《一种肺靶向性的免疫纳米脂质体及其制备方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种肺靶向性的免疫纳米脂质体及其制备方法.pdf（13页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102370620 A (43)申请公布日 2012.03.14 CN 102370620 A *CN102370620A* (21)申请号 201010263760.3 (22)申请日 2010.08.26 A61K 9/127(2006.01) A61K 31/661(2006.01) A61K 31/573(2006.01) A61K 47/48(2006.01) A61K 47/42(2006.01) A61P 11/00(2006.01) A61P 11/06(2006.01) A61P 9/00(2006.01) (71)申请人 同济大学附属上海市肺科医院。
2、 地址 200433 上海市杨浦区政民路 507 号 (72)发明人 李惠萍 陈学远 (74)专利代理机构 上海元一成知识产权代理事 务所 ( 普通合伙 ) 31268 代理人 吴桂琴 (54) 发明名称 一种肺靶向性的免疫纳米脂质体及其制备方 法 (57) 摘要 本发明属于医药技术领域。涉及一种具有肺 靶向性的免疫脂质体及其制备方法。本发明的免 疫脂质体， 由肺表面活性蛋白 A 多克隆抗体、 药物 活性成分和纳米脂质体组成， 以地塞米松磷酸钠 等糖皮质激素为药物活性成分， 以纳米脂质体为 载体， 以 SP-A 多抗为特异性肺组织靶向剂。本发 明的免疫纳米脂质体具有明确肺靶向性， 且高效、 稳。
3、定的实现药物活性成分对肺部的靶向输送， 使 肺脏中 DXM 峰浓度较常规制剂提高 5.08 倍， 12h 药时曲线下面积提高 40.21 倍。能减少糖皮质激 素用药剂量、 提高对肺部疾病的疗效， 同时减少全 身不良反应， 具有新的临床实用价值。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 3 页 CN 102370620 A1/1 页 2 1. 一种肺靶向性的免疫纳米脂质体， 其特征在于， 由肺表面活性蛋白 A 多抗、 治疗药 物和纳米脂质体组成 ； 其中， 以纳米脂质体为载体， 以肺表面活性蛋白 A 多抗为特异。
4、性肺组 织靶向剂 ； 所述的治疗药物为地塞米松磷酸钠， 其与纳米脂质体中磷脂的比值为 1mg:1 20mol ； 所述的纳米脂质体由磷脂、 胆固醇和脂质体辅料为材料制成 ； 脂质体辅料选自二硬脂 酰磷脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇 2000、 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇 2000- 吡啶基 - 联巯 基 - 丙酸酯 ； 所述的肺表面活性蛋白A多抗与磷脂比例为110g ： 1mol ； 磷脂与胆固醇的摩尔 比为 1.5 4:1 ； 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇 2000 占脂质摩尔量的 4% 15% 。 2. 按权利要求 1 所述的肺靶向性的免疫纳米脂质体， 其特征在于， 所述的治疗药物。
5、还 选自氢化可的松、 泼尼松龙或甲泼尼龙。 3. 按权利要求 1 所述的肺靶向性的地塞米松免疫纳米脂质体， 其特征在于， 所述的磷 脂选自大豆卵磷脂、 蛋黄卵磷脂或二棕榈酰磷脂酰胆碱。 4. 按权利要求 1 所述的肺靶向性的免疫纳米脂质体， 其特征在于， 所述的纳米脂质体 形态呈球形， 大小基本均一 ； 平均粒径为 12838nm ； 纳米脂质体对药物活性成分的包封率 为 92.233.34% 。 5. 权利要求 1 所述的肺靶向性的免疫纳米脂质体的制备方法， 其特征在于， 其包括步 骤 ： 1） 制备地塞米松纳米脂质体 ； 以磷脂、 大豆卵磷脂、 蛋黄卵磷脂或二棕榈酰磷脂酰胆碱、 胆固醇、 。
6、二硬脂酰磷脂酰乙 醇胺 - 聚乙二醇 2000、 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇 2000- 吡啶基 - 联巯基 - 丙酸酯 为原料， 采用薄膜分散法制备地塞米松纳米脂质体 ； 2） 地塞米松纳米脂质体的表征 ： 形态、 粒径、 包封率和稳定性 ； 3) 制备肺表面活性蛋白 A 多抗偶联地塞米松免疫纳米脂质体。 6. 按权利要求 5 的方法， 其特征在于， 步骤 3) 中通过下述步骤制备肺表面活性蛋白 A 多抗偶联地塞米松免疫纳米脂质体 ： 用薄膜分散法制备含二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇 2000- 吡啶基 - 联巯基 - 丙酸 酯的地塞米松纳米脂质体 ； 向肺表面活性蛋白A多抗溶液。
7、中加入N-琥珀酰亚胺-吡啶基-联巯基-丙酸酯乙醇溶 液， 实现抗体的巯基化， 通过二硫苏糖醇使衍生化抗体还原 ； 超滤去除游离二硫苏糖醇 ； 移 取超滤管内抗体溶液， 与含二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇 2000- 吡啶基 - 联巯基 - 丙 酸酯的地塞米松纳米脂质体悬液混合， 室温， 搅拌放置过夜， 制得肺表面活性蛋白 A 多抗偶 联地塞米松免疫纳米脂质体 ； 所述的肺表面活性蛋白 A 多抗与磷脂比例为 1 10g ： 1mol。 7. 权利要求 1 的肺靶向性的免疫纳米脂质体在制备治疗肺部疾病的药物中的用途。 8. 按权利要求 7 的用途， 其特征在于， 所述的肺部疾病是支气管哮喘、 。
8、慢性阻塞性肺疾 病、 间质性肺疾病、 肺血管炎、 急性肺损伤、 急性呼吸窘迫综合征或结节病。 权 利 要 求 书 CN 102370620 A1/8 页 3 一种肺靶向性的免疫纳米脂质体及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于医药技术领域。涉及一种肺靶向性的免疫脂质体， 尤其涉及一种具有 肺靶向性的地塞米松免疫纳米脂质体及其制备方法。 背景技术 0002 现有技术公开了糖皮质激素类药物具有很强的抗炎作用与免疫抑制作用， 已被广 泛应用于全身各系统炎症性和免疫性疾病的治疗。 此类药物也广泛应用于呼吸系统疾病的 治疗， 如支气管哮喘、 慢性阻塞性肺疾病、 间质性肺疾病、 肺血管炎、 急性肺损伤。
9、、 急性呼吸 窘迫综合征等。许多疾病， 如支气管哮喘、 结节病等， 需长期应用激素治疗。但糖皮质激素 类药物又是一类不良反应十分明显的药物， 长期应用或大剂量应用常可导致一系列不良反 应， 如高血压、 血糖升高、 消化性溃疡、 胃肠道出血、 Cushing 综合征、 骨质疏松、 骨无菌性坏 死、 骨折、 伤口愈合延迟、 诱发或加重感染、 儿童生长迟缓等， 严重时可致残或危及生命。正 是由于这种 “双刃剑 ” 效应严重影响了糖皮质激素类药物的临床疗效及治疗的依从性。 因 此 ,如何扬长避短 ,趋利避害， 最大限度地发挥此类药物的治疗效应,同时尽可能地减少 其不良反应， 已成为临床及基础研究中亟待。
10、解决的重要课题。 0003 近年来， 纳米靶向技术的发展为这一医学难题的解决带来了希望。纳米技术已广 泛应用于材料学、 电子学、 生物医药等多个领域并获得突破性进展。研究显示， 当微粒尺寸 进入纳米量级时 , 由于量子尺寸效应和表面效应 , 纳米粒子呈现出新奇的物理化学和生 物学特性， 如纳米技术可增加药物的溶解度， 提高其生物利用度， 增加药物的靶向作用， 从 而达到减少药物用量、 增强疗效、 减少副作用的目的。 纳米靶向载体正成为纳米技术与药 物控释技术研究的热点， 其具有根据生理和智能需要来调控药物的释放， 在纳米尺寸形成 释药系统的特征。 根据刺激信号的不同， 释药系统可分为化学、 物。
11、理和生物信号刺激响应性 药物释放系统。 生物靶向是利用抗体、 细胞膜表面受体或特定基因片段的专一性作用， 将配 位子结合在纳米载体上， 与目标细胞表面的抗原性识别器发生特异性结合， 使药物或目的 基因能准确送到病变组织细胞， 在对病变组织细胞取得疗效的同时， 又避免对正常细胞的 伤害。 0004 研究还表明， 型肺泡上皮细胞是肺脏药物递送的重要靶点之一。型肺泡上皮 细胞是肺组织所特有的具有增殖和分泌功能的细胞， 约占肺实质细胞总数的 16% 。型细 胞能合成表面活性物质， 储存在板层小体中， 再分泌至肺泡表面发挥生理作用。 肺泡表面活 性物质主要成份是约 90的脂质和 10的蛋白， 其中蛋白成。
12、份为特异性肺表面活性蛋白 (surfactant protein ,SP)， 按其发现先后命名为 SP-A、 SP-B、 SP-C、 SP-D。其中 SP-A 是由 248 个氨基酸组成的亲水性糖蛋白， 是最早发现且在型肺泡上皮细胞中强烈表达、 信号最 为丰富的蛋白。研究发现， 型上皮细胞除具有合成和分泌 SP-A 的功能以外， 其细胞表面 同时还具有高亲和力、 特异性的 SP-A 受体。SP-A 在肺外表达量极少， 在肺内则为高浓度表 达， 表现为肺特异性。 说 明 书 CN 102370620 A2/8 页 4 发明内容 0005 本发明的目的是针对现有技术存在的不足， 提供一种具有肺靶向。
13、性的免疫脂质 体， 尤其涉及一种具有肺靶向性的地塞米松免疫脂质体。 0006 本发明的另一目的是提供所述免疫脂质体的制备方法。 0007 本发明提供的一种具有肺靶向性的地塞米松免疫脂质体， 由肺表面活性蛋白 A 多 抗、 治疗药物和纳米脂质体组成。本发明基于所述的肺表面活性蛋白 A 的特性， 以地塞米松 磷酸钠 （DXM） 为治疗药物， 以纳米脂质体为载体， 以肺表面活性蛋白 A 多克隆抗体为特异性 肺组织靶向剂， 制备一种高效、 稳定、 具有明确肺靶向性的免疫纳米脂质体。 0008 本发明中， 所述的纳米脂质体以磷脂、 胆固醇和脂质体辅料等为材料制成。 0009 本发明中， 所述的磷脂可以是。
14、大豆卵磷脂 （SPC） 、 蛋黄卵磷脂 （EPC） 、 二棕榈酰磷 脂酰胆碱 （DPPC） 等。 0010 本发明中， 所述的脂质体辅料包括二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇 2000 (DSPE-PEG2000） 、 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇 2000- 吡啶基 - 联巯基 - 丙酸酯 （DSPE-PEG2000-PDP） 等。 0011 本发明中， 肺表面活性蛋白 A 多抗与磷脂比例为 1 10g 多抗 ： 1mol 磷脂。磷脂与胆固醇的摩尔比为 1.5 4:1 ； 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇 2000(DSPE-PEG2000） 占脂质摩尔量的 4% 15% 。 001。
15、2 本发明中， 所述的治疗药物还可以选自氢化可的松、 泼尼松龙或甲泼尼龙。 治疗药 物与纳米脂质体中磷脂的比值为 1mg( 治疗药物 ):1 20mol ( 磷脂 )。 0013 本发明中， 地塞米松纳米脂质体形态呈球形， 大小基本均一 （如图 1 所示） 。 0014 本发明中， 地塞米松纳米脂质体平均粒径为 12838nm。 0015 本发明中， 地塞米松纳米脂质体对地塞米松磷酸钠的包封率为 92.233.34% 。 0016 本发明中， 地塞米松纳米脂质体稳定性考察结果显示 ： 脂质体混悬液于 40C 放置 4 周后， 脂质体对地塞米松磷酸钠的包封率无显著性变化 （p 0.05） ， 样。
16、品放置稳定 （如表 1 所示） 。 0017 本发明的肺靶向性的地塞米松免疫纳米脂质体能通过药物的靶向输送， 减少用药 剂量， 提高对肺部疾病的疗效， 同时又减少全身不良反应， 具有新的临床实用价值。 0018 本发明提供了肺靶向性的地塞米松免疫纳米脂质体的制备方法， 其特征在于， 其 包括步骤 ： 1、 制备地塞米松纳米脂质体 （NLP） 采用薄膜分散法制备地塞米松纳米脂质体。 称取磷脂、 大豆卵磷脂、 蛋黄卵磷脂或二棕 榈酰磷脂酰胆碱、 胆固醇、 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇 2000(DSPE-PEG2000）（磷脂与 胆固醇的摩尔比为1.54:1 ； DSPE-PEG2000占脂。
17、质摩尔量的4%15% )， 以三氯甲烷 （或 三氯甲烷 / 甲醇） 溶解， 置于圆底烧瓶水浴 （温度应高于磷脂的相变温度） ， 80 120r min-1 减压旋转蒸发除去有机溶剂， 烧瓶壁上形成一层均匀透明薄膜。370C 真空干燥过夜。称取 处方量地塞米松磷酸钠 （或氢化可的松、 泼尼松龙、 甲泼尼龙等） ， DXM 与磷脂的比值为 1mg DXM:1 20mol 磷脂。以与有机溶剂等容积的生理盐水溶解， 置于成膜圆底烧瓶中， 水 浴， 80 120r min-1旋转 2h 水化干燥脂质膜。将制备的悬液室温静置 2h。使用脂质体挤 出器将悬液依次经 400nm、 200nm、 100nm 聚。
18、碳酸脂膜挤出， 经每个层级滤膜往返 10 15 次 说 明 书 CN 102370620 A3/8 页 5 挤出， 即得地塞米松纳米脂质体悬液 ； 取脂质体悬液， 置于截留分子量为 10KD 的超滤管中， 5000 10000rmin-1离心 30min 以上， 去除未包封的游离地塞米松磷酸钠。 0019 2、 地塞米松纳米脂质体的表征 地塞米松纳米脂质体形态呈球形， 大小基本均一 （如图 1 所示） ； 地塞米松纳米脂质体平均粒径为 12838nm ； 地塞米松纳米脂质体包封率 ： 地塞米松纳米脂质体对地塞米松磷酸钠的包封率为 92.233.34% ； 地塞米松纳米脂质体稳定性考察 ： 结果。
19、显示， 脂质体混悬液于 40C 放置 4 周后， 脂质体 对地塞米松磷酸钠的包封率无显著性变化 （p 0.05） ， 样品放置稳定 （如表 1 所示） 。 0020 表 1 地塞米松纳米脂质体稳定性试验 3、 制备肺表面活性蛋白 A 多抗偶联地塞米松免疫纳米脂质体 （SPA -NLP） 选用 N- 琥珀酰亚胺 - 吡啶基 - 联巯基 - 丙酸酯 （SPDP） 为交联剂， 将抗体与脂质体交 联， 制备免疫纳米脂质体。 （如图 2 所示） 。 0021 采用薄膜分散法制备含二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇 2000- 吡啶基 - 联巯 基-丙酸酯 （DSPE-PEG2000-PDP） 的地塞米松。
20、纳米脂质体。 配方为磷脂 （大豆卵磷脂、 蛋黄卵 磷脂、 二棕榈酰磷脂酰胆碱等） 、 胆固醇、 DSPE-PEG2000、 DSPE-PEG2000-PDP（DSPE-PEG2000 与 DSPE-PEG2000-PDP 的摩尔比为 2 5:1） 。 0022 向 SP-A 多抗溶液 （SC-7699,Santa Cruz Biotechnology） (SP-A 多抗与磷脂比 例为 1 10g 多抗 ： 1mol 磷脂 ) 中缓慢加入浓度为 20molml-1的 SPDP 乙醇溶液 （SPDP 与 Ab 的摩尔比约为 15 20 ： 1 ； 乙醇浓度不超过 5 )， 混匀， 室温下反应 30。
21、min。将 混合物移入截留分子量为 10KD 的超滤管中， 3500 5000rmin-1离心 10min。加入适量 0.2mol L-1的醋酸 - 醋酸钠缓冲液 （pH5.5） 。向混合物中加入过量的 2.5mol L-1的二硫苏 糖醇溶液 （以 0.2molL-1 ， pH5.5 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液配制） 。混匀， 室温下静置 30min。 加入 pH7.0 的柠檬酸 - 磷酸盐缓冲液， 3500 5000rmin-1离心超滤 5min ； 共 3 次以去除 游离二硫苏糖醇。移取超滤管内抗体溶液， 与含 DSPE-PEG2000-PDP 的地塞米松纳米脂质体 悬液混合， 室温， 搅拌。
22、放置过夜。 0023 4、 肺表面活性蛋白 A 多抗偶联地塞米松免疫纳米脂质体的组织靶向性实验 健康雄性 SD 大鼠 105 只， 体重 （9812） g， 随机分为 3 组 ： 肺表面活性蛋白 A 多抗偶 联地塞米松免疫纳米脂质体 (SPA NLP) 组、 地塞米松纳米脂质体 (NLP) 组和地塞米松 （DXM） 组。 （1） SPA NLP 组经鼠尾静脉注射 SPA NLP（按地塞米松磷酸钠 2mg/Kg 体重 计） ；（2） 地塞米松纳米脂质体组经鼠尾静脉注射 NLP（按地塞米松磷酸钠 2mg/Kg 体重计） ； （3） 地塞米松组经鼠尾静脉注射地塞米松磷酸钠 2mg/Kg。以给药后 1。
23、5min、 30min、 1h、 2h、 4h、 8h、 12h 为时间点。在每个时间点三组各取大鼠 5 只， 乙醚麻醉后眼眶取血， EDTA 抗凝， 离心后分离血浆。抽血后迅速处死大鼠， 取心、 肝、 脾、 肺、 肾等组织， 生理盐水冲洗， 滤纸吸 说 明 书 CN 102370620 A4/8 页 6 干， 精密称重。血浆及各组织 -200C 保存备测。使用高效液相色谱仪， 外标法测定血浆及组 织中地塞米松磷酸钠浓度。 0024 结果显示， 注射地塞米松纳米脂质体与 SPA-NLP 的血液循环时间较地塞米松磷酸 钠注射液延长， 血药浓度提高。注射后 30min、 1、 2、 4、 8、 1。
24、2h, SPA-NLP 组的血药浓度均显著 高于地塞米松组 (p 0.05)。在各取样时间点上 NLP 组、 SPA-NLP 组肺脏中地塞米松磷酸 钠浓度均显著高于地塞米松组 （p 0.05)， 而 SPA-NLP 组升高更为明显。NLP 组、 SPA-NLP 组在肝、 脾中地塞米松磷酸钠浓度有增高的趋势， 但以 NLP 组增高更明显。在 30min、 1、 2h 时间点上， SPA-NLP 组在肾脏中的药物分布显著低于的地塞米松组 （p 0.01)， 但在 8h 则 高于地塞米松组 （p 0.01)。三组制剂在心脏中的地塞米松磷酸钠浓度无明显差异 （p 0.05)（如图 3 所示） 。 00。
25、25 采用峰浓度比 （Ce） 和相对摄取率 （Re） 两个指标来考察 SPA- NLP 与 NLP 在大鼠体 内各组织器官的靶向情况。 0026 Ce （Cp） c/(Cp)s 式中 Cp为药物峰值 ； c 表示注射 SPA-NLP 或 NLP 后某一器官组织内的药物分布情况 ； s 表示注射地塞米松磷酸钠后在上述相同器官组织内的药物分布情况。 每个器官或组织的Ce 值表明药物分布的差异性， Ce值愈大， 表明药物分布差别越大。 0027 Re （AUCi） c/(AUCi)s 式中 AUCi是采用 3P87 药动学计算软件由浓度 - 时间曲线计算得第 i 个器官或组织的 药时曲线下面积。Re。
26、 1 表示在该器官或组织具有靶向性， Re越大靶向效果越好 ； Re 1 表 示在该器官或组织无靶向性。 0028 结果显示 （如表 2、 3 所示） ， SPA-NLP 在肺表现出明显的靶向性。以峰浓度比 （Ce） 和相对摄取率 （Re） 两个指标来考察， 注射 SPA-NLP 后肺脏地塞米松磷酸钠的峰浓度为注射 DXM 注射液的 5.08 倍 （Ce=5.08） ； 12h 药时曲线下面积 （AUC0-12h） 为注射 DXM 注射液的 40.21 倍 （Re =40.21） 。由于肝脾的吞噬作用， SPA-NLP、 NLP 在肝脾中亦有一定程度的富集， 但 SPA-NLP 组地塞米松磷酸。
27、钠在肝脾的聚集较 NLP 组减少。在心脏、 肾脏 SPA-NLP 组 Re、 Ce 均 小于 1， 无靶向性。 0029 表 2 血浆和组织中地塞米松磷酸钠的 AUC0-12h、 峰浓度 （Cmax） 注 ： AUC0-12h 12h 药 - 时曲线下面积 表 3 NLP 与 SPA-NLP 的组织靶向性评价 说 明 书 CN 102370620 A5/8 页 7 注 ： Re， 相对摄取率 ； Ce， 峰浓度比 实验结果表明， 本发明制得的肺表面活性蛋白 A 多抗偶联地塞米松免疫纳米脂质体的 优点有 ： 具有明确肺靶向性， 且高效、 稳定， 能实现地塞米松磷酸钠对肺部的靶向输送， 使肺脏 中。
28、DXM峰浓度较常规制剂提高5.08倍， 12h药时曲线下面积提高40.21倍， 能减少糖皮质激 素用药剂量、 提高对肺部疾病的疗效， 同时又减少全身不良反应。 0030 为了便于理解， 以下将通过具体的附图和实施例对本发明的具有肺靶向性的免疫 脂质体进行详细地描述。需要特别指出的是， 具体实例和附图仅是为了说明， 显然本领域 的普通技术人员可以根据本文说明， 在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改 变， 这些修正和改变也纳入本发明的范围内。 附图说明 0031 图 1 地塞米松纳米脂质体透射电镜下照片。 0032 图 2 采用 SPDP 将抗体与脂质体交联制备免疫脂质体的基本原理图。 。
29、0033 图 3 静脉注射 DXM、 NLP 与 SPA-NLP 后血浆及各组织中地塞米松磷酸钠的浓度分 布， 其中， DXM ： 地塞米松磷酸钠注射液 ； NLP ： 地塞米松纳米脂质体 ； SPA-NLP ： 肺表面活性蛋白 A 多抗偶联地塞米松免疫纳米脂质体。 具体实施方式 0034 实施例 1 1、 制备地塞米松纳米脂质体 （NLP） 采用薄膜分散法制备地塞米松纳米脂质体。精密称取处方量的大豆卵磷脂、 胆固醇、 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇 2000(DSPE-PEG2000） （摩尔比为 1.8 ： 1 ： 0.2） ， 以三氯 甲烷溶解， 置于圆底烧瓶， 500C 水浴， 1。
30、20rmin-1减压旋转蒸发除去有机溶剂， 烧瓶壁上形 成一层均匀透明薄膜。370C 真空干燥过夜。精密称取处方量地塞米松磷酸钠 (DXM 与磷脂 的比值为 1mg DXM:10mol 磷脂 )， 以与三氯甲烷等容积的生理盐水溶解， 置于成膜圆底烧 瓶中， 500C 水浴， 120rmin-1旋转 2h 水化干燥脂质膜。将制备的悬液室温静置 2h。使用 LiposoFastTM脂质体挤出器将悬液依次经 400nm、 200nm、 100nm 聚碳酸脂膜挤出， 经每个层 级滤膜往返 13 次挤出， 即得地塞米松纳米脂质体悬液。取脂质体悬液， 置于截留分子量为 10KD 的超滤管中， 10000r。
31、min-1离心 30min， 去除未包封的游离地塞米松磷酸钠。 0035 2、 地塞米松纳米脂质体的表征 说 明 书 CN 102370620 A6/8 页 8 1） 形态观察 ： 取脂质体悬液适量以生理盐水稀释 50 倍， 以醋酸铀染色， 经透射电镜观察其形态。可 见脂质体呈球形， 大小基本均一 （如图 1 所示） 。 0036 2） 粒径测定 : 脂质体悬液适量以蒸馏水适当稀释后于250C下经激光粒径测定仪测定其粒径分布。 地 塞米松纳米脂质体平均粒径为 12838nm。 0037 3） 包封率测定 ： 使用高效液相色谱仪， 内标法测定， 内标物为醋酸氢化可的松。地塞米松磷酸钠在 8 96。
32、gml-1范围内与内标物醋酸氢化可的松 28gml-1的比值 （X） 与其峰面积比 (Y) 构 成良好的线性关系， 标准曲线 Y=0.59065X-0.1441, 相关系数 r=0.9991 。分别取低、 中、 高 浓度的地塞米松磷酸钠对照品溶液 （分别为 8,48,96g ml-1） 进行精密度 （ RSD） 实验。结 果日内 RSD 分别为 2.5, 1.7, 2.1% ； 日间 RSD 分别为 2.8, 3.3, 3.9% 。地塞米松纳米脂 质体对地塞米松磷酸钠的包封率为 92.233.34% 。 0038 4） 稳定性考察 ： 脂质体混悬液于 40C 放置 4 周后， 脂质体对地塞米松。
33、磷酸钠的包封率无显著性变化 （p 0.05） ， 样品放置稳定 （如表 1 所示） 。 0039 3、 制备肺表面活性蛋白 A 多抗偶联地塞米松免疫纳米脂质体 （SPA -NLP） 选用 N- 琥珀酰亚胺 - 吡啶基 - 联巯基 - 丙酸酯 （SPDP） 为交联剂， 将抗体与脂质体交 联， 制备免疫纳米脂质体。 0040 本发明中， 抗体与 SPDP 反应， 在抗体上引入一可形成巯基的基团， 实现抗体的巯 基化 ； 二硫苏糖醇(DTT)与衍生化抗体 （PDP-Ab） 反应， 将抗体衍生物中的二硫键 （-S-S-） 还 原 ; 除去 DTT， 将抗体溶液与含 PDP 基团的脂质体混合过夜， 在此。
34、期间， 稳定性较差的芳香 吡啶巯基 （-S-Pyr） 在二硫键位置被已还原的抗体中的脂肪族巯基取代， 使得抗体与脂质体 通过二硫键相连。其交联反应如图 2 所示。 0041 本发明中， 在制备脂质体时即加入二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇 2000- 吡啶 基 - 联巯基 - 丙酸酯 （DSPE-PEG2000-PDP） ， 使免疫脂质体的制备过程简化。 采用薄膜分散法制备含二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇 2000- 吡啶基 - 联巯 基 - 丙酸酯 （DSPE-PEG2000-PDP）的地塞米松纳米脂质体。其中， 大豆卵磷脂、 胆固醇、 DSPE-PEG2000、 DSPE-PEG20。
35、00-PDP 的摩尔比为 1.8 ： 1 ： 0.15 ： 0.05。 0042 向适量 SPA-Ab 溶液中 (Ab 与磷脂的比例为 4g 多抗 ： 1mol 磷脂 ) 缓慢加入 浓度为 20molml-1的 SPDP 乙醇溶液 （SPDP 与 Ab 的摩尔比约为 20 ： 1 ； 乙醇浓度不超过 5)。 混匀， 室温下反应30min。 将混合物移入截留分子量为10KD的超滤管中， 3500r min-1 离心 10min。加入适量 0.2molL-1的醋酸 - 醋酸钠缓冲液 （pH5.5） 。向混合物中加入过量 的 2.5mol L-1的二硫苏糖醇溶液 （以 0.2mol L-1 ， pH。
36、5.5 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液配制） 。混 匀， 室温下静置 30min。加入 pH7.0 的柠檬酸 - 磷酸盐缓冲液， 3500r min-1离心超滤 5min ； 共 3 次以去除游离二硫苏糖醇。移取超滤管内抗体溶液， 与含 DSPE-PEG2000-PDP 的地塞米 松纳米脂质体悬液混合， 室温， 搅拌放置过夜， 制得肺表面活性蛋白 A 多抗偶联地塞米松免 疫纳米脂质体。 0043 说 明 书 CN 102370620 A7/8 页 9 实施例 2 肺表面活性蛋白 A 多抗偶联地塞米松免疫纳米脂质体的组织靶向性实验 健康雄性 SD 大鼠 105 只， 体重 （9812） g， 随机分为。
37、 3 组 ： 肺表面活性蛋白 A 多抗偶 联地塞米松免疫纳米脂质体 (SPA NLP) 组、 地塞米松纳米脂质体 (NLP) 组和地塞米松 （DXM） 组。 （1） SPA NLP 组经鼠尾静脉注射 SPA NLP（按地塞米松磷酸钠 2mg/Kg 体重 计） ；（2） 地塞米松纳米脂质体组经鼠尾静脉注射 NLP（按地塞米松磷酸钠 2mg/Kg 体重计） ； （3） 地塞米松组经鼠尾静脉注射地塞米松磷酸钠 2mg/Kg。以给药后 15min、 30min、 1h、 2h、 4h、 8h、 12h 为时间点。在每个时间点三组各取大鼠 5 只， 乙醚麻醉后眼眶取血， EDTA 抗凝， 离心后分离血浆。
38、。抽血后迅速处死大鼠， 取心、 肝、 脾、 肺、 肾等组织， 生理盐水冲洗， 滤纸吸 干， 精密称重。血浆及各组织 -200C 保存备测。使用高效液相色谱仪， 外标法测定血浆及组 织中地塞米松磷酸钠浓度。 0044 三种制剂注射后， 观察不同时间点地塞米松磷酸钠在大鼠血浆及心、 肝、 脾、 肺、 肾 等组织中分布 （如图 3 所示） 。统计分析结果显示 , 地塞米松纳米脂质体与 SPA-NLP 的血 液循环时间较地塞米松磷酸钠注射液延长， 血药浓度提高。注射后 30min、 1、 2、 4、 8、 12h, SPA-NLP 组的血药浓度均显著高于地塞米松组 (p 0.05)。在各取样时间点上 。
39、NLP 组、 SPA-NLP 组肺脏中地塞米松磷酸钠浓度均显著高于地塞米松组 （p 0.05)， 而 SPA-NLP 组 升高更为明显。NLP 组、 SPA-NLP 组在肝、 脾中地塞米松磷酸钠浓度有增高的趋势， 但以 NLP 组增高更明显。在 30min、 1、 2h 时间点上， SPA-NLP 组在肾脏中的药物分布显著低于的地塞 米松组 （p0.01)， 但在8h则高于地塞米松组 （p0.01)。 三组制剂在心脏中的地塞米松 磷酸钠浓度无明显差异 （p 0.05)。 0045 采用峰浓度比 （Ce） 和相对摄取率 （Re） 两个指标来考察 SPA- NLP 与 NLP 在大鼠体 内各组织器。
40、官的靶向情况。 0046 Ce （Cp） c/(Cp)s 式中 Cp为药物峰值 ； c 表示注射 SPA-NLP 或 NLP 后某一器官组织内的药物分布情况 ； s 表示注射地塞米松磷酸钠后在上述相同器官组织内的药物分布情况。 每个器官或组织的Ce 值表明药物分布的差异性， Ce值愈大， 表明药物分布差别越大。 0047 Re （AUCi） c/(AUCi)s 式中 AUCi是采用 3P87 药动学计算软件由浓度 - 时间曲线计算得第 i 个器官或组织的 药时曲线下面积。Re 1 表示在该器官或组织具有靶向性， Re越大靶向效果越好 ； Re 1 表 示在该器官或组织无靶向性。 0048 结果。
41、显示 SPA-NLP 在肺表现出明显的靶向性 （如表 2、 3 所示） 。以峰浓度比 （Ce） 和相对摄取率 （Re） 两个指标来考察， 注射 SPA-NLP 后肺脏地塞米松磷酸钠的峰浓度为注射 DXM 注射液的 5.08 倍 （Ce=5.08） ； 12h 药时曲线下面积 （AUC0-12h） 为注射 DXM 注射液的 40.21 倍 （Re =40.21） 。由于肝脾的吞噬作用， SPA-NLP、 NLP 在肝脾中亦有一定程度的富集， 但 SPA-NLP 组地塞米松磷酸钠在肝脾的聚集较 NLP 组减少。在心脏、 肾脏 SPA-NLP 组 Re、 Ce 均 小于 1， 无靶向性。 0049 。
42、结果表明， 本发明的肺表面活性蛋白 A 多抗偶联地塞米松免疫纳米脂质体具有明 确肺靶向性， 且高效、 稳定， 能实现地塞米松磷酸钠对肺部的靶向输送， 使得肺脏中 DXM 峰 浓度较常规制剂提高 5.08 倍， 12h 药时曲线下面积提高 40.21 倍。能达到减少糖皮质激素 说 明 书 CN 102370620 A8/8 页 10 用药剂量、 提高对肺部疾病的疗效， 同时又减少全身不良反应的目的。 说 明 书 CN 102370620 A1/3 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 102370620 A2/3 页 12 图 2 说 明 书 附 图 CN 102370620 A3/3 页 13 图 3 说 明 书 附 图 。