一种包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102370987 B (45)授权公告日 2013.05.29 CN 102370987 B *CN102370987B* (21)申请号 201010263759.0 (22)申请日 2010.08.26 A61K 45/00(2006.01) A61K 9/127(2006.01) A61K 38/19(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61K 47/34(2006.01) A61K 47/32(2006.01) A61K 47/36(2006.01) A61K 47/26(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (7。

2、3)专利权人 复旦大学 地址 200433 上海市杨浦区邯郸路 220 号 (72)发明人 郭良然 蒋新国 范丽 (74)专利代理机构 上海元一成知识产权代理事 务所 ( 普通合伙 ) 31268 代理人 吴桂琴 CN 1417229 A,2003.05.14, 权利要求 1-10. CN 1448405 A,2003.10.15, 说明书第 1-6 页 . Takuji Naka， Kenji Sugamura et al Effects of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand alone and in combi。

3、nation with chemotherapeutic agents on patients colon tumors grown in SCID mice.CANCER RESEARCH .2002,( 第 62 期 ), 第 5800-5805 页 . Jun-qiang TIAN,Zhi-ping Wang,et alIN VITRO ENHANCED CYTOTOXICITY OF TUMOR-INFILTRATING LYMPHOCYTES TRANSFECTED WITH TUMOR NECROSIS FACTOR-RELATED APOPTOSIS-INDUCING LIGAN。

4、D AND/OR INTERLEUKIN-2 GENE IN HUMAN RENAL CELL CARCINOMA. UROLOGY .2006, 第 67 卷 ( 第 5 期 ), 第 1093-1097 页 . (54) 发明名称 一种包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体 (57) 摘要 本发明属药物制剂领域， 涉及一种包载抗肿 瘤药物组合物的注射用脂质体。本发明以脂质体 同时包载凋亡素和化疗药物， 利用脂质体对药物 的保护作用提高凋亡素的稳定性 ； 利用脂质体的 长循环作用， 显著延长凋亡素和化疗药物的体内 滞留时间 ； 利用脂质体对于肿瘤的增强渗透和滞 留效应， 使更多凋亡素和化疗药物被。

5、动靶向而浓 集于肿瘤组织 ； 利用凋亡素和化疗药物不同的抗 肿瘤机理， 发挥强力的协同作用， 提高对于肿瘤的 治疗效果， 降低药物的毒副作用。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 陈卫星 权利要求书 3 页 说明书 15 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书3页 说明书15页 附图2页 (10)授权公告号 CN 102370987 B CN 102370987 B *CN102370987B* 1/3 页 2 1. 一种包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体， 其特征在于， 所述制剂由长循环脂质 体、 凋亡素、 抗肿瘤化学药物及药剂学上。

6、必要的辅料制成， 其中长循环脂质体、 凋亡素、 抗肿 瘤化学药物和辅料所占的质量比分别为8599.97%、 0.0110%、 0.0114%、 0.011% ； 所述的注射用脂质体是以脂质体为药物载体同时包载凋亡素和抗肿瘤化学药物， 或以 脂质体分别包载凋亡素和抗肿瘤化学药物后， 再将两种脂质体以一定比例混合均匀 ； 所述的注射用脂质体所包载的凋亡素和抗肿瘤化学药物的质量比均为 200 ： 1 40000 ； 所述的长循环脂质体是以磷脂、 胆固醇、 长循环辅料和必要的辅料为材料制成的脂 质双分子囊泡， 其中， 所述的长循环辅料选自聚乙二醇 - 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、 聚乙二 醇-二棕榈酰磷脂酰。

7、胆碱、 聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、 神经节苷脂、 聚丙烯酰胺、 壳 聚糖、 聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯醇 ； 所述的必要的辅料选自抗氧化剂， 包括维生素 E、 维生 素C、 反丁烯二酸、 苹果酸、 没食子酸丙酯、 亚硫酸氢钠和偏亚硫酸氢钠、 L-半胱氨酸或L-异 亮氨酸 ； 所述的抗肿瘤化学药物选自阿霉素、 盐酸阿霉素、 紫杉醇、 多烯紫杉醇、 喜树碱、 羟基喜 树碱、 长春碱、 长春新碱、 长春地辛、 长春瑞宾、 顺铂、 卡铂或放线菌素 D。 2. 根据权利要求 1 所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体， 其特征在于， 所述 的凋亡素选自人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体、 重组人凋亡素 。

8、2 配体或表达 TRAIL 或 Apo2-L 的基因。 3. 根据权利要求 2 所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体， 其特征在于， 所述 的 TRAIL 全分子由 281 个氨基酸组成， 分子量约为 32000 道尔顿， 其 N- 末端第 15 40 位 氨基酸为疏水区域形成的跨膜结构， N- 末端第 95 281 位或 114 281 位氨基酸组成的 C- 末端胞外区域为亲水性区域 ； TRAIL 的活性形式为胞外亲水性区域与锌离子络合形成的 同源三聚体 ； 所述的 Apo2-L 是由工程菌重组表达产生的 TRAIL 全分子的 N- 末端第 95 281 位或 第 114 281 位氨。

9、基酸所形成的亲水性蛋白分子， 或是 N- 末端第 95 与 114 位之间任何一 位氨基酸到第 281 位氨基酸所形成的亲水性蛋白分子。 4. 根据权利要求 2 所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体， 其特征在于， 所述 的表达 TRAIL 或 Apo2-L 的基因通过工程菌表达 TRAIL 全分子或 Apo2-L。 5. 根据权利要求 1 所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体， 其特征在于， 所述 的凋亡素被包载后， 每次凋亡素的给药剂量为 10 5000g/kg， 给药方案为每天给药或间 隔给药， 每一疗程的给药剂量为 0.14 70mg/kg。 6. 根据权利要求 1 所述的包载。

10、抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体， 其特征在于， 所述 的凋亡素被包载后， 每次凋亡素的给药剂量为 50 1000g/kg ； 给药方案为每天给药或间 隔给药， 每一疗程的给药剂量为 0.7 14mg/kg。 7. 根据权利要求 1 所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体， 其特征在于， 所述 的抗肿瘤化学药物中， 阿霉素和盐酸阿霉素的给药剂量为 0.5 4.0mg/kg， 紫杉醇和多烯 紫杉醇的给药剂量为 2.0 10.0mg/kg， 喜树碱和羟基喜树碱的给药剂量为 0.1 1.0mg/ kg， 长春碱的给药剂量为 0.05 0.4mg/kg， 长春新碱的给药剂量为 5.0 100.0g/k。

11、g， 长 春地辛的给药剂量为 0.05 0.4mg/kg， 长春瑞宾的给药剂量为 0.2 2.0mg/kg， 顺铂的给 权 利 要 求 书 CN 102370987 B 2 2/3 页 3 药剂量为 1.0 20.0mg/kg， 卡铂的给药剂量为 1.0 20.0mg/kg， 放线菌素 D 的给药剂量 为 1.0 10.0g/kg。 8. 根据权利要求 1 所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体， 其特征在于， 所述 的抗肿瘤化学药物中， 阿霉素和盐酸阿霉素的给药剂量为 1.0 2.5mg/kg ； 紫杉醇和多烯 紫杉醇的给药剂量为3.06.0mg/kg ； 喜树碱和羟基喜树碱的给药剂量为0。

12、.1250.4mg/ kg ； 长春碱的给药剂量为 0.1 0.2mg/kg ； 长春新碱的给药剂量为 20.0 60.0g/kg ； 长 春地辛的给药剂量为0.060.2mg/kg ； 长春瑞宾的给药剂量为0.51.5mg/kg ； 顺铂的给 药剂量为 2.5 12.0mg/kg ； 卡铂的给药剂量为 1.5 12.0mg/kg ； 放线菌素 D 的给药剂量 为 2.0 7.0g/kg。 9. 根据权利要求 1 所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体， 其特征在于， 所述 的磷脂是蛋黄卵磷脂、 大豆磷脂、 氢化豆磷脂、 二月桂酰卵磷脂、 二硬脂酰卵磷脂、 1- 肉豆蔻 酰-2-棕榈酰卵磷脂。

13、、 1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰卵磷脂、 1-棕榈酰-2-硬脂酰卵磷脂、 1-硬脂 酰 -2- 棕榈酰卵磷脂、 二油酰基卵磷脂、 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、 二棕榈酰甘油、 二棕榈酰 磷脂酸、 二棕榈酰神经鞘磷脂、 二棕榈酰卵磷脂、 二棕榈酰磷脂酰二丝氨酸、 二月桂酰磷脂 酰甘油、 二油酰磷脂酰甘油、 二肉豆蔻酰磷脂酸、 二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、 脑磷脂酰丝氨 酸、 二肉豆蔻酰卵磷脂、 二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、 脑神经鞘磷脂、 二硬脂酰磷脂酰甘油、 二 硬脂酰神经鞘磷脂或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种或多种。 10. 根据权利要求 1 所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体， 其特征在于， 所述 的磷。

14、脂是蛋黄卵磷脂、 大豆磷脂和氢化豆磷脂。 11. 根据权利要求 1 所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体， 其特征在于， 所选 用的磷脂在脂质体中所占的质量比为 40 99.5%。 12. 根据权利要求 1 所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体， 其特征在于， 所选 用的磷脂在脂质体中所占的质量比为 49 90%。 13. 根据权利要求 1 所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体， 其特征在于， 所述 的长循环辅料是聚乙二醇 - 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。 14. 根据权利要求 13 所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体， 其特征在于， 所 述的聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺在脂质体。

15、中所占的质量比为125%， 聚乙二醇-二 硬脂酰磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量为 1000 4000。 15. 根据权利要求 13 所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体， 其特征在于， 所 述的聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺在脂质体中所占的质量比为315% ； 聚乙二醇-二 硬脂酰磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量为 1000 4000。 16. 根据权利要求 1 所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体， 其特征在于， 所述 的必要的辅料为维生素 C、 维生素 E 或亚硫酸氢钠。 17. 根据权利要求 1 所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体， 其特征在于， 所述 的脂质体以水、 磷酸盐。

16、缓冲液、 Tris 缓冲液、 碳酸盐缓冲液、 5葡萄糖溶液或生理盐水为分 散介质。 18. 根据权利要求 1 所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体， 其特征在于， 所述 的脂质体采用薄膜分散法或逆向蒸发法制备， 并采用超声或高压均质控制粒径。 19. 根据权利要求 1 所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体， 其特征在于， 所述 权 利 要 求 书 CN 102370987 B 3 3/3 页 4 的脂质体通过静脉、 皮下、 肌内、 膜内、 腹膜内或其它静脉途径给药。 20. 权利要求 1 所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体在制备治疗人肺癌、 乳 腺癌、 卵巢癌、 脑胶质瘤、 肝癌。

17、、 胰腺导管癌或肠癌药物中的用途。 权 利 要 求 书 CN 102370987 B 4 1/15 页 5 一种包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体 技术领域 0001 本发明属药物制剂领域， 涉及一种包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体。本发 明的注射用脂质体同时包载抗肿瘤蛋白 （基因） 药物凋亡素和抗肿瘤化学药物， 将药物靶向 递送至肿瘤组织， 通过药物不同的作用机理和协同作用， 提高肿瘤治疗效果， 降低药物的毒 副作用。 背景技术 0002 恶性肿瘤是人类最难对付的顽症之一。 近年来， 肿瘤的发病率急剧上升， 其治疗难 度大、 死亡率高， 己成为人类死亡的第二大病因。据报道， 全世界每年约有。

18、 600 万人死于恶 性肿瘤 ； 中国癌症患者约 450 万人， 死亡率逾 30， 已成为严重的社会问题。目前， 临床上 常采用的治疗恶性肿瘤的手段包括手术、 化疗及放疗等。 对于早期肿瘤， 手术切除辅以其它 疗法往往可取得较好的治疗效果 ； 而对于晚期肿瘤， 多以放、 化疗综合治疗以延缓病情的发 展， 但均伴随严重的免疫系统抑制或毒副作用， 难以有效提高患者的生存率和生活质量。 因 而， 探寻疗效好、 不良反应较小的治疗手段或药物一直是肿瘤治疗的研究热点和努力方向。 0003 作为肿瘤坏死因子超家族的一员， 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 （TNF related apoptosis indu。

19、cing ligand， TRAIL） 近年来受到诸多研究者和制药公司的关注。现有技 术公开了 TRAIL 全分子由 281 个氨基酸组成， 分子量约为 32000 道尔顿， 其 N- 末端第 15 40 位氨基酸为疏水区域形成的跨膜结构， N- 末端第 95 281 位或 114 281 位氨基酸组 成的 C- 末端胞外区域为亲水性区域。TRAIL 的活性形式为胞外亲水性区域与锌离子络合 形成的同源三聚体。与其他肿瘤坏死因子或化疗药物相比， TRAIL 可快速启动细胞凋亡信 号途径， 强力、 广谱诱导肿瘤和转化细胞凋亡， 对正常组织细胞则基本无影响。 有研究显示， 随着TRAIL浓度的增加，。

20、 其对人胶质瘤U87细胞的诱导凋亡作用明显增强， 对正常细胞基本 无杀伤作用 （参见 Henning Walczak 等， Nat Med， 2002， 8 ： 808-815） 。TRAIL 的这一优点使 其在肿瘤治疗方面有着广阔的应用前景。由美国 Gentech 和 Immunex 公司联合研制开发的 TRAIL 已于 2001 年经 FDA 批准进入 I 期临床研究。基于 TRAIL 的潜在应用优势， 国内外已 有研究者通过生物工程技术， 利用工程菌重组表达产生 TRAIL 全分子 N- 末端第 95 281 位或第 114 281 位氨基酸所形成的亲水性蛋白分子， 称之为重组人凋亡素 。

21、2 配体。 0004 本发明下文中统称人 TRAIL 全分子、 重组人凋亡素 2 配体或表达上述 2 种蛋白的 基因为凋亡素。 0005 尽管凋亡素在抗肿瘤方面有着诸多优势， 但治疗实践显示其仍存在以下缺陷 ： 某些肿瘤细胞对凋亡素不敏感。本发明在前期研究中发现， 凋亡素对某些神经胶质瘤和黑 色素瘤细胞株基本无杀伤作用， 这一结果极大限制了凋亡素的临床应用范围 ； 半衰期很 短 （人体的 T1/2 0.6 h） ， 凋亡素进入体循环后和肿瘤细胞没有充分的作用时间， 疗效持续 时间短， 需要频繁给药 ； 组织分布广泛， 对肿瘤细胞无靶向治疗作用， 一定程度上减弱了 其抗肿瘤效果。 0006 目前。

22、尚未有相关专利或文献报道能够同时克服上述缺陷， 即在增强肿瘤细胞对凋 说 明 书 CN 102370987 B 5 2/15 页 6 亡素敏感性的同时增加凋亡素的体内滞留时间， 提高其抗肿瘤效果。例如， 美国专利 “Use of TRAIL Polypeptides to Treat Cancer” （专利申请号为 496632） ，“DNA encoding a cytokine that induces apoptosis” （专利号为 08/5763223） ，“Cytokine that induces apoptosis” （专利号为 6284236） ，“Use of TRAIL 。

23、polypeptides to induce apoptosis” （专利号为 7736637） ； 中国专利 “人截短型重组可溶性 TRAIL-180 蛋白及其在制备肿瘤治疗 药物中的应用” （专利申请号为 02116262.X） ，“人截短型重组可溶性 TRAIL-170 蛋白及其 在制备肿瘤治疗药物中的应用” （专利申请号为 02116263.8） ，“重组人可溶性 TRAIL 蛋白、 其制备方法及其应用” （专利申请号为 02148672.7） ，“一种重组人可溶性凋亡素 2 配体的 构建与纯化工艺” （专利申请号为 01144948.9） ，“新型肿瘤凋亡素 2 配体基因、 其表达的。

24、肿 瘤凋亡素及其制法” （专利申请号为 02110880.3） ，“人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突 变蛋白、 其制法及其药物组合物” （专利申请号为 01132158.X） 等。上述专利主要涉及凋亡 素的制备、 纯化工艺及其抗肿瘤作用的初步研究。少量文献报道凋亡素与化疗药物合用可 增加其对肿瘤细胞的治疗效果 （参见 Naka T 等， Cancer Res， 2002， 62 ： 5800-5906 ； Heather Wahl 等， Gynecol Oncol， 2007， 105 ： 104-112 ； Thomas J 等， Cancer Immunol Immun， 2006， 55。

25、 ： 76-84） 。联合用药虽然提高了凋亡素对肿瘤细胞的杀伤作用， 但增加的效率有限， 且凋 亡素体内滞留时间短的问题仍无法解决。 0007 凋亡素作为一种蛋白 （基因） 药物， 亲水性强、 稳定性极差， 以脂质体包载时存在包 封率低， 易泄露， 活性难以保持等缺点。目前， 尚未见有效地以脂质体包载凋亡素的文献报 道。 发明内容 0008 本发明的目的是克服现有技术的缺陷， 提供一种新的包载抗肿瘤药物组合物的注 射用脂质体， 特别是一种同时包载抗肿瘤蛋白 （基因） 药物凋亡素和抗肿瘤化学药物， 且能 提高肿瘤治疗效果， 降低毒副作用的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体。 0009 本发明以脂。

26、质体同时包载凋亡素和化疗药物， 利用脂质体对药物的保护作用提高 凋亡素的稳定性 ； 利用脂质体的长循环作用， 延长凋亡素和化疗药物的体内滞留时间 ； 利 用脂质体对于肿瘤的增强渗透和滞留效应 （EPR 效应） ， 使更多凋亡素和化疗药物被动靶向 而浓集于肿瘤组织 ； 利用凋亡素和化疗药物不同的抗肿瘤机理， 发挥强力的协同作用， 提高 对于肿瘤的治疗效果， 降低药物的毒副作用。 0010 本发明在制备技术上解决了现有技术存在的技术难点， 以聚乙二醇修饰的脂质体 包载凋亡素， 通过调节处方和工艺使得脂质体对凋亡素有较高的包封率， 并保持凋亡素的 活性。本发明注射用脂质体经实验， 结果显示， 所述的。

27、凋亡素被脂质体包载后， 其体内循环 时间显著延长。 0011 具体而言， 本发明的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质采用具有长循环特性和 肿瘤被动靶向功能的脂质体为载体， 同时包载抗肿瘤蛋白 （基因） 药物凋亡素和抗肿瘤化学 药物紫杉醇、 多烯紫杉醇、 阿霉素等， 将药物靶向递送至肿瘤组织， 通过两类药物不同的作 用机理和强力的协同抗肿瘤作用， 提高肿瘤治疗效果， 降低药物的毒副作用。 0012 本发明制剂由长循环脂质体、 凋亡素、 抗肿瘤化学药物及药剂学上必要的辅料 制成， 其中脂质体、 凋亡素、 抗肿瘤化学药物和辅料所占的质量比分别为 85 99.97 %， 说 明 书 CN 1023709。

28、87 B 6 3/15 页 7 0.01 10 %， 0.01 14 %， 0.01 1 %。所述的注射用脂质体是以脂质体同时包载凋亡素 和抗肿瘤化学药物， 或以脂质体分别包载凋亡素或抗肿瘤化学药物后， 再将两种脂质体以 一定比例均匀混合制得 ； 本发明注射用脂质体所包载的凋亡素和抗肿瘤化学药物的质量比 均为 200 ： 1 40000。 0013 所述的长循环脂质体以磷脂、 胆固醇、 长循环辅料和必要的制剂辅料为材料制成 的脂质双分子囊泡。 0014 所述的磷脂可以是蛋黄卵磷脂 （EPC） 、 大豆磷脂 （SPC） 、 氢化豆磷脂 （HSPC） 、 二月 桂酰卵磷脂 （DLPC） 、 二硬脂。

29、酰卵磷脂 （DSPC） 、 1- 肉豆蔻酰 -2- 棕榈酰卵磷脂 （MPPC） 、 1- 棕 榈酰 -2- 肉豆蔻酰卵磷脂 （PMPC） 、 1- 棕榈酰 -2- 硬脂酰卵磷脂 （PSPC） 、 1- 硬脂酰 -2- 棕榈 酰卵磷脂 （SPPC） 、 二油酰基卵磷脂 （DOPC） 、 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺 （DPPE） 、 二棕榈酰甘油 （DPPG） 、 二棕榈酰磷脂酸 （DPPA） 、 二棕榈酰神经鞘磷脂 （DPSP） 、 二棕榈酰卵磷脂 （DPPC） 、 二 棕榈酰磷脂酰二丝氨酸 （DPPS） 、 二月桂酰磷脂酰甘油 （DLPG） 、 二油酰磷脂酰甘油 （DOPG） 、 二肉豆蔻酰磷脂酸 。

30、（DMPA） 、 二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺 （DMPE） 、 脑磷脂酰丝氨酸 （PS） 、 二肉 豆蔻酰卵磷脂 （DMPC） 、 二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸 （DMPS） 、 脑神经鞘磷脂 （BSP） 、 二硬脂酰磷 脂酰甘油 （DSPG） 、 二硬脂酰神经鞘磷脂 （DSSP） 或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 （DSPE） 中的一种 或多种。其中优选 EPC、 SPC 和 HSPC。所选用的磷脂占脂质体的质量比为 40 99.5%， 优选 的比例为 49 90%。 0015 本发明所述的长循环辅料包括聚乙二醇 - 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 （PEG-DSPE） 、 聚 乙二醇 - 二棕榈酰磷脂酰胆碱、 聚乙二醇。

31、 - 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、 神经节苷脂、 聚丙烯酰 胺、 壳聚糖、 聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯醇。其中， 优选 PEG-DSPE ； PEG-DSPE 中 PEG 的分子量 范围为 800 5000， 优选的 PEG 分子量范围为 1000 4000。 。 0016 所述的的 PEG-DSPE 所占脂质体的质量比为 1 25%， 优选的比例为 3 15% ； 0017 本发明所述的必要辅料主要为抗氧化剂如维生素 E、 维生素 C、 反丁烯二酸、 苹果 酸、 没食子酸丙酯、 亚硫酸氢钠和偏亚硫酸氢钠、 L- 半胱氨酸和 L- 异亮氨酸。其中， 优选维 生素 E、 维生素 C 和亚硫酸氢钠。 001。

32、8 所述的凋亡素包括人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 （TNF-related apoptosis inducing ligand， TRAIL） 、 重组人凋亡素 2 配体 （Recombinant Human Apo-2 ligand， Apo2-L） 和表达 TRAIL 或 Apo2-L 的基因。 0019 其中， TRAIL 全分子由 281 个氨基酸组成， 分子量约为 32000 道尔顿， 其 N- 末端第 15 40 位氨基酸为疏水区域形成的跨膜结构， N- 末端第 95 281 位或 114 281 位氨 基酸组成的 C- 末端胞外区域为亲水性区域。TRAIL 的活性形式为胞外亲水。

33、性区域与锌离 子络合形成的同源三聚体。Apo2-L 是由工程菌重组表达产生的 TRAIL 全分子的 N- 末端第 95 281 位或第 114 281 位氨基酸所形成的亲水性蛋白分子， 也可以是 N- 末端第 95 与 114位之间任何一位氨基酸到第281位氨基酸所形成的亲水性蛋白分子。 所述的表达TRAIL 或 Apo2-L 的基因可以通过工程菌表达 TRAIl 全分子或 Apo2-L。 0020 上述凋亡素被包载后， 每次的凋亡素给药剂量为 10 5000 g/kg， 优选的每次 给药剂量为 50 1000 g/kg ； 给药方案为每天给药或间隔给药， 每一疗程给药剂量为 0.14 70 。

34、mg/kg， 优选的每一疗程的给药剂量为 0.7 14 mg/kg。 0021 本发明所述的抗肿瘤化学药物包括阿霉素、 盐酸阿霉素、 紫杉醇、 多烯紫杉醇、 说 明 书 CN 102370987 B 7 4/15 页 8 喜树碱、 羟基喜树碱、 长春碱、 长春新碱、 长春地辛、 长春瑞宾、 卡氮芥、 卡铂、 顺铂、 环磷酰 胺、 放线菌素 D、 博来霉素、 柔红霉素、 正定霉素、 丝裂霉素、 阿克拉霉素、 干扰素、 甲氨蝶呤、 5- 氟尿嘧啶、 龟臼乙叉甙、 三本氧胺、 舒尼替尼、 阿糖胞苷等。其中优选的药物为阿霉素、 盐 酸阿霉素、 紫杉醇、 多烯紫杉醇、 喜树碱、 羟基喜树碱、 长春碱、 。

35、长春新碱、 长春地辛、 长春瑞 宾、 卡铂、 顺铂和放线菌素 D。 0022 本发明所述的阿霉素和盐酸阿霉素的每次给药剂量为 0.5 4 mg/kg， 优选的给 药剂量为1.02.5 mg/kg ； 所述的紫杉醇和多烯紫杉醇的给药剂量为210 mg/kg， 优选 的给药剂量为3.06.0 mg/kg ； 所述的喜树碱和羟基喜树碱的给药剂量为0.11.0 mg/ kg， 优选的给药剂量为 0.125 0.4 mg/kg ； 所述的长春碱的给药剂量为 0.05 0.4 mg/ kg， 优选的给药剂量为 0.1 0.2 mg/kg ； 所述的长春新碱的给药剂量为 5 100 g/kg， 优选的给药剂。

36、量为 20 60 g/kg ； 所述的长春地辛的给药剂量为 0.05 0.4 mg/kg， 优 选的给药剂量为0.060.2 mg/kg ； 所述的长春瑞宾的给药剂量为0.22.0 mg/kg， 优选 的给药剂量为 0.5 1.5 mg/kg ； 所述的顺铂的给药剂量为 2.0 20 mg/kg， 优选的给药 剂量为 2.5 12.0 mg/kg ； 所述的卡铂的给药剂量为 1.0 20 mg/kg， 优选的给药剂量为 1.5 12.0 mg/kg ； 所述的放线菌素 D 的给药剂量为 1.0 10 g/kg， 优选的给药剂量为 2 7 g/kg。 0023 本发明采用薄膜分散法或逆向蒸发法制。

37、备注射用脂质体， 并用超声或高压均质控 制粒径。 0024 本发明所述的注射用脂质体， 可以是静脉、 皮下、 肌内、 膜内、 腹膜内或其它途径的 注射给药。 0025 本发明所述的注射用脂质体对人肺癌、 乳腺癌、 卵巢癌、 脑胶质瘤、 肝癌、 胰腺导管 癌、 肠癌等的治疗效果均优于单独用药或非脂质体制剂 （如实施例 6 13 所述） 。 0026 本发明注射用脂质体， 通过增强肿瘤细胞对凋亡素的敏感性， 显著延长凋亡素的 稳定性和体内循环时间， 提高其抗肿瘤效果。 本发明避免了临床单用凋亡素注射剂的缺点， 将脂质体制剂的靶向和长循环优势与两种药物协同的治疗优势融合， 具有良好的临床实践 意义。。

38、 0027 本发明的注射用脂质体显著优点有 ： 0028 1） 对凋亡素有较高的包封率和载药能力， 包载后凋亡素的活性保持良好 ； 0029 2） 显著提高了凋亡素在血液中的稳定性和滞留时间， 增加了凋亡素和肿瘤细胞的 作用时间， 利于提高其抗肿瘤效果。 0030 3） 本发明以长循环脂质体作为载体， 同时包载具有很强协同抗肿瘤作用的凋亡素 和抗肿瘤化学药物， 增加了肿瘤细胞对凋亡素的敏感性。 0031 4） 本发明的长循环脂质体可利用肿瘤部位的 EPR 效应， 增加凋亡素和抗肿瘤化学 药物在肿瘤组织的蓄积， 利于发挥两种药物的协同抗肿瘤效果， 降低对其它组织的毒副作 用。 0032 为了便于。

39、理解， 以下将通过具体的附图和实施例对本发明的包载抗肿瘤药物组合 物的注射用脂质体进行详细地描述。 需要特别指出的是， 具体实例和附图仅是为了说明， 显 然本领域的普通技术人员可以根据本文说明， 在本发明的范围内对本发明做出各种各样的 修正和改变， 这些修正和改变也纳入本发明的范围内。 说 明 书 CN 102370987 B 8 5/15 页 9 附图说明 0033 图 1， 各制剂组给药后人肺癌 A549 瘤体体积与时间的关系。 0034 图 2， 各制剂组给药后人乳腺癌 MCF-7 瘤体体积与时间的关系。 0035 图 3， 各制剂组给药后人卵巢癌 SKOV-3 瘤体体积与时间的关系。 。

40、0036 具体的实施方式 0037 实施例 1、 0038 表 1 包载凋亡素和紫杉醇等脂质体处方中各组分的比例 （w/w %） 0039 将表 1 处方 1 30 中的磷脂、 胆固醇等脂溶性辅料和化学药物溶于适量氯仿中， 于 37水 浴中旋转蒸发成膜 ； 加入水溶性辅料和凋亡素的 PBS 溶液充分混合， 冷水浴水化 2 小时， 冰 浴超声震荡 5 分钟， 挤压过 200 nm 聚碳酯膜 5 10 次。将制得的脂质体过 Sephadex G-50 柱， 用 PBS 缓冲液 （pH7.4） 作为流动相洗脱， 收集脂质体部分， 并将收集到的脂质体分装， 加 入 5 倍于脂质质量的葡萄糖或海藻糖， 。

41、然后过 0.22 m 微孔滤膜， 分装， 冷冻干燥即得。 0040 实施例 2、 0041 表 2 包载凋亡素和阿霉素脂质体处方中各组分的比例 （w/w %） 说 明 书 CN 102370987 B 9 6/15 页 10 0042 分别将表2处方130中的脂溶性辅料溶于适量氯仿中， 以适当比例分为两份A和B， 均置 于37水浴中旋转蒸发成A膜和B膜。 A膜以凋亡素的PBS溶液充分混合， 冷水浴水化2小 时， 冰浴超声震荡 5 分钟， 挤压过 200 nm 聚碳酯膜 5 10 次。将制得的脂质体过 Sephadex G-50 柱， 用 PBS 缓冲液 （pH7.4） 作为流动相洗脱， 收集脂。

42、质体部分， 即得包载凋亡素的脂质 体。 0043 B 膜以 120 mM 的硫酸铵溶液于室温水化 2 小时， 超声震荡 5 分钟， 挤压过 200 nm 聚碳酯膜 5 10 次。将制得的脂质过 Sephadex G-50 柱， 用生理盐水作为流动相洗脱， 收 集脂质体部分， 将收集到的脂质体置 60水浴中加热， 加入处方量阿霉素粉末或盐酸阿霉 素溶液并振摇孵育 30 分钟， 得包载阿霉素的脂质体。 0044 将包载凋亡素和阿霉素的脂质体混合均匀， 即得同时包载凋亡素和阿霉素的脂质 体。 0045 实施例 3、 0046 表 3 包载凋亡素和长春瑞宾等脂质体处方中各组分的比例 （w/w %） 说。

43、 明 书 CN 102370987 B 10 7/15 页 11 0047 将表3处方130中的脂溶性成分溶于适量氯仿中， 于37水浴中旋转蒸发成膜， 以pH7.4 PBS溶解水溶性成分后加入磷脂膜中充分混合， 冷水浴水化2小时， 冰浴超声震荡5分钟， 挤 压过 200 nm 聚碳酯膜 5 10 次。将制得的脂质体过 Sephadex G-50 柱， 生理盐水作为流 动相洗脱， 收集脂质体部分， 即得。 0048 实施例 4、 0049 表 4 包载凋亡素和顺铂等脂质体处方中各组分的比例 （w/w %） 说 明 书 CN 102370987 B 11 8/15 页 12 0050 将表4处方1。

44、30中的脂溶性辅料溶于适量氯仿中， 于37水浴中旋转蒸发成膜， 以pH7.4 PBS溶解凋亡素和药物后加入磷脂膜中充分混合， 冷水浴水化2小时， 冰浴超声震荡5分钟， 挤压过 200 nm 聚碳酯膜 5 10 次。将制得的脂质体过 Sephadex G-50 柱， 生理盐水作为 流动相洗脱， 收集脂质体部分， 即得。 0051 实施例 5、 0052 表 5 包载凋亡素和喜树碱等脂质体处方中各组分的比例 （w/w %） 说 明 书 CN 102370987 B 12 9/15 页 13 0053 制备方法同实施例 1。 0054 实施例 6、 包载凋亡素和放线菌素 D 脂质体对肺癌的药效学试验。

45、 0055 肿瘤细胞 ： 人非小细胞肺腺癌细胞株 A549， 用含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养 液培养。 0056 动物 ： Balb-c 裸小鼠， 4 周龄， 雌性。试验组及阴性对照组每组 6 只裸小鼠。 0057 肿瘤细胞的接种 ： 采用右腋皮下接种模型， 无菌条件下取生长旺盛的 A549 细胞， 以匀浆法制备成约 2.0E7/ml 细胞悬液， 于每只裸鼠右腋皮下接种 0.1ml 癌细胞悬液。 0058 抑瘤率的计算及数据处理 ： 给药后每 3 日以游标卡尺测量各组裸小鼠肿瘤的长径 及短径， 根据公式计算肿瘤体积 （肿瘤体积 = 短径 2 长径 /2） 和抑瘤率 （肿瘤抑。

46、制率 =( 阴性对照组平均瘤重给药组平均瘤重） / 阴性对照组平均瘤重 )100 。 0059 给药方案为尾静脉注射， 每天 1 次， 连续 14 天。肿瘤重量等实验结果见表 6， 各制 剂组给药开始后的肿瘤体积变化情况见图 1。 0060 表 6. 包载凋亡素和放线菌素 D 脂质体抗肿瘤疗效试验结果 说 明 书 CN 102370987 B 13 10/15 页 14 0061 *P 值 0.01 与生理盐水组相比 0062 结果显示， 各药物治疗组的肿瘤体积和重量均显著小于生理盐水组 （p 0.01） ， 表明各制剂对 A549 细胞接种的皮下肿瘤均有一定的治疗效果。但相比单用凋亡素或放线。

47、 菌素 D， 两种药物合用对肿瘤具有更强的治疗效果。以临床常用的溶液剂联合给药， 其对肿 瘤的抑制率为 44.2% ； 若以脂质体同时包载两种药物， 其对肿瘤的抑制率达到 70.2%， 两者 具有极显著性差异 （p 0.001） （如图 1 和表 6 所示） 。本发明所制得的脂质体比现有临床 使用的溶液剂具有更好的治疗效果。 0063 实施例 7、 0064 包载凋亡素和盐酸阿霉素脂质体对乳腺癌的药效学试验 0065 肿瘤细胞 ： 人乳腺癌 MCF-7 细胞 （购自中国科学院上海细胞库） ， 用含 10 % 胎牛血 清的 RPMI-1640 培养液培养。 0066 试验所用动物及肿瘤的接种方法。

48、同实施例 6。给药方案见表 7， 肿瘤体积变化情况 见图 2。 0067 表 7. 包载凋亡素和盐酸阿霉素脂质体对乳腺癌的药效学研究给药方案 0068 结果显示， 单用凋亡素脂质体和盐酸阿霉素脂质体对人乳腺癌肿瘤均有一定的治疗效果， 但两种脂质体合用时， 具有强烈的协同抗肿瘤效果 （如图2所示） ， 由肿瘤的体积变化曲线可 以看到， 给予 （凋亡素+盐酸阿霉素） 脂质体后， 乳腺癌瘤体体积的增长速度显著慢于其他制 剂组。对比两组合用药物的制剂组， 可以看出 （凋亡素 + 盐酸阿霉素） 脂质体制剂组比对应 说 明 书 CN 102370987 B 14 11/15 页 15 的溶液剂组具有更高的肿瘤抑制效果。 上述结果表明了本发明脂质体在肿瘤治疗上的优越 性。 0069 实施例 8、 0070 包载凋亡素和阿霉素脂质体对脑胶质瘤的药效学试验 0071 肿瘤细胞 ： 人脑胶质瘤 U87 细胞， 用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液培养。 0072 动物 ： Balb-c 裸小鼠， 4 周龄， 初始体重为 18 20 克， 雌性。试验组及阴性对照组 每组 6 只裸小鼠。 0073 肿瘤细胞的接种 ： 脑部原位接种模型， 无菌条件下取生长旺盛的 U87 细胞， 。