核酸的衔接线性扩增 发明的背景
1.技术领域
本发明与核酸的体外复制有关。更确切地说，本发明涉及一种用于所感兴趣核酸序列的复制的方法，最终通过引物延伸反应的衔接产生大量所感兴趣的的序列，其中所感兴趣序列以算术线性方式积聚起来。
2.背景技术的简述
核酸的大量复制(如今称为核酸“扩增”并在本文中使用该术语)在实践和理论上具有广泛的用途。H.G.Khorana与其合作者首先提议了用于体外DNA扩增方法，以产生足量地双链DNA(酵母的主要丙氨酸t-RNA基因的部分序列)，这种双链DNA已经通过酶反应将合成的DNA连接而产生。见K.Kleppe等；J.Mol.Biol.56：341-361(1971)。后来，体外扩增被应用到基因组DNA的扩增(Sakaki等，Science 230：1350-1354(1985))，称为今天所知的聚合酶链反应或“PCR”。通过来源广泛的合成的寡核苷酸引物、热稳定DNA聚合酶和自动化温度循环装置，PCR成为分子生物学家广泛应用的工具。
PCR在文献中被称为是“指数扩增”过程。在引物延伸的每一轮或“循环”中，合成了为其它引物结合的引物结合位点，如此，每一个在前一个循环合成的DNA分子将被用作引物依赖的复制的模板。该方法的这一方面，配合存在足够大量的引物分子，随着反应的持续，结果合成的DNA以数学指数方式积聚。
对分子生物学家来说，虽然PCR已被证明是一项有用的技术，并且在人类遗传研究、诊断和法医学甚至在测定抗体方面已得到广泛的应用，然而仍然察觉到其缺点。PCR方法很难准确地定量，这主要由于在每一个循环中扩增的产物呈指数增加。PCR的产物，即双链DNA分子本身难于分析和测序。在测序或其它需要单链的下游处理，例如与探针杂交检测感兴趣的序列之前，都需要进行链的分离。
PCR方法还被证明对前期扩增的DNA序列转移到新反应时所产生的污染特别敏感。这个问题似乎是由于这些事实引起：(1)在任何一个设定的反应循环中产生的大量的DNA，和(2)这个方法使用所有的产物DNA链作为后来的循环的模板。即使是微量的污染DNA也会呈指数扩增，并导致错误的结果。见Kwok和Higuchi，Nature339：237-238(1989)。由于这些污染问题被广泛认识，各种不同的降低这种污染的方法已在文献中屡见报道(如，化学去污染法、物理处理、酶学处理和采用封闭系统)。见John B.Findlay，“Development of PCRfor in vitro Diagnostics，”presented at“Genetic Recognition，”Nov.20，1992，San Diego，CA.
一直需要核酸(DNA)扩增的新方法，该方法应能提供大量DNA或只是选择性地扩增需要的特异序列，并避免目前伴随“PCR”反应的问题。特别是需要一些最终产生大量所感兴趣的核酸分子，或大量的含有所感兴趣核酸序列的核酸分子，但对污染的核酸的存在相对不敏感的核酸扩增的方法。并且还需要求产生单链产物的核酸扩增方法。
本发明的概述
本发明满足了前述的和其它需要，一方面它提供了用于扩增标本中所含的互补核酸链中所感兴趣的特异核酸序列的方法，所述的方法包括下列步骤：
(a)在一定条件下，将链与含有非复制性因子的引物接触，以所述的链为模板合成第一代引物延伸产物，其中链的引物是如此选择的，即它所产生的第一代链在与模板分离后能成为互补链引物的模板，合成第二代引物延伸产物；
(b)将第一代引物延伸产物从它们的模板上分离出来，产生单链分子；以及
(c)在一定条件下用(a)步骤的引物处理第一代引物延伸产物，使用第一代引物延伸产物为模板合成第二代引物延伸产物；
其中，第二代引物延伸产物至少含有所感兴趣核酸的部分序列，并且不能作为引物的模板来合成延伸产物，所述的引物延伸后合成它们的模板。
在本发明的其它方面，(c)步的产物分离开来产生单链分子，整个方法至少重复一次。随着本方法在程序化的热循环装置控制下以自动方式完成，(c)步骤优选是重复多次。
随着第二代引物延伸产物的积聚，它们中的每一个都不能作为引物延伸的模板去产生它的第一代模板，可采用一套新的含有非复制性因子的引物。新的一套引物能便利地与第二代合成产物结合，只使所感兴趣的序列得以扩增。线性复制的过程通过一定数量的循环重复进行。多个引物延伸反应如此“衔接”在一起，最终使得所感兴趣的原始核酸序列得以千倍或百万倍的扩增。因此，本方法被称为“衔接线性扩增”或“LLR”。
本发明的另一方面，多套(巢式)含有非复制性因子的引物能以单一扩增反应混合物供应。这些套引物的选择是使之在严格度逐步降低的情况下能够与各自的模板结合。因此，所有为多次衔接扩增所感兴趣的成份能以单一的反应混合物提供。
根据本发明的再一方面，等位基因特异的核酸复制是通过使用模板上特定多态性位点的特异引物完成的，这些多态性位点已知是指示为某遗传性疾病或异常(如镰型细胞疾病)。包含非复制性因子的等位基因特异引物设计成只引导那些含有想要的等位基因的模板的核酸合成。
本方法产生的合成核酸分子能用于诊断遗传病或异常，作为后续技术如基因克隆的试剂和法医识别，等等。
本文所描述的方法还能以单核酸链为起始原料进行，所述的方法包括：
(a)在特定条件下，将链与含有非复制性因子的第一引物接触，以该链为模板合成第一代引物延伸产物；
(b)将第一代引物延伸产物从其模板上分离出来，产生单链分子；以及
(c)在一定条件下，将第一代引物延伸产物与含有非复制性因子的第二引物结合，应用第一代引物延伸产物为模板合成第二代引物延伸产物；
其中，引物是如此选择的，即第二代引物延伸产物不能作为第一引物的延伸模板。步骤(a)-(c)可重复多次，随后反应被衔接到应用新的一套引物的后一个反应中。
本发明还涉及用于扩增特异核酸序列的试剂盒。所述的试剂盒包括，例如，DNA聚合酶、需扩增序列的一对引物(其中每个引物包含一个非复制性因子)，以及任选的能被该引物对和DNA聚合酶复制的对照核酸序列。该试剂盒还可包含能够确定特定序列的扩增产物是否存在的核酸探针。
附图的简要描述
图1-4为本发明的核酸扩增方法的示意图。
图5-6为与图1-4所代表的方法相连接的核酸扩增方法的示意图。
图7是本发明应用两个引物进行的核酸扩增方法的更详细的示意图。
图8-10显示本发明应用4个引物进行的衔接线性核酸扩增方法的详细示意图。
图11为用PCR方法和本发明方法制备的核酸分子的示意图。
图12是人类β珠蛋白基因(基因库位点为HUMHBB)和本文所述的几个引物的模式图。优选的实施方案的详细描述
本发明的核酸复制方法能够产生大量的特异所感兴趣核酸序列。所述方法的优选形式包括一系列衔接的多重循环引物延伸反应。在每一个多重循环引物延伸反应中，引物依赖性的核酸扩增通过数个循环完成，引物延伸产物通过循环逐步呈数学线性方式积聚。给起始样品中含有感兴趣扩增序列的每一个核酸链都提供一个特定的引物或引物对。引物延伸产物逐循环线性积聚是通过使用含有非复制性序列的引物来保证的，非复制性因子是停止引物延伸反应的因子，其防止核酸聚合酶复制引物的全序列。通过选择合适的包含这种非复制性因子的引物及合适的引物退火条件，保证了大量积聚的引物延伸产物(本文称为“第二代引物延伸产物”)在使用相同引物的后续引物延伸循环中不能作为模板。如此，不同于每个循环产生的引物延伸产物可作为后续循环模板的核酸扩增方法(诸如“PCR”)，“指数扩增”不会逐循环发生。
本发明方法应用了寡核苷酸杂交和引物延伸反应的一些重要性质的优点，本发明采用了下列优点：
·通过变性与引物依赖的延伸的依次循环，DNA聚合酶可以多次复制模板DNA。
·即使在引物与模板不完全互补时，只要条件适宜，就可产生引物依赖的延伸。
·引物延伸可使用前一轮的引物延伸产物作为模板。
·当模板核酸中存在非碱基位点或非核苷酸残基时，引物延伸反应被抑制。
·引物的长度和组成以已知的方式影响某些条件，例如温度，在这种条件下引物能在模板上启动聚合酶诱导的延伸。
·引物延伸反应可应用温度循环装置进行快速循环。
本方法便利地采用了一系列线性扩增反应，这些反应既可以衔接成一个系列进行，也可平行地同时进行，以产生大量的所感兴趣的核酸序列的拷贝。所感兴趣的核酸序列可包含模板链的全部长度，也可只含模板的很小部分。包含所感兴趣序列的模板链可能存在于大致均一的模板中，也可能是一些核酸混合物中的一部分(甚至是非常小的一部分)。
依照本发明，为每一条含需扩增的序列的链提供了含有非复制性因子的引物。对于双链模板，引物可在模板变性前或变性后加入。在酶功能适宜的条件下，引物与相应的起始模板退火并在聚合酶存在时得以延伸，产生第一代引物延伸产物。通过上轮产生的双链核酸的变性、引物与相应链的退火和再次进行引物延伸反应，所述的方法重复进行。用第一代引物延伸产物进行的引物延伸产生第二代引物延伸产物，由于存在非复制性因子，第二代延伸产物在其后的循环中不能作为那些相同引物的模板。
图1-5显示了一个依照本发明的方法用DNA模板进行的引物延伸反应系列(即一个线性扩增反应)的模式图。该方法图示为从利用具有确定末端的双链DNA分子的步骤(a)开始。图1-4中起始DNA的链用实线标示。
起始的双链经过变性，最好在含有该双链的缓冲溶液中加热，所产生的单链与一对引物接触(步骤(b))。每个引物优选地以超过起始模板链的分子数提供，并在其序列中包含非复制性因子，在引物序列中该处用(x)或(o)标示。在适宜的条件下，引物退火到相应的模板上并在DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸存在的条件下遵照引物延伸反应得以延伸(步骤(c))。在图1-4中合成的DNA用点划线(……)标示，而利用起始双链DNA作为模板合成的DNA被称为“第一代”DNA。所生成的模板再次变性，引物再退火(步骤(d))。
如图2步骤(e)所示，利用第一代DNA为模板的引物延伸反应产生第二代DNA，并且不越过掺入到第一代合成DNA中的非复制性因子。这样，合成了用标号10和20标示的DNA分子。如图所示，由于分子10没有掺入一个有效的含非复制因子(x)的引物的结合位点，分子20没有掺入一个有效的含非复制性因子(o)的引物的结合位点，因此这些第二代分子不再参与其后的引物延伸反应。这样，如步骤(f)和(g)所示，在其后的引物延伸循环中，第二代分子以算术线性方式积聚。
经过合适数目的循环之后，合成的DNA被用作(如，衔接至)使用第二套引物的第二个引物延伸反应系列的起始材料。如图5-6所示，选择含非复制性因子(标记为(a)和(b))的引物，以便能够使用分子10和20(图1-4的反应产物)作为进一步DNA合成的模板。这个系列的引物延伸反应同样产生合成的DNA分子(在图6的步骤(e)中用标号30和40标示)的积聚，这些分子不能作为本系列反应中所用的引物的模板。经过合适数目的循环之后，这些合成的分子可衔接到应用含非复制性因子的适宜引物的进一步的复制中去。
于是，显而易见的是，只有在提供新的引物或引物对的情况下，任何一个系列循环的合成核酸产物本身才能作为进一步扩增的模板。因此，如果第一轮线性扩增进行了100个循环，由这个反应产生的100个拷贝可以作为衔接线性扩增(LLA)反应的模板，在后一反应中使用的可与这些合成模板杂交的新引物。进一步的100个线性扩增循环产生10000个累加的扩增(100×100)。应用第三对引物重复这一过程，产生1×106个累加的扩增。通过使用其他的引物和引物延伸循环，可获得更进一步的扩增。
图7更详细地图示了依照本发明使用2个引物进行扩增的方法。根据该图，使用2个引物进行逐步的引物延伸循环。每个引物与靶序列互补，但在互补的核苷酸的一个位置上含有单一的非复制性因子(x)。
这里须考虑4个反应。在反应1，引物P1产生模板上面的链的拷贝(第一代核酸，产物I)，在每一个循环中产生一个产物I的拷贝，m个循环产生m个拷贝；在反应2，引物P2同样产生模板下面的链的拷贝(第一代核酸，产物II)，在每一个循环中产生一个产物II的拷贝，n个循环产生n个拷贝；在实践中n与m相同。
在反应3，引物P1产生反应2的产物II(标示为模板II)的拷贝(第二代核酸，产物III)，模板II掺入了非复制性因子处以外的部分不被复制。这样产物III既不是引物P1也不是引物P2的模板。
同样，在反应4，引物P2产生模板I的拷贝(第二代核酸，产物IV)，模板I掺入了非复制性因子处以外的部分不被复制。这样产物IV既不是引物P1也不是引物P2的模板。
表1示出每种产物的积聚是循环次数的函数。如表所示，公式(n2＋n)/2可用来计算反应的产量。
表1：在2个引物的LLA反应中产物的积聚
循环数(n) I 累加 III 累加 累加 (n2＋n)/2
I III I＋III1 1 1 0 0 1 12 1 2 1 1 3 33 1 3 2 3 6 64 1 4 3 6 10 105 1 5 4 10 15 156 1 6 5 15 21 217 1 7 6 21 28 288 1 8 7 28 36 369 1 9 8 36 45 4510 1 10 9 45 55 5511 1 11 10 55 66 6612 1 12 11 66 78 7813 1 13 12 78 91 9114 1 14 13 91 105 10515 1 15 14 105 120 120100 1 100 99 5,050200 1 200 199 20,100500 1 500 499 125,2501,000 1 1,000 999 500,500
如果在反应中包括第三个引物，这个引物含有非复制性因子并与产物III或IV互补，将积聚一种新的比产物III或IV都短的产物，这种产物的量将比反应中任何其他DNA链都要多，并且大多数保持单链状态。
图8-10描绘了根据本发明进行的将线性扩增反应“衔接”在一起以产生大量的DNA合成的反应。在这个反应中应用了4个引物，因此将两个双引物反应衔接在一起同时进行。在这个反应中，引物P1和P3与靶核酸的上面的链互补，P2和P4与下面的链互补。引物P3的互补位置为引物P1互补位置的5′(根据模板而定)。同样，引物P4的互补位置在P2互补位置的5′(根据模板而定)。所感兴趣的核酸序列将位于由两个引物对界定的区域内。
应考虑6个不同的反应，每个反应的差别在于使用的模板，它们被标示在图中。反应1A、1B、2A和2B分别导致与相应起始核酸模板互补的第一代合成核酸的线性积聚(分别为产物IA、IB、IIA和IIB)。反应3A、3B、4A和4B分别导致第二代合成核酸的线性积聚，由于在反应1A、1B、2A和2B中合成的核酸含有非复制性因子，所以这些第二代合成核酸不能作为引物P1或P2的模板。从反应5和6可见，引物P3和P4由于其互补位点的位置可以分别启动原始模板DNA和模板IVA和IIIA的DNA合成。当然产物IIIB和IVB不能作为这个反应的模板，但它们包含所感兴趣的核酸序列。
显而易见的是，可能存在本文所述的反应的变动方法。例如，线性扩增反应可以依次衔接起来，而不是如图8-10所述的同时进行。因此，引物P3和P4可在引物延伸n个循环后加入反应混合物，而n可在例如2至100之间。
在另一变动中，引物P1和P2可以这样选择，在不允许引物P3和P4启动合成的条件(例如温度)下，引物P1和P2能与模板DNA退火并能启动DNA合成。在初始的反应混合物中提供引物P1、P2、P3和P4。第一轮线性扩增是在比较严格的条件下进行，只有引物P1和P2参与引物延伸。在合适的循环次数之后将反应条件严格程度降低一些，使所有四个引物都参与核酸合成。引物P1和P2继续使用初始模板产生第一代引物延伸产物和利用第一代产物为模板产生第二代引物延伸产物；引物P3和P4也利用引物P1和P2的第二代引物延伸产物作为模板。同样所感兴趣的核酸序列也是位于由两个引物对界定的区域内。
如果在反应中加入含有非复制性因子并与产物IIIB或IVB互补的第五个引物，一种比产物IIIB或IVB短的新产物将积聚起来。在反应中这个产物将比任何其他的DNA链都要丰富，而且大部分保持单链状态。分子生物学领域的技术人员会认识到，只要使用奇数数目的引物来实践本发明将产生单链DNA的积聚。
使用含有非复制性因子的引物保证了，除以初始材料中所含的原始核酸链为模板合成的引物延伸产物(本文中这些引物延伸产物被称为“第一代引物延伸产物”)外，本方法中产生的任何合成核酸都不能作为后续引物延伸反应的模板。这样，避免了如同在PCR反应中那样(Kleppe et al.and Saiki et al.，同前)的合成核酸逐循环以数学指数方式的积聚。
在分子生物学和DNA化学领域的有经验的科学家将能合成含有非复制性因子的引物。例如，含有1，3-丙二醇残基(它停止DNA合成)的引物可根据Seela et al.，Nucleic Acids Res.15，3113-3129(1987)描述的方法合成，也可从Glen Research，44901 Falcon Place，Sterling，VA，20166 USA购买。含有1，4-脱水-2-脱氧-D-核糖醇(1，4-anhydro-2-deoxyl-D-ribitol，非碱基位点的模型)的引物可借助Eritja et al.，Nucleosides & Nucleotides 6，803-814(1987)合成。公开的欧洲专利申请416，817A2(Imperial ChemicalIndustries PLC；March 13，1991)描述了下述引物的合成方法，在引物中含有一或多个2′脱氧核糖呋喃糖基萘部分(2′deoxyribofuranosyl naphathalene moiety)作为引物序列与多聚核苷酸尾端之间的非复制性因子。合成含有其他能够停止聚合酶依赖的模板复制的因子如核糖核苷和脱氧核糖核苷的衍生物的寡核苷酸引物，对本领域技术人员来说是显而易见的。非复制性因子最好不位于引物的末端的残基。
作为例子，典型的扩增反应从含有包含在较长的序列之中的需复制的序列的双链DNA分子开始进行。每条链特异的寡核苷酸引物与相应的链退火，每个引物都含有一个本文所述的非复制性因子。这些引物的选择是其在界定需要扩增的序列的位点与相应的链结合。
引物延伸的第一个循环在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷碱基存在下并在适宜于选定的酶的条件下进行。产生的第一代合成DNA将在其3′端掺入寡核苷酸引物和在其下游(5′)掺入另一引物的整个结合位点。
进行第二个引物延伸循环，其中第一代合成DNA作为在其3′端没有掺入的那一引物的模板。DNA合成沿着模板进行，当聚合酶分子遇到模板中包含的非复制性因子时停止合成。产生的合成DNA(本文称为“第二代合成的DNA”)具有两个末端，其5′端由整个的引物序列限定，3′端由另一个引物的部分序列所限定--这部分是由DNA合成酶在遇到非复制性因子之前拷贝出来的。
第二代合成DNA将不作为模板参与下一步DNA的合成。如上所述，第二代合成DNA只包含引物结合必需位点的一部分。在选定的引物退火和延伸条件下，引物结合位点的一部分不足以令引物结合并作为引物依赖的DNA合成的位点。这样，当第三及以后的引物延伸循环进行时，只有初始的DNA和第一代合成DNA才能成为模板。这些模板的继续拷贝产生含有所感兴趣的序列的第二代合成DNA的逐轮“线性”积聚。
在合适的引物延伸循环的次数之后，通过为每条链提供第二个引物可获得进一步的复制，选择的第二引物是使其在由初始的引物对界定的区域内结合初始的模板链。这些第二引物也含有非复制性因子，因此保证了它们的引物延伸产物不能成为用这些引物进行的后续的核酸合成的循环的模板。
已知引物结合条件，特别是温度，可推断某特定的引物是否与特定的模板结合。见Rychlik et al.，Nucleic Acids Res.18，6409-6412；Wu et al.，DNA Cell Biol.10,233-238(1991)。因此，在含有不同碱基组成和/或长度的引物的反应混合物中，选择引物结合的温度也可用来选择能够启动DNA合成的引物。例如，在单一的扩增反应混合体系中，通过提供分别在72℃、62℃和52℃启动合成的第一、二、三套引物，在72℃进行第一个系列的引物延伸反应可保证只有第一套引物才能发挥启动引物依赖的核酸合成的功能。在进行了合适的循环数之后，引物延伸的温度可降低到62℃，使第一和第二套引物能引导DNA合成。降低引物延伸反应的温度至52℃可允许所有3套引物参与引物依赖的DNA合成。在本发明方法中使用引物混合物，使得方法能更有效地进行，不需要研究人员在方法进行过程中单独地加入每一套引物。
通过使用市售的程序化热循环装置，可在一个扩增反应混合物中提供上述3套引物。这些引物的选择是使那些于最严格条件下引导DNA合成的引物在模板上结合到其他引物的3′端。同样，那些在较弱条件下引导DNA合成的引物结合到模板上其他引物的5′端。第一系列的引物延伸反应(循环)在最严格的引物退火条件下(最高温度)进行，只有第一套引物参与含有所感兴趣序列的DNA合成。经过预先设定的引物延伸次数后，引物退火条件降低到较弱的强度。在选定的条件下，通过引导第一系列引物延伸循环中产生的第二代合成DNA的线性拷贝，第二套引物将启动进一步的DNA扩增。当条件进一步被调整到使第三套引物参与引物依赖的DNA合成时，在第一和第二系列引物扩增反应中产生的第二代合成DNA起DNA复制模板的作用。
设计在预选温度下结合的引物是在分子生物学家的技术之内。根据引物的长度和碱基组成，通过现有规则程序(wu et al.，DNA Cell Biol.10，233-238(1991))和计算机程序(Rychlik etal.，Nucleic AcidsRes.18，6409-6412(1990))可预测出特定引物起作用的温度。体外DNA扩增的合适温度循环可通过人工或商购程序化热循环仪实现。使用热气循环仪可达到非常快的循环周期(wittwer et al.，Nucleic Acids Res.17，4353-4357(1989))，短至30秒的循环周期是可能的(wittwer et al.，Biotechniques 10，76-83(1991))。因此，在约50分钟短的时间内可获得100个引物延伸循环。等位基因特异的线性扩增
在本发明的一个实施方案中，引物被设计成其3′端核苷酸与模板上的一个已知存在变异(多态性)的特定核苷酸互补。变异核苷酸可能是一个涉及某种遗传疾病(如镰状细胞贫血)的核苷酸，或其他已知是多态性的位点。如果在引物3′端核苷酸与模板DNA相应的核苷酸之间存在错配，引物的设计确保它较差地延伸或优选是完全不延伸。见Petruska，et al.，PNAS USA 85，6252-6256(1988)。因此，这样的一个引物是“等位基因特异的”，在所感兴趣的核酸序列中能识别某一个碱基是否存在。在本发明方法中使用一个等位基因特异引物若产生合成DNA便提示初始DNA模板中存在着所感兴趣的等位基因。
这种应用寡核苷酸延伸进行等位基因特征分析已被用于进行等位基因特异的PCR。见Newton et al.，Nucleic Acids Res.17，2503-2516(1989)。然而，在等位基因特异的PCR反应中遇到反应运行的困难，一直不能达到如同在常规PCR中那样的指数增长行为(见Ugozzoli et al.，Methods 2，42-48(1991))。可是，本扩增方法由于在等位基因特异的引物内存在一个非复制性因子，从而达到逐循环线性增长行为，克服了这些困难。扩增产物的检测
本发明扩增方法的最初产物是具有限定长度的单链合成DNA。产物链的长度是通过最后使用的引物位置所决定的，等于该引物本身的长度与包含了从引物3′端到模板上非复制性因子间核苷酸数目的总和。通过已知的核酸检测技术能检测反应产物，这些技术包含：应用放射性、荧光物质或酶学方法等标记的引物或探针，电泳、高压液相色谱法等。
在诊断人类和其它动物遗传疾病上，本发明将有重要的用途。许多人类遗传疾病是序列已知的基因中特异改变所致。对于这些特异的突变，使用杂交或其它等位基因特异的技术(见上)可进行以DNA分析为基础的诊断，来确定有疾病风险的个体的DNA中存在哪一种变异基因序列。显然，为发展这些技术，靶DNA的扩增一直是有用的。模板扩增的主要优点是：能使用小样品量、改进了检测系统中信噪比、具有真正的自动化潜力及扩增系统本身同时就可能成为检测系统。
本发明的方法提供了同其它扩增反应所提供的同样的优点，同时还有其它优势。产物是单链，因此在检测前不必变性。如果使用奇数量的引物，就会产生过量的单链分子。这些分子利于用作例如杂交探针，因此比其它扩增技术提供了更多的优点。更进一步的优点是，产物的线性积累，因而能准确定量；与在后续的循环中应用相同引物、用新合成的DNA作为模板的指数方法相比，降低了“假阳性”率。实施例
在以下实施例中采用的几种试剂，介绍如下：
TE(Tris-EDTA)：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0
TBE(Tris-硼酸盐-EDTA)：89mM Tris-HCl，89mM硼酸，2mM EDTA，pH8.3
Klenow多聚酶缓冲液：50mM Tris-HCl，10mMMgCl2，pH7.6
激酶缓冲液：50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，5mM DTT，0.1mM亚精胺-HCl，0.1mM EDTA，pH7.6
DNA多聚酶I缓冲液：50mM Tris-HCl，10mMMgSO4，0.1mM DTT，50μg/ml牛血清白蛋白，pH7.2
序列酶缓冲液：40mM Tris-HCl，20mM MgCl2，50mM NaCl，pH7.5
Bst多聚酶缓冲液：20mM Tris-HCl，20mM MgCl2，pH8.5
Taq多聚酶缓冲液：50mM KCl，10mM Tris-HCl，1.5mM MgCl2，0.01％W/V明胶，pH8.3
10X Ficoll加样缓冲液：100mM Tris-HCl pH7.5，10mM EDTA，0.5％溴酚蓝，0.5％二甲苯蓝，30％Ficoll
5X SSPE：50mM磷酸钠pH7.0，0.9mM NaCl和5mM EDTA
6X SSC：0.9M NaCl，0.09M柠檬酸钠
本发明方法将通过以下实施例进行描述，但不限制寻求保护的范围。实施例1 在模板中存在1，3-丙二醇时阻断引物延伸
为证实1，3-丙二醇组分作为非复制性因子阻断DNA合成的能力，合成了带有或不带含1，3-丙二醇组分(记为非复制性因子“X”)的单一核苷酸碱基的模板和与模板3′端互补的引物。合成的序列如下：名称 序列(5′→3′)DNA II 207 GCTCCCTTAGCATGGGAGAGTCTCCGGTTCDNA II 207X GCTCCCTTAXCATGGGAGAGTCTCCGGTTCP12 GAACCGGAGACT
将引物和模板退火形成以下的引物模板复合物：
5 ′GCTCCCTTAGCATGGGAGAGTCTCCGGTTC
TCAGAGGCCAAG 5′
5 ′GCTCCCTTAXCATGGGAGAGTCTCCGGTTC
TCAGAGGCCAAG 5′
在α-[32P]-dCTP存在下，用不同的DNA多聚酶(DNA多聚酶IKlenow片段、AmpliTaq多聚酶(PerkinElmer-Cetus Corp.)、BST多聚酶(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)和Sequenase多聚酶(United States Biochemical，Cleveland，OH))延伸引物模板的复合物，其后产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
引物和模板以引物/模板10∶1比例混合，应用对多聚酶适宜的缓冲液，20μl的反应体系中包含1pmol207或207-X、10pmol P12、25μm dNTP、0.5μCiα-[32P]-dCTP和AmpliTaq缓冲液、BST缓冲液、Klenow缓冲液、序列酶缓冲液。样品在90℃加热2分钟，在0℃中冷却5分钟，然后加入1U DNA多聚酶在37℃反应10分钟。结果显示丙二醇残基阻断所有4种DNA多聚酶的引物延伸，产物如下所示：
5′GCTCCCTTAGCATGGGAGAGTCTCCGGTTC
<-----------------TCAGAGGCCAAG 5′
5′GCTCCCTTAXCATGGGAGAGTCTCCGGTTC
<--------TCAGAGGCCAAG 5′实施例2 含丙二醇碱基的引物不支持PCR
制备4种寡核苷酸，其中2种包含非复制性的1，3-丙二醇组份。在Eppendorf Ecosyn D300自动DNA合成仪上合成序列，在Z位点上掺入MMT-丙二醇氨基磷酸酯。将序列输入合成仪时，Z被引入。序列如下所示：名称 序列(5′→3′)BGP-2 22 GGGTGGGAAAATAGACCAATAGBGP-2 22X GGGTGGGAAAATAGACCXATAGBGP-1 30 GGCAGGAGCCAGGGCTGGGCATAAAAGTCABGP-1 30X GGCAGGAGCCAGGGCTGGGCATAAAXGTCA
人β-珠蛋白基因(GenBank Locus HUMHBB)中与寡核苷酸的互补位置见图12。
用4种引物的不同结合进行体外扩增反应。在标准PCR反应缓冲液中，每个反应包含100ng人基因组DNA、两种引物各6pmol。反应在热循环仪(Ericomp)中进行，加热至94℃持续3分钟，55℃冷却30秒，加热至72℃ 30秒，然后进行31次如下的加热与冷却的循环：94℃1分钟、55℃30秒、72℃30秒，热循环之后样品在72℃中再保温3.5分钟。只有不包含丙二醇的引物(BGP-1 30和BGP-2 22)的反应产生319bp的扩增产物。因此，这证实含丙二醇的引物不支持PCR。实施例3 含丙二醇的引物产生特异的DNA片段
质粒pHβA与含丙二醇的引物(BGP-1 30X和BGP-222X)或不含丙二醇组份的对照引物(BGP-1 30和BGP-2 22)混合。引物/模板混合物的热循环条件为94℃20秒分离双链模板，然后48℃持续20秒。在最后循环后，反应混合物在48℃中进一步保温5分40秒以完成引物延伸反应和退火单链DNA。加入含丙二醇引物(本发明)的反应混合物经45次的引物延伸循环。使用不含丙二醇组份引物的PCR反应经10次引物延伸循环。反应产物经1.5％琼脂糖胶(TBE缓冲液)电泳。含丙二酚的引物产生的DNA片段比PCR产生的片段小。片段较小是由于引物延伸不到模板链的末端，在产物上留下5′单链伸出。
图11显示了PCR反应产物与本发明LLA反应产物的比较。以指数增长的PCR主要产物是带有与所加入的引物末端相应的确定末端的完整双链。而本方法的产物由于引物延伸没有超过非复制性因子，比相应的PCR产物短。实施例4 含有丙二醇的引物支持DNA扩增
根据本发明，用BGP-1 30X和BGP-2 22X进行不同循环次数的扩增反应。扩增产物用来进行斑点杂交，杂交信号与已知量的包含该序列的质粒DNA进行比较。
反应体系15μl，标准PCR缓冲液，包含：1.1ng质粒pHβA(含克隆在PBR322中的完整人β-珠蛋白基因)、5pmol BGP-1 30X、5pmol BGP-2 22X、83μMdNTP、2.5U AmpliTaqR DNA多聚酶。热循环反应在CorbettResearch FTS-1热循环仪进行，程序如下：94℃20秒、48℃20秒，分别循环45、32和22次。在循环的末尾反应物被加热至94℃20秒，48℃保温4分钟。
反应的产物(3μl)与10μl 4N NaOH、250mM EDTA混合后，点在Zeta-Probe膜(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)上，膜上还点有56、118和231ng同样变性的质粒pHβA。膜在5X SSPE、1％ SDS、5mg/mlBlotto、10μg/ml Homomix I RNA中与5′-32P-CTGCAGTAACGGCAGACTTCTCCT在55℃杂交3小时。杂交后，室温下用6X SSC洗膜，用Bio-Rad MolecularImager扫描。反应产生近250倍的扩增，证实本发明的方法能使所感兴趣核酸序列的扩增。
实施例5 人基因组β-珠蛋白基因的扩增
根据本发明，线性扩增反应在15μl体积中进行，包含Taq多聚酶缓冲液、模板DNA(800ng的基因组DNA或104分子的质粒pHβA)、200μM每种dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)、2pmol寡核苷酸引物BGP5-22X和BGP4-22X和2U Ampli-Taq多聚酶(Perkin-Elmer Cetus)。质粒pHβA包含人β-珠蛋白基因4.4kb PstI片段，克隆在pBR322的PstI位点。作为阴性对照，设置了除模板DNA之外包含前述反应所用的所有成分(“无模板”对照)的反应。变性模板DNA 3分钟后，进行99次如下扩增循环：在55℃退火30秒、72℃聚合15秒、94℃变性30秒。在最后一次循环后，样品在55℃退火30秒并最终在72℃聚合4分钟。
在第一阶段(100次循环)后，从每个样品(基因组DNA、质粒DNA和阴性对照)取出7.5μl，与7.5μl包含Taq多聚酶缓冲液、5pmol引物BGP1-35X和BGP2-35X及2U Ampli-Taq多聚酶的反应液混合。循环程序同第一阶段，只是退火温度为63℃。
为了控制扩增产生的片段的大小，进行了两种反应。一种反应包含Taq多聚酶缓冲液、5pmol引物BGP5-22X和BGP4-22X、1×108分子质粒pHβA和3U Ampli-Taq多聚酶。第二个对照反应除应用引物BGP1-35X和BGP2-35X外，包含了以前反应相同的成分。模板DNA在94℃变性4分钟，然后用以下条件的程序循环48次：55℃退火和多聚30秒、94℃变性30秒。在最后一次循环后样品在55℃退火30秒，在72℃多聚4分钟。引物 序列(5′-->3′)BGP1-35X CCAGGGCTGGGCATAAAAGTCAGGGCAGAGXCATCBGP2-35X GGGTGGGAAAATAGACCAATAGGCAGAGAGXGTCABGP4-22X CCAAAGGACTCAAAGAAXCTCTBGP5-22X CCTCACCCTGTGGAGCCXCACC
LLA产物的分析：
全部反应物(15μl)与1.6μl 10 X Ficoll加样缓冲液混合后，进行1.5％琼脂糖凝胶(Bio-Rad超纯琼脂糖)电泳。在TBE缓冲液110伏电泳90分钟。然后凝胶用溴化乙锭(1μg/ml)染色30分钟、脱色15分钟之后，在紫外光(UV)下照相。电泳后的DNA通过碱转移法(Reed，K.C.and D.A.Mann，Rapid transfer of DNAfrom agarose gels to nylon membranes，NucleicAcids Res.13：7207-7221(1985))转移到尼龙膜(zeta probe，Bio-Rad)，通过UV照射固定到膜上(Church，G.M.and W.Gilbert，Genomic Sequencing，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：1991-1995(1984))。膜在5X SSPE，1％SDS，10μg/ml同源混合(homomix)RNA和0.5％无水的脱脂奶粉(Carnation，LosAngeles，CA)中预杂交一小时，然后用2.5×106cpm/ml的5′端用32P标记的5′CAGGAGTCAGGTGCACCATGGT探针在55℃杂交2小时。在室温用6X SSC洗脱膜30分钟两次，然后放射自显影30分钟。
基因组DNA产生与珠蛋白基因质粒DNA对照相同的片段。片段的大小是由BGP1-35和BGP2-35X引物所产生的片段大小。实施例6 LLA扩增产物比体外PCR扩增产物耐污染：
本发明的“LLA”扩增反应在包含Taq多聚酶缓冲液、模板DNA(3.5×109质粒pHβA的分子)、200μM每种dNTP(dATP、TTP、dCTP和dGTP)、5pmole寡核苷酸引物BGP1-22X和BGP2-22X及1.25单位Ampli-Taq DNA多聚酶(Perkin-ElmerCetus)的15μl反应体积中进行。在模板DNA变性1分钟后，48℃退火30秒、94℃变性30秒扩增49个循环。在最后一次循环后，样品在48℃保温4分钟。
为了比较，在包含Taq多聚酶缓冲液、模板DNA(3.5×109质粒pHβA分子)、200μM每种dNTP(dATP、TTP、dCTP和dGTP)、5pmole寡核苷酸引物BGP1-22和BGP2-22，和1.25单位Ampli-Taq DNA多聚酶(Perkin-Elmer Cetus)的15μl反应体积中进行PCR反应。在模板DNA变性1分钟后，在48℃退火30秒和94℃变性30秒扩增9个循环。在最后一次循环后，样品在48℃保温4分钟。
LLA和PCR产物分析
LLA和PCR产物经两倍连续稀释(1/64μl、1/32μl、1/16μl、1/8μl、1/4μl、1/2μl、1μl、2μl、4μl、8μl)后，与1X Ficoll加样缓冲液混合，在1.5％琼脂糖凝胶(Bio-Rad超纯琼脂糖)中电泳，在1XTBE缓冲液中110伏电泳90分钟。电泳后DNA通过碱转移被转移到尼龙膜上(Reed and Mann，1985)，通过UV照射交连固定在膜上(Church and Gilbert，1984)，然后用2X SSC中和。膜在5X SSPE、1％SDS、10μg/ml同源混合RNA和0.5％脱脂奶粉和2.5×106cpm 32P标记的5′CAGGAGTCAGGTGCACCATGGT探针杂交。55℃杂交2小时。杂交后，膜在室温用6X SSC洗脱30分钟，共洗两次，然后用Bio-Rad GS-250分子显像仪扫描和定量。
扩增子污染试验
等量的LLA(1/26μ1)和PCR(1/16μl)产物(经显像仪定量(如上))，用双蒸水稀释104、105、106倍；这些稀释物用作PCR反应的DNA模板。扩增反应在包含Taq多聚酶缓冲液、模板DNA(LLA或PCR稀释物)、200μM每种dNTP(dATP、TTP、dCTP和dGTP)、5pmole寡核苷酸引物BGP1-22和BGP2-22，和1单位Ampli-Taq多聚酶的15μl反应体积中进行。反应分两份进行，第一步94℃热变性3分钟后，样品经25和30次扩增(55℃30秒、72℃30秒和94℃30秒)，最后在50℃保温30秒和在72℃保温4分钟。同时，包括一个含有除模板DNA外的所有试剂的阴性对照。
为了控制和定量LLA和PCR DNA模板的相对含量，用位于BGP1-22和BGP2-22内侧的不同的引物对(MD040和PC04)进行第二组PCR反应。反应成分(除引物)和反应条件如前一段所述。
15μl反应溶液与1.6μl 10X Ficoll加样缓冲液混合，在1.5％琼脂糖凝胶(Bio-Rad超纯琼脂)中电泳。电压110伏、1X TBE缓冲液中电泳90分钟。凝胶用溴化乙锭(1μg/ml)染色30分钟，脱色15分钟，在紫外光(UV)下照相。电泳的DNA通过碱转移被转移到尼龙膜上(Reed and Mann，1985)，经UV照射固定到膜上(Church(1984))。之后，膜于55℃在5X SSPE、1％SDS、10μg/ml同源混合RNA和0.5％脱水去脂奶粉中预杂交1小时，然后用2.5×106cpm的5′端用32P标记的CAGGAGTCAGGTGCACCATGGT探针杂交2小时，膜用6X SSC在室温洗脱30分钟两次，反应用Bio-Rad GS-250分子显像仪定量。
结果
测定用外侧引物对(测量在第二次反应中扩增子的扩增能力)与用内侧引物对(测量在反应中存在的扩增子的数量)扩增反应的杂交比。如下表所示，LLA反应产生的扩增子能抵抗来自外侧引物的扩增，因此，将抵抗夹带所致的污染。
表2污染对后续扩增的影响稀释 外测∶内侧(PCR) 外侧∶内侧(LLA)10-4 1.58 0.1710-5 1.62 0.02