技术领域
本发明涉及纳米药物制剂技术领域，具体涉及不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联物的自组装 纳米系统及其制备方法和应用。
背景技术
化疗药物是临床抗肿瘤治疗常用的手段之一，但由于制剂中含有的有毒溶媒可能引起明 显不良反应(如泰素中添加的聚氧乙烯蓖麻油可能引起过敏反应及神经毒性等)，并且游离药 物在全身分布无选择性和对细胞杀伤亦无选择性可能引起严重毒副作用(如阿霉素引起的心 脏毒性等)等大大制约了其应用和发展。
纳米递送系统具有缓释、被动靶向、提高生物利用度、延长体内循环时间、改善药动学 行为以及减少疾病用药过程中的毒副作用等优点，因而，近几十年来开发合适的抗肿瘤药物 纳米递送系统已经成为国内外的研究热点。
但是，依赖于载体的纳米递送系统的载药量一般较低，并且利用载体包载药物的形式， 载体中的药物会泄露造成不可预期的毒副作用。
无载体的自组装纳米系统具有纳米给药系统的优势(如被动靶向能力、体内循环时间延 长以及药动学行为改善等)，同时又克服了传统载体纳米递送系统的载药量低等不足，具有很 好的应用前景。
发明内容
本发明克服现有技术的不足，提供一种不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联物的自组装纳米系 统及其制备方法和应用。申请人意外地发现，使用不饱和脂肪酸与抗肿瘤药物偶联，得到的 偶联物在不需要常规纳米药物载体的情况下，可自组形成纳米系统。进一步地，在添加少量 (相比于作为药物载体而言，其用量大幅减少)两亲性高分子材料的情况下，自组装纳米系 统的性质(如粒径等)有所改善。本发明的目的就在于使用不饱和脂肪酸来修饰抗肿瘤药物， 以得到仍保持药物活性但却具有自组装性质的偶联物纳米系统。
第一方面，本发明涉及不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联物的自组装纳米系统。
一种不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联物的自组装纳米系统，所述纳米系统包括不饱和脂肪 酸-抗肿瘤药物偶联物、含水溶液和任选使用的两亲性高分子材料。
优选地所述纳米系统由不饱和脂肪酸修饰的抗肿瘤药物偶联物、含水溶液和任选使用的 两亲性高分子材料组成。
所述的不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联物为不饱和脂肪酸与抗肿瘤药物偶联形成的化合 物。
所述不饱和脂肪酸具有如下结构：CnH2n-1COOH或CnH2n-3COOH或CnH2n-5COOH或CnH2n-7COOH或 CnH2n-9COOH或CnH2n-11COOH，其中n为1-29的整数，优选n为1,2，3,4，5,6，7,8，9,10，11,12， 13,14，15,16，17,18，19,20，21,22，23,24，25,26，27,28，29。所述不饱和脂肪酸优选 为油酸、共轭亚油酸、α-亚麻酸、EPA、DHA等。更优选所述不饱和脂肪酸为共轭亚油酸。 优选地共轭亚油酸是顺9，反11-共轭亚油酸或反10，顺12-共轭亚油酸。
本发明所述的抗肿瘤药物包括但不限于紫衫烷类、喜树碱类、长春碱类、抗生素类、核 苷类和铂类抗肿瘤药物等。
所述紫衫烷类抗肿瘤药物包括紫杉醇、多西紫杉醇、三尖杉宁碱、10-去乙酰巴卡亭III 及7-差向紫杉醇等。
所述喜树碱类抗肿瘤药物包括喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)、9-二甲胺甲基-10- 羟基喜树碱、伊立替康、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、GI147211和DX-8951f等。
所述长春碱类抗肿瘤药物包括长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨和20’,20’-二 氟-3’,4’-二氢去甲长春花碱等。
所述抗生物类抗肿瘤药物包括阿霉素和表阿霉素等。
所述核苷类抗肿瘤药物包括吉西他滨、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷等。
所述铂类抗肿瘤药物包括顺铂、卡铂、奈达铂以及奥沙利铂等。
本发明所述的抗肿瘤药物优选紫杉醇、多西紫杉醇、三尖杉宁碱、10-去乙酰巴卡亭III 及7-差向紫杉醇、吉西他滨、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷、SN38、长春碱、阿霉素、顺铂。
更优选地，本发明所述的抗肿瘤药物为紫杉醇、SN38、吉西他滨、长春碱、阿霉素和顺 铂。
所述含水溶液可选纯水、5％葡萄糖溶液、生理盐水、磷酸盐缓冲液等，优选纯水。
所述两亲性高分子材料包括但不限于DSPE-PEG、PLGA-PEG、聚氧乙烯蓖麻油、吐温 类、卵磷脂等，优选DSPE-PEG。
两亲性高分子材料与不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联物的质量比可选40:1～1:80，优选 20:1～1:40，更优选7:1～1:20，最优选1:1～1:20。
第二方面，本发明提供了可用于自组装纳米系统的不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联物及其 制备方法。
所述的不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联物为不饱和脂肪酸与抗肿瘤药物偶联形成的化合 物。
所述的抗肿瘤药物包括但不限于紫衫烷类、喜树碱类、长春碱类、抗生素类、核苷类和 铂类抗肿瘤药物等。
所述紫衫烷类抗肿瘤药物包括紫杉醇、多西紫杉醇、三尖杉宁碱、10-去乙酰巴卡亭III 及7-差向紫杉醇等。
所述喜树碱类抗肿瘤药物包括喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)、9-二甲胺甲基-10- 羟基喜树碱、伊立替康、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、GI147211和DX-8951f等。
所述长春碱类抗肿瘤药物包括长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨和20’,20’- 二氟-3’,4’-二氢去甲长春花碱等。
所述抗生物类抗肿瘤药物包括阿霉素和表阿霉素等。
所述核苷类抗肿瘤药物包括吉西他滨、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷等。
所述铂类抗肿瘤药物包括顺铂、卡铂、奈达铂以及奥沙利铂等。
本发明所述的抗肿瘤药物优选紫杉醇、多西紫杉醇、三尖杉宁碱、10-去乙酰巴卡亭III 及7-差向紫杉醇、吉西他滨、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷、SN38、长春碱、阿霉素、顺铂。
更优选地，本发明所述的抗肿瘤药物为紫杉醇、SN38、吉西他滨、长春碱、阿霉素和顺 铂。
本发明所述的不饱和脂肪酸，具有如下结构：CnH2n-1COOH或CnH2n-3COOH或CnH2n-5COOH或 CnH2n-7COOH或CnH2n-9COOH或CnH2n-11COOH，其中n为1-29的整数，优选n为1,2，3,4，5,6，7,8， 9,10，11,12，13,14，15,16，17,18，19,20，21,22，23,24，25,26，27,28，29。所述不饱 和脂肪酸优选为油酸、共轭亚油酸、α-亚麻酸、EPA、DHA等。
所述偶联物的制备方法包括如下步骤：
所述方法包括：
(1)、将抗肿瘤药物溶解于一定量的适宜溶剂中，加入催化剂和脱水剂，搅拌条件下再加入 不饱和脂肪酸，继续搅拌反应；
(2)、过滤除去沉淀，滤液减压真空干燥，以少量溶剂溶解后经薄层分析法分离，所得产物 条带用提取溶剂充分溶解后，抽滤；
(3)、所得滤液室温下氮气吹干或减压真空干燥，即得不饱和脂肪酸修饰的抗肿瘤药物偶联 物。
所述抗肿瘤药物和不饱和脂肪酸范围如上所定义，且所述不饱和脂肪酸修饰的抗肿瘤药 物偶联物不包括共轭亚油酸-紫杉醇和共轭亚油酸-吉西他滨。
步骤(1)中所述的溶剂选自二氯甲烷、氯仿、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二氧 六环或四氢呋喃中的一种或其混合溶液，优选二氯甲烷；
步骤(1)中所述的催化剂为二甲氨基吡啶；
步骤(1)中所述的脱水剂选自二环己基碳二酰亚胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二 亚胺或二异丙基碳二亚胺中的一种或其混合物，优选二环己基碳二酰亚胺；
步骤(1)中的反应的温度为室温～80℃，根据不同不饱和脂肪酸最优温度不同，优选室温； 反应条件为室内条件或氮气保护下，优选氮气保护条件；反应时间是4-72小时；优选12～24 小时；
步骤(2)中，薄层展开所用溶剂为体积比为1:1～40:1的二氯甲烷/甲醇溶液；优选1:1～20:1；
其中抗肿瘤药物与不饱和脂肪酸的投料摩尔比为1:0.1～1:10；优选1:1～1:4；
所述催化剂与抗肿瘤药物的摩尔比为1:0.1～1:10；优选1:1～4:1；
所述脱水剂与抗肿瘤药物与摩尔比为1:0.1～1:10；优选1:1～4:1。
第三方面，本发明涉及不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联物的自组装纳米系统的制备方法， 制备工艺简单，制备方法包括如下步骤：
将不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联物溶于一定量的适宜的有机溶剂中形成溶液，移取上述 溶液逐滴滴入一定体积的水溶液中，并不断搅拌，用去离子水透析除去有机溶剂，即得自组 装纳米粒分散液(1)。
本发明所述的不饱和脂肪酸，具有如下结构：CnH2n-1COOH或CnH2n-3COOH或CnH2n-5COOH或 CnH2n-7COOH或CnH2n-9COOH或CnH2n-11COOH，其中n为1-29的整数，优选n为1,2，3,4，5,6，7,8， 9,10，11,12，13,14，15,16，17,18，19,20，21,22，23,24，25,26，27,28，29。所述不饱 和脂肪酸优选为油酸、共轭亚油酸、α-亚麻酸、EPA、DHA等。更优选所述不饱和脂肪酸为 共轭亚油酸。优选地共轭亚油酸是顺9，反11-共轭亚油酸或反10，顺12-共轭亚油酸。
本发明所述的抗肿瘤药物包括但不限于紫衫烷类、喜树碱类、长春碱类、抗生素类、核 苷类和铂类抗肿瘤药物等。
所述紫衫烷类抗肿瘤药物包括紫杉醇、多西紫杉醇、三尖杉宁碱、10-去乙酰巴卡亭III 及7-差向紫杉醇等。
所述喜树碱类抗肿瘤药物包括喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)、9-二甲胺甲基-10- 羟基喜树碱、伊立替康、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、GI147211和DX-8951f等。
所述长春碱类抗肿瘤药物包括长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨和20’,20’-二 氟-3’,4’-二氢去甲长春花碱等。
所述抗生物类抗肿瘤药物包括阿霉素和表阿霉素等。
所述核苷类抗肿瘤药物包括吉西他滨、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷等。
所述铂类抗肿瘤药物包括顺铂、卡铂、奈达铂以及奥沙利铂等。
本发明所述的抗肿瘤药物优选紫杉醇、多西紫杉醇、三尖杉宁碱、10-去乙酰巴卡亭III 及7-差向紫杉醇、吉西他滨、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷、SN38、长春碱、阿霉素、顺铂。
更优选地，本发明所述的抗肿瘤药物为紫杉醇、SN38、吉西他滨、长春碱、阿霉素和顺 铂。
所述有机溶剂可选二甲基亚砜、丙酮、乙醇、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙 腈等水溶性溶剂，优选二甲基亚砜、丙酮和乙醇，最优选二甲基亚砜。
所述含水溶液可选纯水、5％葡萄糖溶液、生理盐水、磷酸盐缓冲液等，优选纯水。
药物和有机溶剂形成的溶液与水溶液的体积比可选1:1～1:100，优选1:1～1:50，更优选 1:1～1:20，最优选1:3～1:10。
制备时搅拌转速可选50～1500转/分，优选300～500转/分。
透析时间可选24～72小时，优选36～54小时，优选36-48小时。
第四方面，本发明涉及不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联物自组装纳米系统的进一步优化， 制备方法包括如下步骤：
将不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联物和两亲性高分子材料混合溶于一定量的适宜的有机 溶剂中，移取上述溶液逐滴滴入一定量的水溶液中，并不断搅拌，用去离子水透析除去有机 溶剂，即得自组装纳米粒分散液(2)，任选地将所得纳米粒分散液(2)可进一步离心浓缩。
所述不饱和脂肪酸具有如下结构：CnH2n-1COOH或CnH2n-3COOH或CnH2n-5COOH或CnH2n-7COOH或 CnH2n-9COOH或CnH2n-11COOH，其中n为1-29的整数，优选n为1,2，3,4，5,6，7,8，9,10，11,12， 13,14，15,16，17,18，19,20，21,22，23,24，25,26，27,28，29。所述不饱和脂肪酸优选 为油酸、共轭亚油酸、α-亚麻酸、EPA、DHA等。更优选所述不饱和脂肪酸为共轭亚油酸。 优选地共轭亚油酸是顺9，反11-共轭亚油酸或反10，顺12-共轭亚油酸。
本发明所述的抗肿瘤药物包括但不限于紫衫烷类、喜树碱类、长春碱类、抗生素类、核 苷类和铂类抗肿瘤药物等。
所述紫衫烷类抗肿瘤药物包括紫杉醇、多西紫杉醇、三尖杉宁碱、10-去乙酰巴卡亭III 及7-差向紫杉醇等。
所述喜树碱类抗肿瘤药物包括喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)、9-二甲胺甲基-10- 羟基喜树碱、伊立替康、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、GI147211和DX-8951f等。
所述长春碱类抗肿瘤药物包括长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨和20’,20’-二 氟-3’,4’-二氢去甲长春花碱等。
所述抗生物类抗肿瘤药物包括阿霉素和表阿霉素等。
所述核苷类抗肿瘤药物包括吉西他滨、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷等。
所述铂类抗肿瘤药物包括顺铂、卡铂、奈达铂以及奥沙利铂等。
本发明所述的抗肿瘤药物优选紫杉醇、多西紫杉醇、三尖杉宁碱、10-去乙酰巴卡亭III 及7-差向紫杉醇、吉西他滨、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷、SN38、长春碱、阿霉素、顺铂。
更优选地，本发明所述的抗肿瘤药物为紫杉醇、SN38、吉西他滨、长春碱、阿霉素和顺 铂。
所述两亲性高分子材料包括但不限于DSPE-PEG、PLGA-PEG、聚氧乙烯蓖麻油、吐温 类、卵磷脂等，优选DSPE-PEG。
两亲性高分子材料与不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联物的质量比可选40:1～1:80，优选 20:1～1:40，更优选7:1～1:40，最优选1:1～1:20。
所述有机溶剂可选二甲基亚砜、丙酮、乙醇、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇以及 乙腈等水溶性溶剂，优选二甲基亚砜、丙酮和乙醇，最优选二甲基亚砜。
所述含水溶液可选纯水、5％葡萄糖溶液、生理盐水、磷酸盐缓冲液等、优选纯水。
药物和有机溶剂形成的溶液与水溶液的体积比可选1:1～1:100，优选1:1～1:50，更优选 1:1～1:20，最优选1:3～1:10。
制备时搅拌转速可选50～1500转/分，优选100～1000转/分，更优选300～500转/分。
透析时间可选12～72小时，优选36～54小时，更优选36-48小时。
离心力可选500～15000转/分，优选1000～10000转/分，更优选2000～4000转/分。
第五方面，本发明还涉及不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联物及其自组装纳米系统在制备抗 肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、 淋巴瘤、脑瘤、白血病、鼻咽癌、淋巴瘤、子宫癌。优选乳腺癌、黑色素瘤和脑胶质瘤。
在本发明中，通过对肿瘤细胞体外生长抑制试验表明：本发明所述不饱和脂肪酸-抗肿瘤 药物偶联物自组装纳米系统在体外对肿瘤细胞有一定的抑制作用。
本研究中采用的测定方法为文献报道的磺酰罗丹明B(SRB)比色法，具体操作如下：
(1)将肿瘤细胞以适宜细胞密度接种于96孔板中，孵育24h备用。
(2)纳米粒分散液经0.2微米无菌滤膜过滤除菌后，用培养基稀释成一系列浓度的纳米 粒稀释液。
(3)弃去原培养基后，分别加入纳米粒稀释液，以加入完全培养基为对照，孵育48小 时后，弃去纳米粒稀释液，10％三氯乙酸固定细胞1小时(4℃)，用蒸馏水反复洗涤，空气 中自然晾干，0.4％SRB染液在室温染色20分钟，0.1％乙酸反复洗涤，空气中自然晾干后加 入10微摩尔/升Tris-base溶液，置摇床震荡30分钟后，用酶标仪测定各组在540nm处的吸 光值。
(4)计算存活率：存活率＝(加药组细胞平均吸光值/对照组细胞平均吸光值)×100％。
结果显示各个浓度的不饱和脂肪酸-紫杉醇偶联物自组装纳米粒在体外对多种肿瘤细胞 均有一定的抑制生长作用。
本发明的优点：
(1)本发明提供的不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联物的自组装纳米系统，相比于传统的 游离型抗肿瘤药物制剂而言，具有被动靶向能力，可提高化疗药物的生物利用度， 延长其体内循环时间，改善其药动学行为以及减少化疗过程中的毒副作用等优点。
(2)本发明提供的不饱和脂肪酸-肿瘤药物偶联物的自组装纳米系统源于偶联物本身 的自组装，与传统载体依赖型纳米系统相比，具有载药量高、稳定性强、安全性 好等优点。
(3)本发明提供了不饱和脂肪酸-肿瘤药物偶联物的自组装纳米系统的进一步优化方 案，通过在不饱和脂肪酸-肿瘤药物偶联物自组装过程中引入少量两亲性高分子材 料(如DSPE-PEG等)，可使自组装形成的纳米粒粒径更小、稳定性更好。
(4)本发明所述的不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联物的自组装纳米系统不仅具有很好 的抗肿瘤效果，还具有制备方法简单，易于工业化生产等优势。
附图说明
图1共轭亚油酸-紫杉醇偶联物自组装纳米粒的电镜图
图2：引入DSPE-PEG后共轭亚油酸-紫杉醇偶联物自组装纳米粒的电镜图
具体实施方式
实施例1：油酸-紫杉醇偶联物的合成
在氮气保护下，将紫杉醇(85mg，0.1mmol)溶解于适量无水二氯甲烷中，加入二甲氨 基吡啶(14.4mg，0.1mmol)和二环己基碳二酰亚胺(24.6mg，0.2mmol)，搅拌条件下再 加入油酸(28mg，0.1mmol)，继续室温搅拌反应12小时。过滤除去沉淀，滤液减压真空干 燥，以少量溶剂溶解后经薄层分析法分离，所得产物条带用提取溶剂充分溶解后，抽滤，滤 液经室温下氮气吹干或减压真空干燥，即得油酸-紫杉醇偶联物(产率63％)。
实施例2：α-亚麻酸-紫杉醇偶联物的合成
在氮气保护下，将紫杉醇(85mg，0.1mmol)溶解于适量无水二氯甲烷中，加入二甲氨 基吡啶(14.4mg，0.1mmol)和二环己基碳二酰亚胺(24.6mg，0.2mmol)，搅拌条件下再 加入油酸(28mg，0.1mmol)，继续室温搅拌反应12小时。过滤除去沉淀，滤液减压真空干 燥，以少量溶剂溶解后经薄层分析法分离，所得产物条带用提取溶剂充分溶解后，抽滤，滤 液经室温下氮气吹干或减压真空干燥，即得α-亚麻酸-紫杉醇偶联物(产率68％)。
实施例3：DHA-SN38偶联物的合成
在氮气保护下，将7-乙基-10-羟基喜树碱(40mg，0.1mmol)溶解于适量无水N，N- 二甲基甲酰胺中，加入二甲氨基吡啶(14.4mg，0.1mmol)和二环己基碳二酰亚胺(24.6mg， 0.2mmol)，搅拌条件下再加入共轭亚油酸(33mg，0.1mmol)，继续室温搅拌反应12小时。 过滤除去沉淀，滤液减压真空干燥，以少量溶剂溶解后经薄层分析法分离，所得产物条带用 提取溶剂充分溶解后，抽滤，滤液经室温下氮气吹干或减压真空干燥，即得DHA-SN38偶联物 (产率63％)。
实施例4：EPA-阿霉素偶联物的合成
在氮气保护下，将阿霉素(55mg，0.1mmol)溶解于适量无水二氯甲烷中，加入O-苯 并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，115mg,0.15mmol)和N，N-二异丙基乙胺(100mg,0.77 mmol)，再加入EPA(30mg，0.1mmol)，继续室温搅拌反应12小时。过滤除去沉淀，滤液 减压真空干燥，以少量溶剂溶解后经薄层分析法分离，所得产物条带用提取溶剂充分溶解后， 抽滤，滤液经室温下氮气吹干或减压真空干燥，即得EPA-阿霉素偶联物(产率61％)。
实施例5：共轭亚油酸-长春碱偶联物的合成
在氮气保护下，将长春碱(91mg，0.1mmol)溶解于适量无水二氯甲烷中，加入二甲氨 基吡啶(14.4mg，0.1mmol)和二环己基碳二酰亚胺(24.6mg，0.2mmol)，搅拌条件下再 加入共轭亚油酸(28mg，0.1mmol)，继续室温搅拌反应12小时。过滤除去沉淀，滤液减压 真空干燥，以少量溶剂溶解后经薄层分析法分离，所得产物条带用提取溶剂充分溶解后，抽 滤，滤液经室温下氮气吹干或减压真空干燥，即得共轭亚油酸-长春碱偶联物(产率65％)。
实施例6：α-亚麻酸-吉西他滨偶联物的合成
在氮气保护下，α-亚麻酸(278mg，1mmol)溶解于适量无水四氢呋喃中，搅拌条件下 加入三乙胺(125mg,1.2mmol)，冰浴条件下，逐滴加入氯甲酸乙酯(113mg，1mmol)的 无水四氢呋喃溶液，搅拌反应30分钟，再逐滴加入盐酸吉西他滨(309mg，1mmol)和三乙 胺(125mg,1.2mmol)的无水N，N-二甲基甲酰胺混合溶液，室温条件下搅拌反应48小时。 反应液减压真空干燥，以少量溶剂溶解后经薄层分析法分离，所得产物条带用提取溶剂充分 溶解后，抽滤，滤液经室温下氮气吹干或减压真空干燥，即得α-亚麻酸-吉西他滨偶联物(产 率60％)。
实施例7：共轭亚油酸-顺铂偶联物的合成
将过氧化氢逐滴加入顺铂(1g，3.33mmol),加热至75℃保持5小时使反应充分进行， 室温中避光放置过夜，过滤收集产物，纯水洗涤数次，减压真空干燥后即得 c,c,t-[Pt(NH3)2Cl2(OH)2]纯品。将c,c,t-[Pt(NH3)2Cl2(OH)2](34mg，0.1mmol)溶于适量 二甲基亚砜中，加入二甲氨基吡啶(14.4mg，0.1mmol)和二环己基碳二酰亚胺(24.6mg， 0.2mmol)，搅拌条件下再加入共轭亚油酸(29mg，0.1mmol)，继续室温搅拌反应24小时。 反应液经冻干后，利用丙酮重结晶，离心收集产物，减压真空干燥即得共轭亚油酸-顺铂偶联 物(产率61％)。
实施例8：共轭亚油酸-紫杉醇偶联物的合成
在氮气保护下，将紫杉醇(85mg，0.1mmol)溶解于适量无水二氯甲烷中，加入二甲氨 基吡啶(14.4mg，0.1mmol)和二环己基碳二酰亚胺(24.6mg，0.2mmol)，搅拌条件下再 加入共轭亚油酸(28mg，0.1mmol)，继续室温搅拌反应12小时。过滤除去沉淀，滤液减压 真空干燥，以少量溶剂溶解后经薄层分析法分离，所得产物条带用提取溶剂充分溶解后，抽 滤，滤液经室温下氮气吹干或减压真空干燥，即得油酸-紫杉醇偶联物(产率70％)。
实施例9：共轭亚油酸-紫杉醇偶联物自组装纳米粒的制备
将共轭亚油酸-紫杉醇偶联物溶于适量的二甲基亚砜中得到的5mg/ml共轭亚油酸-紫杉 醇偶联物溶液，移取1ml逐滴滴入3ml纯水中，并不断搅拌，即得共轭亚油酸-紫杉醇偶联 物自组装纳米粒分散液(CLA-PTXNP)，随后转入透析袋中，利用去离子水透析24-48小时 可除去二甲基亚砜，即得。
实施例10：引入DSPE-PEG后的共轭亚油酸-紫杉醇偶联物自组装纳米粒的制备
将共轭亚油酸-紫杉醇偶联物和DSPE-PEG混合溶于适量二甲基亚砜中得到含10％ DSPE-PEG的5mg/ml共轭亚油酸-紫杉醇偶联物溶液，移取1ml逐滴滴入3ml纯水中，并 不断搅拌，即得共轭亚油酸-紫杉醇偶联物自组装纳米粒分散液(CLA-PTXPEGNP)，随 后转入透析袋中，利用去离子水透析24-48小时可除去二甲基亚砜，即得。
实施例11：其他不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联物自组装纳米粒的制备
参考实施例9-10的方法，将通过实施例1-7制备得到的不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联 物分别溶于适量二甲基亚砜中得到5mg/ml不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联物溶液，移取1ml 逐滴滴入3ml纯水中，并不断搅拌，即得带乳光的不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联物自组装 纳米粒分散液，随后转入透析袋中，利用去离子水透析24-48小时除去二甲基亚砜，即得。
实施例12：引入DSPE-PEG后的不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联物自组装纳米粒的制备
将通过实施例1-7制备得到的不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联物(或和DSPE-PEG混合) 溶于适量二甲基亚砜中得到(或含10％DSPE-PEG的)5mg/ml不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联 物溶液，移取1ml逐滴滴入3ml纯水中，并不断搅拌，即得(或含DSPE-PEG的)不饱和脂 肪酸-抗肿瘤药物偶联物自组装纳米粒分散液，随后转入透析袋中，利用去离子水透析24-48 小时小时可除去二甲基亚砜，即得。
试验例1：不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联物自组装纳米粒的结构表征
(1)利用马尔文粒度仪通过动态光散射测定通过实施例9-11制备得到纳米粒的粒径分 布和ζ电位(如图表1)，测定样品体积：1ml；测定温度25℃；分散介质：水。
作为一个实例，抗肿瘤药物为紫杉醇时，引入DSPE-PEG前后不饱和脂肪酸-紫杉醇偶联 物的自组装纳米粒的粒径分布和ζ电位如下所示：
表1引入DSPE-PEG前后不饱和脂肪酸-紫杉醇偶联物自组装纳米粒的粒径分布和ζ电位
(2)利用JEM-1400Plus透射电子显微镜观察通过实施例8-11制备得到纳米粒的形态(如 图1和图2)。
结果显示，不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联物自组装形成的纳米粒为均匀的球形纳米粒， 且粒径均一，表面电位呈负电位。
引入DSPE-PEG后不饱和脂肪酸-抗肿瘤偶联物自组装形成的纳米粒仍为均匀的球形纳 米粒，粒径纯不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联物自组装形成的纳米粒粒径较更小，表面电位仍 呈负电位，表明DSPE-PEG的引入有利于不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联物的自组装行为。
结果显示在不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联物自组装形成的纳米系统中引入很少量的 DSPE-PEG(如实施例10，DSPE-PEG的含量少于10％)即可达到降低粒径，提高稳定性的 目的，这与传统的依赖载体材料的纳米系统(通常载体材料的含量≥90％)明显不同，因而 不饱和脂肪酸-抗肿瘤药物偶联物自组装纳米系统具有更高的载药量。
试验例2：共轭亚油酸-紫杉醇偶联物自组装纳米粒的体外抑制肿瘤细胞生长效应评价
(1)将人乳腺癌MDA-MB-231细胞(1×104细胞/孔)，鼠源黑色素瘤B16-F10细胞(3 ×103细胞/孔)和人脑胶质瘤U87-MG细胞(8×103细胞/孔)分别接种于96孔板中，孵育24h 备用。
(2)纳米粒分散液经0.2微米无菌滤膜将除菌后，用培养基稀释成0.25～32μM的纳米 粒稀释液。
(3)弃去原培养基后，分别加入纳米粒稀释液，以加入完全培养基为对照，孵育48小 时后，弃去纳米粒稀释液，10％三氯乙酸固定细胞1小时(4℃)，用蒸馏水反复洗涤，空 气中自然晾干，0.4％SRB染液在室温染色20分钟，0.1％乙酸反复洗涤，空气中自然晾干 后加入10微摩尔/升Tris-base溶液，置摇床震荡30分钟后，用酶标仪测定各组在540nm处 的吸光值。
(4)通过下列公式计算生存率：
存活率＝(加药组细胞平均吸光值/对照组细胞平均吸光值)×100％
(5)利用GraphPadPrism6计算IC50，共轭亚油酸-紫杉醇偶联物自组装纳米粒体外抑 制不同肿瘤细胞生长情况：
表2共轭亚油酸-紫杉醇偶联物自组装纳米粒体外抑制不同肿瘤细胞生长情况(n＝3)
其中FreeCLA-PTX表示共轭亚油酸-紫杉醇偶联物采用泰素的配制方法配制得到的溶液 剂(40mg溶于2.5ml无水乙醇和2.635g聚氧乙烯蓖麻油，临给药前用5％葡萄糖注射剂 稀释至所需浓度)；
CLA-PTX-NPs表示通过实施例9制备得到的共轭亚油酸-紫杉醇偶联物自组装纳米 粒；
CLA-PTXPEGNPs表示通过实施例10制备得到的引入DSPE-PEG的共轭亚油酸-紫 杉醇偶联物自组装纳米粒。
结果显示引入DSPE-PEG前后的共轭亚油酸-紫杉醇偶联物自组装纳米粒在体外对多种 肿瘤细胞生长都有抑制效应，具有很好的抗肿瘤活性。
上文中已经用一般性说明、具体实施方式和试验对本发明做了详尽的描述，在不偏离本 发明精神的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。