技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，具体是光疗剂，更具体是双重光疗用水溶性碳纳米复合材料及其制备方法与应用。
背景技术
光疗是一种利用可见光或近红外光照射的无创治疗技术，具有远程可控、选择性高及全身性毒性低等独特优点，在恶性肿瘤治疗中具有广泛的应用前景。光热治疗和光动力治疗是当前广泛用于肿瘤治疗的两种不同形式的光疗方法。光热疗法是利用光热试剂吸收特定波长的光，通过非辐射衰减将吸收的能量转化为热导致局部环境温度升高而不可逆地损伤病变细胞。光热疗法可以改善光热过程中的热聚集并选择性地对病灶内的细胞进行加热，从而提高光热疗法的精确性及可控性，可更加有效的实现对病变细胞选择性杀伤。光动力疗法是利用光敏材料在特定波长的光照射下受激，进一步将光子的能量传递给水溶液中氧分子产生单线态氧、超氧自由基、过氧化氢,及羟基自由基等活性氧物种(reactiveoxygenspecies,ROS)。ROS对病变细胞产生氧压，从而杀死肿瘤细胞，具有针对病变部位适用的特异选择性。
单壁碳纳米角（single-walledcarbonnanohorns,SWCNHs）是一类新的碳基纳米材料，通常是由直径为2~5nm，长30~50nm，一端开口，另一端以角锥形封闭的管组成。除了形貌、尺寸与单壁碳纳米管不同，单壁碳纳米角在制备上不需要采用金属作为催化剂，没有金属残留，故生物毒性低。单壁碳纳米角在近红外区有较强吸收，可以吸收光子并通过非辐射衰减转化成热，形成局部光热效应，杀死病变细胞，是较理想的光热治疗剂。但与其他碳基纳米材料相似，碳纳米角不溶于水，也不溶于有机溶剂。将单壁碳纳米角应用于生物医学领域，需首先解决其水溶性，通常的做法是对其表面进行功能化。
目前，对碳纳米角进行功能化的方法，主要是通过共价键偶联和非共键价π-π平面共轭的方法来实现。共价键偶联的方法，需要破坏碳纳米角原有的C–C键，在此基础上采用共价键结合的方式，接上功能分子，达到增大溶解性和实现功能应用的目的。相比之下，非共价方法不需要破坏原有结构，利用碳纳米角已有的C–C共轭结构，选择有平面共轭结构的分子，通过π-π共轭进行功能化以达到增大水溶性的目的。((1)S.Zhu,G.Xu,Nanoscale,2010,2,2538–2549;(2)G.Pagona,A.S.D.Sandanayaka,Y.Araki,JingFan,N.Tagmatarchis,M.Yudasaka,S.Iijima,andO.Ito,J.Phys.Chem.B,2006,110,20729-20732)。
酞菁是结构与卟啉相似，是继卟啉后第二代在临床上应用的光敏剂。由于其优异的光物理及光化学性质，近年来，酞菁在光动力治疗领域的应用受到广泛关注((1)M.Zhang,T.Murakami,K.Ajima,K.Tsuchida,A.S.D.Sandanayaka,O.Ito,S.Iijima,M.Yudasaka,PNAS,2008,39,14773-14778;(2)N.B.R.Vittar,C.G.Prucca,C.Strassert,J.Awruch,V.A.Rivarola,Int.J.Biochem.CellBiol.,2008,40,2192-2205)。酞菁在红光区（650~770nm）有强吸收，并且通过中心配位的金属离子激发三重态的寿命延长，单线态氧产率增高。然而，在水溶液中，酞菁易于自聚集形成二聚体，这大大降低了它的光敏化效率。在使用中，需要合适的载体，以避免酞菁自聚集。目前，临床上还没有同时能实现光热治疗和光动力学治疗的双重治疗的碳基试剂。MinfangZhang等的工作：“FabricationofZnPc/proteinnanohornsfordoublephotodynamicandhyperthermiccancerphototherapy”(M.Zhang,T.Murakami,K.Ajima,K.Tsuchida,A.S.D.Sandanayaka,O.Ito,S.Iijima,M.Yudasaka,PNAS,2008,39,14773-14778;)，是目前已经报道的将光热治疗和光动力学治疗结合的研究工作。包括几步：（1）先氧化碳纳米角，破坏了其表面特性和完整性；（2）通过氧化的孔洞，将酞菁装入纳米角中；（3）在碳纳米角表面载上血清白蛋白，增强其水溶性。但制备方法过于繁复，此外，将酞菁装入碳纳米角内部，没有充分发挥酞菁的光敏性。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种双重光疗用水溶性碳纳米复合材料。
本发明的双重光疗用水溶性碳纳米复合材料，是由单壁碳纳米角与水溶性酞菁构成的π-π平面共轭复合物，或者是由单层无卷曲石墨烯与水溶性酞菁构成的π-π平面共轭复合物。
所述水溶性酞菁选自由铜、锌、铝或硅形成的溶于水的酞菁化合物。优选由铜、锌、铝或硅形成的四氨基或四磺酸基的酞菁化合物。
本发明的另一个目的是克服已有技术的缺陷，提供一种简单、易行的双重光疗用水溶性碳纳米复合材料的制备方法。
该方法包括如下步骤：
(1)用二次水溶解水溶性酞菁，配制成质量浓度为10%~15%的水溶液，按水溶性酞菁质量的45~65%加入单壁碳纳米角或单层无卷曲石墨烯，用超声仪超声30~180分钟；
(2)将上述制得的分散液离心、抽滤、洗涤、干燥，即得双重光疗用水溶性化合物。
作为优选方案，步骤（1），加入的单壁碳纳米角或单层无卷曲石墨烯的为水溶性酞菁质量的50%，超声仪功率为50~300W，超声60~120分钟。
在步骤（2），抽滤时采用孔径为180~250nm微孔滤膜，用二次水洗涤至滤液无色。
在本发明中，其构筑单元为以单壁碳纳米角（SWNH）或单层无卷曲石墨烯为载体，以水溶性酞菁为增溶剂，组成单元间通过π-π相互作用形成复合型的碳纳米复合材料。
本发明还提供一种药物组合物，该药物组合物包含至少一种药学上可接受的载体和本发明所述的双重光疗用水溶性碳纳米复合材料。
本发明还提供所述的双重光疗用水溶性碳纳米复合材料以及前述的药物组合物在制备治疗抗肿瘤药物的应用。
这里，肿瘤包括：宫颈癌、人口腔表皮癌、乳腺癌、鼻咽癌、恶性胶质瘤和纤维母细胞瘤。
特别地，本发明是提供所述的双重光疗用水溶性碳纳米复合材料以及前述的药物组合物在制备红外光源作用下产生效果的治疗抗肿瘤药物的应用。
本发明的双重光疗用水溶性碳纳米复合材料作为光热及光动力治疗双重光疗剂，在红外激光（650nm~808nm）照射下，可以杀死癌细胞。
酞菁含有大的芳香共轭平面，能以π-π作用牢固吸附在同样具有π体系的单壁碳纳米角或单层无卷曲石墨烯上，得到单壁碳纳米角或单层无卷曲石墨烯与酞菁的复合物体系。在此复合体系中，单壁碳纳米角或单层无卷曲石墨烯不仅可以作为载体阻止酞菁自聚集，提高酞菁光动力治疗效果，其自身也可作为光热治疗剂参与疾病的治疗，而酞菁则既可以改善单壁碳纳米角或单层无卷曲石墨烯的溶解性，其自身也具有光动力治疗效果，形成有效的多功能治疗体系。这种不同治疗模式相互协同或结合的多功能治疗体系在疾病治疗过程中，特别是癌症治疗中，不仅可以提高治疗效率，而且能够减少不良的全身性毒性及副作用。因此，这样的光热与光动力学结合的多功能治疗体系将有可能成为一种切实有效的癌症等适用于光治疗疾病的治疗方法。
本发明的优点是：
（1）所得的碳纳米复合材料同时有光热与光动力的双重治疗作用，增强对癌细胞的杀伤效率。
（2）制备方法简便，一步超声法就既解决了单壁碳纳米角或单层无卷曲石墨烯的水溶性，又负载上了光动力治疗剂，并且使用的是非共价修饰，不破坏碳纳米复合材料的表面特性。
附图说明
图1为本发明制备的单壁碳纳米角-酞菁（SWNHs-TSCuPc）复合物及游离酞菁（TSCuPc）的紫外可见（UV-Vis）吸收光谱图。
具体实施方式
制备实施例1
水溶性单壁碳纳米角-酞菁复合物的制备，按如下步骤：
(1)用二次水溶解四磺酸基铜酞菁，配制成质量浓度为10%的水溶液，按四磺酸基铜酞菁与单壁碳纳米角质量比1:0.5的比例加入单壁碳纳米角，用超声仪超声60分钟。
(2)将上述制得的墨色分散液离心，以除去大颗粒聚集物，所得液体用孔径220nm微孔滤膜过滤，并用二次水清洗，直至滤液无色，以除去游离的酞菁。所得墨色固体重新分散在水中，即制得单壁碳纳米角-酞菁复合物，总浓度为1.4mg/mL，其中，酞菁为0.49mg/mL，单壁碳纳米角为0.91mg/mL。
所得单壁碳纳米角-酞菁复合物可以在水体系中均匀分散并稳定存在至少3个月以上。
制备实施例2
水溶性单壁碳纳米角-酞菁复合物的制备，按如下步骤：
(1)用二次水溶解四磺酸基铝酞菁，配制成质量浓度为12%的水溶液，按四磺酸基铝酞菁与单壁碳纳米角质量比1:0.5的比例加入单壁碳纳米角，用超声仪超声60分钟。
(2)将上述制得的分散液离心，以除去大颗粒聚集物，所得液体用孔径220nm微孔滤膜过滤，并用二次水清洗，直至滤液无色，以除去游离的酞菁。干燥即制得单壁碳纳米角-酞菁复合物。
制备实施例3
水溶性单层无卷曲石墨烯-酞菁复合物的制备，按如下步骤：
(1)用二次水溶解四磺酸基铜酞菁，配制成质量浓度为15%的水溶液，按四磺酸基铜酞菁与单层无卷曲石墨烯质量比1:0.5的比例加入单层无卷曲石墨烯，用超声仪超声60分钟。
(2)将上述制得的分散液离心，以除去大颗粒聚集物，所得液体用孔径200nm微孔滤膜过滤，并用二次水清洗，直至滤液无色，以除去游离的酞菁。干燥即制得单层无卷曲石墨烯-酞菁复合物。
制备实施例4
水溶性单壁碳纳米角-酞菁复合物的制备，按如下步骤：
(1)用二次水溶解四氨基硅酞菁，配制成质量浓度为14%的水溶液，按四氨基硅酞菁与单壁碳纳米角质量比1:0.5的比例加入单壁碳纳米角，用超声仪超声160分钟。
(2)将上述制得的分散液离心，所得液体用孔径220nm微孔滤膜过滤，并用二次水清洗，直至滤液无色，以除去游离的酞菁。干燥即制得单壁碳纳米角-酞菁复合物。
测试实施例1
实验方法如下：
(1)将制备实施例1所得的单壁碳纳米角-酞菁复合物复合物溶液用二次水配制酞菁浓度为10μg/mL，取1毫升于标本瓶中，在650nm激光(3Wcm-2)照射下，用热像仪记录溶液的颜色变化，也即溶液的温度变化。
随着光照时间的增加，单壁碳纳米角-酞菁复合物溶液的温度也显著升高，并在6分钟内升高了33℃。证实单壁碳纳米角-酞菁复合物溶液具有良好的光热效应。
(2)以5,5-二甲基-1-氧化吡咯啉溶液(DMPO)为捕获剂，用电子顺磁共振(EPR)技术检测制备实施例1所得的单壁碳纳米角-酞菁复合物溶液在650nm激光(3Wcm-2)照射下产生的自由基信号。
在650nm激光(3Wcm-2)照射下，检测到羟自由基信号，证实单壁碳纳米角-酞菁复合物具有光动力效应。
另外，图1说明单壁碳纳米角-酞菁复合物比游离的酞菁在紫外可见（UV-Vis）下具有更大的吸收值。
应用实施例1
制备实施例1制备的单壁碳纳米角-酞菁复合物作为光热及光动力治疗剂，其体外细胞测试方法如下：
分别配置浓度为50,100,150μg/mL的单壁碳纳米角-酞菁复合物溶液。人宫颈癌细胞（HeLa细胞）在96孔板（每孔104个细胞）中培养24小时后，加入所配制的系列浓度的单壁碳纳米角-酞菁复合物溶液，培养24小时，用650nm激光（3W/cm2）照射3~8min，再培养24小时，用噻唑蓝比色法测细胞存活率。
在650nm激光（3W/cm2）照射条件下，对细胞的杀死率可达70%~85%。证实单壁碳纳米角-酞菁复合物这种结合了光热与光动力的多功能治疗体系对人宫颈癌细胞具有良好的杀死率。
应用实施例2
制备实施例1制备的单壁碳纳米角-酞菁复合物作为光热及光动力治疗剂，其体内裸鼠测试方法如下：
把人口腔表皮癌细胞皮下移植到裸鼠体内，培养6~7天。静脉注射200μL单壁碳纳米角-酞菁复合物溶液到裸鼠体内，随后每天用650nm激光（3W/cm2）照射肿瘤部位10分钟，持续照射10天。
激光照射明显抑制肿瘤细胞的生长，并且肿瘤体积在以肉眼可见的速度减小。持续照射10天后，肿瘤消失。证实单壁碳纳米角-酞菁复合物可有效杀死体内人口腔表皮癌肿瘤细胞。
应用实施例3
应用实施例1、2的方法应用于乳腺癌、鼻咽癌、恶性胶质瘤、纤维母细胞瘤，相同条件下实验的效果也相近。在应用实施例1条件下，对细胞杀死率为70%~90%；在应用实施例2条件下，肿瘤消失。
应用实施例4
采用应用实施例1、2、3的方法，采用其他波长大于650nm的红外和近红外的激光（650nm~808nm），在此波长范围内，其他条件一致时，实验效果也相近。在应用实施例1条件下，对细胞杀死率为60%~90%；在应用实施例2条件下，肿瘤消失。
本发明证实，在制备方法上，所有水溶性酞菁都适用，对所有的水溶性酞菁，制备方法是一样的。在应用上，若是金属酞菁，则是在合适的中心金属（如铜、锌、铝、硅等）存在下的酞菁活性氧产率高，适用于光动力治疗。以锌、铝、硅为中心原子的酞菁都是很好的用于光动力治疗的光敏剂。中心金属元素对活性氧的产生量有一定影响。