技术领域
本发明涉及中药技术领域，具体的说是涉及一种人参籽提取物及其制备 方法和应用。
背景技术
皮肤老化是由自然因素或非自然因素造成的皮肤衰老现象。人出生后皮 肤组织日益发达，功能逐渐活跃，当到达某种年龄就会开始退化，这种退化 往往在人们不知不觉中慢慢进行。引起皮肤老化的原因有很多，如光老化和 外界因素造成的胶原蛋白和弹力蛋白的减少、细胞过早消耗完分裂次数，提 前进入程序衰老等。
细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础，细胞以分裂的方式 进行增殖。Hayflick研究发现，正常细胞有一定的寿命，它们的增殖能力也不 是无限的，而是有一定的界限，这就是有名的Hayflick界限理论。细胞增殖越 快，细胞生命就越短。减缓了细胞增殖就是延长了细胞的生命，延缓了老化 的进程，达到抗老化作用。减缓细胞的增殖，让皮肤细胞暂时处于休眠状态， 避免过早让皮肤细胞消耗完增殖能力，保留肌肤年轻的资本，是减缓肌肤老 化的合理方法之一。
人参籽，又称为人参子，为五加科人参属植物人参PanaxginsengC.A.Mey. 的果实，其是内含一粒种子的果核，常用于体虚乏力，头昏失眠，胸闷气短。 人参籽中的总皂苷含量约为1-2％，人参籽中还含有高达40％的不饱和脂肪酸， 30％的蛋白质。此外，人参籽中还含有11种微量元素，人参多糖，氨基酸，多 肽等成分，对生物体内的代谢过程起着很大作用。到目前为止，还未发现对 人参籽对于皮肤细胞增殖的抑制作用的研究报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种人参籽提取物及其制备方法，使 所述人参籽提取物具有显著的细胞增殖抑制活性，能够应用于细胞增殖抑制 中以及制备细胞增殖抑制剂，具有成为抗皮肤老化产品的潜在优势。
在中药领域，人参籽常用于体虚乏力，头昏失眠，胸闷气短等症，而本 发明经过创造性研究发现，人参籽经过特定方法提取的提取物具有较好地细 胞增殖抑制活性，能够用于细胞增殖抑制剂的制备中。
本发明所述人参籽提取物的制备方法，包括：
步骤1、人参籽加水提取，获得人参籽提取液；
步骤2、人参籽提取液浓缩，上样至大孔吸附树脂，依次用去离子水、由 低到高的梯度浓度乙醇溶液进行梯度洗脱，分别收集其中的去离子水、 30v/v％-95v/v％浓度乙醇洗脱的洗脱液，减压脱除乙醇和水，获得人参籽提取 物。
本发明所述人参籽提取物可以是来自30v/v％-95v/v％浓度中各单一浓度 乙醇洗脱的洗脱液，也可以是它们的混合物。
作为优选，所述制备方法包括：
步骤1、人参籽加水提取，获得人参籽提取液；
步骤2、人参籽提取液浓缩，上样至大孔吸附树脂，依次用去离子水、由 低到高的梯度浓度乙醇溶液进行梯度洗脱，分别收集其中的去离子水、30v/v％ (也可称为30v/v％乙醇洗脱部位，以下类同)、70v/v％、95v/v％浓度乙醇洗 脱的洗脱液，减压脱除乙醇和水，获得人参籽提取物。
作为优选，步骤1为：
人参籽粉碎，按1g:10mL比例加入去离子水，于水浴锅中80-90℃微沸， 提取两次，每次1小时，离心，上清液过滤，收集所有滤液，获得人参籽提 取液。
作为优选，所述步骤2由低到高的梯度浓度乙醇溶液为30v/v％-95v/v％浓 度的梯度浓度乙醇溶液。在本发明的一些具体实施方式中，所述步骤2由低 到高的梯度浓度乙醇溶液为由30v/v％乙醇溶液、70v/v％乙醇溶液和95v/v％ 乙醇溶液组成的梯度浓度乙醇溶液。
作为优选，所述大孔吸附树脂为HP-20型大孔吸附树脂。
同时，本发明还提供由本发明所述制备方法提取的人参籽提取物，优选 地，所述人参籽提取物总黄酮含量为0.14-1.91％。
将本发明制备方法获得人参籽提取物进行细胞增殖抑制活性的检测，结 果显示所述人参籽提取物能够显著抑制皮肤成纤维细胞增殖。据此，本发明 提供了人参籽提取物在抑制皮肤细胞增殖以及在制备皮肤细胞增殖抑制剂中 的应用。作为优选，所述皮肤细胞为皮肤成纤维细胞。
由以上技术方案可知，本发明以人参籽为原材料，经过特殊方法提取获 得一种人参籽提取物，所提取的人参籽提取物具有显著的皮肤细胞增殖抑制 活性，能够用于皮肤细胞增殖抑制剂的制备中，具有成为抗皮肤老化产品的 潜在优势。
附图说明
图1所示为人参籽提取物对人皮肤成纤维细胞增殖的抑制活性柱形图。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种人参籽提取物及其制备方法和应用。本领域技 术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所 有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包 括在本发明。本发明的应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显 能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或 适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种人参籽提 取物及其制备方法和应用进行详细说明。
实施例1：本发明所述人参籽提取物的制备
将50g市售的人参籽粉碎，按1:10(g/ml)加入去离子水，于水浴锅中 80-90℃微沸，提取两次，每次1小时，离心，上清液过滤，收集所有滤液， 减压浓缩，用HP-20大孔树脂层析吸附，依次用去离子水、30％乙醇洗脱、 70％乙醇洗脱和95％乙醇洗脱，分别收集去离子水、30％、70％和95％乙醇洗 脱液减压蒸除溶剂依次得到人参籽提取物A、人参籽提取物B、人参籽提取物 C和人参籽提取物D。
实施例2：人参籽提取物中总黄酮含量测定
以实施例1人参籽提取物为检测对象，同时加入人参籽水提物、以及实 施例1中水洗脱部位的人参籽提取物，按照中华人民共和国药典(2010版) 方法，以芦丁为标准品，测定提取物中总黄酮含量。测定步骤为：1)标准曲 线制作：精密量取对照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml，分别置25ml 量瓶中，各加30％乙醇至6.0ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml。混匀，放置6分 钟，再加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟。加氢氧化钠试液10ml， 再加30％乙醇至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应试剂为空白，用紫外-可 见分光光度法，在510nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为 横坐标，绘制标准曲线。2)取一定量样品置于25ml容量瓶中，其它按照标 准曲线制备步骤，自“加亚硝酸钠溶液1ml”起，依法测定吸光度，同时取供 试品溶液3ml，除不加氢氧化钠试液外，其余同上操作，作为空白，计算提取 物中总黄酮含量(以芦丁计)。结果见表1。
表1人参籽提取物中总黄酮含量
样品名称 总黄酮含量％ 人参籽粗提物 0.84 人参籽提取物A 0.36 人参籽提取物B 1.91 人参籽提取物C 0.88 人参籽提取物D 0.14
实施例3：细胞增殖抑制活性的检测
按照实施例1制备的人参籽提取物，完全溶于去离子水，分别配制成 0.8μg/ml～100μg/ml待测溶液，用于测定对细胞增殖的抑制活性。测定步骤为： 首先将人成纤维细胞种入96孔板中(2000细胞/孔，200μL)；培养72小时 后移除培养基，加入待测溶液10μL，培养24小时后，采用MTT法通过测定 细胞相对数量从而计算出细胞的增殖率。MTT法的检测原理为活细胞线粒体 中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积 在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的甲瓒，用微孔分 光光度计测定550nm波长吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范 围内，MTT结晶形成的量与活细胞数成正比，结果见图1。
由图1可知，本发明人参籽提取物A-D均具有对皮肤成纤维细胞增殖的 抑制作用，其中人参籽提取物B和人参籽提取物C在0.8μg/ml～100μg/ml的 浓度范围内，随着浓度的增大，增殖抑制作用增强。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当 指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下， 还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要 求的保护范围内。