技术领域
本发明涉及石杉碱甲经皮给药制剂技术领域，具体涉及一种石杉碱甲在制备治疗或预防癫痫病的经皮给药制剂中的应用。
背景技术
癫痫(epilepsy)是大脑神经元异常放电导致的一种慢性、反复发作性、短暂性脑功能紊乱所致的神经系统综合征。
全世界约有5000万人患有癫痫，每年大约新发生200万例，目前在发展中国家的发病率要远高于发达国家，而且大约有70％～90％的癫痫患者没有得到恰当的治疗。在严重慢性活动性癫痫患者中，癫痫猝死的危险性每年高达1％。据报道，欧盟每年有4000人癫痫猝死。
据中国最新流行病学资料显示，中国大约有900万左右的癫痫患者，其中500～600万是活动性癫痫患者，同时每年新增加癫痫患者约40万，在中国癫痫已经成为神经科仅次于头痛的第二大常见病。
由于异常放电的起始部位和传递方式的不同，癫痫发作的临床表现复杂多样，可表现为运动、感觉、自主神经、意识及精神等功能障碍。引起癫痫的病因也多种多样。
目前，癫痫患者经过正规的抗癫痫药物治疗，约70％的患者其发作是可以得到控制的，但仍有约30％的患者因耐药而无法控制。对于药物不能控制的癫痫患者现在大多采取手术治疗，但适合手术的患者只占其中很小部分。因此，寻找安全和有效的抗癫痫药物是当前国内外新药研究的热点之一。
石杉碱是中国药学科学家于上世纪八十年代从蕨类药用植物“蛇足草”Huperzia serrate(Thunb.)Trevis.中发掘出来的对乙酰胆碱酯酶有显著抑制作用的新型化学物质。现在，石杉碱甲(Huperzine A)在中国已研发成用于治疗老年良性记忆障碍、改善由脑内胆碱能功能缺陷引起的阿尔茨海默氏症患者记忆功能障碍，以及缓解重症肌无力等疾病的新药。
Huperzine A除了有治疗老年良性记忆障碍等用途外，最近又有新的适应症发现：美国埃默里大学医学院的科学家在抗癫痫药动物模型筛选中，发现Huperzine A有增强小鼠癫痫模型诱发癫痫发作抵抗力的作用。特别是，显示了预防发热性癫痫发作的潜力，这是Dravet综合征(一种严重的儿童期癫痫)的特征(Expert Review of Neurotherapeutics，2016，16(6):1-10)。
Huperzine A对癫痫病的机理与原用于老年良性记忆障碍的抑制胆碱酯酶作用机理不同。美国科学家发现：Huperzine A作用于α7nAChRs和α4β2nAChRs受体，产生一种强有力的抗炎反应，并减少IL-1β,TNF-α蛋白质表达和抑制转录激活NF-κB信号，因此，它提供了对神经元兴奋性毒性和神经元死亡的保护，并增加了与抗惊厥活动相关的伽马氨基丁酸能的神经传递质传输。
科学家还发现，Huperzine A能使SCN1A突变患者的神经元抑制和兴奋之间的平衡正常化，从而防止了癫痫的发生。(Frontiers in Pharmacology,2016，7：357)。
由于Huperzine A防治癫痫病的机理与其治疗老年良性记忆障碍的阿尔茨海默氏症不同，故其给药剂量与有效血药浓度也均不同，并且要求十分苛刻。
斑马鱼在国内外被认为是用来研究癫痫病的有用模型之一，它的SCN1A与人类SCN1A基因同源性高达85％，其信号传导通路与人类基本近似。美国Scott Baraban教授及同事们对“美国食品与药品管理局”(FDA)批准的药物资料库的化合物进行了一次筛选，发现化合物Clemizole在携带类似儿童期癫痫“Dravet综合症”的SCN1A突变的斑马鱼中，抑制了自发痉挛行为和脑电图癫痫发作。由于斑马鱼的SCN1A与人类的SCN1A绝大部分功能和特征相同，因此，斑马鱼在抗癫痫病新药的研究中已得到广泛的应用。(Nat Commun.2013Sep 3)
我们在斑马鱼癫痫模型的试验中发现，在一定的剂量范围内，Huperzine A能产生很强的抗癫痫效果，其抗癫痫作用高于临床上常用的苯妥英钠(见
实施例1)。
由于Huperzine A片在治疗小儿语言发育迟缓的临床试验中发现，有少数合并癫痫的患儿因诱发癫痫发作而终止治疗的情况。为此，国家食品药品监督管理局批准的Huperzine A片剂(“双益平”片)说明书书中把癫痫病患者列为禁忌(Journal of Pediatric Pharmacy 2002，8(1)：27)。
遗传因素在癫痫的发病中起着重要作用。编码Ⅰ型电压门控钠离子通道的SCN1A基因被认为是癫痫的主要治病基因。SCN1A基因不同类型的突变可引发不同的癫痫综合征。
近年，我们通过SCN1A基因突变斑马鱼的研究，终于找到了Huperzine A诱发部分癫痫病人癫痫发作的原因是：由于Huperzine A进入体内的即时血药浓度上升过快、过高，导致过量的乙酰胆碱打破了SCN1A突变患者的神经元抑制和兴奋之间的平衡所致(见实施例2)。
为此，要实现Huperzine A用于癫痫病防治的目标，必须解决严格控制药物进入人体血液的速率与药量的关键技术，将血药浓度控制在一个既安全又有效的范围内。本发明的经皮给药制剂能满足这一临床需要。用药时，石杉碱血药浓度平稳、可控，能有效避免即时血药浓度上升过快、过高而诱发癫痫的可能，安全有效。
至今未见有用于防治癫痫病的Huperzine A经皮给药制剂的报道。
发明内容
鉴于防治癫痫病药物制剂的特殊要求，本发明提供了一种石杉碱甲在制备治疗或预防癫痫病的经皮给药制剂中的应用，该经皮给药制剂用于癫痫病防治时，石杉碱甲血药浓度平稳、可控。
一种石杉碱甲在制备治疗或预防癫痫病的经皮给药制剂中的应用，所述的经皮给药制剂是用石杉碱甲或其医学上可接受的各种盐、类似物、衍生物、前体药物，以及它们的混合物为主要成分制成的治疗或预防癫痫病的经皮给药制剂。每天有设计量的石杉碱甲透过皮肤进入体内。其首次给药后，1-2小时内，石杉碱血药浓度不超过0.1-0.3ng/ml，平均血药浓度范围为0.3-5.0ng/ml，并至少维持3天，使用安全有效。该制剂能精确控制石杉碱的皮肤渗透速率，使石杉碱血药浓度控制在癫痫病防治的安全范围，避免因即时血药浓度上升过快、过高而诱发癫痫的可能，使用安全有效。
含有足够量的石杉碱甲使透过皮肤到达体内的血药浓度在0.3-5.0ng/ml范围，并至少维持有效血药浓度3天；
所述的经皮给药制剂，首次给药后，1-2小时内，石杉碱血药浓度不超过0.1-0.3ng/ml。
所述的经皮给药制剂，其首次给药后的石杉碱平均血药浓度范围为0.3-5.0ng/ml，并至少维持3天。
所述的经皮给药制剂，其中,所述的石杉碱甲可以是石杉碱甲，及其医学上可接受的各种盐、类似物、衍生物、前体药物。
所述的经皮给药制剂，其中，所述的制剂是局部用药产生全身作用的制剂。
所述的经皮给药制剂是聚合物控释型经皮给药贴片，本发明采用乙烯—醋酸乙烯共聚物(EVA)作为聚合物控释材料。
所述的经皮给药制剂，其中所述的制剂是粘附性聚合物骨架型控释贴片,乙烯—醋酸乙烯共聚物(EVA)作为聚合物控释材料，聚丙烯酸酯为粘附剂。
所述的经皮给药制剂，由以下重量份的原料制成：
进一步优选，所述的经皮给药制剂，由以下重量份的原料制成：
最优选的，所述的经皮给药制剂，由以下重量份的原料制成：
一种经皮给药制剂的制备方法，包括以下步骤：
称取石杉碱甲，用乙醇溶解，加入渗透促进剂，混合均匀；另将乙烯—醋酸乙烯共聚物和聚丙烯酸酯用乙酸乙酯溶解；将两者混合均匀，真空脱气，除净气泡后均匀铺在背衬层上，10℃～40℃下挥去大部分有机溶剂，烘箱中干燥，取出冷却，覆盖防粘层，用切段机切割得到经皮给药贴片。
所述的烘箱中干燥的条件为：置于60℃～90℃烘箱中干燥1h～3h，进一步优选，置于80℃烘箱中干燥2h。
取出冷却至10℃～40℃。
所述的乙烯—醋酸乙烯共聚物(Ethylene/vinyl acetate)为控释骨架，其中醋酸乙烯(vinyl acetate)含量范围是3.5％—50％(平均重量)，最佳含量范围是15％—45％，进一步优选为30％—45％。
聚丙烯酸酯(平均分子量17749，固含量30％)为粘附剂。
所述的渗透促进剂为肉豆蔻酸异丙酯(IPM)、二甲基亚砜(DMSO)、十二醇(LA)、油酸(OA)、月桂氮卓酮(AZ)、癸酸(CA)或者癸醇(DeA)。
所述的经皮给药制剂，其它是用石杉碱甲，及其医学上可接受的各种盐、类似物、衍生物、前体药物，以及它们的混合物制成的治疗或预防癫痫病的经皮给药制剂。其首次给药后，1-2小时内，石杉碱血药浓度不超过0.1-0.3ng/ml，平均稳态血药浓度范围为0.3-5.0ng/ml，并至少维持3天。
本发明的经皮给药制剂用于癫痫病防治时，石杉碱血药浓度平稳、可控，因此，能有效避免因即时血药浓度上升过快、过高而诱发病人癫痫发作的可能，使用安全有效。
附图说明
图1为实施例1中Hup A抗癫痫作用评价斑马鱼运动轨迹图；
图2为实施例1中Hup A处理后斑马鱼快速运动距离(mm)与模型对照组比较图；
图3为实施例1中Hup A处理后斑马鱼抗癫痫作用与模型对照组比较图；
图4为实施例5中Hup-A经皮给药制剂与Hup-A口服片剂多剂量给药的峰谷曲线(n＝6)，■为Hup-A经皮给药制剂(Multiple dose patches)的峰谷曲线，▲为Hup-A口服片剂多剂量给药(Multipile dose oral tablets)的峰谷曲线。
具体实施方式
以下给出实施例进一步举例说明本发明，但本发明的实施例仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，所以，在本发明方法的前提下对本发明的任何简单改进均属于本发明要求保护的范围。
实施例1(Huperzine A的抗癫痫作用)
1试验方法：
随机选取210尾受精后6天的野生型AB系斑马鱼于96孔板中，每孔均处理1尾斑马鱼，12孔/组。分别水溶给予Hup A 6.9、20.8、62.5和100μM浓度，阳性对照药苯妥英钠300μM浓度，每孔容量为200μL，同时设置正常对照组(养鱼用水处理正常斑马鱼)和模型对照组。各组处理1h后，除正常对照组外，其余实验组均水溶给予戊四唑诱导斑马鱼建立癫痫模型，利用运动/行为分析仪记录给予戊四唑1h内斑马鱼的运动情况。分析统计斑马鱼的快速运动(seizure，V>20mm/s)距离(D)，以斑马鱼快速运动距离的统计学分析结果评价Hup A(Huperzine A，石杉碱甲)对戊四唑诱导的癫痫模型斑马鱼的抗癫痫作用，统计学处理结果用mean±SE表示。
用方差分析和Dunnett’s T-检验进行统计学分析，p<0.05表明具有显著性差异。
2试验结果
试验结果如表1、图1、图2和图3所示，图1为实施例1中Hup A抗癫痫作用评价斑马鱼运动轨迹图；图2为实施例1中Hup A处理后斑马鱼快速运动距离(mm)与模型对照组比较图，***p<0.001；图3为实施例1中Hup A处理后斑马鱼抗癫痫作用与模型对照组比较图，***p<0.001。
2.1模型对照组斑马鱼快速运动距离(1871mm)与正常对照组(27mm)比较p<0.001，表明模型建立成功。
2.2阳性对照药苯妥英钠300μM浓度组斑马鱼快速运动距离(689mm)与模型对照组比较p<0.001，其抗癫痫作用为63.2％，提示苯妥英钠具有明显的抗癫痫作用。
2.3 Hup A 20.8μM、62.5μM和100μM浓度组斑马鱼快速运动距离分别为872、133和5mm，与模型对照组比较p<0.001，抗癫痫作用分为53.4％、92.9％和99.7％。提示Hup A在20.8、62.5和100μM浓度条件下均具有明显的抗癫痫作用。详见表1、图1、图2和图3。
按照实施例1中的方法对化合物的抗癫痫治疗效果进行定性评价。在Hup A各给药剂量下与癫痫模型组相比，斑马鱼快速运动轨迹明显减少。图1为根据斑马鱼快速运动距离平均值mean±SE绘制的柱形图，由图1可知，Hup A在20.8μM、62.5μM和100μM浓度下均有癫痫治疗作用，与模型对照组比较有统计学差异(P<0.001)，治疗效率分别为：19.1％、53.4％、92.9％、99.7％(P<0.001)。
表1.Hup A抗癫痫作用评价实验结果(mean±SE，n＝10)
与模型对照组比较，***p<0.001
3试验结论
Huperzine A在20.8、62.5和100μM浓度时，对斑马鱼癫痫发作(快速运动距离>20mm/s)的抵抗，量效关系明确，提示，Huperzine A具有明显的抗癫痫作用。
实施例2
Huperzine A对SCN1A基因突变斑马鱼的研究
1试验方法：
1.1电刺激斑马鱼的行为变化
CN1A基因突变斑马鱼60条，随机分为5组(n＝10)。对照组给予0电流伪刺激，其余4组分别给予电流25、50、100、1000μA，刺激1s后，观察斑马鱼的反应。
1.2 Hup A对斑马鱼电刺激诱发癫痫模型的作用
随机选取150尾SCN1A基因突变斑马鱼于96孔板中，每孔均处理1尾斑马鱼，12孔/组。分别水溶给予Hup A 20.8、62.5、100、130和160μM浓度，每孔容量为200μL，同时设置模型对照组。斑马鱼各组药物处理1h后，给予适当的电流刺激，刺激1s后，按以下指标观察斑马鱼行为变化：①惊搐反应：前窜、跳跃、甩尾或急速回旋。②惊厥反应：全身挺直、不动；继而发生侧翻，昏迷或死亡。
1.3统计学方法
应用SPSS19.0软件进行统计分析，卡方检验比较组间差异，P<0.05为差异有显著性意义。
2试验结果
2.1电刺激斑马鱼的行为变化
给予电流25、50、100μA刺激1s后，斑马鱼表现：前窜、跳跃、甩尾或回旋特征反应行为(惊搐反应)；电流1000μA刺激后，斑马鱼表现：全身挺直，不动；继而出现侧翻，昏迷或死亡(惊厥反应)。
动物模型对照组给予25μA电流刺激斑马鱼，50％斑马鱼出现前窜、跳跃、甩尾或回旋惊搐反应；50、100μA电流刺激斑马鱼，100％斑马鱼出现前窜、跳跃、甩尾或回旋惊搐反应；1000μA电刺激斑马鱼，斑马鱼均出现全身挺直不动，继而4只出现侧翻并死亡，其余6只在2min后陆续恢复正常。结果表明，给予电流25μA刺激1s后，可以造成部分SCN1A基因突变斑马鱼抽搐反应模型；给予电流50、100μA刺激1s后，可以造成所有SCN1A基因突变斑马鱼发生抽搐反应；给予电流1000μA刺激后，可以造成SCN1A基因突变斑马鱼惊厥反应模型。实验结果详见表2。
表2电刺激诱发SCN1A基因突变斑马鱼行为变化(mean±SE，n＝10)
2.2 Hup A对斑马鱼模型的作用
随机选取150尾SCN1A基因突变斑马鱼于96孔板中，每孔均处理1尾斑马鱼，12孔/组。分别水溶给予Hup A 20.8、62.5、100、130和160μM浓度，每孔容量为200μL，同时设置模型对照组。斑马鱼各组药物处理1h后，给予电流25μA刺激，刺激1s后，按以下指标观察斑马鱼行为变化：①惊搐反应：前窜、跳跃、甩尾或急速回旋。②惊厥反应：全身挺直、不动；继而发生侧翻，昏迷或死亡。实验结果详见表3。
表3 Hup A对斑马鱼模型的作用(mean±SE，n＝10)
3试验结论
Huperzine A在20.8、62.5和100μM浓度时，对SCN1A基因突变斑马鱼可以提供癫痫发作保护，量效关系明确，提示，Huperzine A具有明显的预防癫痫作用。
Huperzine A在130和160μM浓度时，对SCN1A基因突变斑马鱼癫痫发作的保护作用转为诱发SCN1A基因突变斑马鱼发生抽搐及惊厥反应，有一定的量效关系，试验结果提示，Huperzine A在高浓度时可诱发癫痫。分析其可能的原因，由于Hup A是可逆性胆碱酯酶抑制剂，如果Huperzine A进入体内的即时血药浓度上升过快、过高，则可能导致过量的乙酰胆碱破坏SCN1A突变患者的神经元抑制和兴奋之间的平衡，从而诱发癫痫。
实施例3
称取Huperzine A 20mg，置于烧杯中，用2.5g乙醇溶解，加入0.27g渗透促进剂(见表4)，混合均匀；另称取3g乙烯—醋酸乙烯共聚物(美国杜邦，40W，VA含量＝40％)，1g聚丙烯酸酯(美国国民淀粉化学公司，Duro-Tak 87-4098，平均分子量17749，固含量30％)用8.5g乙酸乙酯溶解；将两者混合均匀，真空脱气，除净气泡后均匀铺在背衬层(美国3M公司的聚酯铝塑复合膜)上，室温25℃下挥去大部分有机溶剂，置于80℃烘箱中再干燥2h，取出冷至室温25℃，覆盖防粘层，切割，即得粘附性聚合物骨架控释型经皮给药贴片。
药物释放速率测试方法：
采用Valia-Chien双室渗透池进行试验，于裸鼠皮肤角质层面贴上揭去防粘层的贴片，接受室加40％PEG400/NS，循环水浴温度为37℃±0.5℃，按规定间隔时间取样，用HPLC法测定接受室渗透液中的Hup-A浓度。
HPLC分析方法：仪器：岛津HPLC-10A，色谱柱：Shim-Pack CLC-DOS(6.0×150mm)。检测波长313nm，流动相：甲醇：水(55：45)，每500ml水中加入40μl三乙胺，流速1ml/min，进样量20μl，进样后测定峰面积，以外标法定量，计算Hup-A的皮肤渗透量。
本法线性范围：0.70-22.3μg/ml，相关系数：0.9999；回收率：98.0±2.0％，变异系数：2.04％，Hup-A在接受液中96小时保持稳定。
下面提供了不同实施方案的裸鼠皮肤渗透速率，结果如表4所示。
表4不同渗透促进剂条件下的HupA裸鼠皮肤渗透速率a
a:IPM(肉豆蔻酸异丙酯)；DMSO(二甲基亚砜)；LA(十二醇)；OA(油酸)；AZ(月桂氮卓酮)；CA(癸酸)；DeA(癸醇)。
实施例4
提供了一种乙烯—醋酸乙烯共聚物(EVA)骨架控释型经皮给药制剂。药物的释放速度由共聚物组成控制。通过调节乙烯—醋酸乙烯共聚物(EVA)中的醋酸乙烯(VAc)含量，可得到不同释放速率的经皮给药制剂。
实验方法同实施例3，并且，采用IPM(肉豆蔻酸异丙酯)作为渗透促进剂，结果见表5。
表5乙烯—醋酸乙烯共聚物(EVA)中醋酸乙烯(VAc)含量对HupA渗透速率的影响a
a采用裸鼠皮肤，在Valia-Chien双室渗透池进行试验。
实施例5
称取Huperzine A 20mg，置于烧杯中，用2.5g乙醇溶解，加入0.27g渗透促进剂(肉豆蔻酸异丙酯)，混合均匀；另称取3g乙烯—醋酸乙烯共聚物(美国杜邦，40W，VA含量＝40％)，1g聚丙烯酸酯(美国国民淀粉化学公司，Duro-Tak 87-4098，平均分子量17749，固含量30％)用8.5g乙酸乙酯溶解；将两者混合均匀，真空脱气，除净气泡后均匀铺在背衬层(美国3M公司的聚酯铝塑复合膜)上，室温25℃下挥去大部分有机溶剂，置于80℃烘箱中再干燥2h，取出冷至室温25℃，覆盖防粘层，用切段机切割，即得经皮给药贴片。
Hup A经皮给药制剂和口服片剂多剂量给药的Beagle犬药动学比较采用双周期交叉试验。
经皮给药制剂：于Beagle犬背部用脱毛剂(6％Na2SO3)脱两块4×6cm大小的皮肤，脱毛剂用清水冼净擦干12hr后，在脱毛处各贴一片10cm2(含Hup-A 2mg)面积大小的贴片，共20cm2。每次给药持续84小时，共给药4次。在前3次给药后的第24小时、84小时取血，在第4次给药后的第4、6、8、10、24、32、48、56、72、84小时以及第84小时除去贴片后的第12、20小时取血。
口服片剂：Hup-A片10片，每24小时给药1次，共给药5次。在前4次给药后的第3小时、24小时取血，在第5次给药后的第0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12、24小时取血。
经皮给药制剂与口服片剂交叉给药的间隔时间为1周。
Hup-A经皮给药制剂与口服片剂的犬Beagle多剂量药物动力学试验表明，多剂量给药达稳态后，经皮给药制剂稳态达峰时Tmax显著延长(P<0.01)，稳达峰浓度Cmax显著降低(P<0.01)。血浓度峰谷波动度(FI％)经皮给药制剂为48％，而口服片剂为160％，经皮给药制剂的血浓度波动度明显小于口服片剂(P<0.01)。
要实现Huperzine A用于癫痫病防治之目的，必须将Huperzine A血药浓度控制在一个既安全又有效的范围内。本发明攻克了严格控制药物进入人体血液的速率与药量的关键技术，使用时，石杉碱血药浓度平稳、可控、峰谷波动度小，能满足临床治疗需要。本发明的经皮给药制剂与现有的口服片剂给药相比，具有显著的优点。
必须指出，上述内容仅是举例说明本发明的应用原则。本领域的技术人员可以做出很多改变和修饰，但都不偏离本发明的原则和范围。