纳他霉素的制备方法 【技术领域】
本发明属于发酵生产纳他霉素的方法，涉及以褐黄孢链霉菌为菌种，采用国内培养基，通过控制条件发酵和蒸发去甲醇法提取纳他霉素的制备技术。
背景技术
纳他霉素(或叫匹马菌素或田纳西菌素)是一种多烯大环内酯类抗真菌抗生素，分子量约为666Dal，相应的实验分子式为C33H47NO13，为两性物质，等电点约为6.5。纳他霉素对几乎所有的真菌具有极强的抗生物活性，对细菌无效。目前，纳他霉素被广泛用做生物食品防腐剂，在医药等领域也有相关的应用。虽然人们已经认识到它有高价值的抗生素特性，但由于其生产成本太高，使国内的相关商业运作受到限制。
早在1960年，英国专利846,933中就描述了生产纳他霉素的传统发酵方法，但生产效率不高。在中国专利CN1070688A、CN1071460A和CN1072959A中提供的生产纳他霉素方法，他们所用的培养基商标为Difco，在国内难以买到，即使买到其价格也是较高的。
目前现有技术从发酵液中提取纳他霉素的工艺，要求发酵液的浓度需大于2％。由于它在各种溶液里地溶解度都不高，特别是在国内纳他霉素的相关研究中其制备的纳他霉素含量＜2g/L，所以纳他霉素的提取过程没有经济性，故当前需要一种比较经济的纳他霉素提取工艺。在美国专利846933中，描述了用甲醇提取纳他霉素的方法，其步骤包括吸附和洗脱；美国专利3892850中，用酸性丁醇提取纳他霉素，再蒸馏最后沉淀，其中还提出用CaCl2增大纳他霉素在甲醇中的溶解度，但这些工艺均需昂贵的费用，(像吸附，洗脱，蒸馏和蒸发；)另外，在专利WO9507998中，公开了通过在发酵液中加入甲醇，然后将其pH值调至1.0至4.5以溶解已沉淀的纳他霉素，除去其他固体后，再将pH值调至6.0-9.0，使纳他霉素沉淀出来的方法，但是这种提取工艺会产生一种副产物—纳他霉素甲酯。
综上所述，不难看出，发酵生产及提取纳他霉素中的问题是影响其推广应用的关键。为此，研究和开发一种经济、实用的纳他霉素的制备、提取方法是当务之急。
【发明内容】
本发明解决了发酵生产纳他霉素使用国外培养基，在国内难以买到，并且价格较高及从发酵液提取纳他霉素工艺复杂、费用昂贵或者有副产物的问题；提供了一种经济、实用，采用国内培养基，通过控制条件发酵和蒸发去甲醇法提取纳他霉素的制备工艺。
技术方案：
本发明是利用发酵法生产纳他霉素，其菌种采用褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)，经孢子悬浮液的制备、种子培养、发酵、提取工序；通过控制pH值和溶解氧水平，以及在发酵期间分批次流加葡萄糖进行生产纳他霉素，并采用低温蒸发法去除甲醇提取纳他霉素。具体步骤包括如下：
(一)制备纳他霉素发酵液
●孢子悬浮液的制备
生产菌种为褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)其原始菌种是从美国典型培养物收集中心处获得，其保藏号为ATCC 13326，通过DES和UV诱变，筛选高产菌株，将该生产菌株在琼脂斜面上生长4-8天后，4℃保藏待用。需要指出，新长好的琼脂斜面孢子可以经4℃冰箱保藏5～15天后使用。其中，制作孢子悬浮液采用的液体为无菌水或新鲜种子培养基，灭菌条件为：121℃，灭菌20～30min。孢子浓度选择为108个/mL。这是因为不同孢子悬浮液浓度对种子生长状态的影响不同，具体见下表。
孢子浓度 种子生长状态
(个/mL) 菌体形态 种子进入对数生
长期的时间(h)
105 种子液澄清，有菌丝体结团现象 45
106 种子液较澄清，有大小不均匀的菌丝体颗粒形 39
成
107 种子液变浑浊，有均匀大量的菌丝体颗粒，颗 29
粒直径约为1-1.5mm
108 种子液浑浊，有极细密的大小均一的菌丝体微 24
粒，微粒直径约0.1-0.5mm
109 种子液浑浊且非常粘稠，无菌丝体微粒 21
由上表可见孢子浓度选择109个/mL以上和107个/mL以下时不可取。
●种子培养
种子培养基：由碳源、氮源、无机离子和微量元素组成，即：
普通蛋白胨 4-8g/L
酵母粉 4-8g/L
葡萄糖 15-30g/L
NaCl 8-15g/L
pH 7.0
将制备好的孢子悬浮液加入到上述种子培养基中，其灭菌条件为120～125℃，灭菌15～25min；在摇床上200rpm转速下，28～30℃培养20～28h。在培养过程中不需要搅拌和通气，即可得到适合接种的种子培养物。
●发酵制取纳他霉素
发酵培养基组成：
大豆蛋白胨 15-30g/L
酵母粉 3.6-5.1g/L
葡萄糖 32-48g/L
pH 7.5
其中，大豆蛋白胨和酵母浸粉，采用北京双旋微生物培养基制品厂生产的产品，同样获得了可观的纳他霉素产量。发酵培养基灭菌采取大豆蛋白胨和酵母粉一起灭菌，条件为120～125℃ 15～25min；葡萄糖单独灭菌，条件为114～118℃ 15～25min。
将长好的种子接入到经灭菌的发酵培养基中，按2％的体积比接种。接入的种子量对纳他霉素的影响较大，当按发酵液体积比＞4％接种时，发酵液比较粘稠，产量不高；而接种量＜1％时，延迟期较长，同时发酵液中菌丝球较大，不利于溶解氧的传递；因此经考察后发现按发酵液体积比2％接种比较经济和利于纳他霉素的生产。
在发酵过程中，因生产菌的繁殖与代谢，必然有泡沫产生，因此需要流加消泡剂，控制泡沫，常用的消泡剂为硅酮和聚醚类，任何一种消泡剂均可用来控制泡沫，只要流加的消泡剂不影响纳他霉素的合成即可。其中优选消泡剂为聚醚类。
发酵过程中，因生产菌的代谢，发酵液的pH不断下降，经对发酵过程中产酸分析，发现当控制pH在5.5～6.0时更有利于纳他霉素的合成。
同时还需不断分批次流加50％的葡萄糖，(葡萄糖灭菌方法同上)。在流加葡萄糖的过程中，补料方式对纳他霉素的合成也有一定影响。其补料的目的是使发酵培养基中维持一定量的葡萄糖，这样即不影响纳他霉素的代谢，同时有利于合成纳他霉素。经比较，多次少量的补料方式流加葡萄糖以维持葡萄糖浓度在2％水平比少次多量方式维持葡萄糖浓度在2％水平好。
因纳他霉素的合成走的是脂肪酸合成途径，TCA循环较弱，故需要氧不是很高，但在代谢和合成纳他霉素的过程中仍需要一定的溶解氧存在。若溶解氧控制过高，使生产菌代谢过于旺盛，反而不利于纳他霉素的合成；若溶解氧太低，也不利于纳他霉素的代谢和合成，故在发酵过程中控制溶解氧水平尤为重要。本发明就是通过调节发酵罐的通气量、转速和罐压，控制发酵液中溶解氧水平在10～30％，发酵96～168h后即可得到含4.0～5.6g/L纳他霉素的发酵液。
(二)从发酵液中提取纳他霉素
该步骤包括：浓缩发酵液；加入甲醇，升高pH；去除菌丝体；再降低pH，蒸发甲醇；回收沉淀、进行干燥得到纳他霉素固体；其具体方法是：
●浓缩发酵液
本发明所需的提取液为任意浓度的纳他霉素发酵液。纳他霉素在提取液中的溶解度随着水的增加而减少，故发酵液体积的减少有利于减少甲醇的用量。浓缩发酵液可任选一种浓缩液体的方法，如蒸发、过滤、离心或离心过滤法。
采用蒸发法浓缩发酵液时，使发酵液浓缩到原体积的1/2以下；
采用过滤法浓缩发酵液时，其滤布孔径不应太大，尽量减少发酵液中的悬浮物透过滤布；
采用重力离心处理时，检测离心上清液中纳他霉素的含量，选择一个合适的转速使发酵液中的悬浮物离心下来；
采用离心过滤法处理时，可将离心和过滤结合起来，在离心的过程中，同时完成过滤。
●加入甲醇、升高pH
纳他霉素在甲醇中有较好的溶解度，且随着pH的升高其溶解度增大，故当发酵液浓缩之后可向上述浓缩的发酵液中加入甲醇，并加碱调节pH到10～11，使浓缩液中的纳他霉素完全溶解。需要说明的是，所加甲醇的量也可以为浓缩前发酵液体积的1/2。因纳他霉素是两性物质，等电点为6.5，故将加入甲醇的浓缩液的pH降低或升高均可使纳他霉素的溶解度升高，使纳他霉素能够完全溶解。本发明采用加碱的方法(所用碱为氢氧化物，如氢氧化钾或氢氧化钠)调节pH到10～11，此时，浓缩液从匀质状态变为固液分离状态，其中固体为菌丝体，悬浮于处理液中。
●去除菌丝体
可采用任何固液分离的方法除去固体悬浮物，如采用重力离心或过滤的方法除去菌丝体；
●降低pH、蒸发去甲醇
加酸调节pH到6.5～7.5，使溶解的纳他霉素部分沉淀下来。为保持纳他霉素的活性，采用低温蒸发去除甲醇，降低纳他霉素的溶解度，加速纳他霉素的沉淀；即任选一种蒸发液体的方法，如自然挥发、加热蒸发、真空蒸发或薄膜蒸发，将甲醇从处理液中除去。蒸发温度一般控制在20～80℃。其蒸发温度也可控制在35℃～45℃。在该温度下，蒸发速度较快，同时也能较好的保持纳他霉素的活性。将甲醇蒸发后，可见处理液中厚厚的白色沉淀。
●固液分离和干燥
将上述结晶的纳他霉素，任选一种固液分离的方法，如过滤或离心得到沉淀；再经水多次洗涤，使获得的固体颜色成为白色；或者通过以上的方法再次对获得的纳他霉素进行重结晶，或用活性炭脱色处理，提高纳他霉素的纯度；最后进行干燥。任何干燥的方法均是可行的，其方法如常温干燥、真空干燥、喷雾干燥或真空冷冻干燥等。需要指出，进行干燥易采用真空干燥法，其温度控制在＜80℃；即可得到纯度不小于80％的纳他霉素。
有益效果
本发明包括纳他霉素的发酵法生产和纳他霉素的提取两方面技术。本技术提供了制备、提取纳他霉素的新工艺技术。解决了生产纳他霉素使用国外培养基，在国内难以买到，并且价格较高及从发酵液提取纳他霉素工艺复杂、费用昂贵或有副产物的问题。其生产方法显著特点是在一级种子培养中不需要往种子液中通气和搅拌，且发酵中纳他霉素的含量达到4-5.6g/L。这样，不仅简化了工艺，而且提高了产率，降低了生产成本。其提取方法适于任意浓度的纳他霉素发酵液，所得到的纳他霉素纯度达到80％以上。该提取纳他霉素的方法同样适用于本发明之外的发酵液的提取。本发明经济、实用、促进其生产的工业化进程；为纳他霉素的广泛应用提供了先决条件；既有经济效益又有社会效益。
【具体实施方式】
实施例1：
生产菌种为褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)，其原始菌种是从美国典型培养物收集中心处获得，其保藏号为ATCC 13326，通过DES和UV诱变，筛选高产菌株。将该生产菌株在琼脂斜面上生长5天后，经4℃冰箱保藏10天后使用。其中，制作孢子悬浮液采用的液体为无菌水或新鲜种子培养基。灭菌条件为：121℃，灭菌20～30min。孢子浓度选择108个/mL。
种子培养基由碳源、氮源、无机离子和微量元素组成，即：
普通蛋白胨 6g/L
酵母粉 6g/L
葡萄糖 20g/L
NaCl 10g/L
pH 7.0
将制备好的孢子悬浮液加入到上述种子培养基中。灭菌条件为120～125℃，灭菌15～25min；在摇床上200rpm转速下，28～30℃培养24h。在培养过程中不需要搅拌和通气，即可得到适合接种的种子培养物。
发酵培养基组成：
大豆蛋白胨 20g/L
酵母粉 4.5g/L
葡萄糖 40g/L
pH 7.5
其中，大豆蛋白胨和酵母浸粉，采用北京双旋微生物培养基制品厂生产的产品。发酵培养基灭菌采取大豆蛋白胨和酵母粉一起灭菌，条件为120～125℃ 15～25min；葡萄糖单独灭菌，条件为114～118℃ 15～25min。
将长好的种子按照2％的接种量接入到5L发酵罐中，发酵初始通风量为0.4v/v-min(单位体积培养基每分钟通气量)，转速为200rpm。在发酵过程中，通过流加氢氧化钠维持发酵液pH为5.6。以多次少量法(按30g/次补加4次)补加50％葡萄糖以维持发酵液中葡萄糖含量为2％，同时加入聚醚类消泡剂以控制发酵液的泡沫水平。随着发酵的进行，不断提高通风量和搅拌转速以维持发酵液中溶解氧水平在10～20％；最高通风量达到1.2v/v-min，最高转速达到600rpm。在28-30℃下，发酵142h，共消耗葡萄糖80g/L。纳他霉素产量达到4.8g/L。
取2.5L上述发酵液，在3500rpm转速下，离心20min，获得纳他霉素和菌丝体固体混合物。加入1.25L甲醇，用氢氧化钠调节pH到10.5，使纳他霉素完全溶解；之后离心除去菌丝体，再用盐酸调节pH到7，在45℃下薄膜蒸发除去甲醇；离心；-50℃真空冷冻干燥。获得10.2g纳他霉素；纯度达到82％。
实施例2：
生产菌株在琼脂斜面上生长8天后，经4℃冰箱保藏15天后使用，发酵过程中控制pH为6，发酵过程控制溶氧水平20-30％，发酵111h，共消耗葡萄糖72g/L，最终纳他霉素产量达到4.0g/L。提取中，发酵液浓缩采用蒸发法，22℃真空蒸发法除去甲醇，加酸调pH到6.5以沉淀溶解的纳他霉素，其它按实施例1中所述进行。获得纳他霉素沉淀的纯度达到81％。
实施例3：
发酵罐为200L，装液量为130L，种子培养为二级培养。二级种子在50L种子罐中进行，培养过程中恒定通气0.5v/v-min，恒定搅拌速度，培养21h。其它同实施例1，发酵168h，共消耗葡萄糖18kg。纳他霉素产量为5.4g/L，获得的纳他霉素纯度达到85％。
实施例4-7为任意浓度(＜4g/L)的纳他霉素发酵液提取例
实施例4：
取3L含有2.8g/L纳他霉素的发酵液，采用薄膜蒸发除去V/2的水后；加入1.5L甲醇，后用20％的氢氧化钠调pH值到10；然后在3500rpm转速下离心20min，除去菌丝体，得到上清液；之后用盐酸调pH到7.0，在35℃下薄膜蒸发除去甲醇；后再在3500rpm转速下离心20min；用蒸馏水洗涤沉淀3次后，-50℃冷冻干燥，获得6.66g纳他霉素。用HPLC检测纯度为85.1％。
实施例5：
方法同实施例4，不同之处在于用氢氧化钠调pH为10.5，最后获得了8.76g纳他霉素，纯度为82.1％。
实施例6：
方法同实施例4，不同之处在于用氢氧化钠调pH为11，37℃自然蒸发除去甲醇，最后获得了5.96g纳他霉素，纯度为84.4％。
实施例7：
取180mL含有1.86g/L的发酵液旋转蒸发除去V/2的水后加入V/2的甲醇，调节pH到10.5，离心除去菌丝体，用活性炭处理上清液后过滤除去活性炭，调节pH到7.5，65℃薄膜蒸发除去甲醇，离心获得沉淀，用蒸馏水洗涤沉淀3次，真空干燥获得0.3g纳他霉素，纯度达到91.5％。