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从酵母菌中释放超氧化物岐化酶的方法
    本发明是关于从微生物中释放胞内蛋白的方法，特别是从酵母菌有选择性地释放SOD的方法。

    细胞破碎是胞内蛋白提取的第一步，其方法主要有机械破碎法(高压匀浆，超声波破碎等)，溶菌酶法及化学渗透法。机械破碎法(Schutte，Biotech.Forum，1986，2、68-80)已应用于工业生产中的细胞破碎，但由于其是整体破碎细胞，胞内所有蛋白和DNA都释放出来，从而使后续目标蛋白的纯化十分困难。超声波法已用于破碎芽孢杆菌，提取SOD(CN1058614A)，但它也是整体破碎细胞，而且超声波对人体有害，使该法无法大规模应用。溶菌酶法由于酶制剂成本太高，而无法工业化(Le Corre，S.，Ascnjo，J.A.；Enzyme Microb.Technol.，1985，7，73-77)。近年来化学渗透法发展较快，它不用整体破碎细胞，而采用某些化学渗透剂处理细胞，使胞内蛋白渗透出来(David Hettwer，Biotechnology and Bioengineering，1989，Vol.33，886-895)。但该法采用高浓度溶剂(7M盐酸胍)及昂贵的表面活性剂(Triton X-100)，使得蛋白质释放成本增高，而且目标蛋白的选择性也差，大量的杂蛋白也同时释放出来。传统的细胞破碎方法主要有下面三个缺点：

    ①需要复杂设备

    ②成本高、操作复杂

    ③选择性差

    本发明主要目的是克服传统方法的缺点，提供了一种成本低廉，选择性高的胞内蛋白释放方法。其特征是采用廉价的醇类有机溶剂浸泡酵母细胞，不用任何复杂设备，所用溶剂包括甲醇、乙醇、丙醇等，浸泡温度10℃-50℃，浸泡浓度50％-90％。浸泡时间30分钟-150分钟。过滤除去溶剂，再用缓冲溶液(如磷酸钾缓冲溶液，Tris-HCl缓冲溶液等)将SOD从酵母菌中有选择地抽提出来，所用缓冲液浓度20mM-100mM，抽提温度10℃-50℃，pH4.0-pH9.0，抽提时间为10小时-24小时，离心或过滤除去菌体，便可得到SOD上清液，本发明的主要优点：

    ①不需要任何复杂设备，只需一搅拌容器即可

    ②成本低。所用醇类溶剂价廉，且可循环使用3次以上

    ③选择性高，可纯化SOD20倍以上

    1.实施例1

    在1克酵母湿菌体中加入乙醇(95％)到溶剂浓度80％(W/W)，静止浸泡90分钟，过滤除去溶剂，加入100mM磷酸钾缓冲溶液(pH6.8)，菌体(克)：缓冲液体积(ml)＝1∶3。在室温下搅拌21小时，离心除去菌体，得到的上清液含有SOD280U/ml，比活240u/mg。

    2.实施例2

    在1克酵母湿菌体中，加入异丙醇到溶剂浓度70％(W/W)，浸泡90分钟后，过滤除去有机溶剂，加入100mM磷酸缓冲溶液(pH6.8)，菌体(g)：缓冲溶液体积(ml)＝1∶3，搅拌20小时，离心除去菌体，上清液含SOD300U/ml，比活250u/mg。

    3.比较例(超声波法)

    1克酵母湿菌体中，加入3ml磷酸钾缓冲溶液(100mM，pH6.8)，在超声波匀浆机(250W)处理1小时，离心除去菌体碎片，得到溶液含SOD320u/ml，比活10u/mg

    本发明实施例和比较例结果如表1

    表1本发明实施例与比较例结果   实施例1  实施例2  比较例SOD活性(U/ml)      280    300    320SOD比活(U/mg)      240    250    10

    由表1可知，本发明SOD释放率在85％以上，而SOD比活提高了20倍以上，从而达到了纯化SOD的目的。