结核分支杆菌诊断及耐药分析芯片及其制备工艺和使用方法.pdf

本发明涉及医学体外诊断技术，具体地讲是一种基因芯片——结核分支杆菌诊断及耐药分析芯片及其制备工艺和使用方法。它是在玻璃基片上分布有多个不同区域的微阵列，在每个微阵列区域中，分别固定有结核分支杆菌型和亚型的特异性探针，另设有质控探针和多个耐药分析探针。利用相应探针与经扩增并加入荧光标记的结核分支杆菌DNA杂交，经扫描仪扫描芯片，并对杂交信号进行处理分析，获得有关信息。这种芯片能同时检测结核分支杆菌存在与否，并分析其不同类型及耐药特性，具有诊断快速准确、特异性高、信息量大的特点，对临床诊断和流行病学筛查都有很大帮助。

1： 一种结核分支杆菌诊断及耐药分析芯片及其制备工艺和使用方法，其特征在于：该芯片为 玻璃基片上分布有多个不同区域的微阵列，在每个微阵列区域中，分别固定有结核分支杆菌 型及不同型的特异性探针。
2： 根据权利要求1所述的结核分支杆菌诊断及耐药分析芯片及其制备工艺和使用方法，其特 征在于：在该芯片的微阵列中，设有质控探针和多个耐药分析探针。
3： 根据权利要求1所述的结核分支杆菌诊断及耐药分析芯片及其制备工艺和使用方法，其特 征在于：探针的大小为15-25个碱基，设计75个探针，质控探针9个，所设计的探针序列如 下：                                          结核分型 Probe                                    Sequence          prob all                        atagtggtt gcgagcatc         1abscessus                       ATCTAAACATAGCCTCGCT         2africanum                       ATCAATGGATACGCTGCC         3avium                           ATCTAGATGAGCGCATGG         4bovis                           ATCAATGGATACGCTGCC         5chelonae                        ATCTAACAAGCCTCGCTC         6diemhoferi                      ATCTAGCACGCAAGAGGA         7gastri                          ATCAAATGGATGCGTTGC       7.1                                TGTCTTGGACTCGTCCAA         8gilvum                          ATCGAAAGATGGTGCACA         9gordonae                        ATCAAAATGTATGCGTTGTC         10 intracellulare                ATCTAGATGAGCGCATAGT         11kansasii                       ATCAAATGGATGCGTTGCC      11.1                                AACACTCGGGCTCTGTTC         12marinum                        ATCAATTGGATGCGCTGC      12.1                                ATCTCTGTTGGTTTCGGG         13phlei                          ATCTGATACTTGATGCTCCT         14scrofulaceum                   ATCTAAACGGATGCGTTGC         15smegmatis                      ATCTAGTTCGTAAGAGTGTG         16szulgai                        ATCAATTGGATGCGCTGC      16.1                                ACTCAGGCTTGGCCAGAG         17terrae                         ATCTAACAAGCAGATTTTTGG         18triviale                       ATCTAGCAGATGAGATCTCT         19tuberculosis                   ATCAATGGATACGCTGCC         20vaccae                         ATCTGAATGCACAGCGCT         21xenopi                         ATCTGGCAAAGACTGTGG         22abscessus                      ACCCTGCTTGGTGGTGG         23africanum                      AGGTGTTGTCCCACCGC              24avium                               CCTCCATCTTGGTGGTG              25bovis                               AGGTGTTGTCCCACCG              26chelonae                            ACCCTGCTTGGTGGTG              27diernhoferi                         CGGTGTCTGTTGTTGCTC              28gastri                              AGAGTGTTGTCCCACCAT              29gilvum                              GGGTCGGTGTGTTGTTG              30gordonae                            GGGTGCTGTCCCCCCA              31intracellulare                      CCTCCATCTTGGTGGTGG              32kansasii                            AGAGTTGTCCCACCATCT              33marinum                             GGGATGTTGTCCCACCAT              34phlei                               GGGTGCCGGTGTGTTG              35scrofulaceum                        TGAGTGGTGTCCCTCCA              36smegmatis                           GGCGTGTTGTTGCCCTG              37szulgai                             GAGCTGTTGTCCCACCA              38terrae                              GCCTCACACTTGGTGGT              39triviale                            TCACCGGTTTTGGTGTGG              40tuberculosis                        GGTGTTGTCCCACCGC              41vaccae                              GGGTCGGCGTGTTGTT              42xenopi                              TGGTGGCGGGGTGTGG              43fortuitum                           ATCACCTCCTTTCTAAGGAGCAC                                                    耐药 Probe                                              Sequence ethambutol     579                                 5`-atggaatgtc gcaaccaaat g isoniazid      579-1                               5`-atagaatgtc gcaaccaaat g rifampin primer                                             Sequence                F2465                               5`-cgggtg ctctatgcaa tgttc                R2748                               5`-tcctcgtcga tttccctcag Probe                                              Sequence                n2553                               5`-actaccac ccgcacggc                m2567                               5`-actaccac ccgcactgcg                n2568                               5`-gcg acgcgtcgat ctacg                m2574                               5`-ggcg acgtgtcgat ctacg                m2576                               5`-gcg acgcgtcgat cta                n2585                               5`-at ctacgacagc ctggtgcg                m2585t                              5`-at ctactacagc ctggtgcgc                m2585c                              5`-t ctaccacagc ctggtgcgc                m2585a                              5`-ctacaacagc ctggtgcgc                m2586g                              5`-cgat ctacggcagc ctgg                m2586c                              5`-cgat ctacgccagc ctgg qumolone       m2589c                              5`-tcgat ctacgacacc ctggtg ciprofloxacin Probe                                              Sequence ethambuto      n7855                               5`-ctacatcctg ggcatggcc                  m7868c  5`-tacatcctg ggcctggcc                  m7868g  5`-catcctg ggcgtggcc                  m7870a  5`-gggcatagcc cgagtcg                  m7870t  5`-gggcattgcc cgagtcg                  m7870c  5`-gggcatcgcc cgagtc Probe                    Sequence                  n169    5`-acc cgggtgacga cttctc pyrazinamide     m169    5`-acc cgggt9acca cttctc
4： 根据权利要求1所述的结核分支杆菌诊断及耐药分析芯片及其制备工艺和使用方法，其特 征在于：本发明制备工艺按如下步骤进行： (1)、设计结核特异性探针和引物； 从数据库中获得可靠的结核分支杆菌病毒基因序列以及耐药特征序列，根据所述的探针 序列设计探针； 从数据库中获得可靠的结核分支杆菌病毒基因序列以及耐药特征序列，为准确鉴别不同 基因型结核病原体，用引物F3、R385、F25、R568对提取的结核DNA作常规PCR或巢式 PCR，扩增不同类型结核杆菌16S-18S间隔区序列，筛选47个寡核苷酸探针，鉴别不同的结 核杆菌类型；选择对乙胺丁醇、异烟肼、利福平耐药的变异菌株特征序列，用引物F418、R621 进行扩增，选择579和579-1探针鉴别多药耐药基因菌株；用引物F2465、R2748扩增对喹诺 酮、环内沙星耐药菌株的变异区核酸序列，用寡核苷酸探针n2553 m2567 n2568 m2574 m2576 n2585 m2585t m2585c m2585a m2586g m2586c m2589c鉴别野生型和耐喹诺酮、环丙沙星药型 菌株；用引物F7769、R7921扩增对乙胺丁醇耐药菌株的变异区核酸序列，用寡核苷酸探针 n7855 m7868g m7870a m7870t m7870c鉴别野生型和乙胺丁醇耐药型菌株；用引物F34、R308 扩增对吡嗪酰胺耐药菌株的变异区核酸序列，用寡核苷酸探针n169、m169鉴别野生型和吡 嗪酰胺药型菌株； (2)、合成探针； (3)、制备芯片； 用去离子水将合成的探针溶解，浓度为200mmol/l，在玻璃基片上进行点样；点好的芯片于 37℃下水化3天，然后在80℃下烘干2小时；以探针缓冲液及蒸馏水冲洗玻片，吹干；以 封闭液封闭玻片，之后洗涤3次，吹干备用。
5： 根据权利要求4所述的结核分支杆菌诊断及耐药分析芯片的使用方法，其特征在于：对待 测样品的预处理过程中，PCR扩增引物序列如下：                               结核分型 primer                        Sequence                F3             5`-tgggacgaag tcgtaacaag g                R385           5`-tgccaaggca tccaccat                F25            5`-acgttc ccgggccttg                R568           5`-tgacagctcc ccgaggc                               耐药 primer                        Sequence ethambutol     F418           5`-ggctcatatc gagaatgc rifampin       R621           5`-ctcatcatca aagcggac primer                        Sequence quinolone      F2465          5`-cgggtg ctctatgcaa tgttc ciprofloxacin  R2748          5`-tcctcgtcga tttccctcag primer                        Sequence F7769                         5`-tggcgcacct tcaccct ethambutol     R7921          5`-gaaccagcgg aaatagttgg ac primer                        Sequence                F34            5`-gacttctgcgagggtggct pyrazinamide   R308           5`-tacgctccggtgtaggcac 6.根据权利要求4所述的结核分支杆菌诊断及耐药分析芯片的使用方法，其特征在于：探针 5’端加氨基修饰。 7.根据权利要求4所述的结核分支杆菌诊断及耐药分析芯片的使用方法，其特征在于：点样 从几十点到上千点，点的大小为50-100微米左右。 8.根据权利要求4所述的结核分支杆菌诊断及耐药分析芯片的使用方法，其特征在于：探针 缓冲液为1xSSC，0.1％SDS；封闭液为1％BSA，PH＝7 0.01mol/l PB。 9.根据权利要求1所述的结核分支杆菌诊断及耐药分析芯片的使用方法，其特征在于：使用 方法按如下步骤进行： (1).处理样品； 取病人脑脊液少量，分别提取DNA，备用；如需长时间放置，在-20℃下冻存； (2).PCR扩增 在反应管中加入扩增反应混合物——Taq酶，相应的处理好的样品和引物，足量的dNTP以及 荧光素Cy3标记的dUTP；扩增条件如下： 94℃    5min 94℃    30sec 56℃    30sec 72℃    1min 72℃    5min 以上步骤为30个循环； (3).杂交； PCR产物与芯片上的探针在60℃下杂交2小时，杂交缓冲液(10xSSC，0.1％SDS)与PCR 产物的比例为1∶1。洗涤3次。 (4).检测； 用扫描仪扫描杂交后的芯片，得到图像并输出结果； (5).数据分析 将芯片分析结果输出。
6： 1                                ACTCAGGCTTGGCCAGAG         17terrae                         ATCTAACAAGCAGATTTTTGG         18triviale                       ATCTAGCAGATGAGATCTCT         19tuberculosis                   ATCAATGGATACGCTGCC         20vaccae                         ATCTGAATGCACAGCGCT         21xenopi                         ATCTGGCAAAGACTGTGG         22abscessus                      ACCCTGCTTGGTGGTGG         23africanum                      AGGTGTTGTCCCACCGC              24avium                               CCTCCATCTTGGTGGTG              25bovis                               AGGTGTTGTCCCACCG              26chelonae                            ACCCTGCTTGGTGGTG              27diernhoferi                         CGGTGTCTGTTGTTGCTC              28gastri                              AGAGTGTTGTCCCACCAT              29gilvum                              GGGTCGGTGTGTTGTTG              30gordonae                            GGGTGCTGTCCCCCCA              31intracellulare                      CCTCCATCTTGGTGGTGG              32kansasii                            AGAGTTGTCCCACCATCT              33marinum                             GGGATGTTGTCCCACCAT              34phlei                               GGGTGCCGGTGTGTTG              35scrofulaceum                        TGAGTGGTGTCCCTCCA              36smegmatis                           GGCGTGTTGTTGCCCTG              37szulgai                             GAGCTGTTGTCCCACCA              38terrae                              GCCTCACACTTGGTGGT              39triviale                            TCACCGGTTTTGGTGTGG              40tuberculosis                        GGTGTTGTCCCACCGC              41vaccae                              GGGTCGGCGTGTTGTT              42xenopi                              TGGTGGCGGGGTGTGG              43fortuitum                           ATCACCTCCTTTCTAAGGAGCAC                                                    耐药 Probe                                              Sequence ethambutol     579                                 5`-atggaatgtc gcaaccaaat g isoniazid      579-1                               5`-atagaatgtc gcaaccaaat g rifampin primer                                             Sequence                F2465                               5`-cgggtg ctctatgcaa tgttc                R2748                               5`-tcctcgtcga tttccctcag Probe                                              Sequence                n2553                               5`-actaccac ccgcacggc                m2567                               5`-actaccac ccgcactgcg                n2568                               5`-gcg acgcgtcgat ctacg                m2574                               5`-ggcg acgtgtcgat ctacg                m2576                               5`-gcg acgcgtcgat cta                n2585                               5`-at ctacgacagc ctggtgcg                m2585t                              5`-at ctactacagc ctggtgcgc                m2585c                              5`-t ctaccacagc ctggtgcgc                m2585a                              5`-ctacaacagc ctggtgcgc                m2586g                              5`-cgat ctacggcagc ctgg                m2586c                              5`-cgat ctacgccagc ctgg qumolone       m2589c                              5`-tcgat ctacgacacc ctggtg ciprofloxacin Probe                                              Sequence ethambuto      n7855                               5`-ctacatcctg ggcatggcc                  m7868c  5`-tacatcctg ggcctggcc                  m7868g  5`-catcctg ggcgtggcc                  m7870a  5`-gggcatagcc cgagtcg                  m7870t  5`-gggcattgcc cgagtcg                  m7870c  5`-gggcatcgcc cgagtc Probe                    Sequence                  n169    5`-acc cgggtgacga cttctc pyrazinamide     m169    5`-acc cgggt9acca cttctc 4.根据权利要求1所述的结核分支杆菌诊断及耐药分析芯片及其制备工艺和使用方法，其特 征在于：本发明制备工艺按如下步骤进行： (1)、设计结核特异性探针和引物； 从数据库中获得可靠的结核分支杆菌病毒基因序列以及耐药特征序列，根据所述的探针 序列设计探针； 从数据库中获得可靠的结核分支杆菌病毒基因序列以及耐药特征序列，为准确鉴别不同 基因型结核病原体，用引物F3、R385、F25、R568对提取的结核DNA作常规PCR或巢式 PCR，扩增不同类型结核杆菌16S-18S间隔区序列，筛选47个寡核苷酸探针，鉴别不同的结 核杆菌类型；选择对乙胺丁醇、异烟肼、利福平耐药的变异菌株特征序列，用引物F418、R621 进行扩增，选择579和579-1探针鉴别多药耐药基因菌株；用引物F2465、R2748扩增对喹诺 酮、环内沙星耐药菌株的变异区核酸序列，用寡核苷酸探针n2553 m2567 n2568 m2574 m2576 n2585 m2585t m2585c m2585a m2586g m2586c m2589c鉴别野生型和耐喹诺酮、环丙沙星药型 菌株；用引物F7769、R7921扩增对乙胺丁醇耐药菌株的变异区核酸序列，用寡核苷酸探针 n7855 m7868g m7870a m7870t m7870c鉴别野生型和乙胺丁醇耐药型菌株；用引物F34、R308 扩增对吡嗪酰胺耐药菌株的变异区核酸序列，用寡核苷酸探针n169、m169鉴别野生型和吡 嗪酰胺药型菌株； (2)、合成探针； (3)、制备芯片； 用去离子水将合成的探针溶解，浓度为200mmol/l，在玻璃基片上进行点样；点好的芯片于 37℃下水化3天，然后在80℃下烘干2小时；以探针缓冲液及蒸馏水冲洗玻片，吹干；以 封闭液封闭玻片，之后洗涤3次，吹干备用。 5.根据权利要求4所述的结核分支杆菌诊断及耐药分析芯片的使用方法，其特征在于：对待 测样品的预处理过程中，PCR扩增引物序列如下：                               结核分型 primer                        Sequence                F3             5`-tgggacgaag tcgtaacaag g                R385           5`-tgccaaggca tccaccat                F25            5`-acgttc ccgggccttg                R568           5`-tgacagctcc ccgaggc                               耐药 primer                        Sequence ethambutol     F418           5`-ggctcatatc gagaatgc rifampin       R621           5`-ctcatcatca aagcggac primer                        Sequence quinolone      F2465          5`-cgggtg ctctatgcaa tgttc ciprofloxacin  R2748          5`-tcctcgtcga tttccctcag primer                        Sequence F7769                         5`-tggcgcacct tcaccct ethambutol     R7921          5`-gaaccagcgg aaatagttgg ac primer                        Sequence                F34            5`-gacttctgcgagggtggct pyrazinamide   R308           5`-tacgctccggtgtaggcac 6.根据权利要求4所述的结核分支杆菌诊断及耐药分析芯片的使用方法，其特征在于：探针 5’端加氨基修饰。 7.根据权利要求4所述的结核分支杆菌诊断及耐药分析芯片的使用方法，其特征在于：点样 从几十点到上千点，点的大小为50-100微米左右。 8.根据权利要求4所述的结核分支杆菌诊断及耐药分析芯片的使用方法，其特征在于：探针 缓冲液为1xSSC，0.1％SDS；封闭液为1％BSA，PH＝7 0.01mol/l PB。 9.根据权利要求1所述的结核分支杆菌诊断及耐药分析芯片的使用方法，其特征在于：使用 方法按如下步骤进行： (1).处理样品； 取病人脑脊液少量，分别提取DNA，备用；如需长时间放置，在-20℃下冻存； (2).PCR扩增 在反应管中加入扩增反应混合物——Taq酶，相应的处理好的样品和引物，足量的dNTP以及 荧光素Cy3标记的dUTP；扩增条件如下： 94℃    5min 94℃    30sec 56℃    30sec 72℃    1min 72℃    5min 以上步骤为30个循环； (3).杂交； PCR产物与芯片上的探针在60℃下杂交2小时，杂交缓冲液(10xSSC，0.1％SDS)与PCR 产物的比例为1∶1。洗涤3次。 (4).检测； 用扫描仪扫描杂交后的芯片，得到图像并输出结果； (5).数据分析 将芯片分析结果输出。
7： 1                                TGTCTTGGACTCGTCCAA         8gilvum                          ATCGAAAGATGGTGCACA         9gordonae                        ATCAAAATGTATGCGTTGTC         10 intracellulare                ATCTAGATGAGCGCATAGT         11kansasii                       ATCAAATGGATGCGTTGCC      11.1                                AACACTCGGGCTCTGTTC         12marinum                        ATCAATTGGATGCGCTGC      12.1                                ATCTCTGTTGGTTTCGGG         13phlei                          ATCTGATACTTGATGCTCCT         14scrofulaceum                   ATCTAAACGGATGCGTTGC         15smegmatis                      ATCTAGTTCGTAAGAGTGTG         16szulgai                        ATCAATTGGATGCGCTGC      16.1                                ACTCAGGCTTGGCCAGAG         17terrae                         ATCTAACAAGCAGATTTTTGG         18triviale                       ATCTAGCAGATGAGATCTCT         19tuberculosis                   ATCAATGGATACGCTGCC         20vaccae                         ATCTGAATGCACAGCGCT         21xenopi                         ATCTGGCAAAGACTGTGG         22abscessus                      ACCCTGCTTGGTGGTGG         23africanum                      AGGTGTTGTCCCACCGC              24avium                               CCTCCATCTTGGTGGTG              25bovis                               AGGTGTTGTCCCACCG              26chelonae                            ACCCTGCTTGGTGGTG              27diernhoferi                         CGGTGTCTGTTGTTGCTC              28gastri                              AGAGTGTTGTCCCACCAT              29gilvum                              GGGTCGGTGTGTTGTTG              30gordonae                            GGGTGCTGTCCCCCCA              31intracellulare                      CCTCCATCTTGGTGGTGG              32kansasii                            AGAGTTGTCCCACCATCT              33marinum                             GGGATGTTGTCCCACCAT              34phlei                               GGGTGCCGGTGTGTTG              35scrofulaceum                        TGAGTGGTGTCCCTCCA              36smegmatis                           GGCGTGTTGTTGCCCTG              37szulgai                             GAGCTGTTGTCCCACCA              38terrae                              GCCTCACACTTGGTGGT              39triviale                            TCACCGGTTTTGGTGTGG              40tuberculosis                        GGTGTTGTCCCACCGC              41vaccae                              GGGTCGGCGTGTTGTT              42xenopi                              TGGTGGCGGGGTGTGG              43fortuitum                           ATCACCTCCTTTCTAAGGAGCAC                                                    耐药 Probe                                              Sequence ethambutol     579                                 5`-atggaatgtc gcaaccaaat g isoniazid      579-1                               5`-atagaatgtc gcaaccaaat g rifampin primer                                             Sequence                F2465                               5`-cgggtg ctctatgcaa tgttc                R2748                               5`-tcctcgtcga tttccctcag Probe                                              Sequence                n2553                               5`-actaccac ccgcacggc                m2567                               5`-actaccac ccgcactgcg                n2568                               5`-gcg acgcgtcgat ctacg                m2574                               5`-ggcg acgtgtcgat ctacg                m2576                               5`-gcg acgcgtcgat cta                n2585                               5`-at ctacgacagc ctggtgcg                m2585t                              5`-at ctactacagc ctggtgcgc                m2585c                              5`-t ctaccacagc ctggtgcgc                m2585a                              5`-ctacaacagc ctggtgcgc                m2586g                              5`-cgat ctacggcagc ctgg                m2586c                              5`-cgat ctacgccagc ctgg qumolone       m2589c                              5`-tcgat ctacgacacc ctggtg ciprofloxacin Probe                                              Sequence ethambuto      n7855                               5`-ctacatcctg ggcatggcc                  m7868c  5`-tacatcctg ggcctggcc                  m7868g  5`-catcctg ggcgtggcc                  m7870a  5`-gggcatagcc cgagtcg                  m7870t  5`-gggcattgcc cgagtcg                  m7870c  5`-gggcatcgcc cgagtc Probe                    Sequence                  n169    5`-acc cgggtgacga cttctc pyrazinamide     m169    5`-acc cgggt9acca cttctc 4.根据权利要求1所述的结核分支杆菌诊断及耐药分析芯片及其制备工艺和使用方法，其特 征在于：本发明制备工艺按如下步骤进行： (1)、设计结核特异性探针和引物； 从数据库中获得可靠的结核分支杆菌病毒基因序列以及耐药特征序列，根据所述的探针 序列设计探针； 从数据库中获得可靠的结核分支杆菌病毒基因序列以及耐药特征序列，为准确鉴别不同 基因型结核病原体，用引物F3、R385、F25、R568对提取的结核DNA作常规PCR或巢式 PCR，扩增不同类型结核杆菌16S-18S间隔区序列，筛选47个寡核苷酸探针，鉴别不同的结 核杆菌类型；选择对乙胺丁醇、异烟肼、利福平耐药的变异菌株特征序列，用引物F418、R621 进行扩增，选择579和579-1探针鉴别多药耐药基因菌株；用引物F2465、R2748扩增对喹诺 酮、环内沙星耐药菌株的变异区核酸序列，用寡核苷酸探针n2553 m2567 n2568 m2574 m2576 n2585 m2585t m2585c m2585a m2586g m2586c m2589c鉴别野生型和耐喹诺酮、环丙沙星药型 菌株；用引物F7769、R7921扩增对乙胺丁醇耐药菌株的变异区核酸序列，用寡核苷酸探针 n7855 m7868g m7870a m7870t m7870c鉴别野生型和乙胺丁醇耐药型菌株；用引物F34、R308 扩增对吡嗪酰胺耐药菌株的变异区核酸序列，用寡核苷酸探针n169、m169鉴别野生型和吡 嗪酰胺药型菌株； (2)、合成探针； (3)、制备芯片； 用去离子水将合成的探针溶解，浓度为200mmol/l，在玻璃基片上进行点样；点好的芯片于 37℃下水化3天，然后在80℃下烘干2小时；以探针缓冲液及蒸馏水冲洗玻片，吹干；以 封闭液封闭玻片，之后洗涤3次，吹干备用。 5.根据权利要求4所述的结核分支杆菌诊断及耐药分析芯片的使用方法，其特征在于：对待 测样品的预处理过程中，PCR扩增引物序列如下：                               结核分型 primer                        Sequence                F3             5`-tgggacgaag tcgtaacaag g                R385           5`-tgccaaggca tccaccat                F25            5`-acgttc ccgggccttg                R568           5`-tgacagctcc ccgaggc                               耐药 primer                        Sequence ethambutol     F418           5`-ggctcatatc gagaatgc rifampin       R621           5`-ctcatcatca aagcggac primer                        Sequence quinolone      F2465          5`-cgggtg ctctatgcaa tgttc ciprofloxacin  R2748          5`-tcctcgtcga tttccctcag primer                        Sequence F7769                         5`-tggcgcacct tcaccct ethambutol     R7921          5`-gaaccagcgg aaatagttgg ac primer                        Sequence                F34            5`-gacttctgcgagggtggct pyrazinamide   R308           5`-tacgctccggtgtaggcac 6.根据权利要求4所述的结核分支杆菌诊断及耐药分析芯片的使用方法，其特征在于：探针 5’端加氨基修饰。 7.根据权利要求4所述的结核分支杆菌诊断及耐药分析芯片的使用方法，其特征在于：点样 从几十点到上千点，点的大小为50-100微米左右。
8： 根据权利要求4所述的结核分支杆菌诊断及耐药分析芯片的使用方法，其特征在于：探针 缓冲液为1xSSC，0.1％SDS；封闭液为1％BSA，PH＝7 0.01mol/l PB。
9： 根据权利要求1所述的结核分支杆菌诊断及耐药分析芯片的使用方法，其特征在于：使用 方法按如下步骤进行： (1).处理样品； 取病人脑脊液少量，分别提取DNA，备用；如需长时间放置，在-20℃下冻存； (2).PCR扩增 在反应管中加入扩增反应混合物——Taq酶，相应的处理好的样品和引物，足量的dNTP以及 荧光素Cy3标记的dUTP；扩增条件如下： 94℃    5min 94℃    30sec 56℃    30sec 72℃    1min 72℃    5min 以上步骤为30个循环； (3).杂交； PCR产物与芯片上的探针在60℃下杂交2小时，杂交缓冲液(10xSSC，0.1％SDS)与PCR 产物的比例为1∶1。洗涤3次。 (4).检测； 用扫描仪扫描杂交后的芯片，得到图像并输出结果； (5).数据分析 将芯片分析结果输出。