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1、(10)申请公布号 CN 102526140 A (43)申请公布日 2012.07.04 CN 102526140 A *CN102526140A* (21)申请号 201210048101.7 (22)申请日 2012.02.28 A61K 36/185(2006.01) A61K 125/00(2006.01) (71)申请人 陕西中医学院 地址 712046 陕西省咸阳市世纪大道陕西中 医学院 (72)发明人 白吉庆 王小平 (54) 发明名称 藤梨根提取物及其制备方法 (57) 摘要 本发明涉及藤梨根提取物及其制备方法， 具 体制备方法详见说明书， 本发明的优点是提取物 含总黄酮大于。
2、 50， 具有良好的抗肿瘤作用， 按 常规工艺制备颗粒剂、 片剂、 硬胶囊剂、 软胶囊剂、 滴丸剂、 口服液等剂型。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 1/1 页 2 1. 藤梨根提取物， 其特征在于 ： 藤梨根用 40-80的乙醇回流， 提取三次， 合并提取液， 浓缩， 浓缩液上大孔树脂柱， 先用1-3倍柱体积的水洗脱， 再用3-5倍柱体积的50-70的乙 醇洗脱， 洗脱液减压浓缩至干， 得藤梨根提取物。 2.根据权利要求1所述的提取物， 其特征在于 ： 藤梨根提取物中总。
3、黄酮含量大于50。 3. 根据权利要求 1 所述的提取物， 其特征在于 ： 提取物干粉和药用辅料一起制成颗粒 剂、 片剂、 硬胶囊剂、 软胶囊剂、 滴丸剂或口服液等制剂。 权 利 要 求 书 CN 102526140 A 2 1/4 页 3 藤梨根提取物及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及中药提取物， 具体的说是藤梨根提取物及其制备方法。 背景技术 0002 藤梨根内含黄酮类、 三萜类、 酚类、 蒽醌类、 甾体类和糖类等化合物， 藤梨根别名圆 枣子、 藤梨、 洋桃藤， 具有健胃、 清热、 利湿的功效， 在民间常用于食道癌、 胃癌、 大肠癌、 乳腺 癌的治疗， 并取得了一定的疗效。 并且。
4、在临床上， 藤梨根在抗肿瘤方面， 抗炎和抗病毒方面， 抗氧化和保肝方面， 免疫调节等方面， 均有应用。许多研究认为， 藤梨根的这些作用与其黄 酮类成分有密切关系。 藤梨根提取物由于成分复杂而使制成的制剂不可避免的出现粗、 大、 黑的缺点， 且提取物中含有吸湿性成分限制了剂型的选择， 因此对藤梨根提取物需要进行 纯化， 使纯化后的产品符合中药新剂型的需要。 0003 中药黄酮类化合物的纯化， 传统采用溶剂萃取法和聚酰胺柱层析， 但溶剂萃取操 作麻烦， 且萃取过程易乳化， 萃取所用的有机溶剂如氯仿、 乙酸乙酯等具有不同程度的毒 性。聚酰胺纯化对藤梨根中的黄酮类成分而言吸附较差。因此， 上述两种方法。
5、在藤梨根黄 酮类成分的纯化中不够理想， 而大孔树脂在中药提取物纯化中的应用日渐广泛， 已用于纯 化黄酮等中药成分。 发明内容 0004 本发明的目的在于 ： 克服现有技术中存在的不足之处， 提供制备方便， 疗效好的藤 梨根提取物及其制备方法。 0005 本发明是这样实现的 ： 藤梨根用 40-80的乙醇回流， 提取三次， 合并提取液， 浓 缩， 浓缩液上大孔树脂柱， 先用1-3倍柱体积的水洗脱， 再用3-5倍柱体积的50-70的乙醇 洗脱， 洗脱液减压浓缩至干， 得藤梨根提取物。 0006 藤梨根提取物(总黄酮含量大于50)和药用辅料一起制成颗粒剂、 片剂、 硬胶囊 剂、 软胶囊剂、 滴丸剂或。
6、口服液等制剂。 0007 大孔树脂可以是苯乙烯骨架或其他类型， 如 D101、 D201、 D301、 DM301、 AB-8、 HP 系 列、 ADS 系列等。用大孔树脂吸附有效部位， 再用 50-70的乙醇从大孔树脂上洗脱， 乙醇的 浓度以 60较好， 洗脱液回收乙醇并浓缩， 经减压干燥或喷雾干燥成， 得提取物。 0008 本发明和现有技术相比具有如下优点 ： 本发明提供的纯化方法操作简便、 快捷， 用 乙醇进行洗脱廉价、 无毒， 纯化物中总黄酮的含量达 50以上， 且提取物具有明显的抗肿瘤 作用。 0009 为证实得到的产品具有显著疗效的效果， 我们进行了一系列药效学实验 ： 现以本 发。
7、明颗粒剂对人胃癌 SGC-7901 细胞的影响为例， 说明本发明的主要药效作用如下 ： 0010 一、 对人胃癌 SGC-7901 细胞凋亡的影响。 0011 方法 ： 取对数生长期 SGC-7901 1105培养于 50ml 培养瓶中 24h， 本发明颗粒剂 浓度分别为 4， 8， 16mgml-1， 康力欣胶囊 8g/ml 和空白对照组。共同培养 48h， 0.25胰 说 明 书 CN 102526140 A 3 2/4 页 4 酶消化， PBS 冲洗 2 次， 用 100l 含钙离子 buffer 重悬， 加 5l Annex V-FITC 染料染色 20 30min， 加 5l PI 。
8、燃料染色 5min， 加入适量含钙离子 buffer 调整细胞浓度到 1105 个 /ml 左右， 上流式细胞仪检测。激发波长为 488nm， 发射波长 530nm。 0012 结果 ： 对 SGC-7901 细胞凋亡的影响 ： 与对照组相比， 4 16mgml-1本发明颗粒 剂不同程度的促进 SGC-7901 凋亡， 在 4mgml-1本发明颗粒剂以促进 SGC-7901 凋亡为主 (32.5 )， 在 16mgml-1本发明颗粒剂以促进 SGC-7901 坏死为主 (29.9 )。结果见表 1 0013 表 1 对 SGC-7901 细胞坏死、 正常和凋亡的影响 0014 0015 注 ：。
9、 与空白对照组比较， *P 0.01 0016 二、 对人胃癌 SGC-7901 细胞瘤 p53、 Bcl-2 基因表达的影响 0017 造模 ： BALB/C-nu/nu 裸小鼠根据体重的大小随机为五组， 每组 6 只， 取指数增殖期 SGC-7901 细胞， 用 0.25胰蛋白酶消化制成单细胞悬液， 调整细胞密度至 1.0x107 ml-1， 台 盼蓝染色计数活细胞占 95以上， 于每只裸鼠右后肢腋下皮下接种 2.0x 106个 0.2ml-1细 胞。按照分组给药 ： 空白对照组每天灌胃蒸馏水 ； 康力欣胶囊阳性药物组按 8mgml-1浓度 灌胃 ； 本发明颗粒剂按大 (16mgml-1)。
10、、 中 (8mgml-1)、 小 (4mgml-1) 剂量分组给药。各 组每天灌胃一次， 每次 0.4ml， 共 21d。 0018 p53 基因蛋白表达的测定 ： 采用 10中性甲醛溶液固定瘤块， 24h 内进行石蜡包 埋、 切片。用涂有 Poly-Lysine 的磨沙载波片捞片。采用 SABC 法染色， 将上述石蜡切片经 二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化后， 加入3H2O2甲醇溶液， 室温下孵育10min， 以阻断内源性过 氧化物酶， 消除非特异性染色 ； 在 0.01M 枸橼酸盐缓冲液 (pH 6.0) 中进行热抗原修复 ； 滴 加 5 BSA 封闭液， 室温 20min ； 再加入 1 100。
11、 稀释的鼠抗人 p53 单克隆抗体， 37 1 小时 后滴加生物素化羊抗鼠 IgG， 于 37湿盒中温育 20min 后加入 SABC， 再温育 20min( 上述各 步骤之间皆用 PBS 洗涤 3 次， 每次 5min)， DAB 显色镜下控制 5 10min， 显色完成后用自来 水冲洗 3min 以终止反应， 最后以苏木精对比染色， 脱水， 透明， 封固， 镜下观察， 核染色呈棕 黄色者为阳性细胞。每张切片观察 5 个高倍视野， 计算灰度值。 0019 Bcl-2 基因蛋白表达的测定同 P53 检测法封片后， 再加入 1 50 稀释的鼠抗人 Bcl-2 蛋白单克隆抗体， 置于 4冰箱中过夜。
12、后滴加生物素化羊抗鼠 IgG， 于 37湿盒中 温育 30min 后加入 SABC 复合物， 再温育 30min( 上述各步骤之间皆用 PBS 洗涤 3 次， 每次 5min)， DAB 显色， 镜下控制 5 10min， 显色完成后用自来水冲洗 3min 以终止反应， 最后以 苏木精对比染色， 脱水， 透明， 封固， 镜下观察， 核染色呈棕黄色者为阳性细胞。每张切片观 察 5 个高倍视野， 采用图象分析系统分析阳性表达。 说 明 书 CN 102526140 A 4 3/4 页 5 0020 结果 ： 与阴性对照组比较， 本发明颗粒剂各给药组均有显著的统计学意义 (P 0.01) ； 本发明。
13、颗粒剂大、 中剂量组的 p53 阳性灰度值高于阴性对照组。与康力欣胶囊组 比较， 本发明颗粒剂大、 中剂量组有统计学意义 (P 0.05)。表明， 在本次试验采用的剂量 范围内， 本发明颗粒剂剂量与 p53 阳性灰度值正相关。 0021 见表 2 0022 表 2 对裸鼠移植人胃癌 SGC-7901 细胞瘤 p53 基因蛋白影响 0023 0024 注 ： 与康力欣胶囊组比较P 0.05 ； 与对照组比较 *P 0.01。 0025 与阴性对照组比较， 本发明颗粒剂各给药组均有显著的统计学意义 (P 0.01) ； 本发明颗粒剂大、 中剂量组的 Bcl-2 阳性灰度值高于阴性对照组 ； 与康力。
14、欣胶囊组比较， 本 发明颗粒剂大、 中剂量组有统计学意义(P0.05)。 本次实验表明， 在本次试验采用的剂量 范围内， 本发明颗粒剂剂量中、 小剂量与 Bcl-2 阳性灰度值正相关。见表 3 0026 表 3 对裸鼠移植人胃癌 SGC-7901 细胞瘤 Bcl-2 基因蛋白影响 0027 0028 注 ： 与康力欣胶囊组比较P 0.05 ； 与对照组比较 *P 0.01。 0029 上述实验说明本发明颗粒剂可能是通过抑制p53基因、 下调bcl-2基因表达， 诱导 人胃癌 SGC-7901 细胞凋亡， 从而延缓细胞分裂增殖速度， 抑制胃癌细胞的生长， 达到抗癌 目的。本发明的片剂、 硬胶囊剂。
15、、 软胶囊剂、 滴丸剂或口服液的主要药效学与颗粒剂实验数 据相近， 结论相同。 具体实施方式 0030 实施例 1 ： 取藤梨根饮片， 加 10 倍量的 40的乙醇， 回流提取， 每次 1.5h， 提取 3 次， 过滤， 合并滤液， 浓缩， 浓缩液上大孔树脂柱， 先用 3 倍柱体积的水洗脱， 再用 3 倍柱体 积的 50的乙醇洗脱， 洗脱液回收乙醇并浓缩， 经减压干燥， 得提取物， 备用 ； 然后将上述 提取物使用含10低取代羟丙基纤维素(L-HPC)的80乙醇液作为黏合剂， 以干粉双歧 说 明 书 CN 102526140 A 5 4/4 页 6 糖淀粉为 10 3 2 的比例置于制粒机搅拌。
16、， 制成颗粒剂， 即得。 0031 实施例 2 ： 取藤梨根饮片， 加 8 倍量的 80的乙醇， 回流提取， 每次 1h， 提取 3 次， 过滤， 合并滤液， 浓缩， 浓缩液上大孔树脂柱， 先用 1 倍柱体积的水洗脱， 再用 5 倍柱体积 的 70的乙醇洗脱， 洗脱液减压浓缩， 喷雾干燥， 得提取物， 备用 ； 然后将上述提取物加入 15的 CMS-Na， 用 5 PVP 的乙醇溶液为粘合剂， 压制成片， 即得。 0032 实施例 3 ： 取藤梨根饮片， 加 12 倍量的 60的乙醇， 回流提取， 每次 1h， 提取 3 次， 过滤， 合并滤液， 浓缩， 浓缩液上大孔树脂柱， 先用 2 倍柱体积的水洗脱， 再用 4 倍柱体积的 60的乙醇洗脱， 洗脱液减压浓缩， 喷雾干燥成提取物， 备用 ； 将上述备用物与麦芽糊精， 微 晶纤维 (MCC)， 硬脂酸钙混匀， 装入胶壳中， 即得。 0033 实施例 4 ： 取藤梨根饮片， 加 14 倍量的 70的乙醇， 回流提取， 每次 1h， 提取 3 次， 过滤， 合并滤液， 浓缩， 浓缩液上大孔树脂柱， 先用 2 倍柱体积的水洗脱， 再用 4 倍柱体积的 60的乙醇洗脱， 洗脱液减压浓缩成清膏， 加水至 1000ml， 滤过， 灌装， 灭菌， 即得。 说 明 书 CN 102526140 A 6 。