示， 药物释放量： PBS pH7.4组 PBS pH5.5组 PBS pH7.4加激光组 PBS pH5.5 加激光组。 结果表明： 相比于生 理pH （7.4） 下的释放而言， 在酸性条件下 （pH5.5） 的阿霉素从囊泡中释放速率要快的多。 表 明本发明制备的具有气泡生成功能的载药聚合物囊泡具有pH响应性； 激光照射组的药物释 放量比不加激光照射的释放量多， 表明本发明制备的具有气泡生成功能的载药囊泡具有温 度响应性； 相比于其他组， pH 5.5 PBS加激光组药物释放量最大，。
31、 表明本发明所制备的pH/ 温度响应型聚合物囊泡可以使药物在肿瘤局部有较多的释放。 0037 实施例4 具有气泡生成功能的BG-DIPS对4T1-Luc乳腺癌细胞的细胞毒性测定。 0038 用0.25%胰蛋白酶消化呈指数生长期的4T1-Luc乳腺癌细胞， 再用10%胎牛血清的 说 明 书 5/9 页 7 CN 108653733 A 7 无叶酸RPMI 1640培养液配成单个细胞悬液， 以每孔5000个细胞接种于96孔培养板中， 每孔 体积100 L。 加入用培养基稀释的不同浓度 free DOX & ICG和BG-DIPS， 加药浓度10、 5、 2.5、 1.25、 0.5、 0.05 g。
32、/mL （阿霉素浓度） 。 加药2 h后， 其中药物浓度为2.5 g/mL （阿霉素 浓度） 的free组和BG-DIPS组用1 W/cm2的808 nm激光照射5 min后继续孵育22 h， 然后按照 MTT法检测细胞活性。 细胞存活率按照以下公式计算： 细胞存活率= （实验组OD值空白组OD值） / （阴性组OD值空白组OD值） 如图4所示， 随着DOX浓度和孵育时间的增加， 4T1-Luc细胞的存活率成比例降低。 空白 BG-PS在高聚合物浓度下略微影响细胞活力， 这是由于在酸性环境中产生的CO2气泡会损害 肿瘤细胞。 孵育24 h后， BG-DIPS和游离药物的IC50值分别为8.91。
33、 g/ mL和7.24 g/ mL， 孵育时间延长至48 h时， IC50分别降至5.89 g/ mL和3.47 g/ mL。 与BG-DIPS组相比， 游 离药物组具有更高的细胞毒性， 这是因为游离药物可以通过被动扩散直接进入细胞直接发 挥作用， 而BG-DIPS主要通过内吞途径进入细胞， 然后释放DOX来发挥抗肿瘤活性。 其他研究 组也发现游离药物对癌细胞的细胞毒性高于载药纳米粒子。 激光照射后， 游离药物和BG- DIPS的细胞毒性有不同程度的增强， 并且BG-DIPS对4T1-Luc细胞的杀伤力明显高于游离药 物， 说明激光诱导的光热治疗能显著增强细胞对BG-DIPS的摄取， 通过产生。
34、CO2破坏囊泡而 加速DOX释放， 最终通过化疗协同光热治疗表现出强烈的细胞毒性。 0039 实施例5 4T1-Luc乳腺癌细胞对具有气泡生成功能的BG-DIPS的吞噬及药物在细胞内的分布。 0040 用0.25%胰蛋白酶消化4T1-Luc乳腺癌细胞， 再用10%胎牛血清的RPMI 1640培养基 配成单个细胞悬液， 以每孔7000个细胞接种于激光共聚焦皿， 每孔体积1 mL。 培养过夜后， 将激光共聚焦培养皿中的培养基吸弃， 每个培养皿加入2 mL 用培养基稀释的BG-DIPS及游 离药物， 药物浓度均为10 g/mL （阿霉素浓度） ， 孵育4 h。 同时设置激光照射组， 在给药培养 2 。
35、h后， 两个实验组均用1 W/cm2的808 nm激光照射5 min后继续孵育2 h。 吸弃含有纳米粒 或游离药物的培养基， 用1 mL PBS洗涤细胞2次； 用碧云天的免疫染色固定液1 mL （P0098） 室温固定细胞20分钟； 用碧云天的免疫染色洗涤液 (P0106) 1 mL 洗涤3次， 每次约5分钟； 加入碧云天的DAPI 1 mL， 室温培养20 min， 用PBS洗涤3次 （每次3-5 min） 。 最后加入600 L PBS后用激光共聚焦观察。 0041 如图5所示， 给药4 h后， 游离ICG （绿色） 主要分布在细胞质中， 游离DOX荧光 （红色） 大部分蓄积在细胞核。 而。
36、BG-DIPS处理组在细胞质和细胞核均表现出DOX荧光， 且细胞核荧 光强于细胞质。 这是可能由于在BG-DIPS内化至细胞后， 胞内pH较低的环境促进CO2气泡的 产生， 囊泡结构被破坏， 促进DOX释放并且快速扩散进入细胞核。 与用游离药物处理的细胞 相比， 用BG-DIPS处理的细胞表现出较弱的DOX荧光， 这归因于二者不同的细胞摄取机制以 及BG-DIPS对DOX的控制释放。 激光照射后， 细胞内DOX和ICG的荧光强度明显增加， 表明激光 照射细胞后可以促进药物进入细胞， 因为激光照射引起的热量可以提高细胞通透性和流动 性而增加药物在肿瘤细胞中的积累。 此外， 激光产生的热量促使BG。
37、-DIPS分解成较小的碎 片， 更易于进入细胞； 同时， 这些热量加速了内化到细胞中的BG-DIPS产生二氧化碳气泡， 从 而促进DOX释放并扩散到细胞核内。 0042 实施例6 具有气泡生成功能的双载阿霉素和Ce6的聚合物囊泡的制备方法， 包括如下步骤： 说 明 书 6/9 页 8 CN 108653733 A 8 （1） 将PCL8000-b-PEG8000-b-PCL8000两亲性三嵌段共聚物与Ce6溶于二氯甲烷中， 在旋转 蒸发仪中旋转蒸发除去二氯甲烷， 在反应器内壁形成一层均匀的薄膜， 抽真空过夜除去残 余有机溶剂； （2） 向反应器中加入5 mL浓度为300 mM的碳酸氢铵水溶液，。
38、 所述PCL8000-b-PEG8000-b- PCL8000两亲性三嵌段共聚物与碳酸氢铵水溶液的比为4 mg:1 mL， 于65水化5 h， 震荡混 匀， 放置至室温， 冰浴下超声20 min， 得到稳定的单载Ce6的聚合物囊泡分散液； （3） 将单载Ce6的聚合物囊泡分散液移入MWCO8000-14000 Da的透析袋中， 放在pH7.4的 浓度为300 mM的蔗糖水溶液中透析14小时， 得透析后的单载Ce6的聚合物囊泡分散液； 蔗糖 水溶液的pH是用10 mM组氨酸水溶液进行调节； （4） 将阿霉素溶于去离子水中得浓度为15 mg/mL的溶液1， 将溶液1加入到预热至65 的单载Ce6的。
39、聚合物囊泡分散液中， 在65搅拌1.5 h； 所述溶液1与步骤 （3） 获得的透析后 的单载Ce6聚合物囊泡分散液的体积比为1:10； 冷却至室温， 移入MWCO8000-14000 Da的透 析袋中， 放在pH7.4的PBS溶液中透析12小时， 在透析过程中换新鲜的同浓度的PBS水溶液， 除去游离的阿霉素， 得具有气泡生成功能的双载阿霉素和Ce6的聚合物囊泡。 0043 实施例7 具有气泡生成功能的双载米托蒽醌和吲哚菁绿的聚合物囊泡的制备方法， 包括如下步 骤： （1） 将PCL8000-b-PEG8000-b-PCL8000两亲性三嵌段共聚物与转疏水的吲哚菁绿溶于二氯 甲烷中， 在旋转蒸发。
40、仪中旋转蒸发除去二氯甲烷， 在反应器内壁形成一层均匀的薄膜， 抽真 空过夜除去残余有机溶剂； （2） 向反应器中加入5 mL浓度为300 mM的碳酸氢铵水溶液， 所述PCL8000-b-PEG8000-b- PCL8000两亲性三嵌段共聚物与碳酸氢铵水溶液的比为4 mg:1 mL， 于65水化5 h， 震荡混 匀， 放置至室温， 冰浴下超声30 min， 得到稳定的单载吲哚菁绿的聚合物囊泡分散液； （3） 将单载吲哚菁绿的聚合物囊泡分散液移入MWCO8000-14000 Da的透析袋中， 放在 pH7.4的浓度为300 mM的蔗糖水溶液中透析14小时， 得透析后的单载吲哚菁绿的聚合物囊 泡分散。
41、液； 蔗糖水溶液的pH值用10 mM组氨酸水溶液进行调节； （4） 将米托蒽醌溶于去离子水中得浓度为15 mg/mL的溶液1， 将溶液1加入到预热至65 的单载吲哚菁绿的聚合物囊泡分散液中， 在65搅拌1.5 h； 所述溶液1与步骤 （3） 获得的 透析后的单载吲哚菁绿的聚合物囊泡分散液的体积比为1:10； 冷却至室温， 移入MWCO8000- 14000 Da的透析袋中， 放在pH7.4的PBS溶液中透析12小时， 在透析过程中换新鲜的同浓度 的PBS水溶液， 除去游离的米托蒽醌， 得具有气泡生成功能的双载米托蒽醌和吲哚菁绿的聚 合物囊泡。 0044 实施例8 具有气泡生成功能的双载柔红霉素。
42、和Ce6的聚合物囊泡的制备方法， 包括如下步骤： （1） 将PCL8000-b-PEG8000-b-PCL8000两亲性三嵌段共聚物与Ce6溶于二氯甲烷中， 在旋转 蒸发仪中旋转蒸发除去二氯甲烷， 在反应器内壁形成一层均匀的薄膜， 抽真空过夜除去残 余有机溶剂； （2） 向反应器中加入5 mL浓度为300 mM的碳酸氢铵水溶液， 所述PCL8000-b-PEG8000-b- PCL8000两亲性三嵌段共聚物与碳酸氢铵水溶液的比为4 mg:1 mL， 于65水化5 h， 震荡混 说 明 书 7/9 页 9 CN 108653733 A 9 匀， 放置至室温， 冰浴下超声30 min， 得到稳定的。
43、单载Ce6的聚合物囊泡分散液； （3） 将单载Ce6的聚合物囊泡分散液移入MWCO8000-14000 Da的透析袋中， 放在pH7.4的 浓度为300 mM的蔗糖水溶液中透析14小时， 得透析后的单载Ce6的聚合物囊泡分散液； 蔗糖 水溶液的pH值用10 mM组氨酸水溶液进行调节； （4） 将柔红霉素溶于去离子水中得浓度为15 mg/mL的溶液1， 将溶液1加入到预热至65 的单载Ce6的聚合物囊泡分散液中， 在65搅拌1.5 h； 所述溶液1与步骤 （3） 获得的透析 后的单载Ce6的聚合物囊泡分散液的体积比为1:10； 冷却至室温， 移入MWCO8000-14000 Da 的透析袋中， 。
44、放在pH7.4的PBS溶液中透析12小时， 在透析过程中换新鲜的同浓度的PBS水溶 液， 除去游离的柔红霉素， 得具有气泡生成功能的双载柔红霉素和Ce6的聚合物囊泡。 0045 实验证明， 用阿柔比星、 表阿霉素或伊达比星等蒽环类药物替代本实施例的柔红 霉素， 用ICG、 IR780等疏水性药物代替本实施例的Ce6， 其它同本实施例， 其制备的具有气泡 生成功能的亲水性内腔载阿柔比星、 表阿霉素或伊达比星、 膜层载ICG、 IR780的聚合物囊泡 的性质与本实施例的聚合物囊泡的性质相似。 换言之， 在上述具体实施方式中所描述的各 种亲水性蒽环类药物与疏水性药物， 在不矛盾的情况下， 可以通过任。
45、何合适的方式进行组 合。 0046 实施例9 具有气泡生成功能的亲水性内腔载蒽环类药物、 膜层载光敏剂的pH/温度双重响应型 聚合物囊泡在制备抗肿瘤药物的应用。 0047 为了更好地理解本发明的实质， 以下用实施例1制备的BG-DIPS配制注射液使用， 同游离阿霉素和吲哚菁绿注射液在小鼠4T1-Luc乳腺癌模型中的试验及其结果来说明具有 气泡生成的pH/温度双重敏感性聚合物囊泡富集于肿瘤部位的有效性。 建立荷乳腺癌小鼠 模型， 采用小动物荧光成像分析尾静脉给药后BG-DIPS在组织脏器中的分布。 将荷瘤小鼠 （4T1-Luc） 随机分为BG-DIPS组和free DOX & ICG组， 尾静脉。
46、给药量为阿霉素8 mg/kg， 给药 后4 h、 12 h、 24 h和48 h用小动物荧光成像测体内吲哚菁绿荧光强度， 48 h后解剖心、 肝、 脾、 肺、 肾、 肿瘤， 用小动物荧光成像测各脏器阿霉素荧光强度。 0048 实验结果表明， 尾静脉注射4 h、 12 h、 24 h和48 h后， 游离吲哚菁绿荧光主要集中 在肾和肝脏， 表明该游离药物迅速被代谢， 因此导致药物利用率低、 毒性大； 而具有气泡生 成功能的双载药聚合物囊泡在肝脏、 肾及肿瘤均有荧光， 表明该囊泡具有长循环特性， 能够 通过EPR效应能聚集在肿瘤部位 （图6A） 。 给药48 h后， 游离给药组各脏器阿霉素荧光强度较。
47、 弱， 而具有气泡生成功能的双载药囊泡组中的阿霉素荧光较强， 并且主要集中在肿瘤部位 （图6B） 。 研究表明具有气泡生成功能的双载阿霉素和吲哚菁绿的载药囊泡可以通过EPR效 应有效将药物富集于肿瘤部位， 明显提高药物稳定性， 延长血液循环时间。 0049 实施例10 具有气泡生成功能的亲水性内腔载蒽环类药物、 膜层载光敏剂的pH/温度双重响应型 聚合物囊泡的体内药效学评价。 0050 用实施例1制备的BG-DIPS配制注射液， 以游离药物DOX和ICG混合液为阳性对照， PBS为阴性对照， 分别尾静脉注入荷瘤小鼠 （4T1-Luc） 模型中 （给药剂量为： 8 mg/kg DOX， 每 隔6。
48、天给药一次， 共进行4次注射） 。 对于激光组， 在每次给药24 h后用1 W/cm2的808 nm激光 照射小鼠肿瘤部位5 min。 每2天分别记录各组小鼠的体重和肿瘤体积来反应BG-DIPS在治 说 明 书 8/9 页 10 CN 108653733 A 10 疗乳腺癌中的有效性， 见图7A、 B。 注射PBS小鼠的肿瘤体积无论有无激光照射都迅速增加， 表明4T1-Luc肿瘤生长不受激光照射的影响。 无激光照射的游离药物和BG-DIPS轻度抑制肿 瘤生长， 注射后第24天的肿瘤体积分别为845 mm3和689 mm3， 游离药物组的肿瘤抑制效果不 如BG-DIPS组， 因为游离药物在肿瘤部位的清除速度快， 累积少。 在激光照射下， 游离药物和 BG-DIPS均显示出较好的抗肿瘤效力， 值得注意的是， BG-DIPS联合激光照射能够显著减小 肿瘤体积。 BG-DIPS在激光照射下的抗肿瘤效果最强， 这是由于BG-DIPS可以通过体内长循 环在肿瘤部位得以累积， 并且具有较高的细胞摄取效率、 通过气泡生成而触发DOX和ICG的 释放来实现化疗协同光热治疗。 将小鼠的体重变化作为潜在毒副作用的指标。 如图7C所示， 在游离药物组中观察到明显的体重减轻， 而用BG-DIPS处理的小鼠没有引起显著。