用于预测糖尿病易感性的试剂盒及所用引物 【技术领域】
本发明涉及用于预测糖尿病易感性的试剂盒及所用引物，更具体地，本发明涉及利用新鉴别的糖尿病易感基因PRKCZ的一个单核苷酸多态性(SNP)位点设计的预测糖尿病易感性的试剂盒和引物。本发明还涉及PRKCZ基因在制备预测糖尿病易感性的诊断剂中的应用。
背景技术
大量流行病学资料表明，糖尿病是一种具有明显遗传倾向的复杂的多基因遗传病。遗传因素可明显影响机体对胰岛素的敏感性。最近几年，大多数研究者致力于通过定位克隆法寻找糖尿病相关基因，即寻找患病家系成员间共享的染色体DNA区域间的连锁。已发现2型糖尿病中的一些相对较少见的单基因形式，称为青年晚发型糖尿病(MODY)，是由于突变导致了β细胞功能低下。这些病人通常在青春期到成人早期发病，表现为葡萄糖反应性胰岛素分泌缺陷。这些致病基因中有5个分别编码葡萄糖代谢酶一葡萄糖激酶、转录因子HNF1α、β、4α及胰岛素启动因子(IPF1)。这些基因突变使胰岛素分泌中度或显著减少，最终发展为高血糖血症。这些单基因糖尿病的发病率还不确切，估计占所有2型糖尿病的5％。但是，单纯利用定位克隆的策略来确定多基因遗传病的成功报道还不多除了定位克隆法外，目前对多基因遗传病的相关基因进行研究还有一种方法最常用地方法，即候选基因法，即直接研究疾病候选基因的变异与疾病表型之间的关系。该法主要基于对家系或人群的病例-对照关联分析。关联分析不需要大的家系研究而是比较某个或某一套标记在患者和正常个体的分布程度。某种标记如果在患病个体中分布十分明显，那么就可以认为该标记与疾病表型相关联。但是，候选基因法中由于对致病基因所在位置没有足够了解，在选择候选基因上存在较大的盲目性，主要针对与疾病发生发展相关的一些代谢通路进行研究。将上述两种方法相结合的定位候选克隆法在一定程度上弥补了任何单一一种方法的局限性，为目前多基因遗传病研究中所普遍采用的策略。
同遗传病研究策略相对应，其研究工具—多态性标记也从第一代的限制性片段长度多态性(restrictive fragment length polymorphism，RFLP)，第二代的微卫星标记(microsatellite marker)发展到第三代的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)。尤其在对多基因遗传病进行病例-对照关联分析中，需要利用大量高密度的标记物，前两代多态性标记已明显不能满足这种要求。因此，近年来，SNP作为第三代遗传图谱的构建者已越来越引起人们的广泛关注。
单核苷酸多态性(SNP)主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛分布，平均每500-1000个碱基中就有1个，其总数估计可达300万个甚至更多。近年来，随着人类基因组及遗传学研究的进展，SNP在全面深入地了解个体和群体间基因组的变异或多态性及疾病研究等方面也越来越显示出其重要意义。将SNP用于疾病易感基因定位的一个最大的优点就是它的分布广泛性。其次是它有比微卫星更高的稳定性，可以最大限度地减少遗传过程中由于序列变异所导致的信息遗失。另外，SNP很容易实现高通量的分型，短时间内可以产生大量的结果，这一点是微卫星所无法比拟的。SNP的上述特点决定了它非常适合于进行象糖尿病这样的多基因疾病，尤其是多个微效基因所导致的疾病的定位研究。选择合适的病例和正常对照，采取所导致的疾病的定位研究。选择合适的病例和正常对照，采取关联分析的研究方法，对SNP而言，是非常适合的。
本发明人近几年来一直从事中国北方汉族人群II型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病，NIDDM)基因定位研究。在先前进行的全基因组扫描工作中，本发明人已经分别鉴定出多个易感基因位点，它们分别位于1号，12号，18号及20号染色体上。其中在1号染色体上共有5个存在易感基因的区域。在此基础上，本发明人尝试从定位区域选择合适的候选基因，利用SNP进行了病例-对照关联分析，最终终于鉴定了一个糖尿病易感基因(即PRKCZ基因)，以及该基因上的一个与中国北方汉族人II型糖尿病特别相关的SNP位点。由此经过深入研究完成了本发明。
【发明内容】
根据本发明的一个方面，提供了一种预测糖尿病易感性的试剂盒，所述试剂盒包含基于图1B或图1A的序列设计的用于PCR扩增的特异引物以及通过核酸扩增进行检测的试剂盒所含的常规组件。所述引物针对图中所示的SNP位点而设计，长度为18-46个核苷酸。优选地，所述引物选自SEQ ID NO：1-16组成的一组，更优选地，所述引物为具有SEQ ID NO：16所示序列的单碱基延伸(SBE)引物。
根据本发明的另一方面，提供了用于预测糖尿病易感性的引物，所述引物为基于图1B或图1A的序列设计的用于PCR扩增的特异引物，所述引物针对图中所示的SNP位点R而设计，长度为18-46个核苷酸。优选地，所述引物选自SEQ ID NO：1-16组成的一组。根据本发明的一个更优选的实施方案，本发明的引物为SEQ ID NO：16所示的单碱基延伸(SBE)引物。
根据本发明的再一方面，提供了PRKCZ基因(编码蛋白激酶Cζ亚基)作为糖尿病易感基因在制备用于糖尿病诊断的诊断剂中的应用，PRKCZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示。
【附图说明】
图1A示出本发明的SNP位点(R)所在的PRKCZ基因区域的核苷酸序列。
图1B为图1A序列的互补序列。
【具体实施方式】
定义：
单核苷酸多态性(SNP)：主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。
微卫星位点：把长度为2-6个核苷酸的串联重复序列(VNTR)称为微卫星(microsatellite)，微卫星位点有两个最突出的优点：一是它出现频率很高，遍布于整个基因组，而且，由于短序列在进化上不受选择，因而在同一位点上可变重复单位数目变化很大，一个位点可能有多达几十种的等位基因，信息含量高；二是STR两侧的特异性单拷贝序列稳定性高，可作为检测其多态性的PCR引物。以PCR技术操作，可以实现自动化大规模操作
基因分型及等位基因频率分布：同一种群生物中，相同等位基因核苷酸序列顺序分析，在此表示相同SNP位点在不同个体中的组成成分的确定，为基因分型。等位基因频率是指所研究的同一种类等位基因里，所期望出现的等位基因占的比例，也就是出现变化的等位基因的所占比例。
疾病易感性(糖尿病易感性)：人群对疾病容易感受程度。
病例-对照关联分析：是一种由因及果的回顾性研究。它是先按疾病状态确定调查对象，分为病例和对照组，通过比较病例组与对照组间所研究的遗传标志出现频率的差异而获得该标志与疾病间关联的信息。
单碱基延伸(SBE)反应：在缺乏dNTP、存在ddNTP的情况下，测序酶可在引物的3’端加上一个ddNTP，但因为不能形成磷酸二酯键，故不会继续延伸，碱基延伸一个后即告终止。只需检测这一个碱基即可。又称微测序法。
参数连锁分析和非参数连锁分析：根据基因的重组率来计算两个基因之间的染色体图距即连锁分析，用分类变量(离散变量)来进行分析，把测量指标按某一标准归类，计数，然后进行分析为参数分析，用实际测量后的结果进行的分析为非参数连锁分析，
PRCKZ基因是一种已知基因，其编码蛋白激酶Cζ亚基，蛋白激酶C是磷脂依赖的丝氨酸—苏氨酸特异的激酶，可将二者磷酸化。PRCKZ已被定位于染色体1p36.33区AL162271克隆中(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp ref.cgi？searchType＝adhoc search & type＝rs & rs＝rs436045)。但是现有技术未披露任何有关PRCKZ基因是一种糖尿病易感基因的信息或提示。
本发明人的先期工作表明，1、12、18和20号染色体上均存在有中国北方汉族人2型糖尿病的易感基因位点，其中1号染色体上有4个区域(1p36、1p31、1q22及1q42-43)显示与2型糖尿病相连锁。如下述实施例所示，进一步对该区域进行的精细扫描结果显示，其中有3个区域(1p36.33-36.23、1q24.3-25.1及1q42.12-42.13)仍存在连锁，特别是在1p36.33-36.23区域，参数连锁分析和非参数连锁分析显示连续5个位点与疾病连锁，说明该区域很有可能存在2型糖尿病的易感基因。
为寻找2型糖尿病易感基因，本发明人采用生物信息学方法选择了位于1p36.33-36.23区域的2型糖尿病候选基因中的23个SNP位点(得自NCBI SNP数据库，www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)，通过长度多重性单碱基延伸(SBE)反应法对其在病例组及对照组进行分型及病例-对照关联分析。SNP的信息可通过生物信息学方法从公共数据库中获取。目前有多个公共数据库储存了几百万条SNP信息，并有许多生物医学网站开辟了专门的SNP网页，人们可以很方便的通过多种方式，如以基因名、登记号、染色体号、功能级别等，进行查寻。但是，这些数据库中的SNP绝大多数只是“候选者”，而非经过验证的真正SNP。它们是利用计算机在对多个克隆序列进行比对时发掘出来的，其中必然存在一部分假阳性SNP。如以下实施例所详细讨论的，所选择的23个SNP位点中发现有1个位于PRKCZ基因内含子的rs436045处的一个SNP位点(R，即A/G)其等位基因频率分布在病例组和对照组中的差异有统计学意义(P＜0.05)，提示这一SNP位点与2型糖尿病相关，进一步得出结论，其所在基因PRKCZ基因为中国北方人2型糖尿病的易感基因。
因此，本发明的一个方面涉及糖尿病易感基因PRKCZ基因在预测糖尿病易感性中的应用。基于PRKCZ基因，可以获得各种诊断剂和试剂盒以用于预测糖尿病易感性。
PRKCZ所在基因组序列如SEQ ID NO：17所示，全长为6580bp，本发明所揭示的SNP位点(R)位于该序列的3342-3850位之间，这一区域的核苷酸序列如图1A所示，图中R为SNP位点，其代表碱基A/G多态性，即该位点可以为A，也可以为G。这一区域的互补序列如图1B所示，图中Y代表本发明的SNP位点的互补碱基，其代表碱基T/C。
本发明还涉及用于预测糖尿病易感性的引物。优选地，所述引物基于图1B的序列而设计，由此，PCR扩增后的产物测序可以直接测得SNP位点。当然，本发明的引物也可以基于图1A的序列设计，这样PCR扩增后的产物测序得到SNP的互补碱基。本发明的引物的长度可以为18-46个核苷酸。优选地，本发明的引物具有SEQID NO：1-16所示的序列，特别优选的是SEQ ID NO：16所示的SBE引物。下表1举例示出了本发明的引物的一些组合，引物的解链温度(Tm)以及这些组合得到的产物大小。本领域技术人员能够理解，本发明的引物不限于这些列出的引物及其组合。
表1 SEQ ID NO：引物序列及Tm产物大小 1 6有义：GATGGTTGGAGCCTCTGTCT(59.3C)反义：GCTGTGGCTGCTGGAGAGCC(61.0℃)394bp 2 6有义：ATGGTTGGAGCCTCTGTCTG(60.3℃)反义：GCTGTGGCTGCTGGAGAGCC(61.0℃)393bp 2 7有义：ATGGTTGGAGCCTCTGTCTG(60.3℃)反义：GTGGATGGCCCAAGACTTTG(59.9℃)328bp 3 6有义：GGATATCCTGCTTCCCACTG(59.5℃)反义：GCTGTGGCTGCTGGAGAGCC(61.0℃)351bp 3 8有义：GGATATCCTGCTTCCCACTG(59.5℃)反义：CGTGGGGTATAAACCATGGT(60.9℃)387bp 3 9有义：GGATATCCTGCTTCCCACTG(59.5℃)反义：CACCACGTGGGGTATAAACC(59.6℃)392bp 3 10有义：GGATATCCTGCTTCCCACTG(59.5℃)反义：TCCACCACGTGGGGTATAAA(60.5℃)394bp 3 11有义：GGATATCCTGCTTCCCACTG(59.5℃)反义：CTCCACCACGTGGGGTATAA(60.6℃)395bp 3 12有义：GGATATCCTGCTTCCCACTG(59.5℃)反义：CCCACTCCACCACGTGGGGT(59.3℃)399bp 4 6有义：ATCCTGCTTCCCACTGTGTT(59.6℃)反义：GCTGTGGCTGCTGGAGAGCC(61.0℃)347bp 4 8有义：ATCCTGCTTCCCACTGTGTT(59.6℃)反义：CGTGGGGTATAAACCATGGT(60.9℃)383bp 4 9有义：ATCCTGCTTCCCACTGTGTT(59.6℃)反义：CACCACGTGGGGTATAAACC(59.6℃)398bp 4 10有义：ATCCTGCTTCCCACTGTGTT(59.6℃)反义：TCCACCACGTGGGGTATAAA(60.5℃)390bp 4 11有义：ATCCTGCTTCCCACTGTGTT(59.6℃)反义：CTCCACCACGTGGGGTATAA(60.6℃)351bp 4 12 有义：ATCCTGCTTCCCACTGTGTT(59.6℃) 反义：CCCACTCCACCACGTGGGGT(59.3C) 395bp 4 13 有义：ATCCTGCTTCCCACTGTGTT(59.6℃) 反义：CAACCCACTCCACCACGTGG(60.4℃) 398bp 4 14 有义：ATCCTGCTTCCCACTGTGTT(59.6℃) 反义：ACAACCCACTCCACCACGTG(59.3℃) 399bp 4 15 有义：ATCCTGCTTCCCACTGTGTT(59.6℃) 反义：AACAACCCACTCCACCACGT(59.7℃) 400bp 5 6 有义：TCCTGCTTCCCACTGTGTTT(60.7℃) 反义：GCTGTGGCTGCTGGAGAGCC(61.0℃) 346bp 5 8 有义：TCCTGCTTCCCACTGTGTTT(60.7℃) 反义：CGTGGGGTATAAACCATGGT(60.9℃) 382bp 5 9 有义：TCCTGCTTCCCACTGTGTTT(60.7℃) 反义：CACCACGTGGGGTATAAACC(59.6℃) 387bp 5 10 有义：TCCTGCTTCCCACTGTGTTT(60.7℃) 反义：TCCACCACGTGGGGTATAAA(60.5℃) 389bp 5 11 有义：TCCTGCTTCCCACTGTGTTT(60.7℃) 反义：CTCCACCACGTGGGGTATAA(60.6℃) 390bp 5 12 有义：TCCTGCTTCCCACTGTGTTT(60.7℃) 反义：CCCACTCCACCACGTGGGGT(59.3℃) 384bp 5 13 有义：TCCTGCTTCCCACTGTGTTT(60.7℃) 反义：CAACCCACTCCACCACGTGG(60.4℃) 397bp 5 14 有义：TCCTGCTTCCCACTGTGTTT(60.7℃) 反义：ACAACCCACTCCACCACGTG (59.3℃) 398bp 5 15 有义：TCCTGCTTCCCACTGTGTTT(60.7℃) 反义：AACAACCCACTCCACCACGT(59.7℃) 399bp
本发明进一步涉及包含本发明的一或多种引物的试剂盒，该试剂盒用于检测糖尿病的易感性。除了本发明的引物之外，所述试剂盒还包含运用PCR扩增而进行检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟悉这些常规组件和检测方法。
以下将参照实施例进一步描述本发明。
实施例1中国北方汉族人群2型糖尿病易感基因的精细定位
1、2型糖尿病家系的收集
收集中国北方汉族人群中满足以下要求的2型糖尿病家系：
1)家系中连续2代或2代以上出现2型糖尿病患者，每代至少有一个患者、一个正常人。
2)糖尿病患者应是在正规医院确诊的、对胰岛素不敏感者(除外1型糖尿病)。入选的对照个体年龄应在35岁以上(以尽量排除尚未发病的家系成员)。
3)除糖尿病外，不合并其它明显器质性疾病，如高血压、冠心病(除外糖尿病所导致的并发症)等。
在采集家系前应确保所有家系成员都了解采血目的，即有知情权，血样提供人在了解了所有情况后，若同意，要在“知情同意书”上签字，才能实施抽血和其它个人情况的调查。若不同意，则尊重其个人意见。将收集的资料严格保密，不对外公布供血成员的姓名、年龄、疾病等所有资料。
对入选家系的每一个成员，除已明确诊断的2型糖尿病患者外，均应进行口服葡萄糖糖耐量试验(Oral Glucose Tolerance Test，OGTT)，以确认每一个成员是否可作为正常对照。OGTT试验过程：抽取空腹静脉血及口服75g葡萄糖(5分钟内喝完)后30分钟、60分钟、120分钟及180分钟的静脉血，观察血糖浓度的动态变化情况。此外，记录每一个体一般情况，包括性别、出生年月、籍贯、发病年龄、身高、体重、心率、呼吸、血压、用药情况、有无合并症、以及血脂、血电解质等项目，必要时行特殊检查，以排除合并有高血压、心脏病、动脉粥样硬化等疾病的家系。
2型糖尿病的诊断严格按照WHO于1985年颁发的标准执行。即：空腹血葡萄糖浓度≥7.8mmol/L或餐后2小时血糖≥11.1mmol/L为糖尿病。OGTT的判断标准为：服糖后2小时血葡萄糖浓度＜7.8mmol/L为正常，≥11.1mmol/L为糖尿病，在7.8-11.1mmol/L之间为糖耐量低减(impaired glucose tolerance，IGT)。
共采集到60个符合以上条件的2型糖尿病家系，成员共计367人。其中2型糖尿病患者180例，正常人171例，IGT患者16例。这些家系分别来自北京、山东、河北、内蒙古、河南等地的汉族人群。绘制所有家系的家系图，并对每一家系及家系成员进行编号，此编号同DNA入库号一致。在所收集到的家系中，15％(9/60)为三代家系，85％(51/60)为二代家系。患者中男性为83人，女性为97人；IGT者16人。家系成员平均年龄为50.03岁，其分布情况(分患病和正常)见表2：
表2 2型糖尿病家系成员年龄构成 年龄段 病例组 正常组 IGT 总计 ＜30 10 17 2 29 31-40 26 45 2 73 41-50 51 56 7 115 51-65 42 26 3 70 ＞65 51 27 2 80 总计 180 171 16 367
取所有家系每一成员的外周血样备用。
2、PCR扩增微卫星片段、基因分型
常规方法提取上述血样中的基因组DNA，提取后的DNA均溶解于TE缓冲液中，注明样品所属家系、编号等资料，-20℃保存待用。
在以往全基因组扫描阳性区(1p36，1p31，1p12，1q22，1q42-43区，20p12，20q13区，12p12区及18q23区)选择杂合度较高、分布较为均匀的微卫星位点进行第二轮扫描。共选择了60个位点，其中：1号染色体5个阳性区域内34个，平均密度3.2cM；12号染色体4个，平均密度2.2cM；18号染色体4个，平均密度1.9cM；20号染色体上3个区域内18个，平均密度2.6cM。这些微卫星位点的最低杂合度为0.64，最高为0.88，平均值0.748。部分微卫星位点的遗传学位置自http：//www-genome.wi.mit.edu查找所得(在“HumanPhysical Mapping Project”栏下)，部分自法国Genethon的人类多态性中心的资料上获得。在所用的60个微卫星位点中，16个在ABI公司Version 2.0试剂盒中已有引物，46个需新设计合成引物。新合成的一对引物中的一条用荧光物质FAM或HEX标记。所有引物在合成时综合考量PCR扩增片段长度的大小及可能的合理分组情况来确定荧光标记的颜色。反应所用的引物序列参见法国Genethon遗传图谱的Microsatellite Markers Data Set。各微卫星位点扩增片段长度及引物信息见表3。
表3 60个微卫星位点的大小范围与标记荧光
位点名称 片段大小(bp) 标记荧光 位点名称 片段大小(bp) 标记荧光
D1S243 142-170 HEX D1S2709 191-197 FAM
D1S468 173-191 HEX D1S2800 195-225 FAM
D1S2845 193-233 FAM D1S235 175-195 FAM
D1S214 122-152 NED D1S2850 145-153 FAM
D1S2663 183-205 FAM D12S1625 264-280 FAM
D1S472 228-244 FAM D12S77 163-193 FAM
D1S2892 93-129 FAM D12S336 117-135 NED
D1S2722 195-223 FAM D12S89 254-288 HEX
D1S463 223-233 HEX D18S465 233-251 HEX
D1S211 170-198 HEX D18S61 213-243 NED
D1S2627 265-279 FAM D18S1125 268-286 FAM
D1S2868 210-224 FAM D18S488 239-264 HEX
D1S497 250-278 FAM D20S906 229-247 FAM
D1S206 208-226 NED D20S842 156-180 HEX
D1S495 138-164 FAM D20S889 93-129 FAM
D1S2707 137-159 FAM D20S849 214-236 FAM
D1S2878 152-178 NED D20S95 82-100 FAM
D1S196 322-338 HEX D20S892 205-223 FAM
D1S2815 210-237 FAM D20S115 238-250 NED
D1S218 266-286 NED D20S851 128-150 FAM
D1S466 155-175 FAM D20S901 260-268 FAM
D1S2692 187-217 HEX D20S186 121-143 HEX
D1S245 235-253 FAM D20S852 152-176 HEX
D1S205 94-112 FAM D20S112 217-241 FAM
D1S425 336-360 NED D20S912 267-283 FAM
D1S419 162-194 FAM D20S857 204-220 FAM
D1S2860 168-184 FAM D20S840 141-165 FAM
D1S2880 113-135 FAM D20S120 213-241 FAM
D1S213 107-133 NED D20S100 213-239 HEX
D1S2833 92-108 FAM D20S102 169-177 FAM
PCR扩增后，在377电泳仪(ABI公司)上进行电泳，用377电泳图象收集软件(ABI PrismTM 377-96 Collection或ABI PrismTM377XL Collection)收集结果，在GENEHUNTER2.0软件(美国麻省理工学院遗传系编写，从http：//cmag.cit.nih.gov上可自由下载)上运算，计算相关的位点与表型连锁的P值、Z值。结果显示在所研究的10个区域中有3个区域继续显示出与糖尿病连锁的证据，如表4所示：
表4 3个阳性区域内有意义位点的遗传位置、P信及Z信
位点名称 距p末端距离(cM) 细胞遗传学位置 统计P值 统计Z值
D1S243 0.0 1p36.33 0.00834 1.653
D1S468 6.2 1p36.33 0.0015 2.135
D1S2845 11.1 1p36.32 0.033 1.292
D1S214 16.4 1p36.31 0.0025 2.005
D1S2663 16.9 1p36.23 0.00205 1.996
D1S2815 193.8 1q24.3 0.00126 2.17
D1S218 196.5 1q25.1 0.043 1.2
D1S2800 256.2 1q42.12 0.0128 1.579
D1S235 258.7 1q42.13 0.0547 1.363
从上表可以看出，1p36.33-36.23区有意义(P＜0.05)的阳性位点最多，共有5个，最低的P值为0.0015，Z值2.135，5个位点分布在长达16.9cM的区域内。1q24.3-25.1区有2个位点，1q42.12-42.13区有1个位点满足P＜0.05的标准，另外D1S235的P值虽然略高于0.05，但其Z值已达统计学界值(Z＞1.36)，因此可以认为该位点与糖尿病还是有连锁关系的。这两个区域已分别精细定位至2.7cM(D1S2815-D1S218)和2.5cM(D1S2800-D1S235)的狭窄范围内。引人注目的是在1p36.33-36.23区，连续5个位点都出现了P值小于0.05的情况，因此下一步选择此区域克隆易感基因。
实施例2糖尿病易感基因PRKCZ的鉴定及该基因内SNP的相关研究
1、中国北方汉族人群2型糖尿病患者及正常对照标本的收集
正常组及2型糖尿病组人群外周血样本均采自北京协和医院内分泌科门诊。标本来源均为我国北方地区，包括北京、山东、河北、内蒙古自治区等地，以北京为主。糖尿病可为散发，也可为糖尿病家系的成员(但此时每一家系中通常只有一个患者入选，同一家系中没有任何血缘关系的成员可以选择一个以上)；正常对照来自正常人群，要求其家庭三代以内没有糖尿病患者(包括I型糖尿病)，对照组与患病组年龄及性别相匹配。
2型糖尿病诊断同实施例1。入选的每个成员记录一般情况，包括性别、出生年月、籍贯、发病年龄、身高、体重、心率、呼吸、血压、用药情况、有无合并症等，对每个成员检查血脂、血电解质等项目，必要时行特殊检查，以排除合并有高血压、心脏病、动脉粥样硬化等疾病。入选的每个成员都应在“知情同意书”上签字。
共采集到325份标本，其中病例组173份，对照组152份。两组在性别、年龄上相匹配，糖尿病患者的平均年龄为51.99岁，正常对照采样时的平均年龄为48.8岁。在所有成员中，男女的比例为169：156，病例组男性92人，女性81人；对照组男性77人，女性75人。两组成员的年龄分布情况如下：
表5 患病组和对照组成员的年龄构成 年龄段 病例组 对照组 ＜30 2 4 30-39 12 18 40-49 30 54 50-65 91 62 ＞65 38 14 总计 173 152
2、候选基因的确定及候选基因中用于基因分型的SNP位点的选择
基于实施例1的结果，即染色体1p36.33-36.23区域与2型糖尿病相连锁，利用生物信息学方法从NCBI SNP数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)中选出位于这一区域或其附近的10个与葡萄糖代谢相关基因中的23个SNP位点用于基因分型研究。所述的10个候选基因如下：
(1)蛋白激酶Cζ亚基(PRKCZ)基因：位于1p36.33区AL162271克隆中。蛋白激酶C是磷脂依赖的丝氨酸-苏氨酸特异的激酶，可将二者磷酸化，该家族至少包括10个结构相关的成员。
(2)氨氯吡咪敏感性钠离子通道δ亚基(dNaCh，SCNN1D)基因：位于1p36.32区NT_002209中，编码产物属非电压敏感型通道蛋白，可被利尿剂氨氯吡咪抑制，介导腔内离子的电扩散，以异源四聚体的形式存在于膜上。
(3)乙酰CoA硫酯水解酶(HBACH)基因：位于1p36.23区NT 002530中。编码产物属乙酰辅酶家族成员之一，可水解棕榈酸CoA的CoA硫酯及其它长链脂肪酸。
(4)PER3([果蝇]节律蛋白的同源蛋白3)基因：位于1p36.23区NT_002530中。在哺乳动物脑、肝、骨骼肌等处表达，受生理节奏及光照影响，基因表达水平呈周期性振荡。
(5)Urotensin II：位于1p36.23区NT_002530中。目前对其蛋白功能所知甚少，但已知其保守性很高。一个G蛋白偶联受体GPR14可作为其受体。
(6)DJ-1(RNA结合蛋白调节亚基)：位于1p36.23区NT 002163中。
(7)5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因：位于1p36.21区AL354994克隆中。5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶参与叶酸代谢，是同型半胱氨酸叶酸依赖的再甲基化过程的关键酶，以同源二聚体形式发挥催化活性，受S-腺苷蛋氨酸别构调节。
(8)赖氨酸羟化酶(PLOD)基因：位于1p36.21区dJ1077B9(长126525bp，属unfinished sequence)中。赖氨酸羟化酶为同源二聚体蛋白，结合于胞膜上，可催化赖氨酸残基的羟化，所产生的羟化赖氨酸基团是碳水化合物在胶原上的粘附位点，这一步对分子间交联的稳定性很重要。
(9)乙酰脱氢酶4(ALDH4)基因：位于1p36区AL080251克隆中。乙酰脱氢酶为线粒体基质NAD+依赖型脱氢酶，催化脯氨酸降解步骤的第二步。
(10)氯离子通道B(CLCNKB)基因：位于1p36.13区bA254I4.00143(长47068bp，属unfinished sequence)中，编码电压门控型氯离子通道蛋白B型，主要在肾中表达，它和A型有94％的同源性。氯离子通道可参与调节细胞体积、膜电位稳定性、信号传导及跨上皮转运等。
所选择的23个SNP位点如表6所示。
表6 1p36区通过生物信息学方法选择的SNP SNP名称所处基因名称及在基因中的位置所处ContigSNP类型细胞遗传学位置距p末端的物理距离(Mb) rs262669PRKCZ外显子NT_004350C/T1p36.331.215 rs436045PRKCZ内含子NT_004350A/G1p36.331.204 rs586965SCNN1D内含子NT_025635C/G1p36.322.310 rs609805SCNN1D外显子NT_025635A/G1p36.322.311 ss91351HBACH内含子NT_019265C/T1p36.235.931 ss91350HBACH内含子NT_019265C/T1p36.235.935 rs228669PER3外显子NT_028054C/T1p36.237.548 rs228691PER3外显子NT_028054A/G1p36.237.559 rs170633PER3内含子NT_028054C/T1p36.237.559 rs228677PER3外显子NT_028054C/T1p36.237.567 rs170629UTS2内含子NT_028054C/T1p36.237.589 rs228648UTS2内含子NT_028054C/T1p36.237.592 rs161825DJ-1外显子NT_028054A/G1p36.237.658 rs15854MTHFR3′端NT_004488A/G1p36.2111.020 rs1801131MTHFR外显子NT_004488C/A1p36.2111.037 rs1801133MTHFR外显子NT_004488C/T1p36.2111.039 rs15431PLOD外显子NT_004488T/G1p36.2111.218 rs11740ALDH4NT_021902A/G1p3614.900 rs14311ALDH4NT_021902C/T1p3614.900 rs9117ALDH4NT_021902C/T1p3614.900 rs5259CLCNKB外显子NT_004873A/C1p36.1319.302 rs5251CLCNKB外显子NT_004873C/G1p36.1319.304 rs5254CLCNKB外显子NT_004873A/G1p36.1319.307
3、SNP位点基因分型分析
主要采用3种方法进行SNP的分型：长度多重性单碱基延伸(Length Multiplexed Single Base Extension，LM-SBE)反应，限制性片段长度多态性(restrictive fragment length polymorphism，RFLP)-PCR及测序分型。
1).LM-SBE反应进行SNP分型
1.1)引物设计与合成：针对上述23个SNP位点中的每一个SNP位点设计3条引物，其中的2条为PCR引物，用于扩增包含SNP位点的一段序列，另外一条是SBE引物，用于单碱基延伸反应。PCR引物通过Primer 3.0程序在线设计，扩增片段长度为150～300bp。
SBE引物设计原则：引物要位于SNP位点的5′端，其3′端的最后一个碱基恰好是与SNP紧邻的前一个碱基。引物长度在18-46个核苷酸之间，Tm值在55-80℃之间。预备同组的几个位点为不同类型交替出现，其长度相差4个(或其倍数)碱基，且它们之间不能形成发卡结构，较长的SBE引物不能形成回折等二级结构。参照文献(Lindhlad-Toh K，Winchester E，Daly MJ，et al.Lange-scalediscovery and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in themouse.Nat.Genet..2000，24：381-386)。
另外，设计用作分子量大小标准的FAM标记的DNA片段，其大小分别为：19bp、23bp、27bp、31bp、35bp、39bp、43bp、47bp，所有序列均为AT重复而成。
1.2)PCR反应及产物鉴定：将不同类型及不同SBE引物长度的多个SNP位点(一般为3-5个)组合为一组，先进行多重PCR扩增包含SNP位点的相应数目DNA片段。反应体系5μl，各组分如下：
名称 原液浓度 加样量(μl) 体系终浓度
Mg2+ 25mM 0.6 3mM
缓冲液 10× 0.5 1×
dNTP 2mM 0.075 30nM
引物 10μM 0.05×n 各0.1μM
AmpliGold 5U/μl 0.05 0.05U/l
模板 50ng/l 1 5ng/μl
ddH2O 补齐至5μl
采用Touch-down PCR，其程序如下：94℃、12分钟后，进行15个循环的94℃30秒、63℃ 30秒(每一循环温度下降0.5℃)、72℃50秒，随后24个循环的94℃30秒、56℃30秒、72℃ 50秒，最后72℃10分钟两次。反应结束后用1％琼脂糖电泳鉴定，在UV灯下观察有无产物，并在紫外凝胶成像仪拍照，记录时间、位点名称、样品号等。
1.3)PCR产物纯化：PCR反应后体系中残存的dNTP及没有参与反应的单链引物会影响下一步的SBE反应，故用作SBE反应模板的PCR产物需要清除这两者。牛小肠碱性磷酸酶(Calf IntestineAlkaline Phosphatase，CIP)可以将dNTP 5′端的磷酸基团去除，使之不能形成磷酸二酯键，从而不能参与DNA链的延伸；核酸外切酶I(Exonuclease I，ExoI)可从单链DNA的3′端到5′端方向逐个降解核苷酸，从而避免PCR反应剩余的引物影响下一步的SBE反应。在每5μ1 PCR产物中加入1μl酶混合液，其中含CIP 1.5U/μl，ExoI 1U/μl，混匀，置入37℃水浴箱消化1.5小时，取出后离心，90℃15min灭活CIP及ExoI，用作SBE反应模板。
1.4)LM-SBE反应：由于体系中只有荧光标记的ddNTP(本实验中分别为JOE-ddATP，FAM-ddGTP，TAMRA-ddCTP ROX-ddUTP)，使用对荧光标记ddNTP掺入率比较高的热测序酶(ThermoSequenase)来进行反应，可使每个SBE引物在反应中仅延伸一个碱基即告终止。尽管扩增只是线性增长的，但40个循环后，在ddNTP足量的情况下，其总量也达到了模板的40倍，足以进行检测。
反应体系为5μl，各组分如下：
名称 原液浓度 加样量(μl) 体系终浓度
Mg2+ 25mM 0.5 2.5nM
缓冲液 10× 0.5 1×
JOE-ddATP 0.12μM 0.1 2.4nM
FAM-ddGTP 0.12μM 0.1 2.4nM
TAMRA-ddCTP 0.12μM 0.1 2.4nM
ROX-ddUTP 0.60μM 0.1 12nM
SBE引物 2μM 0.05×n 40nM
Theromo Sequenase 10U/μl 0.025 0.05U/μl
模板 1
ddH2O 补齐至5μl
反应程序为：95℃、3分钟后，进行40个循环的95℃30秒、50℃30秒、60℃40秒，最后60℃2分钟。
1.5)电泳：SBE产物1μl与上样缓冲液等比例混合，在377测序仪上进行电泳。加样时可分别于电泳时及加样后30分钟2次加样，在加样孔的两端分别各加一个孔的大小标准。电泳结束后通过观察SBE产物电泳位置并与大小标准比较，即可判断是哪一个位点。
1.6)基因型判定及数据整理：根据条带颜色判定SNP基因型，蓝色为G/G， 绿色为A/A，黄色为C/C，红色T/T，蓝/绿色为A/G，黄/红色为C/T。将各位点分型结果整理为Excel格式以进行统计处理。
2)RFLP-PCR进行SNP分型：对于改变酶切位点的SNP，可先进行PCR扩增，扩增产物用相应的内切酶消化，电泳后根据条带位置判定基因型。完全酶切或不能被酶切的为两种不同的纯合型，不完全酶切的为杂合型。
3)测序分型：对于不适合用以上两种方法分型或分型结果不理想的位点进行测序分型。
以上各SNP位点的分型均先在48个随机选取的正常对照个体中进行，对分型结果统计后计算各位点等位基因频率。对等位基因频率高于15％的位点再进一步在病例组及对照组中进行分型。结果显示，23个候选SNP位点中1个(rs586965)未扩增出PCR产物；3个(rs5251、rs15431和rs15854)位点在所有检测个体中均为杂合型；其余20个位点中有7个(ss91350、ss91351、rs9117、rs5259、rs228691、rs228677及rs170633)在检测个体中均为同种纯合基因型，并非SNP；4个(rs1801131、rs14311、rs5254及rs609805)位点等位基因频率低于15％，未进行进一步分型；最后进行分型的SNP位点共8个(rs1801133、rs436045、rs228648、rs11740、rs262669、rs228669、rs170629及rs161825)，它们分别位于6个基因内，等位基因频率为26.3％-43.16％。
在病例组和对照组中，上述8个分型的SNP位点均符合Hardy-Weinberg平衡。经SPSS统计软件10.0版(免费下载于http：//linkage.rockefeller.edu/soft/)分析，有1个SNP位点位于PRKCZ基因内含子的rs436045处，等位基因频率分布在两组中差异有统计学意义(P＜0.05)，如表7所示。
表7 病例组与对照组SNP分型SPSS统计分析结果
等位基因
SNP C T A G 总计 P值
rs11740 病例组 129 245 374 0.978
对照组 110 208 318
总计 239 453 692
rs161825 病例组 216 140 356 0.917
对照组 176 116 292
总计 392 256 648
rs170629 病例组 261 119 380 0.710
对照组 156 76 232
总计 417 195 612
rs228648 病例组 113 297 410 0.029
对照组 111 205 316
总计 224 502 726
rs228669 病例组 264 110 374 0.455
对照组 212 100 312
总计 476 210 686
rs262669 病例组 269 129 398 0.639
对照组 207 107 314
总计 476 236 712
rs436045 病例组 329 75 404 0.003
对照组 207 81 288
总计 536 156 692
rs1801133 病例组 224 156 380 0.607
对照组 133 101 234
总计 357 257 614
如上表可以看出，位于PRCKZ基因的1个SNP位点rs436045的等位基因频率在病例组和对照组存在显著差异，因此提示这一位点与2型糖尿病相关。进而提示PRCKZ基因为一种新的糖尿病易感基因。
PRKCZ的基因组序列如SEQ ID NO：17所示，全长为6580bp，所揭示的SNP位点(R)位于该基因的3342-3850位之间，这一区域的核苷酸序列如图1A所示，图中R为SNP位点，其代表碱基A/G多态性，即该位点可以为A，也可以为G。这一区域的互补序列如图1B所示，图中Y代表所述SNP位点的互补碱基，其代表碱基T/C。
基于这一SNP位点，可以设计适当长度的引物，用于经PCR扩增而预测糖尿病易感性。
实施例3 预测糖尿病易感性引物的设计及糖尿病易感性的预测
1.SBE引物
引物要位于SNP位点的5’端，其3’端的最后一个碱基恰好是与SNP紧邻的前一个碱基。该引物只有一条。长度为18-46个碱基之间，每隔4个碱基设计一条。要避免含有过多的G+C，Tm值在55～80℃之间。由于SNP位点中转换型者较多，因此应避免连续几个出现相同的序列类型(如连续几个C/T型)，如遇到准备放入同一个组的几个位点都是C/T型时，可以将其中的数个从反链设计，即变为A/G型，最好是C/T与A/G间隔出现。另外预备同组的几个位点之间不能有发卡等形成，较长的SBE引物不能形成回折等二级结构。根据以上原则设计的一个引物为：5′TTGCATTGGCCTCTGCCAGCCACCTGAGGGCACTGCTTGGACCAAA 3′(SEQ IDNO：16)，其为该链的同序引物，即与其互补链结合。以此SBE引物对待测个体基因组DNA进行SBE反应检测SNP位点的序列。
2、普通PCR扩增引物
根据SNP位点所在的序列(图1A和1B)，设计如SEQ ID NO：1-15所示的引物。如表1所示进行各种组合。以所述组合为引物，以得自待测个体血样的基因组DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行测序检测所述SNP位点的单核苷酸多态性。
序列表
<110>中国医学科学院基础医学研究所
北京诺赛基因组研究中心有限公司
国家人类基因组南方研究中心
中国医学科学院北京协和医院
<120>用于预测糖尿病易感性的试剂盒及所用引物
<130>I20031212CB
<160>17
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gatggttgga gcctctgtct 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
atggttggag cctctgtctg 20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ggatatcctg cttcccactg 20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
atcctgcttc ccactgtgtt 20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
tcctgcttcc cactgtgttt 20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
gctgtggctg ctggagagcc 20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
gtggatggcc caagactttg 20
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
cgtggggtat aaaccatggt 20
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
caccacgtgg ggtataaacc 20
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
tccaccacgt ggggtataaa 20
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
ctccaccacg tggggtataa 20
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
cccactccac cacgtggggt 20
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
caacccactc caccacgtgg 20
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
acaacccact ccaccacgtg 20
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
aacaacccac tccaccacgt 20
<210>16
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
ttgcattggc ctctgccagc cacctgaggg cactgcttgg accaaa 46
<210>17
<211>6580
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>17
gatcatactg cctgggaggt cagtgcagag gagatgccag gagcaccgag gatgtggcag 60
gcacgggaga gtccagccag tgtctgggag gccctgagga cgaggttggg gacaccagga 120
aatggggagc ctaggcggct gtgtgcttag ggcaggtggg tgtgggtgaa caggcagttt 180
ggctcaggct gggactcagg agagtgtggc tggaggtggc cacattggga atatctgtgg 240
agtatggtgc cagggagtgt tgcagcacag agatcccgtc cgcaccccag cccaccctgg 300
ccgccttttc tgaggacaca cgttgtgagt cttctggggc tgcagaacac agcaccacta 360
actggcagct taaacaatgg aaacttgctc tccggcagtc tggggctgga agtccaaaac 420
gaaggtgtct ttatgagtca gggttctcca gagggatggt accaatggga tgcatgtaca 480
tgaaagggag ttgattaggg agaactggcc ctcgggcgca caagacgaag tcttacgata 540
ggccagctgc aggctgggga agaaagaagc cagtagtggc tcactccgag tccaaaagcc 600
tcagaagcag ggaagccgac agtgcagcct tcagcctctg ccagaggctc cagagccccc 660
ggcaaaccac taataagtcc cggagtctaa aggcccaaga acctggaatc tgatgtccca 720
gggtaggacg agtggcagga agcatccagc atgggagaaa gatgaaagcc agaagaccca 780
ggaaaactgc ttctcccacc tgcttccgcc tgctttgccc cagccgcact ggcagctgat 840
tggacgccac cgcccaccca cattgagggt gggtcttgcc ctcccagtcc actgactcaa 900
ataccagtct cagggcagcg ccctcataga cacacccaga tgcaatactt caccagttct 960
ctaggcatcc ttcaacccag tcaagtcggc gcctggtgtt acccattaca gtgccgcagg 1020
gctgcgccct ccttcccccg cagccactgg tagctgcggg cagccttgtt cctgtgctgg 1080
cagaggaacc actcacctct gtttccgtct ccacatggcc tcctctgtat ctgtctcttc 1140
tgtcattctg catgacggat tagcccagag tgaaccctac ccacccagtg acatgggcca 1200
gggctccggg cagcacaggg tgtggcctct cactgtgcag ctttgaggag aaaagtccat 1260
tctgctgatg gcaggtgcag accataagtg accctccccc tccccaccac caccagtgag 1320
caaaagcttt tcctttcctt cctgcagaca ctggaggaaa gggtggcagg tggacccacc 1380
acagccccgc tctgctgtgg aggtacagcc cttctgggcg tgtgaacgag ccagtttcac 1440
aaacacagag gccaaggcga gagtggcccg aaagcctgca acctgactgc tcagggaggg 1500
cggctgccct gcagttcagc ctgtccgatt cccgcctaat tgtgcccggg ctctgatctc 1560
gccacctgct cgtaacgttc tctgtccgga cctcagagcc gctccatgta gtgctcactt 1620
catgttaatt gcaggaccac tcagatcacc tctgctgtca cttaaaaggg gcatttcagg 1680
aggaaagcac ttggttttgt gtgaatcagt aagacttaaa ggggaacaag cacccaggag 1740
aagagagact tttccgtcct ctttgttggt gaagcgagga tgaaagagtg ggcatccgtc 1800
gctggggact gggctccccg cccagctctt tctgtgcact tgaaagcact gcccttggac 1860
tttgagaagg aagcgttcag tgggggagcc aaagggagag agccagcgag gttctgaaga 1920
aggaggtgag gaggggctgc ctcctccatg aaggatggtg ccgggggtgg cagggaagcc 1980
cactcagtgg aacagaactg ctgggtcaga gctggcccag ggctgagcac ttcttgcaga 2040
ggagggaagg gatcctccag taaatcctga ggaggtgatt ggttaattat cagcccagga 2100
atggggggtg aggtgggtag gaatccaggc tgctggctcc catcacagta aacggcaggt 2160
ggattgaggt taaaaaaaaa tcacagggcc cggcgcagtg gctcacgcct gtaatcccag 2220
cactttggga ggccgagatg ggtgatcgct tgaggccagg agttcaagat ccatctggcc 2280
aacatggtga aacccatctg tactaaaaat acaaaaatta gccaggcgtg gtggcacgtg 2340
cctgtaatcc cagctactca ggagtctgag gcaggagaat cacttgaacc caggaggcgg 2400
gggttgcggt gagctgagat tgtgccactg ggcgacagag tgagactccg tctcaaataa 2460
ataaaaagaa gaaacctaga agctgtgcag atctctggag aaaaaccggg cagtgaggac 2520
cagagggtct ttagactcag ccacacagaa ttttcagatt ttttcagttt ccaaattaaa 2580
tgcaaaaaac atacaggaaa ggggtttgta gcacgtaaaa cccagaagag atccagacat 2640
ctcacactta gaattgaaga gctcctacac aaaggctttt ggtaaatgct gggaccgaga 2700
agctgagaac cggtgtgaat ggttaatgaa gtaagactgt aattgtttag agatgaggac 2760
agcatgacct ccacaggtga tcagggaaac acaagacatt ttctctgtca acatcaaaga 2820
tgttaaaagt aattaaagcc ggccgggcgt ggtggctcac gcctgtaatt ccagcacttt 2880
gggaggccga ggtgggtgga tcacgaggtc agcagttcaa gaccagcctg gccaagttgg 2940
tgaaaccccg tgtctactaa aaatacaaaa aaagtagcca ggcgtggtgg tgggttcctc 3000
taatcccagc tactcgggag gctgaggcag agaattgctt gaacccggga ggcagaggtt 3060
gtagtgagcc gagatggcac cactgcactc cagcctgggc gacagagcag gactctgtct 3120
caaaacaaca caaaacaaaa acaaaacaac aaaaaagtaa ttaaagccca gggttgctgt 3180
catggggtct gccaaccctg gggatgtggg acaggcatgg accctactct ctggaaatca 3240
cgcagaaatg tgcagcgatg ttcccatcct gcctctcttc aaaagaaatc acccgtcatt 3300
cggaggtttg tgtatgggga agatcagctc agcattattt ttacaagcaa gagtgggaat 3360
cgtgtctgga gttagctact ccctttgctg tgaacaaccc actccaccac gtggggtata 3420
aaccatggta gggccacgtc tctgagctgt ggctgctgga gagccctctg ctggtggcac 3480
atagggcaca agtgccgcag ggacagctgg gtggatggcc caagactttg gcctttatca 3540
tgagtggaca gaggagtgac cacttgggtc cctggagaag aggctataga gagtgagggt 3600
ggggaaggga gatcagaaga tgccatccat gagcagcagt gcctgtcaga tttggtccaa 3660
gcagtgccct caggtggctg gcagaggcca atgcaattcc ttttcaagcc agcatcaaag 3720
aattcctgat gataaataaa tcaggcatct gagctcgcaa tggaaaacca caaaacacag 3780
tgggaagcag gatatcctga gtccaagctg gtaaaagccc agacagaggc tccaaccatc 3840
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gaacatgcca ctgtactcca gcttgggtga cagagtgaga ctccgtctca aaaaaaaaga 4200
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