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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510235782.1 (22)申请日 2015.05.11 A61K 47/36(2006.01) A61K 9/14(2006.01) A61K 38/19(2006.01) (71)申请人 唐浩 地址 410011 湖南省长沙市芙蓉区人民中路 139 号湘雅二医院心血管外科 (72)发明人 唐浩 王彬 吴忠仕 谭凌 邓登谱 (74)专利代理机构 长沙正奇专利事务所有限责 任公司 43113 代理人 何为 李宇 (54) 发明名称 可负载细胞因子且生理环境下稳定的纳米颗 粒制备方法 (57) 摘要 一种可负载细胞因子且生理环境下。
2、稳定的 纳米颗粒制备方法为， 将低分子肝素溶于去离 子水配制成浓度为 0.05-0.45mg/ml 的低分子 肝素溶液 ； 再将分子量为 4500-5500D， 脱乙酰程 度 90的壳寡糖溶于去离子水配制成浓度为 0.75-1.25mg/ml 的壳寡糖溶液 ； 然后在室温下将 低分子肝素溶液按比例逐滴加入在磁力搅拌器 搅拌下的壳寡糖溶液中， 搅拌参数为 700-800 转 / 分， 使两者充分结合呈微球 ； 搅拌完成后， 利用 1醋酸溶液或者 1氢氧化钠溶液将搅拌后的 壳寡糖 / 肝素悬液的 PH 值滴定至 7.35-7.45 ； 将 超声振荡仪置入滴定好的壳寡糖 / 肝素悬液中进 行超声振荡。
3、， 使微球粒径进一步减小形成纳米颗 粒， 即得。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图6页 CN 106334191 A 2017.01.18 CN 106334191 A 1/1 页 2 1.一种可负载细胞因子且生理环境下稳定的纳米颗粒制备方法， 其特征在于具体包括 步骤为 ： 1) 将低分子肝素溶于去离子水配制成浓度为 0.05-0.45mg/ml 的低分子肝素溶液 ； 2) 将分子量为 4500D-5500D， 脱乙酰程度 90的壳寡糖溶于去离子水配制成浓度为 0.75-1.25mg/ml 的壳寡糖溶液 ； 。
4、3) 在室温 22 -28下将低分子肝素溶液逐滴加入在磁力搅拌器搅拌下的壳寡糖溶 液中， 低分子肝素溶液与壳寡糖溶液混合比例 R 为 5:4R5:2， 或者 4:15R90的壳寡糖溶于去离子水配制成浓度为1.0mg/ ml 的壳寡糖溶液 ； 3) 在室温 22 -28下将低分子肝素溶液逐滴加入在磁力搅拌器搅拌下的壳寡糖溶 液中， 低分子肝素溶液与壳寡糖溶液混合比例 R 为 5:4R5:2， 或者 4:15R1:5， 搅拌参数 为 750 转 / 分， 使两者充分结合呈微球 ； 4)搅拌完成后， 利用1醋酸溶液或者1氢氧化钠溶液将搅拌后的壳寡糖-肝素悬液 的 PH 值滴定至 7.35-7.45 。
5、； 5) 将超声振荡仪置入滴定好的壳寡糖 - 肝素悬液中进行超声振荡， 使微球粒径进一步 减小形成纳米颗粒， 即得壳寡糖 - 肝素纳米颗粒。 权 利 要 求 书 CN 106334191 A 2 1/4 页 3 可负载细胞因子且生理环境下稳定的纳米颗粒制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种可负载细胞因子的纳米生物材料， 特别是一种可负载细胞因子且 生理环境下稳定的纳米颗粒制备方法。 背景技术 0002 壳聚糖 (chitosan,CS) 化学名称为聚葡萄糖胺 (1-4)-2- 氨基 -B-D 葡萄糖， 是甲 壳素脱乙酰基的产物。由于其具有良好的生物相容性和生物可降解性， 目前广泛应用于生。
6、 物载药材料的研制， 尤其是应用于纳米载药颗粒的的基本材料。肝素作为一种糖胺聚糖广 泛存在于机体内。 SDF-1、 VEGF和NGF等细胞因子已经证实N端具有可与肝素结合的保守 序列， 能与肝素特异性结合， 可以负载于含有肝素成分的纳米颗粒。 而壳聚糖分子链上含有 丰富的自由氨基和阳离子成分， 而肝素是含有负电荷的羧基。 将壳聚糖溶解于含有1醋酸 去离子水溶液中， 通过 5的 NaOH 调节 pH， 使溶液 pH 为 5 左右。随后在磁力搅拌器搅拌时 逐滴加入低分子肝素钠溶液。 通过调整壳聚糖和肝素的浓度以及体积比能够构建出不同粒 径参数的纳米微粒。目前已经有通过自组装的方法构建出可装载 VE。
7、GF 的壳聚糖 / 肝素纳 米颗粒， 研究显示了良好的载药性能， 并能一定程度上促进生物基质材料的体内再生。 但是 由于壳聚糖只能溶于酸性液体 (pH90 的壳寡糖溶于去离子水配制成浓度为 0.75-1.25mg/ml 的壳寡糖溶液 ； 3) 在室温下将低分 子肝素溶液逐滴加入在磁力搅拌器搅拌下的壳寡糖溶液中， 低分子肝素溶液与壳寡糖溶液 混合比例R为5:4R5:2， 或者4:15R1:5搅拌参数为700-800转/分， 使两者充分结合呈 微球 ； 4) 搅拌完成后， 利用 1醋酸溶液或者 1氢氧化钠溶液将搅拌后的壳寡糖 / 肝素悬 液的PH值滴定至7.35-7.45 ； 5)将超声振荡仪置入。
8、滴定好的壳寡糖/肝素悬液中进行超声 振荡(参数 ： 500-700w， 持续2-6s， 间隔1-5s， 8-12个周期)， 使微球粒径进一步减小形成纳 米颗粒， 即得壳寡糖 - 肝素纳米颗粒。 说 明 书 CN 106334191 A 3 2/4 页 4 0005 壳聚糖 - 肝素纳米颗粒需要先通过交联剂附着于血管支架上才能进行在体实验 研究。而壳寡糖作为低聚的壳聚糖， 具有较好的溶解度， 能够直接溶于生理 pH 溶液中， 发明 人在背景技术研究的基础上做了进一步的改进， 通过调整配方， 增加超声振荡处理， 采用壳 寡糖和低分子肝素构建新型的壳寡糖 - 肝素纳米颗粒， 使其能够稳定存在于生理溶。
9、液中， 这极大的增加了壳寡糖 - 肝素纳米颗粒的生物相容性。 0006 与现有技术相比， 本发明所具有的有益效果为 ： 本发明构建出的壳寡糖 / 肝素纳 米颗粒不仅具有较好的粒径参数以及形貌 ( 表 1， 图 2)， 并且能够稳定存在于 7.35-7.45 的 pH 溶液中， 这使得壳寡糖 / 肝素纳米颗粒具有更好的生物相容性。因此壳寡糖 / 肝素纳米 颗粒可以直接负载所需的药物(如细胞因子、 抗生素， 见图3)后直接注入目标组织， 更好的 发挥药物的生理功能。 附图说明 0007 图 1 为本发明壳寡糖 / 肝素纳米颗粒制备流程图。 0008 图 2 为实施例组 3 的纳米颗粒的粒度分布图。。
10、 0009 图 3 为实施例组 3 的纳米颗粒在电镜下的形貌图 (B-D)。 0010 图 4 为本发明壳寡糖 - 肝素纳米颗粒负载细胞因子示意图。 0011 图 5A 为间充质干细胞 (MSC) 迁移实验示意图。 0012 图 5B 显示在图 5A 的下室添加负载不同浓度的 SDF-1 的纳米颗粒与 SDF-1 溶 液后， 进行 24 小时的细胞迁移实验后， 细胞迁移数目的比较 ； 0013 图 5C、 图 5D 显示将纯纳米颗粒 (NP)、 将 10ng/ml 的 SDF-1 溶液以及负载 10ng/ml 的 SDF-1 的纳米颗粒添加到图 5A 的下室后， 分别进行迁移实验 12、 24。
11、、 36 小时， 比较各组诱 导细胞迁移的数目 ( 放大倍数 ： 100， *P0.05,*P0.01) 由结果可知， 负载于纳米颗粒 后， SDF-1不仅可以保持诱导细胞迁移的活性， 还能使SDF-1发挥更好的趋化性能， 36h细胞 迁移数目高于 SDF-1 组。 0014 图 6A 表示不同浓度的 VEGF 促进内皮细胞生殖的作用比较。 0015 图 6B 表示负载不同浓度的 VEGF 的纳米颗粒与不同浓度的 VEGF 溶液促进内皮细 胞生殖的作用比较。 0016 图7A、 图7B表示负载于纳米颗粒的VEGF与纯VEGF溶液在小鼠体内消散速度比较 (*P0.05,*P90的壳寡糖溶于去离子。
12、水配制成 浓度为 1.0mg/ml 的壳寡糖溶液 ； 3) 在室温下按表 1 所示的不同比例关系分别将低分子肝 素溶液逐滴加入在磁力搅拌器搅拌下的壳寡糖溶液中， 形成组 1、 组 2、 组 3、 组 4， 搅拌参数 均为 750 转 / 分， 使各组低分子肝素溶液和壳寡糖溶液充分结合呈微球 ； 4) 搅拌完成后， 利 用 1醋酸溶液或者 1氢氧化钠溶液将搅拌后的壳寡糖 / 肝素悬液滴定至 7.35-7.45 ； 5) 将超声振荡仪置入滴定好的壳寡糖 - 肝素悬液中进行超声振荡 ( 参数 ： 400-600w， 持续 3s， 间隔2s， 10个周期)， 使微球粒径进一步减小形成纳米颗粒， 即得壳。
13、寡糖/肝素纳米颗粒， 如 说 明 书 CN 106334191 A 4 3/4 页 5 图 4 所示。通过粒度分析仪和透射电镜对制备好的纳米颗粒进行表征， 表征参数详见表 1、 图 2、 图 3。 0018 表 1 壳寡糖 / 肝素纳米颗粒的配比以及粒径参数 0019 0020 注 ： CSO， 壳寡糖 ； heparin， 肝素 ； PDI， 多分散系数 0021 壳寡糖 / 肝素纳米颗粒由于生物相容性更好， 因此可以不需要交联剂附着于支架 材料上即可直接进行实验研究和在体应用。发明人的研究已经证明壳寡糖 - 肝素纳米颗粒 能够高效负载细胞因子 (SDF-1 和 VEGF)， 详见表 2。 。
14、0022 表 2 各组纳米颗粒 SDF-1 和 VEGF 的封装率 (EE) 0023 0024 由表 2 可知， 组 1- 组 4 的封装率都非常高， 封装率越高载药能力越强， 而实际应用 中细胞因子的需求远低于表 2 中的负载量。由此可见， 本发明制备的壳寡糖 - 肝素纳米颗 粒能够高效负载细胞因子。 0025 另外， 发明人通过如图 5A 所示的间充质干细胞 (MSC) 迁移实验 ( 将间充质干细胞 MSC 接种于容器上室， 将纳米颗粒 NP、 SDF-1 或者负载 SDF-1 的纳米颗粒添加到容器下室， 中间用聚碳酸酯膜隔开 ) 证明了壳寡糖 - 肝素纳米颗粒所负载的 SDF-1 子能。
15、够有效地发挥 其诱导干细胞迁移的生理活性 ( 如图 5B- 图 5D) ； 通过脐静脉内皮细胞增殖实验证明了壳 寡糖 / 肝素纳米颗粒所负载的 VEGF 能够有效的发挥其促进内皮细胞增殖的生理活性 ( 如 说 明 书 CN 106334191 A 5 4/4 页 6 图 6A、 图 6B)。图 6A 表示不同浓度的 VEGF 促进内皮细胞生殖的作用比较。图 6A 中内皮细 胞添加剂包括各种细胞因子以及其他添加物， 是最强的促进内皮细胞增殖的添加剂， 在此 作为背景参考。图 6B 表示负载不同浓度的 VEGF 的纳米颗粒与不同浓度的 VEGF 溶液促进 内皮细胞生殖的作用比较。 0026 为了证。
16、明本发明制备的壳寡糖 - 肝素纳米颗粒具有更好的使细胞因子局限于靶 位的效果， 发明人进行了荧光分子成像实验。发明人分别将 100ul 的 CY5 荧光标记的 VEGF 和 100ul， cy5 标记的 VEGF 负载于壳寡糖 - 肝素纳米颗粒后， 注入小鼠背部皮下后， 利用荧 光分子成像(FMT)系统分别在不同时间点观察荧光的消散速度， 以此观察两组VEGF在局部 停留的时间， 从结果可知， 负载于壳寡糖 - 肝素纳米颗粒后， VEGF 消散速度明显慢于对照组 ( 如图 7A、 图 7B 所示 )， 很明显， 这样更有利于细胞因子在局部更好的发挥。 说 明 书 CN 106334191 A 6 1/6 页 7 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 106334191 A 7 2/6 页 8 图 4 图 5A 说 明 书 附 图 CN 106334191 A 8 3/6 页 9 图 5B 图 5C 说 明 书 附 图 CN 106334191 A 9 4/6 页 10 图 5D 图 6A 说 明 书 附 图 CN 106334191 A 10 5/6 页 11 图 6B 图 7A 说 明 书 附 图 CN 106334191 A 11 6/6 页 12 图 7B 说 明 书 附 图 CN 106334191 A 12 。