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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410088031.7 (22)申请日 2014.03.12 A61K 39/39(2006.01) A61K 39/02(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (73)专利权人 中国药科大学 地址 211198 江苏省南京市江宁区龙眠大道 639 号 (72)发明人 奚涛 邢莹莹 宋辉 陆园园 吕小波 CN 1909924 A,2007.02.07, 游猛 . 鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白作为免疫佐剂 的研。
2、究 .中国优秀硕士学位论文全文数据库 农 业科技辑 .2011,D050-195. 邓乐等 . 幽门螺杆菌感染与 Toll 样受 体 .国际消化病杂志 .2007, 第 27 卷 ( 第 5 期 ),317-319. (54) 发明名称 一种幽门螺杆菌多表位疫苗的新型嵌合鞭毛 蛋白佐剂 (57) 摘要 本发明提供一种幽门螺杆菌多表位疫苗的新 型嵌合鞭毛蛋白佐剂。本发明的幽门螺杆菌多 表位疫苗的新型嵌合鞭毛蛋白佐剂， 其活性成分 是一条多肽链， 主要是由鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白 Flic 的 D0 和 D1 区与幽门螺杆菌鞭毛蛋白 FlaA 的 D2 和 D3 区构成。该蛋白佐剂的核苷酸序列是 由 。
3、PCR 技术合成的， 并利用表达载体在大肠杆菌 中表达， 经蛋白纯化后， 得到该佐剂蛋白。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 曹丙洲 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 序列表5页 附图3页 CN 103861101 B 2016.04.27 CN 103861101 B 1.一种幽门螺杆菌多表位疫苗的新型嵌合鞭毛蛋白佐剂， 其活性成分是一条多肽， 主 要由鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白Flic的D0和D1区与幽门螺杆菌鞭毛蛋白FlaA的D2和D3区构成， 其氨基酸序列如序列1所示。 2.如权利要求1所述的一种幽门螺杆菌多表位疫苗的新型嵌合。
4、鞭毛蛋白佐剂， 其天然 核苷酸序列如序列2所示， 经密码子优化的核苷酸序列如序列3所示。 3.包含序列2或序列3所示的的核苷酸序列的表达载体、 转基因细胞系或宿主菌。 4.如权利要求1所述的一种幽门螺杆菌多表位疫苗的新型嵌合鞭毛蛋白佐剂， 其特征 为在Flic/D0、 FlaA/D2-D3和Flic/D1之间的间隔氨基酸序列为GGGGS。 5.如权利要求1所述的一种幽门螺杆菌多表位疫苗的新型嵌合鞭毛蛋白佐剂的制备方 法， 其特征在于， 经密码子优化， 通过PCR技术合成嵌合鞭毛蛋白的核苷酸序列， 并构建含有 该核苷酸序列的重组表达载体pETCF及其重组基因工程菌， 重组基因工程菌株发酵后， 利。
5、用 蛋白质纯化技术获得该嵌合鞭毛蛋白佐剂。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 103861101 B 2 一种幽门螺杆菌多表位疫苗的新型嵌合鞭毛蛋白佐剂 技术领域 0001 本发明属于生物医药领域， 具体涉及到一种幽门螺杆菌(Hp)多表位疫苗的新型嵌 合鞭毛蛋白的设计、 构建和制备方法。 背景技术 0002 鞭毛蛋白是细菌鞭毛的主要组成蛋白， 根据鞭毛蛋白基因结构与功能将鞭毛蛋白 分为四个区域， 即高度保守的N-末端和C-末端(D0， D1区)和高度变异的中间部分(D2， D3 区)， 这些复杂的表面复合物与细菌运动有关， 同时也与诱导特异性免疫应答相关联。 机体 对外来抗原物质如对病。
6、原微生物的识别是由细胞的特定受体介导的。 目前已证实， 这一识 别主要是通过细胞表面的Toll样受体(Toll-like receptor， TLRs)家族分子来实现的。 TLRs可识别病原微生物高度保守的结构基序， 即所谓的病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns， PAMPs)， 并诱导产生天然免疫应答。 特定的TLRs可以识 别相应的PAMPs， 其中鞭毛蛋白高度保守的D0， D1区能以配体受体识别的方式激活表达TLR5 受体的APC， 如树突状细胞(DC)， 巨噬细胞以及肠上皮细胞， 诱导分泌前炎性因子及细胞因 子， 进而介导激活T。
7、细胞和B细胞应答； 而高度变异的D2， D3区的抗原性能刺激机体产生特异 性的免疫反应； 细菌鞭毛蛋白作为佐剂不仅可使机体产生特异性的体液和细胞免疫， 越来 越多的研究显示鞭毛蛋白还能通过TLR5受体调节黏膜免疫反应。 细菌鞭毛蛋白与TLR5受体 结合后， 主要是通过髓样分化因子MyD88激活白介素受体相关激酶(IRAK4)和肿瘤坏死因子 受体相关因子6(TRAF6)， TRAF6被磷酸纤维素化后， 诱导转化因子 活化激酶1(TAK1)和促分 裂原活化蛋白酶MKK6， 激活下游的NF- B、 JNK和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38信号通 路， 诱导促炎细胞因子如IL-6、 IL-12及。
8、TNF- 等基因的表达。 目前， 鞭毛蛋白已作为一种有 效的免疫佐剂用于各类疫苗的研究中， 如尿道致病性大肠埃希菌(Uropathogenic Escherichia coli， UPEC)， 抗鼠疫(耶尔森氏 )杆菌(Yersinia Pestis)、 疟原虫 (Plasmodium falciparum)、 破伤风梭菌(Clostridium tetani)、 西尼罗病毒(West Nile viruses)等疫苗的研究。 0003 Hp中的鞭毛蛋白在Hp的定植过程中起着至关重要的作用， 能够通过摆动提供动 力， 帮助Hp穿过黏液层， 到达胃上皮表面适合其生存的微氧环境， 是影响Hp定植及。
9、感染持续 存在的重要因素。 但是， 由于Hp鞭毛蛋白因其结构特殊性， 虽然能引发机体产生特异性的抗 体反应， 却不能被APC上的TLR5识别， 刺激机体产生有效的黏膜免疫应答， 从而逃避了机体 的免疫监督形成持续感染。 0004 如何解决Hp鞭毛蛋白不能有效调节黏膜免疫的问题以及能否改造Hp鞭毛蛋白使 其做为Hp疫苗的生物佐剂， 使其既能刺激机体产生体液和细胞免疫， 又能调节黏膜免疫反 应， 有效清除Hp胃黏膜感染， 抑制Hp胃部定植， 增强疫苗治疗Hp感染的效果， 成为Hp疫苗研 究的一个新的思路。 根据国内外研究报道， 鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白Flic高度保守的D0， D1区 能以配体受体识别。
10、的方式激活TLR5， 调控TNF- 、 IL-6和IL-12等促炎细胞因子的合成， 具有 很好的免疫佐剂功效， 已经应用于流感疫苗、 鸡瘟疫苗等病原体疫苗研究中， 其中与Flic融 说 明 书 1/4 页 3 CN 103861101 B 3 合表达的两个流感病毒疫苗已经进入II期临床实验 0005 本发明的思路如下： 依据鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白Flic和Hp鞭毛蛋白FlaA的结构特 点和免疫学效果， 通过生物信息学软件分析， 选择了能特异性激活TLR-5的鼠伤寒沙门菌鞭 毛蛋白Flic的D0和D1区域与Hp鞭毛蛋白FlaA的D2， D3区域， 设计出了一种Hp多表位疫苗的 嵌合鞭毛蛋白佐剂CF。
11、， 该嵌合鞭毛蛋白佐剂结构新颖， 功能独特。 通过密码子优化、 基因合 成和基因克隆等技术， 成功构建了CF， 通过原核表达和蛋白纯化等技术， 获得了纯化蛋白 CF。 发明内容 0006 本发明的第一个方面是提供了一种幽门螺杆菌多表位疫苗的新型嵌合鞭毛蛋白 佐剂。 0007 本发明的第二个方面是提供了该幽门螺杆菌多表位疫苗的嵌合鞭毛蛋白的制备 方法。 0008 本发明的第一个方面是提供了一种幽门螺杆菌多表位疫苗的新型嵌合鞭毛蛋白 佐剂CF。 该嵌合鞭毛蛋白CF主要由鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白Flic的D0和D1区域与Hp鞭毛蛋白 FlaA的D2和D3区域嵌合构成， 具有以下优点： (1)鼠伤寒沙门菌。
12、鞭毛蛋白Flic高度保守的D0 和D1区能以配体受体识别的方式激活表达TLR5受体的APC， 如树突状细胞(DC)， 巨噬细胞以 及肠上皮细胞， 诱导分泌前炎性因子及细胞因子， 进而介导激活T细胞和B细胞应答。 (2)天 然的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白Flic可以激活TLR5介导的黏膜免疫应答， 但不能产生针对Hp鞭 毛蛋白FlaA的特异性抗体。 本发明的嵌合鞭毛蛋白CF既保留鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白Flic可 以刺激TLR5能力， 又可以激发针对Hp鞭毛蛋白FlaA的特异性抗体。 0009 本发明的第二个方面是提供了幽门螺杆菌多表位疫苗的嵌合鞭毛蛋白CF的制备 方法， 其技术路线简述如下： 0010 。
13、(1)嵌合鞭毛蛋白CF分子的结构设计 0011 在GenBank数据库中查找幽门螺杆菌26695鞭毛蛋白FlaA的D2、 D3区域的核苷酸序 列以及肠炎沙门氏菌鞭毛蛋白Flic(GenBank： AEO27871.1)的D0、 D1区的核苷酸序列， 通过 生物信息学软件对Flic的D0区、 D1区与FlaA的D2-D3的间隔序列， 加以分析和确定， 设计一 个具有科学合理结构的嵌合鞭毛蛋白。 0012 (2)重组表达质粒pETCF(含有嵌合基因CF)的构建 0013 将所设计的嵌合鞭毛蛋白CF的基因序列送至基因合成公司进行密码子的优化并 合成， 利用基因克隆技术将CF基因克隆至pET28a载体。
14、中， 构建重组表达载体pETCF。 0014 (3)嵌合鞭毛蛋白CF的原核表达及纯化 0015 将重组表达载体pETCF转化进大肠杆菌BL21(DE3)中， 构建重组基因工程菌株BL21 (DE3)/pETCF。 利用IPTG诱导表达， 并通过HisTrapTM FF crude镍离子亲和层析和 DEAESepharose FF阴离子交换层析能够获得高纯度嵌合鞭毛蛋白CF。 附图说明 0016 图1： 嵌合鞭毛蛋白CF的分子结构设计特点。 0017 图2： 重组表达载体pETCF的质粒图谱。 说 明 书 2/4 页 4 CN 103861101 B 4 0018 Nco I和Xho I之间为插。
15、入的嵌合基因CF； 0019 图3： 嵌合鞭毛蛋白CF的原核蛋白表达。 0020 1： 未加IPTG诱导的pET28a空载； 2： 加IPTG诱导的pET28a空载； 3： 未加IPTG诱导的 pETCF； 4： 加IPTG诱导的pETCF； 0021 图4： 嵌合鞭毛蛋白CF的HisTrapTM FF crude镍离子亲和层析纯化。 0022 1-6： 20mM咪洗脱下的杂蛋白和部分目的蛋白； 7-11： 30mM咪唑洗脱的目的蛋白CF； 12-16： 40mM咪唑洗脱下的部分目的蛋白CF和杂志蛋白； 17-22： 50mM咪洗脱下的杂蛋白； 23- 27： 500mM咪洗脱下的杂蛋白； 具。
16、体实施方式 0023 材料 0024 1.IPTG溶液： 称取1.2g IPTG置于50ml离心管中， 加入40ml无菌水， 充分混匀溶解 后， 定容至50ml。 用0.22 m滤器过滤除菌， 小份分装， -20保存。 0025 2.卡那霉素(Kan)贮液(50mg/mL)： 称取50mg卡那霉素(Kan)溶于1mL无菌水， 制得 浓度为50mg/mL的贮存液， 通过0.22 m细菌滤器过滤除菌， 溶液分装保存于-20冰箱中。 0026 3.培养基： (1)LB液体培养基： 称取10g胰蛋白胨、 5g酵母提取物和5gNaCl， 加蒸馏 水至1000ml， 调整pH至7.4， 高压蒸气灭菌。 (。
17、2)LB固体培养基： 1.5g琼脂粉/100ml LB培养 液， 高压灭菌后， 倾倒平板。 0027 4.DNA电泳缓冲液(50x TAE)： 称取242g Tris、 37.2g Na2EDTA2H2O和57.1ml冰乙 酸， 加水至1000ml， 使用时稀释50倍。 0028 5.SDS-PAGE电泳缓冲液(5X)： 称取Tris粉末15.1g、 甘氨酸94g、 SDS5.0g； 加入约 800ml的去离子水， 搅拌溶解； 加去离子水定容至1L， 室温保存； 注意： 加水时应让水延着壁 缓缓流下， 以避免由于SDS的原因产生很多泡沫。 0029 6.考马斯亮蓝蛋白染色试剂： (1)考马斯亮。
18、蓝G-250染液(蛋白质定量用)： 考马斯 亮蓝G-250100mg溶解在50ml95乙醇中， 然后加入86磷酸100ml， 用蒸馏水稀释至 1000ml。 (2)考马斯亮蓝R-250染液： 0.29g考马斯亮蓝R-250溶解在250ml脱色液中。 (3)固定 液： 500ml乙醇、 100ml冰醋酸用蒸馏水稀释至1000ml。 (4)脱色液： 250ml乙醇、 80ml冰醋酸用 蒸馏水稀释至1000ml。 (5)保存液： 25ml87甘油溶于225ml脱色液中。 0030 实例1： 新型嵌合鞭毛蛋白CF的分子结构设计 0031 在GenBank数据库中查找鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白Flic(Ge。
19、nBank： AEO27871.1)的 D0、 D1区的核苷酸序列和幽门螺杆菌26695鞭毛蛋白FlaA的D2、 D3区的核苷酸序列， 其中 Flic的D0区对应的的核苷酸序列为1426， Flic的D1区对应的的核苷酸序列为1255 1515， FlaA的D2-D3区对应的核苷酸序列为559909。 0032 经过生物信息学软件DNAstar分析， 间隔序列(GGGGS)易形成转角和 -折叠， 不易 形成 -螺旋， 为柔性结构， 能有效间隔开Flic/D0、 FlaA/D2-D3和Flic/D1， 有利于幽门螺杆 菌鞭毛蛋白FlaA抗原表位的有效呈递且表现出较高的复性效率。 0033 结果：。
20、 嵌合鞭毛蛋白CF的分子结构设计特点和思路如图1所示。 0034 实例2： 重组表达载体pETCF(含有嵌合基因CF)的构建 0035 将所设计的嵌合鞭毛蛋白CF的基因序列送交南京思普金生物有限公司进行密码 说 明 书 3/4 页 5 CN 103861101 B 5 子的优化并全基因合成， 并克隆至pET28a中。 0036 结果： 思普金生物有限公司采用T7启动子和终止子通用引物进行基因测序， 证明 PCR合成的pETCF中嵌合基因CF的核苷酸序列完全正确， 且无移码突变。 重组表达载体pETCF 的质粒图谱如(图2)所示。 0037 实例3： 嵌合鞭毛蛋白的原核表达 0038 将思普金生。
21、物有限公司合成的重组质粒pETCF转化进E.coli BL21(DE3)菌株中。 在预先制备好的含50 g/mL Kan的LB平板上， 接种环划线基因工程菌株BL21(DE3)/pETCF， 倒置于37培养箱， 过夜培养1216h后， 挑取单个菌落， 接种于含50 g/mL Kan的LB培养基 中， 37， 180rpm， 培养1216h。 送至思普金生物有限公司进行序列测定。 0039 将测序正确的菌种以2接种量接种于含50 g/mL Kan LB培养基中， 37， 180rpm 振荡过夜， 次日晨再将该菌液以1接种量接种于含50 g/mL Kan的LB液体培养基中， 37， 180rpm摇。
22、瓶3h(OD值在0.60.8)， 加入IPTG使终浓度达到0.5mmol/L， 16， 180rpm诱导表 达， 以空载体菌BL21(DE3)/pET28a作为阴性对照。 0040 结果： 将基因工程重组菌株BL21(DE3)/pETCF在PH值为7、 IPTG浓度为0.5mmol/L、 诱导温度18、 诱导时间为10h的情况下进行诱导表达。 与对照菌株对比， 基因工程重组菌 株BL21(DE3)/pETCF在约33KD处出现目的蛋白条带， 与嵌合鞭毛蛋白CF的理论大小相符合 (图3)。 嵌合鞭毛蛋白在可溶性蛋白和包涵体蛋白中都有存在。 0041 实例4： 嵌合鞭毛蛋白CF的纯化 0042 (。
23、1)HisTrapTM FF crude镍离子亲和层析柱的纯化 0043 向装填好的HisTrapTM FF crude柱中加入适量的去离子水将乙醇冲洗干净后， 加 入8倍柱体积的Binding buffer平衡， 平衡结束后即可上样。 收集菌体后， 每100mg菌体加入 1-5mlBinding Buffer， 超声裂解菌体。 将菌体裂解液负载上柱， 流速为10倍柱体积/小时； 使用15倍柱体积的Wash buffer冲洗柱子， 收集流穿峰； 使用5倍柱体积的Elution Buffer 洗脱， 收集洗脱峰； 依次使用3倍柱体积的Binding Buffer和5倍柱体积的去离子水洗涤后， 用。
24、3倍柱体积的20乙醇平衡(乙醇要将填料浸没)， 4保存。 0044 结果： 经HisTrapTM FF crude镍离子亲和层析柱的纯化后， 收集的各个蛋白峰进行 SDS-PAGE分析， 可以发现嵌合鞭毛蛋白CF集中在30mM咪唑洗脱产生的蛋白峰(图4)。 0045 (2)阴离子交换层析(Sepharose FF)的纯化 0046 Sepharose FF阴离子交换层析方法： 用离子交换层析缓冲液A平衡DEAE Sepharose FF离子交换层析柱。 将经过HisTrapTM FF crude亲和层析一级纯化后的蛋白样 品以10ml/min流速上样DEAE Sepharose FF阴离子交换。
25、层析柱； 用离子交换层析缓冲液B洗 脱蛋白； 洗脱方式： 连续梯度洗脱40min， 收集目的蛋白峰。 0047 结果： 经Sepharose FF阴离子交换层析纯化， 收集的各个蛋白峰进行SDS-PAGE分 析， 嵌合鞭毛蛋白CF主要集中在用0.5MNaCl的磷酸盐缓冲溶液洗脱下的蛋白峰中。 说 明 书 4/4 页 6 CN 103861101 B 6 0001 序 列 表 1/5 页 7 CN 103861101 B 7 0002 序 列 表 2/5 页 8 CN 103861101 B 8 0003 序 列 表 3/5 页 9 CN 103861101 B 9 0004 序 列 表 4/5 页 10 CN 103861101 B 10 0005 序 列 表 5/5 页 11 CN 103861101 B 11 图1 图2 说 明 书 附 图 1/3 页 12 CN 103861101 B 12 图3 说 明 书 附 图 2/3 页 13 CN 103861101 B 13 图4 说 明 书 附 图 3/3 页 14 CN 103861101 B 14 。