黄酮苷类化合物在制备治疗和预防肝炎药物中的应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102379888 B (45)授权公告日 2013.04.24 CN 102379888 B *CN102379888B* (21)申请号 201110177780.3 (22)申请日 2011.06.29 A61K 31/7048(2006.01) A61P 1/16(2006.01) A61P 31/20(2006.01) A23L 1/29(2006.01) (73)专利权人 江西中医学院 地址 330004 江西省南昌市湾里区云湾路 18 号 (72)发明人 刘建群 舒积成 张锐 张维 潘景行 任晓静 CN 101011435 A,2007.08.08, 摘。

2、要 . CN 101045072 A,2007.10.03, 权利要求书 . Fraga, Cesar G. et al.Biochemical Pharmacology . Biochemical Pharmacology .1987,第36卷(第 5 期 ),717-20 页 . Cholbi, M. R. et al. Inhibitory effects of phenolic compounds on carbon tetrachloride-induced microsomal lipid peroxidation .Experientia .1991, 第 47 卷 ( 第 2 。

3、期 ),195-9 页 . Gordon, Paul B.et al.Protection by naringin and some other flavonoids of hepatocyticautophagy and endocytosis against inhibition by okadaic acid . Journal of Biological Chemistry .1995,第 270 卷 ( 第 11 期 ),5830-8 页 . (54) 发明名称 黄酮苷类化合物在制备治疗和预防肝炎药物 中的应用 (57) 摘要 本 发 明 属 于 制 药 领 域，三 个 黄 酮 苷 。

4、类 化 合 物 木 犀 草 素 -7-O-L- 鼠 李 糖 -(1 2)-D- 葡萄糖苷 （俗名忍冬苷） 、 芹 菜素 -7-O-L- 鼠李糖 -(1 2)-D- 葡萄 糖苷 （俗名野漆树苷） 、 木犀草素 -6-C-D- 葡萄 糖 -8-C-D- 木糖苷在制备预防或治疗肝炎的 药物或保健食品中的应用。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张婷 权利要求书 1 页 说明书 9 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书9页 (10)授权公告号 CN 102379888 B CN 102379888 B *CN102379888B* 1/1 。

5、页 2 1. 黄酮苷类化合物木犀草素 -7-O-L- 鼠李糖 -(1 2)-D- 葡萄糖苷或 芹菜素 -7-O-L- 鼠李糖 -(1 2)-D- 葡萄糖苷或木犀草素 -6-C-D- 葡萄 糖 -8-C-D- 木糖苷在制备预防或治疗肝炎的药物或保健食品中的应用。 2. 如权利要求 1 所述的黄酮苷类化合物与制剂允许的赋形剂或药用辅料组合在制备 预防或治疗肝炎的药物或保健食品中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102379888 B 1/9 页 3 黄酮苷类化合物在制备治疗和预防肝炎药物中的应用 技术领域 0001 本发明属于制药领域， 具体涉及通式代表的黄酮苷类化合物在制备治疗和预防 肝炎药物。

6、中的应用。 背景技术 0002 0002 肝炎是发病率和死亡率高、 危害严重的传染性疾病之一， 根据病因可分为 病毒性肝炎、 自身免疫性肝炎、 药物中毒性肝炎、 酒精性肝炎和其它感染因子引起的肝炎 等。肝炎中以病毒性肝炎对人类危害最大， 特别是乙型肝炎。目前， 全世界慢性乙型肝炎病 毒携带者已超过3.5亿， 我国是肝炎病毒感染的高流行地区， 约有超过1.2亿乙肝表面抗原 携带者， 慢性乙型肝炎还容易发展为肝硬化甚至肝癌， 每年约有 50 万人死于病毒性肝炎相 关疾病。 研究表明， 一些黄酮类化合物具有显著的治疗肝炎作用。 从水飞蓟种子中得到的水 飞蓟素、 异水飞蓟素及次水飞蓟素等黄酮类物质经动。

7、物试验及临床实践均证明有很强的保 肝作用， 临床上用以治疗急、 慢性肝炎， 肝硬化及多种中毒性肝损伤等疾病， 均取得了较好 的效果。水飞蓟素和水飞蓟宾能保护肝脏免受四氯化碳和毒伞素等的肝毒性损害， 水飞蓟 素还可以有效抑制由乙醇诱导的大鼠肝脏急性中毒而导致的谷胱甘肽缺乏症。 槲皮素和桑 黄素具有显著的保肝作用， 能够显著抑制微囊藻素在动物体内的肝毒性作用。另外 （+） - 儿 茶素在欧洲用作抗肝脏毒性药物， 对脂肪肝及因半乳糖胺或四氯化碳等引起的中毒性肝损 伤均有一定效果。 0003 凤尾草 （Pteris multifida Poir.） 为凤尾蕨科植物， 具有清热解毒、 凉血止血、 消 肿。

8、解毒等功效， 民间用于治疗肝炎、 菌痢、 淋浊、 便血、 扁桃体炎、 痈肿疮毒、 湿疹等。据文献 报道凤尾草主要化学成分有黄酮类、 萜类、 甾醇类、 苯丙素类和挥发油类等化合物。国内外 学者从凤尾草中分离鉴定的黄酮类化合物主要有芹菜素、 木犀草素、 槲皮素、 柚皮素和木香 素等为母核的黄酮苷和苷元。目前， 国内外均未明确阐明凤尾草治疗肝炎的药效物质基 础。为了寻找凤尾草治疗肝炎的药效活性成分， 发明人对凤尾草进行了系统的化学成分研 究， 结合治疗肝炎药效活性筛选， 发现治疗和预防肝炎作用的以下通式代表的三个黄酮 苷类化合物， 可应用于制备治疗和预防肝炎药物。 发明内容 0004 本发明所涉及的。

9、从凤尾草 （Pteris multifida Poir.） 中提取分离的黄酮苷类化 合物如通式所示 ： 0005 说 明 书 CN 102379888 B 2/9 页 4 0006 式 0007 其中 化合物编号R1R2R3R4 1H-Glc-2” -RhaHOH 2H-Glc-2” -RhaHH 3Glc HXyl OH 0008 化合物 1 ： 木犀草素 -7-O-L- 鼠李糖 -(1 2)-D- 葡萄糖苷， 俗名忍冬苷 0009 化合物 2 ： 芹菜素 -7-O-L- 鼠李糖 -(1 2)-D- 葡萄糖苷， 俗名野漆树苷 0010 化合物 3 ： 木犀草素 -6-C-D- 葡萄糖 -8-。

10、C-D- 木糖苷。 0011 本发明的目的是提供通式代表的化合物在制备预防和治疗肝炎， 包括乙型肝 炎、 免疫型肝炎、 酒精性肝炎和药物中毒性肝炎等肝炎药物和保肝保健食品中的应用。 0012 本发明是通过下述技术方案来实现的， 取江西产干燥凤尾草 （Pteris multifida Poir.） 经 70% 乙醇回流提取， 减压浓缩得稠浸膏， 用水混悬， 依次用石油醚、 乙酸乙酯、 正丁 醇萃取后， 剩余水相部分经大孔树脂柱、 聚酰胺柱、 Sephadex LH-20 凝胶柱色谱纯化， 溶剂 重结晶得化合物 13。 0013 化合物 1 ： 黄色粉末 ( 甲醇 )， mp261-262， Al。

11、Cl3和盐酸镁粉反应阳性 , Molish 反应阳性， 提示为黄酮苷类化合物。用盐酸加热水解后薄层色谱检测有木犀草 素、 鼠李糖和葡萄糖。ESI-MS m/z ： 595 M+H+， 593 M-H-, 449 M+H-Rhamnose+， 287 M+H-Rhamnose-glucose+ , 447M-H-Rhamnose -, 285M-H-Rhamnose-glucose-。根据 MS 和 NMR 信息确定化合物分子式为 C27H30O15。1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) : 6.75 ( s ,1H , H-3) , 6.38 ( d ,1H ,J = 1.8Hz。

12、 , H-6) , 6.74 (d ,1H ,J = 1.8Hz , H-8) , 7.41 (d ,1H ,J = 2.0Hz , H- 2 ) , 6.91 ( d , 1H ,J = 8. 3Hz , H-5 ) , 7.44 (dd ,1H ,J = 2.0Hz ,8.2 , H-6 ) , 13.00 ( s , 1H , OH-5), , 9.62( brs , 2H , OH-3 , 4 ) ,5.26 ( d ,J = 7.0Hz , H-1 ) , 5.14 ( s ,1H , H-1 ), 1.20 ( d ,3H , J = 6.2Hz , H-6) , 3.003.80。

13、 (m)。 13C-NMR (DMSO-d6): 164.4(C-2) , 103.2 (C-3) , 181.8 (C-4) , 161.1(C-5) , 97.7(C-6) , 162.5 (C-7) , 94.4 (C-8) , 156.9(C-9) , 105.4 (C-10) , 121.3 (C-1) , 113.5 (C-2) , 145.8 (C-3) , 149.9 (C-4 ) , 116.0 (C-5 ) , 119.1(C-6 ) , 99.2 (C-1 ) , 77.1(C-2 ) , 77.0 (C-3 ) , 69.6 (C-4 ) , 76.3(C-5 ) , 。

14、60.5 (C-6 ) , 100.4 (C-1 ) , 70.4(C-2 ) , 70.5 (C-3 ) , 71.8 (C-4 ) , 68.3 (C-5 ) , 18.0 (C-6 ) 。根据以上数据， 并与文献对照， 确定化合物 1 为木犀草素 -7-O-L- 鼠李 糖 -(1 2)-D- 葡萄糖苷， 俗称忍冬苷。 说 明 书 CN 102379888 B 3/9 页 5 0014 化合物 2 ： 黄色粉末 ( 甲醇 )， mp201-202， AlCl3和盐酸镁粉反应阳性 , Molish 反应阳性， 提示为黄酮苷类化合物。用盐酸加热水解后薄层色谱检测有芹菜素、 鼠李糖和 葡萄糖。E。

15、SI-MS m/z ： 579 M+H+， 601 M+Na+, 577 M-H-, 433 M+H-Rhamnose+， 271 M+H-Rhamnose-glucose+, 269 M-H- Rhamnose -glucose-。 根 据 MS 和 NMR 信 息确定化合物分子式为 C27H30O14。1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz): 7.93(2H, d, J = 8.8 Hz, H-2,6),6.96 (2H, d, J =8.8 Hz, H-3,5),6.86 (1H, s, H-3),6.80(1H, d, J =2.2 Hz, H-8),6.38 ( 1H, 。

16、d, J = 2.2 Hz, H-6 ) ,12.96 (1H, s, OH-5) ,10.48 (1H, s, OH-4 ), 5.22 ( 1H, d, J = 7.4 Hz, H-1 ),5.14(1H, d, J=1.3Hz, H-1),1.21(3H, d, J=6.2Hz, H-6)。 13C-NMR (DMSO-d6, 500MHz): 164.2 (C-2) , 103.1(C-3), 181.9(C-4), 156.9 (C-5), 99.3(C-6), 162.5(C-7), 94.5(C-8), 161.4 (C-9), 105.4(C-10) , 120.9(C-1),。

17、 128.5(C-2,6), 116.0(C-3,5), 161.0(C-4 ), 97.8 (C-1 ), 77.2(C-2 ), 77.0(C-3 ), 69.6 (C-4 ), 76.2(C-5 ), 60.4(6 ), 100.4 (C-1 ), 70.3(C-2 ), 70.4( C-3 ), 71.8(C-4), 68.2(C-5), 18.0(C-6)。 根据以上数据， 并与文献对照， 确定化 合物 2 为芹菜素 -7-O-L- 鼠李糖 -(1 2)-D- 葡萄糖苷， 俗称野漆树苷。 0015 化合物 3 ： 淡黄色粉末 ( 甲醇 )， mp283-284， AlCl3和盐酸镁粉。

18、反应阳性 , Molish 反应阳性， 提示为黄酮苷类化合物。ESI-MS m/z ： 581 M+H+， 579 M-H-。根 据 MS 和 NMR 信息确定化合物分子式为 C26H28O15。1H-NMR(DMSO,500 MHz): 4.75(1H, d, J=9.9Hz, H-1 of Glc), 4.69(1H, d, J=9.6Hz, H-1 of Xyl), 6.66(1H, s, H-3), 7.52(1H, dd, J=2.1,8.2Hz ， H-6 ), 7.47(1H, d, J=2.1Hz, H-2 ), 6.87(1H, d, J=8.1Hz, H-5 )。13C-N。

19、MR (DMSO,500 MHz): 164.2(C-2)， 102.5(C-3)， 182.1(C-4)， 155.0(C-5)， 108.0(C-6)， 105.6(C-8)， 158.2(C-9)， 103.6(C-10)， 119.4(C-1 )， 114.1(C-2)， 145.8(C-3)， 149.6(C-4)， 116.0(C-5) 121.9(C-6)， 74.2， 70.1， 73.8， 68.4， 69.5 ( C-1 -C-5 , of Xyl ) ， 73.2， 71.8， 78.9， 70.8， 82.0， 61.5 (C-1 -C-6 , of Glc) 。根据以。

20、上数据， 并与文献对照， 确定化合物 3 为木犀草 素 -6-C-D- 葡萄糖 -8-C-D- 木糖苷。 0016 通式代表的黄酮苷类化合物可以来源于凤尾草 （Pteris multifida Poir.） 或 其它植物， 也可以来源于化学合成、 半合成或生物转化。 0017 通式代表的黄酮苷类化合物或以其为基本活性的药物组合物可以与药学上合 适的辅料或载体结合， 采用公知方法制成注射剂、 片剂、 胶囊剂、 滴丸剂、 控释制剂、 缓释制 剂、 纳米制剂等制剂药物或保健食品， 用于肝炎预防和治疗。 0018 本发明对通式代表的黄酮苷类化合物进行了药效学评价试验。 0019 一、 黄酮苷类化合物对。

21、 CCl4致小鼠原代肝实质细胞损伤的影响试验 0020 采用二步胶原酶灌注技术分离获取小鼠原代肝实质细胞 ： 小鼠腹腔注射戊巴比妥 麻醉， 背位固定， 腹正中 V 形切口， 充分暴露门静脉， 经门静脉插管向肝脏灌注预温 37的 前灌流液 （无钙镁 Hank s 平衡盐溶液， 内含 0.5mM EGTA、 25mM HEPES， pH 7.4） ， 同时打开后 腔静脉， 冲干净肝组织中残血， 然后打开胸腔， 剪断前腔静脉， 结扎后腔静脉， 再用预温 37 的灌流液 （含 0.1% 胶原酶、 4mM CaCl2、 0.8mM MgSO4的 HBSS）继续灌流， 控制流速约 6ml/ min， 灌流。

22、数分钟至肝组织韧性消失， 轻压不易复原， 停止灌流， 将肝脏转移至冷的无血清 说 明 书 CN 102379888 B 4/9 页 6 RPMI-1640 液中， 用眼科镊除去肝包膜， 抖动分散肝细胞， 将肝细胞悬液过 100 目滤网， 滤液 离心 2min， 沉淀为肝实质细胞。 0021 在 96 孔板中加入肝实质细胞， 每孔细胞数为 2104， 于 37， 5%CO2培养箱中 培养 4h， 肝细胞单层用 William s E 培养液洗涤 2 次， 给药培养 3h， 弃去上清， 再加入 CCl4(0.15%) 和药物共培养 2h， 模型组只加 CCl4培养 2h， 取上清按试剂盒说明测谷丙。

23、转氨 酶 (ALT) 和谷草转氨酶 (AST) 活力。每组药物三个浓度 （100、 30、 10M） ， 每个浓度六个复 孔， 阳性药物为甘草酸二铵盐 （30M） 。实验结果见表 1。 0022 表 1 黄酮苷类化合物对 CCl4致小鼠原代肝实质细胞损伤的影响 0023 0024 注 ： 与模型组比较， *P0.05， *P0.01， *P0.005 0025 表 1 结果表明 ： CCl4模型组的 ALT 和 AST 活性明显高于正常对照组。黄酮苷类化 合物 1、 2、 3 均剂量依赖性地抑制 CCl4损伤后肝实质细胞 ALT 和 AST 水平的升高， 保肝降酶 活性优于相同浓度的阳性药甘草。

24、酸二铵盐。 0026 二、 黄酮苷类化合物对 CCl4所致小鼠急性肝损伤的影响试验 0027 实验采用常规 CCl4急性肝损伤模型， 具体方法如下 ： 0028 昆明种小鼠 60 只， 随机分为 6 组 （见表 1） ， 给药组按剂量每日灌胃给药 1 次， 对照 组和模型组同时给予等容量饮用水， 连续 6 日， 第五日上午给药后 1h， 模型组和各给药组小 鼠皮下注射 0.5%CCl4花生油 10ml/kg（体重） ， 正常对照组皮下注射等容量生理盐水， 当日 下午加强给药一次。禁食 12h 后， 于第六日上午给药后 1h 断头取血， 离心。按试剂盒说明 测定血清中 ALT 和 AST 活力单。

25、位， 结果见表 2。 0029 表 2 黄酮苷类化合物对 CCl4所致急性肝损伤小鼠血清转氨酶的影响 说 明 书 CN 102379888 B 5/9 页 7 0030 0031 注 ： 与模型组比较， *P0.05， *P0.01， *P0.005 0032 表 2 结果表明 ： 小鼠皮下注射 CCl4后 24h， 血清 ALT 和 AST 水平明显高于对照组。 化合物 13 高剂量组 （0.5g/kg） 和中剂量组 （0.3g/kg） 以及甘草酸二铵盐 （0.3g/kg） 连用 6 日， 可使血清中 ALT 和 AST 活力明显低于模型组， 化合物 13 高、 中剂量组效果优于阳性 对照药。

26、甘草酸二铵盐。实验结果表明本发明化合物 13 有明显的保肝降酶活性。 0033 三、 黄酮苷类化合物对 BCG+LPS 致大鼠原代肝实质细胞损伤的影响试验 0034 采用二步胶原酶灌注技术分离获取大鼠原代肝实质细胞 ： 取正常大鼠或卡介苗 （BCG） 致敏 12d 的大鼠， 乙醚麻醉， 开腹， 分离门静脉并经门静脉插管， 以预温 37的无钙 灌流液灌流肝脏， 剪断下腔静脉， 分离周围组织， 采用型胶原酶灌流液循环灌流数分钟， 取出肝脏转移至 4 MEM 培养液中， 用 MEM 培养液清洗 2 次， 用眼科镊除去肝包膜， 抖动分 散肝细胞， 将肝细胞悬液过 100 目滤网， 滤液离心 2min，。

27、 沉淀加培养液混悬均匀， 同条件重 复离心3次。 0.4%台盼蓝染色， 光镜计数细胞产量和活率， 活率在95%以上的肝细胞用于下 一步实验。 0035 将分离的正常或 BCG 致敏的大鼠肝细胞接种于 24 孔培养板中， 用 MEM 培养液稀释 成 2.5105细胞 / 孔， 于 37， 5%CO2培养箱中培养 16h， 换以不含血清和地塞米松的 MEM 培养液， BCG 致敏的大鼠肝细胞用 10mg/L 的脂多糖 (LPS) 攻击， 造成免疫型肝损伤细胞模 型， 分别加入测试药物和阳性药， 培养 16h， 收集培养孔内的细胞上清液， 按照试剂盒说明测 ALT、 AST、 LDH 活性和 NO 。

28、含量。每组药物三个浓度 （100、 30、 10M） ， 每个浓度六个复孔， 阳 性药物为甘草酸二铵盐 （30M） 。实验结果见表 3。 0036 表 3 黄酮苷类化合物对 BCG+LPS 致大鼠原代肝实质细胞损伤的影响 说 明 书 CN 102379888 B 6/9 页 8 0037 0038 注 ： 与模型组比较， *P0.05， *P0.01， *P0.005 0039 表 3 结果表明 ： BCG+LPS 模型组肝细胞上清液的 ALT、 AST、 LDH 活性和 NO 水平明显 高于正常对照组。黄酮苷类化合物 1、 2、 3 均剂量依赖性地抑制卡介苗联合脂多糖所致的免 疫性肝损伤后肝。

29、细胞 ALT、 AST、 LDH 和 NO 水平的升高， 化合物 1 效果优于同浓度的阳性药甘 草酸二铵盐， 化合物 2、 3 效果与同浓度的阳性药甘草酸二铵盐相当。 0040 四、 黄酮苷类化合物对酒精致大鼠原代肝细胞损伤的影响试验 0041 采用二步胶原酶灌注技术分离获取大鼠原代肝细胞。 将分离的大鼠肝细胞接种于 24孔培养板中， 用高糖DMEM培养液稀释成5.0105细胞/孔， 于37， 5%CO2培养箱中培养 24h后， 更换新鲜培养液， 分别加入测试药物和阳性药， 培养1h， 再加入100mM无水酒精共同 培养8h， 收集培养孔内的细胞上清液， 按照试剂盒说明测ALT、 AST、 M。

30、DA活性和SOD含量。 每 组药物三个浓度 （100、 30、 10M） ， 每个浓度六个复孔， 阳性药物为甘草酸二铵盐 （30M） 。 实验结果见表 4。 0042 表 4 黄酮苷类化合物对酒精致大鼠原代肝细胞损伤的影响 0043 说 明 书 CN 102379888 B 7/9 页 9 0044 注 ： 与模型组比较， *P0.05， *P0.01， *P0.005 0045 表 4 结果表明 ： 酒精模型组肝细胞上清液的 ALT、 AST 和 MDA 活性明显高于正常对 照组， SOD 水平明显低于正常对照组。黄酮苷类化合物 1、 2、 3 均剂量依赖性地抑制酒精损 伤后肝细胞 ALT、。

31、 AST 和 MDA 水平的升高， 升高 SOD 水平， 说明黄酮苷类化合物 13 能减小酒 精性肝细胞损伤程度， 降低脂质过氧化， 提高内源性抗氧化能力， 具有护肝保健作用。化合 物 1 效果优于同浓度的阳性药甘草酸二铵盐， 化合物 2、 3 效果与同浓度的阳性药甘草酸二 铵盐相当。 0046 五、 黄酮苷类化合物对雷公藤甲素致人正常肝细胞 （L-02） 损伤的影响试验 0047 采用 MTT 法实验 ： 0048 将人正常肝细胞 （L-02） 复苏后， 取处于对数生长期的细胞， 用胰酶消化后， 调整 细胞悬液浓度为 1106/ml， 以 10% 小牛血清的 DMEM 培养基均匀接种于 96。

32、 孔培养板中， 每 孔 100l（边缘孔用无菌 PBS 填充） 。5%CO2， 37孵育培养 24h 后， 弃去培养液， 分别加入 40g/ml 雷公藤甲素 （TP） ， 正常对照组除外， 继续培养 24h 后， 弃去培养液， 再分别加入 0， 75， 150， 300g/ml 不同剂量的受试药物和谷胱甘肽 (GSH) 阳性对照药。每组设 6 个复孔， 另设正常对照孔和调零孔。5%CO2， 37孵育 24h 后各孔加入 20l 0.5% 的 MTT， 37 避光 说 明 书 CN 102379888 B 8/9 页 10 培养 4h。终止培养， 小心弃上清液， 各孔加入 100lDMSO， 混。

33、匀， 振荡器振荡 10min， 使结晶 物充分溶解。酶标仪在波长 490 nm 处测定其吸光度值 （A） ， 以吸光度值 （A） 间接反映 L-02 在培养孔中的增殖密度。并以正常组细胞 A 值为 100%， 其余组 A 值与正常组 A 值相除得细 胞存活率 （%） 。实验结果见表 5。 0049 表 5 黄酮苷类化合物对雷公藤甲素致人正常肝细胞 （L-02） 损伤的影响 0050 0051 注 ： 与模型组比较， *P0.05， *P0.01， *P0.005 0052 表 5 结果表明 ： 黄酮苷类化合物 1 和 3 在体外能够明显改善由 TP 诱导的 L-02 细 胞的体外损伤， 特别是。

34、化合物 1 能剂量依赖性地明显改善由 TP 诱导的 L-02 细胞的体外损 伤， 改善效果显著优于阳性对照组 GSH ； 化合物 2 能稍微的改善由 TP 诱导的 L-02 细胞的体 外损伤， 其改善的程度与阳性对照组 GSH 相当。说明化合物 13 对雷公藤甲素药物中毒性 肝损伤有保护作用。 具体实施方式 0053 下面通过实施例做进一步描述， 但本发明并不限于实施例所述范围。 0054 实施例 1 ： 0055 将干燥凤尾草全草 15kg， 粉碎， 用 150 升 70% 乙醇在室温下浸泡 12h 后加热回流 提取 3 次， 每次 2h， 合并滤液， 减压浓缩得浸膏。浸膏加 4 倍量水分散。

35、， 依次用石油醚、 乙酸 说 明 书 CN 102379888 B 9/9 页 11 乙酯、 正丁醇萃取， 将水相减压浓缩， 得水部位 1kg。将水部位上 LSA-40 型大孔树脂柱吸附 3h 后， 以 4 5ml/min 速度依次用蒸馏水、 20%、 50%、 70%， 95% 乙醇洗脱， 得各洗脱部位， 收集 50-70% 乙醇洗脱液， 减压蒸干， 得 40g 浸膏。将该 40g 浸膏上聚酰胺 （60-100 目） 柱层析， 依次用蒸馏水、 25 % , 50 %， 75 %， 95 % 乙醇洗脱， 聚酰胺薄层色谱检测合并相同流份， 收 集 50% 乙醇洗脱液， 减压蒸干， 得 50% 乙。

36、醇洗脱流份浸膏 8g。将 50% 乙醇洗脱流份浸膏经 Sephadex LH-20 柱层析， 5% 甲醇水洗脱， 每个流份收集 5 ml， 薄层色谱检测合并相同流份， 减压挥干溶剂， 甲醇重结晶， 得化合物 1（30mg) 和 化合物 2（35mg)。 0056 收集经大孔树脂柱用 20% 乙醇洗脱液， 减压蒸干， 得 45g 浸膏。将该 45g 浸膏上聚 酰胺 （60-100 目） 柱层析， 依次用蒸馏水、 25 % , 50 %， 75 %， 95 % 乙醇洗脱， 聚酰胺薄层色 谱检测合并相同流份， 收集25%乙醇洗脱液， 减压蒸干， 得25%乙醇洗脱流份浸膏7g。 将25% 乙醇洗脱流份。

37、浸膏经 Sephadex LH-20 柱层析， 5% 甲醇水洗脱， 每个流份收集 5 ml， 薄层色 谱检测合并相同流份， 减压挥干溶剂， 甲醇重结晶， 得化合物 3（20mg)。 0057 实施例 2 ： 0058 化合物 13 的片剂制备 ： 取 100mg 化合物 1 或化合物 2 或化合物 3 与淀粉 50mg， 糊精 50mg 混合， 用适量 30% 乙醇做湿润剂， 制成软材， 用常规方法制粒， 加入适量硬脂酸镁 混合， 制成片剂。 0059 实施例 3 ： 0060 化合物13的胶囊剂制备 ： 取100mg化合物1或化合物2或化合物3与淀粉120mg， 糊精20mg， 糖粉20mg混合， 用适量30%乙醇做湿润剂， 制成软材， 用常规方法制粒， 装入硬胶 囊中， 即得。 0061 实施例 4 ： 0062 化合物 13 的缓释胶囊剂制备 ： 取 100mg 化合物 1 或化合物 2 或化合物 3 与羟丙 基甲基纤维素 K15M 120mg， 乙基纤维素 45cps 40mg， 乳糖 40mg 混合， 加适量 10% 聚乙烯吡 咯烷酮 k30 乙醇溶液， 制成软材， 用常规方法制粒， 装入硬胶囊中， 即得。 说 明 书 CN 102379888 B 。