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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810623494.7 (22)申请日 2018.06.15 (71)申请人 江苏远山生物技术有限公司 地址 224000 江苏省盐城市亭湖区南洋镇 新港村四组(28) (72)发明人 胡浩 (74)专利代理机构 北京慕达星云知识产权代理 事 务 所( 特 殊 普 通 合 伙 ) 11465 代理人 李冉 (51)Int.Cl. A61K 35/742(2015.01) A61K 9/12(2006.01) A61P 17/06(2006.01) A61P 7/00(200。
2、6.01) A61P 31/10(2006.01) (54)发明名称 凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂 的制备方法及应用 (57)摘要 本发明公开了一种凝结芽孢杆菌与地衣芽 孢杆菌混合喷雾剂的制备方法， 具体步骤如下： 制备凝结芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌菌液； 凝结芽 孢杆菌与地衣芽孢杆菌菌液混合。 本发明的凝结 芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合菌液喷雾剂， 无刺 激、 无腐蚀、 无污染， 适合治疗各个年龄， 各种皮 肤， 各种类型的灰指甲和牛皮癣； 效果显著、 对皮 肤无损坏； 使用浓度低、 稳定性好、 并且不复发。 权利要求书1页 说明书4页 CN 108721336 A 2018.11.02 。
3、CN 108721336 A 1.一种凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂的制备方法， 其特征在于， 具体步骤 如下： (1)制备凝结芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌菌液: a、 菌种培养： 将保存的凝结芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别转接在新鲜配制的固体培养 基摆成的试管斜面上， 于30-37培养24小时， 取此斜面菌种转接茄子瓶斜面， 于30-37培 养24小时； b、 种子罐培养： 在种子罐中加入液体培养基， 调节pH至7.6-7.8， 开搅拌， 121灭菌20- 30分钟， 开冷却水降温， 并通无菌空气控制罐压为0.04-0.06MPa， 当温度降至36-38时， 将 长好的茄子瓶上的菌体用100-2。
4、00ml无菌生理盐水清洗， 接种至种子罐内的液体培养基中， 保持30-38、 罐压0.04-0.06MPa， 搅拌速度为120-160转/分， 进行深层通气搅拌培养16-24 小时； c、 发酵罐培养： 当种子罐内培养液中凝结芽抱杆菌或地衣芽孢杆菌的菌数达到10亿 cfu/ml时， 将种子罐中的培养液以5-10的接种量转入1m3发酵罐的液体培养基中， 保持 30-38、 罐压0.04-0.06MPa， 搅拌速度120-160转/分， 进行深层通气搅拌培养24-30小时； (2)凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌菌液混合： 将步骤(1)制备的凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌菌液按体积比1:1混合均匀后， 即得。
5、凝 结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂。 2.根据权利要求1所述的一种凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂的制备方法， 其特征在于， 步骤(1)所述固体培养基的配制方法如下： 取蛋白胨8-10g， 牛肉膏5-7g， 氯化 钠5-7g， 蒸馏水定容至1000ml， 调节pH 7.2-7.4， 加入18-20g琼脂， 加热熔化， 装入试管或茄 子瓶， 121灭菌30分钟， 冷却， 摆成斜面备用。 3.根据权利要求1所述的一种凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂的制备方法， 其特征在于， 步骤(1)所述液体培养基的配方为： 蛋白胨8-20g， 酵母膏5-15g， 磷酸氢二钾 0.2-2g， 磷酸二氢。
6、钾0.2-2g， 硫酸镁0.1-2g， 葡萄糖8-20g， 碳酸钙1-10g， 水1000ml。 4.根据权利要求1所述的一种凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂的制备方法， 其特征在于， 所述喷雾剂的规格为100ml/瓶。 5.凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合菌液在制备治疗灰指甲和牛皮癣喷雾剂中的应 用。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108721336 A 2 凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂的制备方法及应用 技术领域 0001 本发明涉及发酵领域， 具体涉及一种凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合菌液喷雾 剂的制备方法及应用。 背景技术 0002 凝结芽孢杆菌(Bacillus 。
7、coagulans)， 属于芽孢杆菌属， 细胞呈杆状， 革兰氏阳性 菌， 端生芽孢， 无鞭毛； 其分解糖类生成L-乳酸， 为同型乳酸发酵菌。 凝结芽孢杆菌是兼性厌 氧菌， 在有氧及无氧的环境下都可生长， 能适应低氧的肠道环境， 对酸和胆汁有较高的耐受 性， 能够进行乳酸发酵， 产生的L-乳酸能降低肠道pH值， 抑制有害菌， 并能促进双歧杆菌等 有益菌的生长和繁殖。 0003 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为革兰氏阳性兼性厌氧菌， 细胞呈杆 状， 芽孢呈椭圆形或柱状， 中生或偏中生， 孢囊不膨大或轻微膨大。 地衣芽孢杆菌对外界环 境有较强的抵抗力， 对高温、 酸性、。
8、 胆盐和人工胃液有一定的耐受能力。 0004 甲癣， 俗称 “灰指甲” ， 是指皮癣菌侵犯甲板或甲下所引起的疾病。 甲真菌病是由皮 癣菌、 酵母菌及非皮癣菌等真菌引起的甲感染。 灰指甲的危害众多： 影响美观、 限制工作、 产 生异常心理障碍、 并发症多和成为人体传染源等， 严重影响人们的日常生活。 现有治疗灰指 甲的药物， 抗菌性能不一， 高效抗菌药物有效浓度高， 价格也高， 稳定性差， 有毒性、 腐蚀性、 刺激性气味， 对皮肤有一定的损伤， 对环境也有一定的污染。 0005 牛皮癣又称 “银屑病” ， 是一种常见的慢性皮肤病。 目前， 治疗牛皮癣的药品较多， 有西药制剂也有中药制剂， 市售的。
9、这些药物对牛皮癣有一定的抑制作用， 但疗效较慢， 而且 不易根治。 0006 现有的各种药物和制剂只能治疗灰指甲或牛皮癣的单一疾病， 且价格高、 疗效慢、 不易根治， 还具有毒性和腐蚀性。 因此， 亟需一种对不同皮肤， 不同类型的灰指甲和牛皮癣 都有特效的混合菌液喷雾剂。 发明内容 0007 本发明所要解决的技术问题是提供一种凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合菌液 喷雾剂， 无刺激、 无腐蚀、 无污染， 适合治疗各个年龄， 各种皮肤， 各种类型的灰指甲和牛皮 癣； 效果显著、 对皮肤无损坏； 使用浓度低、 稳定性好。 0008 为实现上述目的， 本发明采用以下技术方案： 0009 一种凝结芽孢杆菌。
10、与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂的制备方法， 具体步骤如下： 0010 (1)制备凝结芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌菌液: 0011 a、 菌种培养： 将保存的凝结芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别转接在新鲜配制的固体 培养基摆成的试管斜面上， 于30-37培养24小时， 取此斜面菌种转接2个250ml的茄子瓶斜 面， 于30-37培养24小时； 0012 b、 种子罐培养： 在种子罐中加入液体培养基， 装液量为30-60， 调节pH至7.6- 说 明 书 1/4 页 3 CN 108721336 A 3 7 .8， 开搅拌， 121灭菌20-30分钟， 开冷却水降温， 并通无菌空气控制罐压为0 .04- 0.06M。
11、Pa， 当温度降至36-38时， 将长好的2个茄子瓶上的菌体用100-200ml无菌生理盐水 清洗， 接种至种子罐内的液体培养基中， 保持30-38、 罐压0.04-0.06MPa， 搅拌速度为120- 160转/分， 进行深层通气搅拌培养16-24小时； 0013 c、 发酵罐培养： 当种子罐内培养液中凝结芽抱杆菌或地衣芽孢杆菌的菌数达到10 亿cfu/ml时， 将种子罐中的培养液以5-10的接种量转入1m3发酵罐的液体培养基中， 保 持30-38、 罐压0.04-0.06MPa， 搅拌速度120-160转/分， 进行深层通气搅拌培养24-30小 时； 发酵罐培养基组成和配制方法与种子罐相同。
12、； 0014 (2)凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌菌液混合： 0015 将步骤(1)制备的凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌菌液按体积比1:1混合均匀后， 即 得凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂。 0016 优选地， 步骤(1)所述固体培养基的配制方法如下： 取蛋白胨8-10g， 牛肉膏5-7g， 氯化钠5-7g， 蒸馏水定容至1000ml， 调节pH 7.2-7.4， 加入18-20g琼脂， 加热熔化， 装入试管 或茄子瓶， 121灭菌30分钟， 冷却， 摆成斜面备用。 0017 优选地， 步骤(1)所述液体培养基的配方为： 蛋白胨8-20g， 酵母膏5-15g， 磷酸氢二 钾0.2-2g， 磷酸二。
13、氢钾0.2-2g， 硫酸镁0.1-2g， 葡萄糖8-20g， 碳酸钙1-10g， 水1000ml。 0018 优选地， 所述喷雾剂的规格为100ml/瓶。 0019 进一步， 凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合菌液在制备治疗灰指甲和牛皮癣喷雾 剂中的应用。 0020 本发明的有益效果是： 本发明的凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合菌液喷雾剂， 无刺激、 无腐蚀、 无污染， 适合治疗各个年龄， 各种皮肤， 各种类型的灰指甲和牛皮癣； 效果 显著、 对皮肤无损坏； 使用浓度低、 稳定性好、 并且不复发。 具体实施方式 0021 以下所举实例只用于解释本发明， 并非用于限定本发明的范围。 0022 凝结芽孢。
14、杆菌(Bacillus coagulans)编号为GDMCC 1.645的冻干菌种， 购自广东 省微生物菌种保藏中心。 0023 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)编号为GDMCC 1.863的冻干菌种， 购自 广东省微生物菌种保藏中心。 0024 实施例1 0025 一种凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂的制备方法， 具体步骤如下： 0026 (1)制备凝结芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌菌液: 0027 a、 菌种培养： 将保存的凝结芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别转接在新鲜配制的固体 培养基摆成的试管斜面上， 于30培养24小时， 取此斜面菌种转接2个250ml的茄子瓶斜面，。
15、 于30培养24小时； 0028 b、 种子罐培养： 在种子罐中加入液体培养基， 装液量为30， 调节pH至7.6， 开搅 拌， 121灭菌20分钟， 开冷却水降温， 并通无菌空气控制罐压为0.04MPa， 当温度降至36 时， 将长好的2个茄子瓶上的菌体用100ml无菌生理盐水清洗， 接种至种子罐内的液体培养 基中， 保持30、 罐压0.04MPa， 搅拌速度为120转/分， 进行深层通气搅拌培养24小时； 说 明 书 2/4 页 4 CN 108721336 A 4 0029 c、 发酵罐培养： 当种子罐内培养液中凝结芽抱杆菌或地衣芽孢杆菌的菌数达到10 亿cfu/ml时， 将种子罐中的培。
16、养液以5的接种量转入1m3发酵罐的液体培养基中， 保持30 、 罐压0.04MPa， 搅拌速度120转/分， 进行深层通气搅拌培养30小时； 发酵罐培养基组成和 配制方法与种子罐相同； 0030 (2)凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌菌液混合： 0031 将步骤(1)制备的凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌菌液按体积比1:1混合均匀后， 装 入100ml喷雾瓶， 即得凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂。 0032 实施例2 0033 一种凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂的制备方法， 具体步骤如下： 0034 (1)制备凝结芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌菌液: 0035 a、 菌种培养： 将保存的凝结芽孢杆菌和。
17、地衣芽孢杆菌分别转接在新鲜配制的固体 培养基摆成的试管斜面上， 于35培养24小时， 取此斜面菌种转接2个250ml的茄子瓶斜面， 于35培养24小时； 0036 b、 种子罐培养： 在种子罐中加入液体培养基， 装液量为40， 调节pH至7.7， 开搅 拌， 121灭菌25分钟， 开冷却水降温， 并通无菌空气控制罐压为0.05MPa， 当温度降至37 时， 将长好的2个茄子瓶上的菌体用150ml无菌生理盐水清洗， 接种至种子罐内的液体培养 基中， 保持35、 罐压0.05MPa， 搅拌速度为140转/分， 进行深层通气搅拌培养20小时； 0037 c、 发酵罐培养： 当种子罐内培养液中凝结芽抱。
18、杆菌或地衣芽孢杆菌的菌数达到10 亿cfu/ml时， 将种子罐中的培养液以8的接种量转入1m3发酵罐的液体培养基中， 保持35 、 罐压0.05MPa， 搅拌速度140转/分， 进行深层通气搅拌培养27小时； 发酵罐培养基组成和 配制方法与种子罐相同； 0038 (2)凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌菌液混合： 0039 将步骤(1)制备的凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌菌液按体积比1:1混合均匀后， 装 入100ml喷雾瓶， 即得凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂。 0040 实施例3 0041 一种凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂的制备方法， 具体步骤如下： 0042 (1)制备凝结芽孢杆菌和地。
19、衣芽孢杆菌菌液: 0043 a、 菌种培养： 将保存的凝结芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别转接在新鲜配制的固体 培养基摆成的试管斜面上， 于37培养24小时， 取此斜面菌种转接2个250ml的茄子瓶斜面， 于37培养24小时； 0044 b、 种子罐培养： 在种子罐中加入液体培养基， 装液量为60， 调节pH至7.8， 开搅 拌， 121灭菌30分钟， 开冷却水降温， 并通无菌空气控制罐压为0.06MPa， 当温度降至38 时， 将长好的2个茄子瓶上的菌体用200ml无菌生理盐水清洗， 接种至种子罐内的液体培养 基中， 保持38、 罐压0.06MPa， 搅拌速度为160转/分， 进行深层通气搅拌培养。
20、16小时； 0045 c、 发酵罐培养： 当种子罐内培养液中凝结芽抱杆菌或地衣芽孢杆菌的菌数达到10 亿cfu/ml时， 将种子罐中的培养液以10的接种量转入1m3发酵罐的液体培养基中， 保持38 、 罐压0.06MPa， 搅拌速度160转/分， 进行深层通气搅拌培养24小时； 发酵罐培养基组成和 配制方法与种子罐相同； 0046 (2)凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌菌液混合： 说 明 书 3/4 页 5 CN 108721336 A 5 0047 将步骤(1)制备的凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌菌液按体积比1:1混合均匀后， 装 入100ml喷雾瓶， 即得凝结芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌混合喷雾剂。 00。
21、48 实施例4动物急性毒性试验 0049 取体重基本一致的小白鼠30只， 分成3组， 将实施例1-3制备的喷雾剂分别经小鼠 背部给药， 每只小鼠每次喷施3ml， 每天3次。 观察三天， 结果发现， 没有一例小鼠死亡， 表明 本发明的喷雾剂对小鼠无急性毒性。 0050 实施例5一般药理试验 0051 采用Beagle犬、 小鼠对本发明的喷雾剂进行一般药理学研究。 分别对Beagle犬背 部外喷低(5ml)、 中(10ml)、 高(20ml)三个剂量的实施例1-3制备的喷雾剂和蒸馏水(对照实 验)， 共4个组， 对心血管系统、 呼吸系统进行观察。 结果发现， 实施例1-3制备的喷雾剂对 Beagl。
22、e犬收缩压、 舒张压、 平均动脉压、 心率、 心律、 呼吸频率、 节律和幅度均无明显影响。 0052 小鼠背部外喷低(2ml)、 中(4ml)、 高(8ml)三个剂量的实施例1-3制备的喷雾剂和 蒸馏水(对照实验)， 共4个组， 对神经系统观察(自发活动计数、 爬杆试验及阈下剂量戊巴比 妥钠催眠协同试验作用)。 结果发现， 实施例1-3制备的喷雾剂对小鼠自发活动、 爬杆能力无 明显影响， 对阈下剂量戊巴比妥钠催眠无协同作用。 0053 结果表明， 实施例1-3制备的喷雾剂对Beagle犬心血管系统、 呼吸系统无明显影 响， 对小鼠神经系统无明显影响， 说明本品具有良好安全性。 0054 实施例。
23、6 0055 试验选30例志愿者， 为1445岁的灰指甲患者。 患者就诊前一个月内未使用过任 何口服及外用药物治疗。 志愿者分为3组， 每组患者分别将实施例1-3制备的喷雾剂喷施在 灰指甲患处， 每天2次， 3个月后， 观察效果。 结果发现， 患者均无不良反应， 且治疗后有显著 效果， 无复发情况。 0056 试验选15例志愿者， 为1445岁的牛皮癣患者。 患者就诊前一个月内未使用过任 何口服及外用药物治疗。 志愿者分为3组， 每组患者分别将实施例1-3制备的喷雾剂喷施在 牛皮癣患处， 每天2次， 3个月后， 观察效果。 结果发现， 患者均无不良反应， 且治疗后有显著 效果， 无复发情况。 。
24、0057 注： 本发明所述志愿者均符合受试者志愿入选标准。 0058 本说明书中各个实施例采用递进的方式描述， 每个实施例重点说明的都是与其他 实施例的不同之处， 各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。 对于实施例公开的装置 而言， 由于其与实施例公开的方法相对应， 所以描述的比较简单， 相关之处参见方法部分说 明即可。 0059 对所公开的实施例的上述说明， 使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。 对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的， 本文中所定义的 一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下， 在其它实施例中实现。 因此， 本发明 将不会被限制于本文所示的这些实施例， 而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一 致的最宽的范围。 说 明 书 4/4 页 6 CN 108721336 A 6 。