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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810923479.4 (22)申请日 2018.08.14 (71)申请人 江苏省农业科学院 地址 210014 江苏省南京市玄武区钟灵街 50号 (72)发明人 赵艳红 吕芳 卢宇 常晨 左晓昕 邓碧华 张金秋 (74)专利代理机构 北京德崇智捷知识产权代理 有限公司 11467 代理人 乔献丽 (51)Int.Cl. A61K 9/19(2006.01) A61K 47/26(2006.01) A61K 47/34(2017.01) A61K 47/38(2006.0。
2、1) A61K 47/18(2006.01) A61K 47/10(2006.01) A61K 39/245(2006.01) A61P 31/22(2006.01) (54)发明名称 猪伪狂犬病活疫苗冻干耐热保护剂、 其制备 方法及用途 (57)摘要 本发明提供了一种猪伪狂犬病活疫苗冻干 耐热保护剂、 及其制备方法和用途， 该保护剂特 征为无明胶、 无蛋白。 该保护剂包括蔗糖2- 8、 异麦芽酮糖3%-6%、 D-山梨醇1%-5%、 甘油1%- 5%、 羟丙甲纤维素0.1%-5%、 蛋氨酸0.1%-3.5%、 多 聚D-赖氨酸0.01%-0.05%， Hanks （含酚红） ， 双纯 水补足。
3、至100%， 上述成分均以重量百分比计。 使 用该冻干耐热保护剂制备的猪伪狂犬病活疫苗 耐热性能较好， 冻干损失在0.5-0.65Lg、 3710d 耐热损失在0.2-0.25Lg、 2-830个月保存期损 失在0.7-0.9Lg， 有效解决了疫苗在保存、 运输中 的低温冷链问题， 尤其是解决了偏远地区农村低 温冷链问题。 权利要求书1页 说明书8页 附图2页 CN 108938574 A 2018.12.07 CN 108938574 A 1.一种猪伪狂犬病活疫苗冻干耐热保护剂， 其特征在于， 所述保护剂包括蔗糖、 异麦芽 酮糖、 D-山梨醇、 甘油、 羟丙甲纤维素、 蛋氨酸、 多聚D-赖氨。
4、酸、 Hanks （含酚红） 。 2.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病活疫苗冻干耐热保护剂， 其特征在于， 所述保护剂 包括蔗糖2%-8%、 异麦芽酮糖3%-6%、 D-山梨醇1%-5%、 甘油1%-5%、 羟丙甲纤维素0.1%-5%、 蛋 氨酸0.1%-3.5%、 多聚D-赖氨酸0.01%-0.05%， Hanks （含酚红） ， 双纯水补足至100%， 上述成分 均以重量百分比计。 3.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病活疫苗冻干耐热保护剂， 其特征在于， 所述保护剂 包括蔗糖5%、 异麦芽酮糖4%、 D-山梨醇2%、 甘油1.5%、 羟丙甲纤维素3%、 蛋氨酸2.5%、 多聚D- 赖氨酸0.0。
5、1%， Hanks （含酚红） ， 双纯水补足至100%， 上述成分均以重量百分比计。 4.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病活疫苗冻干耐热保护剂， 其特征在于， 所述保护剂 的pH为7.2-7.6。 5.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病活疫苗冻干耐热保护剂的制备方法， 其特征在于， 其包括步骤 （1） 将蔗糖、 异麦芽酮糖、 D-山梨醇、 甘油、 羟丙甲纤维素按上述比例称量溶于双 纯水中溶解， 置于110高压灭菌20min； 步骤 （2） 蛋氨酸、 多聚D-赖氨酸， Hanks （含酚红） 按 上述量进行配比溶于双纯水中， 用0.22um的滤膜除菌， 然后与步骤 （1） 中制备得到的组分混 合， 。
6、从而得到所述冻干耐热保护剂。 6.一种包括根据权利要求1所述的冻干耐热保护剂的猪伪狂犬病活疫苗的冻干方法， 其特征在于： 所述冻干方法包括以下步骤： 将所述保护剂与猪伪狂犬病病毒抗原混匀后， 分装， 用丁基三叉塞半加塞后的制品置 入冻干机箱体内4预冷45min， 以1.37/min的速度将温度降至-40， 维持4-5h使疫苗冻 实， 抽真空至500mTorr后， 再以1.87/min的速度将温度逐步升高直至6， 在此温度下维 持2h， 再以2.2/min的速度降温至-22， 维持4.5h后， 再以2.4/min的速度将温度逐步 升高直至28加塞出箱， 冻干全程为26h之内。 7.根据权利要求6。
7、所述的猪伪狂犬病活疫苗的冻干方法， 其特征在于， 将含量测定为 108.0TCID50/ml以上的猪伪狂犬病病毒抗原与根据权利要求1所述的冻干耐热保护剂混匀， 保护剂为无明胶、 无蛋白的 “绿色” 保护剂。 8.采用根据权利要求1-5中任一项所述的保护剂冻干的猪伪狂犬病毒， 其特征在于， 冻 干损失在0.5-0.65Lg， 3710d耐热损失在0.2-0.25Lg； 21d耐热损失为0.5-0.59Lg； 2-8 30个月保存期损失在0.7-0.9Lg。 9.一种冻干猪伪狂犬病活疫苗， 其特征在于， 所述猪伪狂犬病活疫苗通过根据权利要 求6所述的方法制成。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 。
8、CN 108938574 A 2 猪伪狂犬病活疫苗冻干耐热保护剂、 其制备方法及用途 技术领域 0001 本发明属于免疫技术领域， 具体涉及一种猪伪狂犬病活疫苗冻干耐热保护剂及其 制备方法和用途。 背景技术 0002 猪伪狂犬病(Pseudorabies)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus， PRV)引起 的多种家畜以发热、 奇痒(猪除外)、 繁殖障碍、 脑脊髓炎为主要症状的一种高度接触性传染 病。 它是研究疱疹病毒生物学的一个有用的模式病毒。 伪狂犬病毒的分类学命名为猪疱疹 病毒I型， 属于疱疹病毒甲亚科水痘疱疹病毒属。 所有的疱疹病毒都有一个双股DNA基因组， 病毒粒子。
9、大小相近(200-250nm)， 结构(衣壳、 被膜和囊膜)相似， 且在生活周期上有潜伏期 (Roizman et al.,2001)。 PRV由于能感染突触连接的神经元， 也被用做神经细胞线路的 “活” 追踪器。 世界动物卫生组织(OIE)将其列为B类动物疫病， 我国将其列为二类动物疫病。 现已有40多个国家报道40多种动物感染该病， 我国自1948年刘永纯首次报道猪伪狂犬病以 来， 已有20多个省市报道此病的发生。 近年来的研究表明， 猪伪狂犬病的发生率逐年增加， 成为我国当前危害养猪业的重要疫病之一。 0003 防控该病最为有效的方法是疫苗免疫， 目前市场上的活疫苗主要包括： 传统减毒 。
10、活疫苗、 基因工程载体活疫苗、 基因缺失活疫苗和遗传重组活疫苗等。 大多数活疫苗为弱毒 疫苗， 弱毒疫苗是一种病原致病力减弱但仍具有活力的完整病原疫苗。 长期以来， 弱毒疫苗 因其独特的优势在防控猪传染病方面发挥了重要作用。 弱毒疫苗毒株可以在宿主体内繁殖 (复制)， 但不像自然感染(野生)病原微生物那样致病， 弱毒疫苗除产生体液免疫外， 还可以 激活细胞免疫反应和局部免疫反应， 产生记忆性CD8+T淋巴细胞， 接种次数少而免疫力较持 久。 弱毒疫苗的免疫过程是对宿主自然感染的模仿， 病原体通过在宿主中增殖并被多个系 统传递和分发， 刺激机体产生高效的免疫反应。 通常认为弱毒疫苗免疫效果持久牢。
11、固， 局部 不良反应小， 接种途径广泛， 接种次数少。 但是猪伪狂犬疫苗目前存在的最大问题是不耐受 冷冻干燥， 且猪伪狂犬活疫苗在2-8条件下的保存期只有3-6个月， 大多需要在-15以下 保存。 疫苗耐热性能差， 使得免疫效果大大降低。 0004 长期以来， 国内的兽用活疫苗大多采用传统的冻干工艺制备， 国内主要采用蔗糖、 明胶、 脱脂乳等简单的组方作为保护剂， 冻干的疫苗大多在-15以下储存； 国外采用低聚 糖、 多元醇、 蛋白、 抗氧化剂、 缓冲剂、 填充剂等复合组方作为保护剂， 制备的冻干疫苗2-8 可保存2年。 近年来， 国内很多致力于疫苗制造技术的研究主要集中在耐热保护剂配伍和筛 。
12、选研究上， 成功筛选出以PVP K30、 山梨醇、 乳酸钙和硫脲为主要成分的耐热保护剂， 对鸡新 城疫、 传染性支气管炎二联活疫苗(La Sota株+H120株)有较好的耐热效果， 37保存10d病 毒含量下降0.4个滴度； 王颖用响应面法优化猪伪狂犬病毒耐热保护剂最优配方为谷氨酸 钠2、 L-精氨酸盐酸盐2、 D-山梨醇2、 酶解酪蛋白7.6、 海藻糖1、 明胶4、 蔗糖 15.2、 牛血清白蛋白2。 但是对于疫苗冻干工艺保护剂的研究鲜有报道。 事实上， 尽管冻 干技术应用广泛， 历史悠久， 但在实际冻干工艺中， 仍然依赖于技术人员的能力和经验。 影 说 明 书 1/8 页 3 CN 108。
13、938574 A 3 响冻干保护剂的因素主要有： 一是微生物因素， 微生物种类差异(如病毒有无囊膜)、 培养方 式的选择以及疫苗的种类； 二是保护剂配方、 原料及其性质、 原料配比以及该疫苗适合的冻 干工艺。 而且耐热疫苗保护剂和冻干程序是相互配套的工艺， 预冻方式、 预冻温度和干燥温 度的不合理， 容易导致冻干制品冻形不合格， 例如塌陷、 萎缩、 熔融等， 甚至大大降低冻干疫 苗的效价。 在药物制剂领域， 早已有根据药品的热参数来确定预冻温度和干燥温度， 再进一 步科学优化冻干程序的策略。 0005 因此， 发明人针对目前市场上猪伪狂犬疫苗普遍存在的不耐受冷冻以及运输过程 中不耐热的问题， 。
14、配方以无明胶、 无外源蛋白为主， 选择以蔗糖、 山梨醇、 甘油、 羟丙甲纤维 素等成分设计耐热保护剂组方， 根据配方的共晶点、 塌陷温度科学设计冻干程序， 以37加 速耐老化试验、 残余水分为筛选指标， 从而获得耐热性能好的组方与冻干工艺， 以期解决猪 伪狂犬疫苗不耐冻与不耐热的问题。 发明内容 0006 针对现有技术的缺陷， 本发明的目的在于提供一种猪伪狂犬低毒活疫苗冻干耐热 保护剂及其使用方法， 用以解决猪伪狂犬疫苗不耐受冷冻以及运输与保存过程中不耐热的 问题。 0007 本发明的另一目的在于提供一种猪伪狂犬低毒活疫苗冻干耐热保护剂， 其特征在 于， 所述保护剂不含有明胶、 外来蛋白， 提。
15、高了疫苗的耐热效果， 并降低了损失。 0008 进一步地， 本发明提供一种冻干耐热保护剂， 其特征在于， 所述保护剂包括多聚D- 赖氨酸。 0009 进一步地， 本发明提供一种冻干耐热保护剂， 其特征在于， 所述保护剂包括多聚D- 赖氨酸0.01-0.05。 0010 进一步地， 本发明提供一种冻干耐热保护剂， 其特征在于， 所述保护剂包括羟丙甲 纤维素。 0011 进一步地， 本发明提供一种冻干耐热保护剂， 其特征在于， 所述保护剂包括蛋氨 酸。 0012 进一步地， 本发明提供一种冻干耐热保护剂， 其特征在于， 所述保护剂包括异麦芽 酮糖。 0013 进一步地， 本发明提供一种冻干耐热保护。
16、剂， 其特征在于， 所述保护剂包括蔗糖、 异麦芽酮糖、 D-山梨醇、 甘油、 羟丙甲纤维素、 蛋氨酸、 多聚D-赖氨酸， Hanks(含酚红)。 0014 进一步地， 本发明提供一种猪伪狂犬病活疫苗冻干耐热保护剂， 其特征在于， 所述 保护剂包括蔗糖2-8、 异麦芽酮糖3-6、 D-山梨醇1-5、 甘油1-5、 羟丙甲纤 维素2-6、 蛋氨酸0.5-5、 多聚D-赖氨酸0.01-0.05， Hanks(含酚红)， 双纯水补 足至100， 上述成分均以重量百分比计。 0015 进一步地， 本发明提供一种猪伪狂犬病活疫苗冻干耐热保护剂， 其特征在于， 所述 保护剂包括蔗糖5、 异麦芽酮糖4、 D-。
17、山梨醇2、 甘油1.5、 羟丙甲纤维素3、 蛋氨酸 2.5、 多聚D-赖氨酸0.01， Hanks(含酚红)， 双纯水补足至100， 上述成分均以重量百分 比计。 0016 进一步地， 本发明提供一种猪伪狂犬病活疫苗冻干耐热保护剂， 其特征在于， 所述 说 明 书 2/8 页 4 CN 108938574 A 4 保护剂包括蔗糖6、 异麦芽酮糖5、 D-山梨醇3.5、 甘油3、 羟丙甲纤维素4、 蛋氨酸 3.5、 多聚D-赖氨酸0.03， Hanks(含酚红)， 双纯水补足至100， 上述成分均以重量百分 比计。 0017 进一步地， 本发明提供一种猪伪狂犬病活疫苗冻干耐热保护剂， 其特征在于。
18、， 所述 保护剂包括蔗糖8、 异麦芽酮糖6、 D-山梨醇5、 甘油5、 羟丙甲纤维素5、 蛋氨酸 4.5、 多聚D-赖氨酸0.05， Hanks(含酚红)， 双纯水补足至100， 上述成分均以重量百分 比计。 0018 进一步地， 本发明提供一种猪伪狂犬病活疫苗冻干耐热保护剂， 其特征在于， 所述 保护剂的pH为7.2-7.6。 0019 进一步地， 本发明提供一种猪伪狂犬病活疫苗冻干耐热保护剂的制备方法， 其包 括步骤(1)将蔗糖、 异麦芽酮糖、 D-山梨醇、 甘油、 羟丙甲纤维素按上述比例称量溶于双纯水 中溶解， 置于110高压灭菌20min； 步骤(2)蛋氨酸、 多聚D-赖氨酸， Han。
19、ks(含酚红)按上述 量进行配比溶于双纯水中， 用0.22um的滤膜除菌， 然后与步骤(1)中制备得到的组分混合， 从而得到所述耐热保护剂。 0020 进一步地， 本发明提供一种猪伪狂犬病活疫苗冻干耐热保护剂的制备方法， 其包 括步骤(1)将蛋氨酸、 多聚D-赖氨酸， Hanks(含酚红)按上述量进行配比溶于双纯水中， 用 0.22um的滤膜除菌； 步骤(2)将蔗糖、 异麦芽酮糖、 D-山梨醇、 甘油、 羟丙甲纤维素按上述比 例称量溶于双纯水中溶解， 置于110高压灭菌20min， 然而与步骤(1)中制备得到的组分混 合， 从而得到所述耐热保护剂。 0021 进一步地， 本发明提供一种包括上述。
20、冻干耐热保护剂的猪伪狂犬病活疫苗的冻干 方法， 其特征在于： 所述冻干方法包括以下步骤： 0022 将所述冻干耐热保护剂与猪伪狂犬病病毒抗原混匀后， 分装， 用丁基三叉塞半加 塞后的制品置入冻干机箱体内4预冷45min， 以1.37/min的速度将温度降至-40， 维持 4-5h使疫苗冻实， 抽真空至500mTorr后， 再以1.87/min的速度将温度逐步升高直至6， 在此温度下维持2h， 再以2.2/min的速度降温至-22， 维持4.5h后， 再以2.4/min的速 度将温度逐步升高直至28加塞出箱， 冻干全程为26h。 0023 进一步地， 本发明提供一种猪伪狂犬病活疫苗的冻干方法， 。
21、其特征在于， 将猪伪狂 犬病病毒抗原与上述冻干耐热保护剂以1:1体积比混匀。 0024 进一步地， 本发明提供一种猪伪狂犬病活疫苗的冻干方法， 其特征在于， 将含量测 定为108.0TCID50/ml的猪伪狂犬病病毒抗原与上述冻干耐热保护剂混匀。 0025 进一步地， 本发明提供一种猪伪狂犬病活疫苗的冻干方法， 其特征在于， 将含量测 定为108.0TCID50/ml的猪伪狂犬病病毒抗原与上述冻干耐热保护剂以1:1体积比混匀。 0026 进一步地， 本发明提供了一种冻干猪伪狂犬病活疫苗， 其特征在于， 所述猪伪狂犬 病活疫苗通过上述方法制成。 0027 本发明的有益效果是： 0028 1、 冻。
22、干时间短， 全程仅为26h之内， 主要保护剂为蔗糖， 成本低于一般保护剂中所 用的海藻糖， 有效的降低了冻干成本。 0029 2、 本发明与以往活疫苗耐热保护剂相比最大的区别在于， 解决了猪伪狂犬冻干过 程中不耐冻的问题。 本发明不仅解决无脂蛋白活疫苗不耐受问题， 还使该新型耐热保护剂 说 明 书 3/8 页 5 CN 108938574 A 5 在冻干过程中疫苗中的抗原损失很小， 有效的解决了猪伪狂犬病毒在冻干中的难题。 0030 3、 该新型耐热保护剂耐热性能较好， 在3710d的耐老化试验中， 病毒含量仍然保 持为107.88TCID50， 冻干与耐老化损失仅0.55Lg， 有效的解决了。
23、疫苗在保存、 运输中的低温 冷链问题， 尤其是解决了偏远地区农村低温冷链问题； 同时还降低了疫苗保存、 运输的成 本。 0031 4、 现有技术中， 猪伪狂犬活疫苗在2-8条件下的保存期只有3-6个月， 大多需要 在-15以下保存， 采用本发明所述猪伪狂犬低毒活疫苗冻干保护剂可使猪伪狂犬低毒活 疫苗在2-8保存24个月， 病毒含量损失0.7Lg， 有效延长了该疫苗的保存期限， 解决了该疫 苗需冷冻运输， 保存， 储存不便的问题； 0032 5、 本发明所述猪伪狂犬病活疫苗冻干耐热保护剂成分及制备方法简单， 不含明胶 和外源蛋白， 安全无不良反应， 对猪伪狂犬低毒活疫苗免疫效力不产生任何影响。 。
24、附图说明 0033 图1示出了根据本发明实施方式的真空冷冻干燥曲线。 0034 图2示出了使用根据本发明实施方式的猪伪狂犬病活疫苗冻干耐热保护剂通过三 种冻干工艺进行冷冻干燥后所得样品的示意图。 0035 图3示出了根据本发明实施方式的猪伪狂犬活疫苗病毒滴度随时间的变化曲线图 (快速冻干样品2-8保存24个月)； 0036 图4示出了根据本发明实施方式的猪伪狂犬低毒活疫苗抗体检测水平。 具体实施方式 0037 下面将结合具体的实施方式， 对本发明作进一步的说明。 下文的描述仅用于理解 本发明， 而不构成对本发明的限制。 0038 实施例1猪伪狂犬病活疫苗抗原制备和Hanks(含酚红)的配制 0。
25、039 毒株： PRV-Bartha-k61； 细胞： 猪睾丸细胞(ST)， 均由国家兽用生物制品工程技术 研究中心提供。 取猪伪狂犬病毒样本， 用2DMEM做100倍稀释， 接种ST细胞， 37培养48h 后， 收获病毒液， 并反复冻融两次后， 纱布过滤， 收获上清， 留样后置于-80冻结保存。 经检 验无菌， 病毒含量测定为108.0TCID50/ml， 方可用于配苗。 0040 Hanks(含酚红)的配制 0041 Hanks液是生物医学实验中最常用的无机盐溶液和平衡盐溶液(Balanced Salt Solutions,BSS)。 其配制方法如下： 0042 原液A 说 明 书 4/8。
26、 页 6 CN 108938574 A 6 0043 0044 原液B 0045 (1) 0046 0047 (2)0.4酚红溶液： 取酚红0.4g， 置玻璃研钵中， 逐滴加入0.1N NaOH， 并研磨， 直 至完全溶解， 约加0.1N NaOH 10ml。 将溶解的酚红吸入100ml量瓶中， 用双蒸水洗下研钵中 残留酚红液， 并入量瓶中， 最后补加双蒸水至100ml。 0048 将(1)液和(2)液混合， 补加双蒸水至1000ml， 即为原液B。 0049 应用液 0050 原液A1份 原液B1份 双蒸水18份 0051 混合后， 分装于200ml小瓶中， 10磅高压蒸汽灭菌15分钟， 临。
27、用前用无菌的5.6 NaHCO3调pH至7.2-7.6。 0052 实施例2耐热保护剂热参数的测定 0053 为更好的设定冻干曲线， 发明人测定了耐热保护剂的塌陷温度。 塌陷温度采用低 温冻干显微镜测定， 检测条件为： Temp-40， Vac 20.0Pa， Ramp Row 3Rate 3/min， Limit-40。 具体由上海东富龙股份有限公司进行检测。 检测结果为： 保护剂-15。 0054 实施例3保护剂1的制备和疫苗的冻干 0055 冻干耐热保护剂1由以下重量百分比的成分组成： 蔗糖5、 异麦芽酮糖4、 D-山 梨醇2、 甘油1.5、 羟丙甲纤维素3、 蛋氨酸2.5、 多聚D-赖。
28、氨酸0.01， Hanks(含酚 红)， 双纯水补足至100。 0056 取耐热保护剂1与检验合格的PRV-Bartha-k61抗原以1:1体积混合、 分装至7ml西 林瓶中， 2ml/瓶， 用丁基三叉塞半加塞后的制品置入冻干机箱体内4预冷45min， 以1.37 /min的速度将温度降至-40， 维持4-5h使疫苗冻实， 抽真空至500mTorr后， 再以1.87/ min的速度将温度逐步升高直至6， 在此温度下维持2h， 再以2.2/min的速度降温至-22 说 明 书 5/8 页 7 CN 108938574 A 7 维持4.5h后， 再以2.4/min的速度将温度逐步升高直至28加塞出。
29、箱， 冻干全程为26h。 0057 实施例4保护剂2的制备和疫苗的冻干 0058 冻干耐热保护剂2由以下重量百分比的成分组成： 蔗糖6、 异麦芽酮糖5、 D-山 梨醇3.5、 甘油3、 羟丙甲纤维素4、 蛋氨酸3.5、 多聚D-赖氨酸0.03， Hanks(含酚 红)， 双纯水补足至100。 0059 取耐热保护剂2与检验合格的PRV-Bartha-k61抗原以1:1体积混合、 分装至7ml西 林瓶中， 2ml/瓶， 用丁基三叉塞半加塞后的制品置入冻干机箱体内4预冷45min， 以1.37 /min的速度将温度降至-40， 维持4-5h使疫苗冻实， 抽真空至500mTorr后， 再以1.87/。
30、 min的速度将温度逐步升高直至6， 在此温度下维持2h， 再以2.2/min的速度降温至-22 维持4.5h后， 再以2.4/min的速度将温度逐步升高直至28加塞出箱， 冻干全程为26h。 0060 实施例5保护剂3的制备和疫苗的冻干 0061 冻干耐热保护剂3由以下重量百分比的成分组成： 蔗糖8、 异麦芽酮糖6、 D-山 梨醇5、 甘油5、 羟丙甲纤维素5、 蛋氨酸4.5、 多聚D-赖氨酸0.05， Hanks(含酚红)， 双纯水补足至100。 0062 取耐热保护剂3与检验合格的PRV-Bartha-k61抗原以1:1体积混合、 分装至7ml西 林瓶中， 2ml/瓶， 用丁基三叉塞半加。
31、塞后的制品置入冻干机箱体内4预冷45min， 以1.37 /min的速度将温度降至-40， 维持4-5h使疫苗冻实， 抽真空至500mTorr后， 再以1.87/ min的速度将温度逐步升高直至6， 在此温度下维持2h， 再以2.2/min的速度降温至-22 维持4.5h后， 再以2.4/min的速度将温度逐步升高直至28加塞出箱， 冻干全程为26h。 0063 实施例6对照组中牧实业股份有限公司的耐热保护剂苗(专利号CN103656660)的 制备 0064 将对照制品置于4、 37保存， 不同时间取样， 测定病毒含量。 0065 中牧实业股份有限公司的冻干保护剂是由以下重量百分比的成分组成。
32、： 乳糖 16、 水解乳白蛋白4、 聚乙烯吡络烷酮0.5、 谷氨酸钠2、 精氨酸盐酸盐2、 水解蚕丝 蛋白1、 甘露醇2、 灭菌双蒸水补足至100， 完全溶解上述物质， 经110高压灭菌 15min。 取耐热保护剂与检验合格的PRV-Bartha-k61以1:1体积混合、 分装至7ml西林瓶中， 2ml/瓶， 用丁基三叉塞半加塞后的制品置入冻干机箱体内， 进行冻干。 0066 实施例7冻干制品的检测 0067 冻干制品的物理性状、 剩余水分测定按照现行 中华人民共和国兽药典 附录的方 法和标准进行。 0068 表1冻干制品的物理性状、 剩余水分测定结果 0069 组别物理性状剩余水分(,n4)。
33、 实施例3疏松海绵状1.160.08 实施例4疏松海绵状1.630.02 实施例5疏松海绵状1.540.06 中牧实业股份有限公司疏松海绵状1.810.06 0070 从物理性状、 剩余水分结果看， 均符合 中华人民共和国兽药典 附录的规定， 且含 水量低于中牧实业股份有限公司的冻干制品。 说 明 书 6/8 页 8 CN 108938574 A 8 0071 冻干制品病毒含量检测方法： 病毒含量测定按瓶签注明的解毒含量， 将疫苗用2 DMEM复溶后， 再作10倍倍比稀释， 取10-5、 10-6、 10-7、 10-8， 4个稀释度， 每个稀释度接种6个传 代细胞(ST)单层孔， 阳性对照与。
34、阴性对照也各接6个孔， 每孔0.1/ml， 置371/5CO2 培养72h， 检查病毒的特异性细胞病变并根据Reed-Muench法计算TCID50。 每头份疫苗病毒含 量应不低于105.5TCID50。 0072 表2冻干制品的370d、 10d21d TCID50测定结果 0073 0074 0075 试验结果显示， 实施例3、 4、 5的冻干制品前后损失均小于中牧的耐热保护剂， 冻干 损失在0.5-0.65Lg， 而且370d到10d TCID50耐热损失在0.2-0.25Lg； 21d耐热损失为0.5- 0.59Lg。 0076 表明本发明的保护剂不仅较好的解决猪伪狂犬病毒在冻干过程中。
35、不耐受热同时 还解决长途运输中所缺少的冷链问题， 降低生产成本。 0077 试验结果还显示， 本发明保护剂370d、 10d耐热损失均比中牧实业股份有限公司 的保护剂低。 表明本发明不仅成本比中牧实业股份有限公司低， 耐热稳定性也比中牧实业 股份有限公司的保护剂效果好。 0078 实施例8伪狂犬低毒活疫苗的保存期测定 0079 将实施例7中冻干的3批次疫苗于2-8进行长期保存， 分别在保存第3、 6、 9、 12、 18、 24、 30个月测定疫苗效价， 并以病毒滴度损失1.0Lg作为疫苗的保存终点。 3批次疫苗在 2-8保存30个月病毒含量损失0.7-0.9Lg， 证明本发明所述保护剂及其冻。
36、干程序有效保护 了猪伪狂犬病毒的疫苗效价， 见表3。 0080 表3各批次猪伪狂犬病毒活疫苗的效价比较 0081 0082 实施例9猪伪狂犬活疫苗细菌内毒素试验 0083 依据 中华人民共和国药典 三部检测疫苗的细菌内毒素， 应不高于30EU/头份。 试 验以实施例3-5样品与国药集团的商品苗伪狂宁为对照。 检测结果均合格， 但是实施例3-5 的样品细菌内毒素远低于伪狂宁。 具体结果见表4。 0084 表4疫苗细菌内毒素值测定 说 明 书 7/8 页 9 CN 108938574 A 9 0085 0086 0087 实施例10猪伪狂犬活疫苗安全性检验 0088 根据 兽用生物制品 要求， 试。
37、验选用14日龄无母源抗体的健康仔猪， 将实施例3、 4、 5中制备的猪伪狂犬低毒活疫苗进行10倍剂量肌肉注射， 同时选用商品苗伪狂宁(国药集 团扬州威克生物工程有限公司， 规格： 20头份/瓶， 每头份含量不低于5000TCID50， 批号： 0516003， 生产日期： 20161030， 有效期至20180429)进行肌肉注射。 结果如表6所示， 均无不 良反应。 0089 表6各批次疫苗的不良反应情况 0090 0091 实施例10猪伪狂犬低毒活疫苗免疫效力检验 0092 免疫效力检验选取实施例3冻干耐热活疫苗： PRV耐热活疫苗(本品系用猪伪狂犬 病病毒Bartha K61株接种猪睾丸。
38、细胞-T细胞培养)； 伪狂宁为对照疫苗； 猪伪狂犬病病毒 ELISA抗体检测试剂盒购自武汉科前生物股份有限公司。 从图4抗体测定的水平结果看， 冻 干耐热疫苗在14日龄仔猪的28天抗体水平依然与商品苗抗体水平一致。 0093 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点。 本领域的技术 人员应该了解， 本发明不受上述实施例的限制， 上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理， 在不脱离本发明精神和范围的前提下， 本发明还会有各种变化和改进， 这些变 化和改进都落入权利要求要求保护的本发明范围内。 本发明要求的保护范围由所附的权利 要求书界定。 说 明 书 8/8 页 10 CN 108938574 A 10 图1 图2 图3 说 明 书 附 图 1/2 页 11 CN 108938574 A 11 图4 说 明 书 附 图 2/2 页 12 CN 108938574 A 12 。