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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810809820.3 (22)申请日 2018.07.23 (71)申请人 遵义医学院附属医院 地址 563000 贵州省遵义市大连路149号 (72)发明人 何毅怀 沈访 汪杰 陈贵梅 唐永静 陈娉婷 (74)专利代理机构 北京高沃律师事务所 11569 代理人 刘奇 (51)Int.Cl. A61K 31/739(2006.01) A61K 31/7008(2006.01) (54)发明名称 一种急性差异性肝损伤诱导剂及其制备方 法和应用 (57)摘要 本发明提供了一。
2、种急性差异性肝损伤诱导 剂及其制备方法和应用， 属于动物模型的造模领 域。 本发明所述急性差异性肝损伤诱导剂包括有 效成分D-氨基半乳糖和脂多糖； 所述D-氨基半乳 糖在诱导剂中的浓度为50120mg/mL； 所述脂多 糖在诱导剂中的浓度为0.110g/mL； 所述诱 导剂的溶剂为生理盐水本发明所述应用包括以 下步骤： 向洁净小鼠腹腔施用急性差异性肝损伤 诱导剂， 1248h后得到急性差异性肝损伤模型 小鼠。 本发明的应用成功率高， 并且条件要求低、 方法简便、 造模周期短、 重复性好， 有明显肝损伤 改变， 足以供给肝脏实验的需求。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 1086859。
3、39 A 2018.10.23 CN 108685939 A 1.一种急性差异性肝损伤诱导剂， 包括有效成分和溶剂， 所述有效成分包括D-氨基半 乳糖和脂多糖； 所述D-氨基半乳糖在诱导剂中的浓度为50120mg/mL； 所述脂多糖在诱导 剂中的浓度为0.110 g/mL； 所述溶剂为生理盐水。 2.根据权利要求1所述的急性差异性肝损伤诱导剂， 其特征在于， 所述D-氨基半乳糖在 诱导剂中的浓度为7090mg/mL； 所述脂多糖在诱导剂中的浓度为0.52 g/mL。 3.根据权利要求1或2所述的急性差异性肝损伤诱导剂， 其特征在于， 所述D-氨基半乳 糖在诱导剂中的浓度为80mg/mL； 所述。
4、脂多糖在诱导剂中的浓度为1 g/mL。 4.权利要求13任意一项所述急性差异性肝损伤诱导剂的制备方法， 包括以下步骤： 1)将D-氨基半乳糖和脂多糖溶于生理盐水中， 得到溶解液； 2)将步骤1)中所述溶解液进行滤菌处理， 得到急性差异性肝损伤诱导剂。 5.根据权利要求4所述的急性差异性肝损伤诱导剂的制备方法， 其特征在于， 所述滤菌 处理采用滤菌器进行， 所述滤菌器的孔径为0.120.45 m。 6.根据权利要求5所述的急性差异性肝损伤诱导剂的制备方法， 其特征在于， 所述滤菌 器的孔径为0.22 m。 7.权利要求13任意一项所述的急性差异性肝损伤诱导剂或利用权利要求46任意 一项所述的制备。
5、方法制备得到的急性差异性肝损伤诱导剂在制备急性差异性肝损伤模型 小鼠中的应用。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 所述急性差异性肝损伤模型小鼠的造模方 法， 包括以下步骤： 向洁净小鼠腹腔施用急性差异性肝损伤诱导剂， 1248h后得到急性差 异性肝损伤模型小鼠。 9.根据权利要求7或8所述的应用， 其特征在于， 所述洁净小鼠在施用前需禁饮禁食10 15h。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于， 以洁净小鼠重量计， 所述急性差异性肝损 伤诱导剂的施用量为(812)mL/kg。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108685939 A 2 一种急性差异性肝损伤诱导剂及。
6、其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及动物模型的造模技术领域， 尤其涉及一种急性差异性肝损伤诱导剂及 其制备方法和应用。 背景技术 0002 肝损伤是由多种病因所致的以短时间内大量肝细胞变性、 坏死和炎细胞浸润等为 特征的肝功能损伤的临床综合征， 死亡率高。 而肝细胞坏死是各型肝损伤共同的病理特点， 包括:肝细胞坏死(necrosis)、 程序性坏死(necroptosis)、 凋立(apoptosis)及自噬 (autophagyd。 肝病病情进展， 即肝细胞的存活状态与多种因素有关， 在各种致病因素作用 下， 肝细胞通过启动多种保护机制维持细胞内环境稳定， 促进细胞存活。 故肝细。
7、胞自身的抗 损伤能力与损伤因素共同决定肝病的结局。 而绝大多数肝损伤患者优先选择的治疗方法为 内科综合治疗， 然而， 由于发病机制尚不清楚， 内科治疗效果局限， 肝病患者的死亡率为50 80。 0003 实验动物急性肝损伤模型是研究各种肝脏疾病的发病机制的与治疗药物筛选中 必不可缺的一个工具。 近年来国内外制造实验性肝损伤动物模型方法主要集中在化学性肝 损伤模型和免疫性肝损伤模型。 化学性肝损仿模型主要是由四氯化碳(CCL4)、 D-半乳糖(D- Gal)等； 免疫性肝损伤模型多采用刀豆蛋白A(Con)、 脂多糖(BCG+LPS)造模等。 而肝脏损伤 的复杂性以及肝功能损害的多样性使得同一模型。
8、不能从本质上全面性、 客观反应肝损伤， 且现有技术未提及急性差异性肝损伤的实验动物及化学、 免疫二重因素损伤的模型， 因此， 动物差异性肝损伤模型的建立有待进一步完善与改进。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种急性差异性肝损伤诱导剂及其制备方法和应用， 本发 明的技术方案条件要求低、 方法简便、 造模周期短、 建模成功率高、 重复性好。 0005 为了实现上述发明目的， 本发明提供以下技术方案： 0006 本发明提供了一种急性差异性肝损伤诱导剂， 包括有效成分和溶剂， 所述有效成 分包括D-氨基半乳糖和脂多糖； 所述D-氨基半乳糖在诱导剂中的浓度为50120mg/mL； 所 述脂多糖。
9、在诱导剂中的浓度为0.110 g/mL； 所述诱导剂的溶剂为生理盐水。 0007 优选的， 所述D-氨基半乳糖在诱导剂中的浓度为7090mg/mL； 所述脂多糖在诱导 剂中的浓度为0.52 g/mL。 0008 优选的， 所述D-氨基半乳糖在诱导剂中的浓度为80mg/mL； 所述脂多糖在诱导剂中 的浓度为1 g/mL。 0009 本发明提供了一种上述方案中急性差异性肝损伤诱导剂的制备方法， 包括以下步 骤： 0010 1)将D-氨基半乳糖和脂多糖溶于生理盐水中， 得到溶解液； 0011 2)将步骤1)中所述溶解液进行滤菌处理， 得到急性差异性肝损伤诱导剂。 说 明 书 1/4 页 3 CN 1。
10、08685939 A 3 0012 优选的， 所述滤菌处理采用滤菌器进行， 所述滤菌器的孔径为0.120.45 m。 0013 优选的， 所述滤菌器的孔径为0.22 m。 0014 本发明提供了上述方案中的急性差异性肝损伤诱导剂在制备急性差异性肝损伤 模型小鼠中的应用。 0015 优选的， 所述急性差异性肝损伤模型小鼠的造模方法， 包括以下步骤： 向洁净小鼠 腹腔施用急性差异性肝损伤诱导剂， 1248h后得到急性差异性肝损伤模型小鼠。 0016 优选的， 所述洁净小鼠在施用前需禁饮禁食1015h。 0017 优选的， 所述急性差异性肝损伤诱导剂的施用量为(812)mL/kg。 0018 优选的。
11、， 所述急性肝损伤诱导剂的施用次数为1次。 0019 本发明的有益效果： 本发明提供了一种急性差异性肝损伤诱导剂及其制备方法和 应用。 采用本发明的诱导剂及应用方法在普通实验室即可得到急性差异性肝损伤模型小 鼠， 不需要高精密仪器以及特殊环境， 实现的条件要求低； 同时， 本发明中经过简单的试剂 配制、 腹腔注射及活动观察、 病理切片检测即可得到模型， 过程简洁， 具有建模成功率高、 重 复性好的优点； 此外， 本发明的造模周期短， 通常1224小时即可得到模型。 附图说明 0020 图1为急性差异性肝损伤模型小鼠的造模流程； 0021 图2为小鼠不同程度肝损伤病理切片图； 图a为正常组(H&。
12、E400倍)小鼠肝脏病理 图； 图b为模型组(H&E400倍)小鼠普通损伤肝脏病理图； 图c为模型组(H&E400倍)小鼠 重症化损伤肝脏病理图。 具体实施方式 0022 本发明提供了一种急性差异性肝损伤诱导剂， 包括有效成分和溶剂， 所述有效成 分包括D-氨基半乳糖和脂多糖； 所述D-氨基半乳糖在诱导剂中的浓度为50120mg/mL， 优 选为7090mg/mL， 更优选为80mg/mL； 所述脂多糖在诱导剂中的浓度为0.110 g/mL， 优选 为0.52 g/mL， 更优选为1 g/mL； 所述诱导剂的溶剂为生理盐水， 优选为医用生理盐水。 在 本发明的具体实施过程中， 所述D-氨基半乳。
13、糖、 脂多糖和生理盐水购自于美国Sigma公司。 0023 D-氨基半乳糖是一种细胞毒性药物， 能够影响肝细胞内尿苷代谢， 造成肝细胞能 量代谢及DNA、 RNA和蛋白质合成障碍， 进而造成肝细胞损伤。 现有技术中单独使用D-氨基半 乳糖诱导肝损伤效果并不理想， 这是由于D-氨基半乳糖发挥作用还与细胞膜的完整性、 肿 瘤坏死因子等因素有关。 0024 脂多糖是细菌提取物， 是一种内毒素， 其进入细胞后产生一些损伤因子(例如肿瘤 坏死因子、 白介素等)诱导细胞启动内源性免疫应答从而导致肝损伤。 0025 本发明提供了一种急性差异性肝损伤诱导剂的制备方法， 在本发明中， 将D-氨基 半乳糖和脂多糖。
14、溶于生理盐水中， 得到溶解液。 本申请对溶解时间和溶解温度没有特殊限 定， 溶解液为稳定均一溶液即可， 在具体实施过程中， 溶解温度一般为常温。 0026 在本发明中， 将上述溶解液进行滤菌处理， 得到急性差异性肝损伤诱导剂； 所述滤 菌处理采用滤菌器进行， 所述滤菌器的孔径为0.120.45 m， 优选为0.22 m； 所述急性差异 性肝损伤诱导剂的存放的温度优选为-20。 说 明 书 2/4 页 4 CN 108685939 A 4 0027 本发明提供了上述急性差异性肝损伤诱导剂在制备急性差异性肝损伤模型小鼠 中的应用； 所述急性差异性肝损伤模型小鼠的造模方法， 包括以下步骤： 向洁净小。
15、鼠腹腔施 用急性差异性肝损伤诱导剂， 1248h后得到急性差异性肝损伤模型小鼠。 0028 本发明对所述洁净小鼠的来源及品种并没有特殊限定， 优选为昆明小鼠； 所述洁 净小鼠要求性别相同、 生长周龄及体重相似； 所述洁净小鼠的体重优选为2327g， 更优选 为25g； 所述洁净小鼠的生长周龄优选为48周， 更优选为56周； 所述洁净小鼠在施用前 需禁饮禁食1015h， 优选为12h； 以洁净小鼠的体重计， 所述急性差异性肝损伤诱导剂的施 用量为(812)mL/kg， 优选为10mL/kg； 所述急性肝损伤诱导剂的施用次数为1次。 0029 在本发明中， 急性差异性肝损伤诱导剂给小鼠腹腔施用后通。
16、过小鼠腹腔网膜吸收 后进入肝脏， 造成肝损伤， 由于同样大小、 性别的老鼠机体内部的差异， 造成肝损伤 “轻重不 一” 的表现， 即实现急性差异性肝损伤。 0030 在本发明中， 所述腹腔施用的方式优选为腹腔注射； 所述腹腔注射的方法包括以 下步骤， 将装有急性差异性肝损伤诱导剂的注射针皮下刺入小鼠腹腔， 然后将药物推入腹 腔中； 所述腹腔注射中注射针刺入皮下的位置优选为小鼠下腹部离腹白线0.30.7cm处， 更优选为0.5cm处； 所述腹腔注射注射针沿皮下向前推进的距离优选为35cm， 更优选为 4cm； 所述注射针的针头与小鼠腹部的角度优选为2535 ， 更优选为30 ； 所述注射针的针 。
17、头进入腹腔的距离优选为1cm。 0031 本发明中， 在腹腔注射过程中， 针头刺入的速度要快， 待抵抗感消失瞬间， 说明针 头已利入腹腔内； 注射时小鼠头呈低位， 尾部稍稍提起， 使内脏前移， 避免注射进脏器。 0032 在本发明中， 注射药物1248h后， 根据小鼠的活动反应及肝组织病理变化特点分 为普通损伤组和重症损伤组， 完成小鼠急性差异性肝损伤模型建立。 0033 在本发明中， 所述小鼠活动反应包括活动、 反应速度， 食量， 呼吸情况及是否死亡。 0034 在本发明中， 所述小鼠肝组织病理变化观察方法包括以下步骤： 处死小鼠后， 取新 鲜肝脏组织块用固定液固定， 进一步制成病理切片制成。
18、病理切片， 进行染色检查； 所述小鼠 处死的方式优选为小鼠经摘除眼球放尽血液后颈椎脱臼法处死； 所述固定液优选为福尔马 林； 所述染色观察的方法优选为苏木精-伊红染色(H&E染色)检查。 本申请对所述新鲜小鼠 肝脏与固定液的比例没有具体限制， 以固定液能将新鲜小鼠肝脏组织淹没即可。 0035 在本发明中， 所述普通损伤组和重症损伤组的分组指标优选为： 肝小叶结构是否 清楚， 小鼠肝细胞水肿、 脂肪变性及细胞坏死程度以及肝细胞亚大片坏死程度。 0036 下面结合实施例对本发明提供的一种急性差异性肝损伤诱导剂及其制备方法和 应用进行详细的说明， 但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。 003。
19、7 实施例1一种急性差异性肝损伤诱导剂的制备方法 0038 1)取10mL医用生理盐水溶解D-氨基半乳糖800mg、 脂多糖10 g， 获得溶解液； 0039 2)对溶解液用0.22 m滤菌器滤菌， 获得急性差异性肝损伤诱导剂， -20度存放。 0040 实施例2一种急性差异性肝损伤模型小鼠的造模方法 0041 1)取8只体重252g、 生长周龄为5的清洁同性别昆明小鼠作为模型组， 禁饮禁食 12小时， 备用； 0042 2)向模型组小鼠腹腔中注射实施例1中制备得到的急性差异性肝损伤诱导剂， 1次 注射， 注射过程中， 选择在小鼠下腹部离腹白线约0.5cm处将注射针刺入皮下， 沿皮下向前 说 。
20、明 书 3/4 页 5 CN 108685939 A 5 推进35cm， 然后使针头与小鼠腹部约成30 角刺入腹腔， 针头刺入的速度要快， 待抵抗感 消失瞬间， 说明针头已利入腹腔内， 进入腹腔后的针头不超过1cm， 注射时小鼠头呈低位， 尾 部稍稍提起。 0043 3)注射诱导剂1248h后观察小鼠的活动反应； 并且经摘除眼球放尽血液后颈椎 脱臼法处死上述小鼠取新鲜肝脏组织块100mg， 用福尔马林液固定， 进一步制成病理切片， 进行苏木精-伊红染色检查。 结合活动反应和病理结果将模型组其分为普通肝损伤组及重 型肝损伤组， 完成小鼠急性差异性肝损伤模型建立。 0044 4)以上所有步骤重复3。
21、次。 0045 实验结果如下： 从模型组小鼠活动反应可见， 模型组小鼠表现为活动、 反应迟钝， 食量变差， 出现肝性脑病， 甚至死亡； 结果如图2所示， 图2-b为模型组(H&E400倍)小鼠普 通损伤肝脏病理图， 结果显示： 肝小叶结构尚清楚， 肝细胞水肿、 脂肪变性， 有点状或小片状 肝细胞坏死， 部分肝细胞亚大片坏死； 图2-c为模型组(H&E400倍)小鼠重症化损伤肝脏病 理图， 结果显示： 重症化肝损害的病理表现肝小叶结构分界不清楚， 甚至无肝小叶结构， 肝 细胞亚大片坏死， 部分肝细胞大片坏死。 0046 对比例1 0047 1)除昆明小鼠为4只， 注射药物为等量生理盐水外， 其余。
22、操作均与实施例2相同。 0048 2)注射生理盐水1248h后观察小鼠的活动反应； 并且经摘除眼球放尽血液后颈 椎脱臼法处死上述小鼠取新鲜肝脏组织块100mg， 用福尔马林液固定， 进一步制成病理切 片， 进行苏木精-伊红染色检查。 0049 3)以上所有步骤重复3次。 0050 从正常组小鼠活动反应可见， 注正常组小鼠活动、 反应快， 食量如常， 呼吸平稳， 无 死亡； 图2-a为正常组(H&E400倍)小鼠肝脏病理图， 结果显示： 肝小叶完整， 未见肝细胞变 性或坏死。 0051 由以上实施例可知， 本发明提供了一种急性差异性肝损伤诱导剂及其制备方法和 应用， 利用本发明的方案在普通实验室即可得到急性差异性肝损伤模型小鼠， 不需要高精 密仪器以及特殊环境， 实现的条件要求低； 同时， 本发明中经过简单的试剂配制、 腹腔注射 及活动观察、 病理切片检测即可得到模型， 过程简洁， 周期短、 具有建模成功率高、 重复性好 的优点。 0052 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。 说 明 书 4/4 页 6 CN 108685939 A 6 图1 图2 说 明 书 附 图 1/1 页 7 CN 108685939 A 7 。